bacterias fijadoras de n
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Abundancia y Diversidad funcional de bacterias Abundancia y Diversidad funcional de bacterias fijadoras libres de nitrógeno en suelos del Sur del fijadoras libres de nitrógeno en suelos del Sur del
Trapecio Amazónico ColombianoTrapecio Amazónico Colombiano
Andrea MantillaAndrea Mantilla M ScM ScAndrea Mantilla Andrea Mantilla M.ScM.Sc
Septiembre Septiembre de 2010de 2010
ContenidoContenido
1.1. IntroducciónIntroducción
2.2. ObjetivosObjetivos
33 M d lM d l3.3. MetodologíaMetodología
44 ResultadosResultados4.4. ResultadosResultados
5.5. ConclusionesConclusionesFlor de Inirida. Fuente: Rene López
IntroducciónIntroducciónAmazonia: Reserva Natural de Biodiversidad
IntroducciónIntroducción
Bosque húmedo tropical. PNNA. Fuente: Augusto Mazorra. Mico. Tarapacá. Fuente: René López. Heliconias. Guaviare. Fuente: René López. Comunidad Indígena. Fuente: René López
? ? ? ?
El suelo y la rizósferaEl suelo y la rizósferaEl suelo y la rizósferaEl suelo y la rizósfera
Diversidad de macro ymicroorganismos.microorganismos.
Ciclos biogeoquímicos.
Actividad microbiana Actividad microbiana.
P y N más limitantes.
Perfil Suelo Amazónico. Fotografía Clara Peña.
FBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la TierraFBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la TierraFBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la TierraFBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la Tierra
Arazá. Fuente: Jaime Barrera
amaneciendopensamientos1.blogspot.com/2008/03 Cocona. Fuente: Jaime Barrera
Bacterias fijadoras de nitrógenoBacterias fijadoras de nitrógeno
Bacterias fijadoras simbióticasBacterias fijadoras simbióticas Bacterias diazótrofasBacterias diazótrofas
Formación de nódulos. Fuente: http://locuras‐mooy blogspot com
Formación de quistes de Azotobacter sp.p. Fuente:http://locuras‐mooy blogspot commooy.blogspot.com http://locuras‐mooy.blogspot.com
DiazótrofasDiazótrofas PGPRPGPR
1 2 3
Fijación de Nitrógeno Producción de Auxinas
Desarrollo Vegetal
1)Azospirillum. Fuente: http://www.dista.unibo.it. 2) Morfogénesis Copoazú. Fuente: Olga Rodríguez. 3) Ensayo matera. Fuente: http://www.dista.unibo.it. 4) Copoazú. Fuente: Jaime Barrera 4
Objetivo generalObjetivo general
Estimar la abundancia y diversidad funcional
de bacterias diazótrofas aisladas en suelos del
sur del trapecio amazónico colombiano parap p
seleccionar aislamientos con potencial para el
desarrollo de preformulaciones.desarrollo de preformulaciones.
Objetivos específicosObjetivos específicosAislar y caracterizar la comunidad cultivable de bacterias diazótrofas
Objetivos específicos Objetivos específicos
a partir de suelo.
Evaluar y seleccionar in vitro los microorganismos diazótrofos cony g
mayor capacidad fijadora de nitrógeno.
Evaluar y seleccionar in vitro aislamientos diazótrofos productores deEvaluar y seleccionar in vitro aislamientos diazótrofos productores de
AIA.
E l l f ti id d d b t i di ót f t dEvaluar la efectividad de bacterias diazótrofas como promotoras de
crecimiento vegetal sobre el crecimiento de cocona bajo condiciones
de cultivo in Vitro.
Área de estudioÁrea de estudioÁrea de estudioÁrea de estudio
Bosque PNNA. Fuente: Augusto Mazorra
Chagra .Fuente: Clara PeñaPastizal. Finca ganadera Villa Claudia. Fuente: J. P. Forero
Aislamiento de diazótrofasAislamiento de diazótrofasAislamiento de diazótrofasAislamiento de diazótrofas
C í l10 g de muestra en 90 ml de S.S. 0,85% (10‐1)
Agitación a 250 rpm x 1 h 30°C
Cortar raíces, macerarlas y homogenizar con el suelo
Diluciones seriadas hasta 10 ‐5
AMI
Siembra dilución 10‐4 en medios Burk´s y Ashby
Siembra diluciones 10 ‐2 a 10 ‐5
Incubar x 8 d 30ºC
Incubar x 5 d 30°C
AEROB
ICROA
Recuento (UFC/g de suelo) y descripción morfológica
en JMV y Nfb semisólidos
R t NMP/ d l
Incubar x 5 d 30 CIOS
EROLIRecuento por NMP/g de suelo y
protocolo de Dobereiner
IOS
Ensayos ARA y AIA
Inoculacióny suspensión S S 0 85%
Reemplazo de 0.2% C2H2
Cromatografía de gasesInoculación
BHI x 24hDO: 1.8 – 2.2 Abs: 600nm
en S.S. 0.85% con C2H2
Incubación por 48h
Aerobios: 4.5hMicroaerófilos: 24h
30ºCProducción de C2H4
C.N + Trp 0.3% x
Centrifugar y filtrar
C.N + Trp 0.3% x 72h en oscuridad
Cromatograma de HPLC muestra 35‐2Cromatografía Líquida
Amplificación gen nifHAmplificación gen nifH
A B C
DE
(A): Extracción DNA. Fuente: Corpogen. (B): Amplificación nifH. Fuente: E. Mendoza. (C): Secuenciación. Fuente: Sinchi –Corpogen. (D): Alineamiento de secuencias NCBI‐GB. Fuente: Corpogen. (E): Análisis filogenético. Fuente: Corpogen.
Evaluacion del efecto promotorEvaluacion del efecto promotor Porcentaje de germinación y evaluación viabilidad de Tª ambiente y exposición y evaluación viabilidad de
semillas
Selección de 5Selección de 5
y pa luz directa
AIA
Selección de 5 aislamientos: altos valores
de ARA y valores bajos, medios y altos de
AIA
Valores de ARA:12,518 (847,25 + 551,9 nmoles de etileno/h/ml).
Preparación del inóculo microbiano en buffer PBS.
Cultivos de 24‐48 h en AN a una concentración
Inoculación: 5 replicas por
final de 106 UFC
Inoculación: 5 replicas por inoculo, cada replica con 10
semillas. N= 350
25C con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 h de oscuridad durante 5 días. .
Abundancia Diazótrofas Aerobias y MicroaerófilasAbundancia Diazótrofas Aerobias y MicroaerófilasAbundancia Diazótrofas Aerobias y MicroaerófilasAbundancia Diazótrofas Aerobias y MicroaerófilasDiazótrofas aerobias Diazótrofas Microaerófilas
80
100
120
140
o (10 ex
p5)
6.00E+02
8.00E+02
1.00E+03
1.20E+03
g de
suelo
Terraza
0
20
40
60
UFC
/g de su
el
Terraza
Varzea
0.00E+00
2.00E+02
4.00E+02
Bosque Pastizal Chagra
NMP/
g Terraza
Várzea
PASTIZAL CHAGRA BOSQUE
COBERTURA
Cobertura
51 aislamientos agrupados en 19 morfologías.
Nº de Morfologías: B > CH > P.
Distribución morfologías: B > CH > P.
No relación entre paisajes y distribución de morfologías
Ensayo de ARAEnsayo de ARAEnsayo de ARAEnsayo de ARARelación ARA y CoberturaRelación ARA y Cobertura
3000 Aislamientos aerobios: Valores hasta
1000
1500
2000
2500
ileno
/hor
a/m
l de
de c
ultiv
o
Diazótrofos aerobios
Aislamientos aerobios: Valores hasta11,062 + 170,24 nmoles etileno/hora/mlde medio de cultivo de Burk´s.
Aislamientos microaerofilos: valores
0
500
1000
BOSQUE PASTIZAL CHAGRAA. vinelandii
nmol
es d
e et
im
edio
d Aislamientos microaerofilos: valoreshasta 8905,72 + 1117,57 nmolesetileno/hora/ml de medio Nfb.
Control positivo (Azospirillum
Medio de cultivo
Aislamientos recuperados
Aislamientos ARA (+)
Aislamientos ARA positivoAislamientos ARA positivoControl positivo (Azospirillumbrasilense ): valores entre 847,25 + 551,9nmoles de etileno/hora/ml.
117 aislamientos fueron ARA (+) 38p ( )
Burk´s 76 28
Ashby 51 45
Nfb 110 39
117 aislamientos fueron ARA (+), 38perdieron está capacidad, siendo 79 losque se encuentran conservados enCryoBank.
JMV 76 5
TOTAL 313 117
y
Producción de compuestos indólicosProducción de compuestos indólicosProducción de compuestos indólicosProducción de compuestos indólicos
41 aislamientos registraron valores de producción de AIA por HPLC mayores a losregistrados por el control positivo A. lipoferum, con valores que oscilan entre 16,61 + 0,52 y357,13 + 22,43.
Los valores de AIA reportados por los aislamientos de bacterias diazótrofas del banco del Los valores de AIA reportados por los aislamientos de bacterias diazótrofas del banco delInstituto han sido hasta 100 veces mas altos que bacterias de los mismos géneros aisladasen maíz (Bashan, 2004), pastizales y caña de azúcar (Baldani et al. 2007).
GC1
Diapositiva 17
GC1 Gladys Cardona, 25/04/2010
Amplificación del genAmplificación del gen nifHnifH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ C‐MP
Amplificación del gen Amplificación del gen nifHnifH2 y 32 y 3
320 pb 66
Filotipo Alineamiento de secuencias
1 Bradyrhizobium sp CBC1 Bradyrhizobium sp., CBC
2 A. Vinelandii, CBC
3 A. Vinelandii, CBC
4 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC77
5 K. pneumoniae, Enterobacter sp. CBC
6 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
7 Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
8 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
77
9 Paenibacillus sp., CBC
10 S. enterica, Enterobacter sp. y CBC 44
Efecto promotor sobre semillas de CoconaEfecto promotor sobre semillas de Cocona
Viabilidad y Calidad de las semillas Medición tamaño de la radícula
Figura 1. Determinación del efecto de bacterias diazótrofas sobre el crecimiento de la radícula de semillas de cocona.
Figura 2. Efecto de bacterias diazótrofas sobre el crecimiento y germinación de semillas de cocona, dado en peso seco.
ConclusionesConclusionesLa FBN de bacterias diazótrofas de la región amazónica (a partir de losensayos de ARA) mostraron una alta eficiencia (400% mas fijación)
ConclusionesConclusiones
ensayos de ARA), mostraron una alta eficiencia (400% mas fijación)comparados con los controles positivos usados A. Vinelandii .
l l d AIA d l i l i d b i di ó f los valores de AIA reportados por los aislamientos de bacterias diazótrofasdel banco del Instituto han sido hasta 100 veces mas altos que bacterias delos mismos géneros aisladas en maíz (Bashan, 2004), pastizales y caña deazúcar (Baldani et al 2007)azúcar (Baldani et al. 2007).
Los resultados de secuenciación del gen nifH agruparon los aislamientos10 fil ti d d l fil ti (7) lb ó l í d i l i ten 10 filotipos, en donde el filotipo (7) albergó a la mayoría de aislamientos.
La mayoría de éstos géneros pertenecen a la familia Enterobacteriaceaeampliamente reportados como fijadores de nitrógeno y patógenos para elhombre animales y plantashombre, animales y plantas.
ConclusionesConclusiones
S d á d l 50% d l li i d l i
ConclusionesConclusiones
Se destaca que más del 50% de los alineamientos de las secuenciasencontradas corresponden a bacterias no cultivables, resaltando que granparte de las bacterias diazótrofas existentes en la zona de estudio son génerosaún desconocidos y por tanto constituyen una fuente de nuevas especiesaún desconocidos y por tanto constituyen una fuente de nuevas especies.
El banco de bacterias diazótrofas del sur del Trapecio Amazónico sed i l d i i l i é ddestaca por su potencial promotor de crecimiento vegetal, constituyéndosecomo un insumo importante para el desarrollo de preformulacionesmicrobianas para potencializar el efecto de enmiendas orgánicas sobre eldesarrollo de cultivos de importancia económica para la región amazónicadesarrollo de cultivos de importancia económica para la región amazónicacolombiana.
Muchas GraciasMuchas Gracias