bacillus

Fecha emisión: 1996 Revisión: 2

PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS

Fecha revisión: 28.07.2008

Sección Microbiología de Alimentos

PRT- 712.04-035

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1. OBJETIVO

Detectar el número de unidades formadoras de colonias (ufc) o de esporas de Bacillus cereus en el alimento. 2. CAMPO DE APLICACION Y ALCANCE

Aplicar este procedimiento en alimentos en los que se espera detectar >100 células o esporas/ g o mL. 3. FUNDAMENTO

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio-anaerobio facultativo. Es formador de esporas, las que se encuentran en la tierra, polvo y por esta razón es un frecuente contaminante de alimentos. El fundamento del método es utilizar la capacidad de precipitar la lecitina de la yema de huevo que contiene el medio y su característica de no fermentar el manitol, estas 2 propiedades son utilizadas para diferenciar las colonias de B. cereus en el medio de cultivo MYP. La polimixina es un inhibidor del desarrollo de otros bacilos facultativos ambientales. 4. REFERENCIAS

4.1. Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual" online, enero 2001, carpeta 14

5. TERMINOLOGIA

No Aplica.





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6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1. Materiales 6.1.1 Pipetas estériles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 mL. 6.1.2 Propipetas 6.1.3 Placas Petri estériles 15 x 100 mm. 6.1.4 Asas desechables de nicrom o platino de aro 2 mm y 3 mm de diámetro. 6.1.5 Tubos estériles de 13 x 100 mm y tubos de 16 x 125 mm. 6.1.6 Jarra anaerobiosis, Anaerogen o Gas Pack con generador de H2 + CO2 y catalizador. 6.2 Medios de Cultivo y Reactivos 6.2.1 Agar Manitol-Yema de huevo y Polimixina (MYP). 6.2.2 Agar Tirosina. 6.2.3 Agar nutritivo para Bacillus cereus 6.2.4 Caldo Glucosa-Rojo fenol 6.2.5 Caldo Nitrato 6.2.6 Caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer (RM-VP) 6.2.7 Caldo lisozima 6.2.8 Solución de Polimixina 0.1% para agar MYP 6.2.9 Solución de α naftol 0,5% en ácido acético 5M 6.2.10 Solución de ácido sulfanílico 0,4% en ácido acético 2,6M 6.2.11 Solución de α naftol 5% en etano 6.2.12 Solución de KOH al 40% 6.2.13 Emulsión de Yema de Huevo al 50% 6.2.14 Reactivos para tinción de Gram 6.2.15 Zinc en polvo 6.2.16 Agua de dilución de Butterfield en tubos con 9 mL ± 0,2 mL y de 450 mL 6.2.17 Cristales creatina 6.2.18 Solución de tinción Fucsina básica 6.2.19 Metanol 6.2.20 Medio movilidad B cereus 6.3 Equipos 6.3.1 Estufas de incubación reguladas a 30º ± 2° C y 35º ± 2º C 6.3.2 Refrigerador 6.3.3 Vortex 6.3.4 Baño de agua 48-50 °C.





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7 DESARROLLO DEL PROCESO

7.1 Recepción de la muestra en el laboratorio 339

7.1.1 Recibir la dilución 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepción de muestras según PRT-712.01-002.

7.1.2 Preparar a partir de dilución 10-1 diluciones seriadas hasta 10-6 si es necesario, transfiriendo 1 mL a 9 mL de diluyente.

7.1.3 Anotar en la hoja de registro la inscripción de muestras del laboratorio, la clave, N°, fecha de recepción, naturaleza de la muestra, fecha de análisis y analista.

7.1.4 En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la información adicional que se disponga, si la hay.

7.1.5 El período transcurrido entre la preparación del homogeneizado de la muestra y la siembra no debe superar los 20 minutos.

7.2 Siembra recuento de células viables de Bacillus cereus

7.2.1 Secar las placas preparadas con anterioridad con medio MYP por 10 minutos aproximadamente, colocándolas ligeramente abiertas en forma invertida sobre su propia tapa en estufa a 55º C.

7.2.2 Hacer diluciones según corresponda al tipo de muestra a analizar.

7.2.3 Sembrar en superficie y en duplicado 0,1 mL de cada dilución.

7.2.4 Diseminar el inóculo con rastrillo estéril por toda la superficie del agar.

7.2.5 Incubar las placas invertidas a 30ºC ± 2° C por 24 hrs. 7.2.6 Observar las placas a las 24 horas y si la reacción no es clara dejar por 24 horas

adicionales.

7.3 Lectura

7.3.1 Recuento presuntivo para células viables y esporas

7.3.1.1 Seleccionar las placas que contienen entre 15 y 150 colonias.

7.3.1.2 Contar todas las colonias de color rosado, reacción manitol negativo y que presenten reacción de precipitación producto de la lecitinasa.

7.3.1.3 Registrar la lectura en la hoja de Registro de análisis del laboratorio RG-712.00-081.

Recuento presuntivo = Lectura x factor de dilución





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7.3.1.4 En caso de no tener colonias aisladas, proceder como sigue:

7.3.1.5 Tomar una porción de cultivo con asa.

7.3.1.6 Sembrar por agotamiento en una placa de agar MYP previamente seca.

7.3.1.7 Incubar las placas invertidas a 30º C ± 2° C por 24 horas.

7.3.1.8 Registrar las características de este cultivo en la hoja de Registro de análisis del laboratorio RG-712.00-081.

7.3.1.9 Realizar pruebas bioquímicas a las colonias seleccionadas.

7.4 Pruebas confirmativas

7.4.1 Repicar 5 o más colonias según el recuento (si el recuento es bajo, repicar colonias necesarias) para realizar las pruebas bioquímicas.

7.4.2 Del agar MYP transferir a agar nutritivo tendido. Incubar 24 horas a 30° C ± 2° C.

7.4.3 Realizar Gram y observar microscópicamente. B. cereus aparece como bacilo largo Gram positivo, en cadenas cortas a largas; de esporas elipsoidales de disposición central o subterminal y el esporangio no engrosado.

7.4.4 Transferir cultivo con asa de 3 mm a tubos de 13 x 100 mm que contienen 0,5 mL de agua de dilución buffer fosfato, suspenda el cultivo y mezcle en vortex. Use esta suspensión para inocular los siguientes medios confirmatorios:

7.4.4.1 Prueba de Fermentación de glucosa: Inocular con asa de 2 mm el cultivo en 3 mL de caldo glucosa rojo fenol e incubar en anaerobiosis por 24 horas a 35°C ± 2° C.

7.4.4.2 Prueba RM_VP: Inocular el cultivo en 5mL de medio VP con el cultivo, utilizando asa de 3mm de diámetro. Incubar por 48±2 h a 35° C.

7.4.4.3 Prueba lisozima: Inocular el cultivo con asa de 2 mm en 2,5 mL de caldo nutritivo que contenga 0,001% de lisozima. También inocular en 2,5 mL de caldo nutritivo como control positivo. Incubar por 24 horas a 35°C ± 2° C.

7.4.4.4 Prueba tirosina: Inocular con asa de 3 mm, en toda la superficie del agar tirosina tendido. Incubar por 48 horas a 35°C ± 2° C. Incubar los tubos que no presenten crecimiento hasta por 7 días antes de considerar el resultado como negativo.

7.4.4.5 Prueba de reducción de nitratos a nitritos: Inocular en 5 mL de caldo nitrato con el cultivo, utilizando asa de 3 mm. Incubar por 24 horas a 35° C ± 2° C.

7.4.4.6 Agar MYP: puede ser omitido si los resultados son determinantes en el MYP original o inicial. Si no es así dividir la placa en 6-8 secciones iguales y rotular cada sección e inocular con asa de 2 mm el cultivo en la superficie del agar en un área de 4 cm2 de agar Incubar a 35°C ± 2° C por 24 horas.





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7.5 Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B,

thuringiensis y B. anthracis

7.5.1 Prueba de la motilidad: Inocular en medio BC motilidad en picadura en el centro del tubo con asa de 3 mm con cultivo de una suspensión de 24 horas. Inocule 18 a 24 horas a 30° C y examine crecimiento a lo largo de la línea de inoculación. Alternativamente, añada 0,2 mL de agua destilada estéril a la superficie de agar nutritivo tendido e inocule con asa de 3 mm del cultivo de una suspensión. Incube 6 a 8 horas a 30° C ± 2° C y suspenda con asa de 3 mm el líquido a acumulado en la base del agar tendido en una gota de agua estéril sobre un portaobjeto, ponga un cubreobjeto y observe al microscopio.

7.5.2 Desarrollo rizoidal: en agar nutritivo (18 a 20 mL) en placa, dejar secar completamente a temperatura ambiente por 1 a 2 días. Inocular suspensión del cultivo con asa de 2 mm suavemente sólo tocando la parte central del agar en la placa.Incubar a 30° C ± 2° C por 48 a 72 horas.

7.5.3 Actividad hemolítica: en un placa de agar soya tripticase co sangre de cordero inocular con asa de 2 mm una suspensión de 24 horas, se pueden usar cuñas de agar. Incubar a 35° C ± 2° C por 24 horas.

7.5.4 Prueba de cristales de proteína tóxicos: inocular en agar nutritivo tendido con asa de 3 mm una suspensión de un cultivo de 24 h .Incube a 30° C ± 2° C por 24 h y dejar a temperatura ambiente por 2 a 3 días. Preparar extendido o frotis con agua destilada estéril en un porta objeto. Secar al aire y fijar con la llama de un mechero Bunsen.En un soporte de tinción inunde con metanol, deje por 30 segundos, elimine el metanol y seque al aire. Ubique nuevamente el porta objeto en el soporte de tinción e inunde completamente con fucsina básica al 0,5 % o con colorante carbolfucsina de TB. Caliente con un pequeño mechero Bunsen hasta que se desprenda vapor. Espere 1 a 2 min y repita este paso, deje 30 segundos, elimine el colorante y enjuague profundamente con agua corriente. Deje secar y examine al microscopio en inmersión.

7.6 Lectura de las pruebas bioquímicas

7.6.1 En caldo Fermentación de glucosa, agitar vigorosamente el tubo y observar desarrollo por incremento de la turbiedad y viraje del indicador de rojo a amarillo, lo que indica que el ácido ha sido producido anaeróbicamente desde la glucosa, un cambio parcial de color rojo a naranjado puede ocurrir incluso en los tubos de control sin inóculo debido a la reducción de pH debido a la exposición del medio a CO2 formado en la jarra de anaerobiosis. Asegurarse usar controles positivos y negativos para distinguir reacciones falso-positivo.

7.6.2 La prueba en RM_VP para la producción de acetilmetil-carbinol es positiva al pipetear 1 mL y transferirlo a tubos de 16 x 125 mm, luego añadir 0,6 mL de solución de alfa-naftol al 5% en etanol y 0,2 mL de NaOH al 40% .Agitar y se puede añadir unos pocos





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cristales de creatinina. Después de una hora a temperatura ambiente se puede observar la aparición de color rosado intenso o violeta lo que indica que la reacción es positiva.

7.6.3 En caldo lisozima se observa desarrollo por la presencia de turbidez por desarrollo positivo. Si la lectura fuese negativa incubar por 24 horas adicionales antes de descartar.

7.6.4 En el agar tirosina se observa una zona clara en el medio cerca o alrededor de desarrollo de B. cereus. Incubar por un total de 7 días antes de considerar la prueba como negativa.

7.6.5 En caldo nitrato observar la parición color rojo anaranjado al agregar 0,25 mL de ácido sulfanílico al 0,8 % en ácido acético 5 N y 0,25 mL de α naftol al 0,5% en ácido acético 5N, un cambio de color a anaranjado indica que la prueba es positiva, si no aparece color naranjo dentro de 10 minutos, indica que la prueba es negativa y se debe agregar polvo de Zn, no debe observarse cambios para interpretar la prueba como positiva, de lo contrario si al agregar Zinc en polvo se presenta coloración anaranjada, se debe interpretar la prueba como negativa.

7.6.6 En agar MYP observar la producción de lecitinasa indicada por una zona de precipitación alrededor de las colonias. El manitol no es fermentado por lo tanto las colonias son rosadas.

7.6.7 Interpretación de los resultados: B. cereus es un bacilo Gram positivo con esporas, produce lecitinasa y no fermenta manitol en agar MYP, crece y produce ácido en condiciones anaeróbicas a partir de la glucosa, reduce nitratos a nitritos, produce acetilmetil-carbinol, descompone la tirosina, y crece en presencia de lisozima la 0,001%.

7.6.8 Pruebas adicionales: 7.6.8.1 Prueba de la motilidad, los microorganismos móviles producen desarrollo difuso en el

medio de cultivo. Los inmóviles crecen sólo en la línea de inoculación. Si realiza la prueba en agar tendido la observación al microscopio se observan microorganismos móviles.

7.6.8.2 El desarrollo rizoidal se manifiesta por el crecimiento en arborización o desarrollo similar a raíces que se extienden por varios centímetros del centro de la inoculación y es característico de B. mycoides.

7.6.8.3 Actividad hemolítica en B. cereus es fuerte y marcada produciendo 2 a 4 mm de zona de β.- hemólisis (hemólisis completa) alrededor de las colonias. (Seis o más colonias pueden ser testeadas en cada placa).

7.6.8.4 En la prueba de cristales tóxicos de proteína se observan esporas libres y los cristales se observan como formas tetragonales y se tiñen en forma muy oscura. Los cristales son usualmente más pequeños que las esporas.

7.6.8.5 Interpretación resultados pruebas adicionales: B. cereus es móvil, presenta una marcada β- hemólisis, no presenta desarrollo rizoidal y no produce cristales tóxicos de proteína.





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7.7 Cálculo y expresión de resultados

7.7.1 Anotar todas las colonias que cumplen con las pruebas, de acuerdo a los respectivos instructivos

7.7.2 Para realizar el cálculo, aplicar la siguiente fórmula:

Recuento confirmado = Promedio obtenido en dilución * N° colonias confirmadas * dilución * 10

N° colonias repicadas

7.8 Informe de resultados

7.8.1 El resultado se expresa en ufc o esporas de Bacillus cereus por g o mL de producto analizado según corresponda.

8. REGISTROS

Identificación del registro

Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición

RG-712.00-081 Registro resultados de análisis Recuento en placa de Bacillus cereus en alimentos.

Archivador azul rotulado registro informes laboratorio 339.

Acceso restringido al personal de la Sección Microbiología.

Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos.

RG- 712.00-098 Registro control esterilidad medios de cultivo laboratorio 339.

Archivador Registro controles laboratorio 339.



RG 712.00-099 Registro batería bioquímica de cepa control positivo y control negativo Bacillus cereus

Archivador Registro controles laboratorio 339.







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9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág.

Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación

0 1 Se elimina página 1 por cambio en formato documento institucional.

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0 1 Se cambió formato del encabezado de página en todo el documento. Se corrige PRT-702.04-034 por “PRT-712.04-034”. Se cambió número de revisión N° 0 por revisión N° 1 y el total de páginas.

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0 2 Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos.

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0 2 Se actualizó la referencia del punto 4.1 y se eliminaron las referencias del 4.2 al 4.4

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0 3 Se completó el punto 6.1.3 y se agregaron los puntos 6.1.4 al 6.1.6

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0 3 En el punto 6.2.2 se agregó para Bacillus cereus. Se agregaron los puntos 6.2.16 al 6.2.19.

28/07/2008

0 3 En el punto 6.3.1 se modificó 30 ± 2°C y 35± 2°C Se agregó el punto 6.3.5

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0 3 En el punto 7.1.1 corrigió PR-712.01-022 por : PRT-712.01.002. Se agregó el punto 7.1.2. En el punto 7.1.2 se cambió cuaderno por hoja de registro. Se eliminó el punto 7.1.4

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0 4 Se eliminaron los puntos 7.2.1 al 7.2.3. 28/07/2008 0 4 Se agregó al punto 7.2.5:... superficie en ..... 28/07/2008 0 4 Se agregó el punto 7.2.4 28/07/2008 0 4 En el punto 7.2.8 se agregó: 30± 1°C. 28/07/2008 0 4 En el punto 7.4.1 se cambió a :...”15 y 150

colonias”. 28/07/2008

9 4 En el punto 7.4.3 se agregó:... reacción 28/07/2008





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manitol negativo y que presenten reacción de precipitación producto de la lecitinasa

0 4 Al punto 7.4.3 se agregó:... “la hoja de Registro de análisis del laboratorio RG-712.00-081”

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0 5 En el punto 7.4.8 se agregó: ...”en la hoja”... “RG-712.00-081”.

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0 5 Al punto 7.5 se agregó nuevos ítemes correspondiente al 7.5.2 al 7.5.4 cambiando el orden correlativo.

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0 5 El punto 7.5.2 cambió a 7.5.4.1 y se agregó: ...” de 2 mm”....

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0 5 En el punto 7.5.3 se cambió a 7.5.4.2 y se agregó: ...”± 2”...

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0 5 El punto 7.4.3 se cambió a 7.4.3.3 y se agregó:... “de 2 mm” ...”e inocule en 2,5 mL de caldo nutritivo como control”...

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0 5 El punto 7.5.4 se cambió a 7.5.4.4 y se agregó:... “de 3 mm, en toda la superficie”...” hasta “...

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0 5 En el punto 7.5.5 se cambó a 7.5.4.5 y se agregó:... “ en 5 mL”...” caldo nitrato” ...”de 3 mm”...

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0 5 El punto 7.5.6 Prueba de reducción nitratos a nitritos se cambió a “7.5.4.6 Agar MYP”

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0 5 Se agregó el punto 7.5.4.7 Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B, thuringiensis y B. anthracis Se agregaron los ítemes 7.5.4.7.1 al 7.5.4.7.4

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0 6 Se modificó el contenido de los puntos 7.6.1 al 7.6.5 y se agregaron los puntosa 7.6.6 al 7.6.7

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0 6 Se agregó el punto 7.6.8 Pruebas adicionales y sus ítemes del 7.6.8.1 al 7.6.8.5

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0 6 En el punto 7.8 se agregó a l fórmula:... X dil X 10...

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0 6 En el punto 8.0 RESPONSABLES se cambió por REGISTROS y sus ítemes. Se incluyó tabla de registros.

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0 6 El punto 9.0 Distribución se cambió por: TABLA DE MODIFICACIONES.

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0 6 Se agregó el punto 10. ANEXOS y sus ítemes N°1 al N°6

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10. ANEXOS

Anexo N° 1 Tabla diferencial de grupo Bacillus cereus.

Anexo N° 2 Preparación Medios de cultivo.

Anexo N° 3 Preparación Reactivos.

Anexo N° 4 Hoja de registro informe Recuento en placa de Bacillus cereus en alimentos RG-712-00-081.

Anexo N° 5 Hoja de Registro cepa control positivo y control negativo análisis B. cereus RG 712.00-099.

Anexo N° 6 Hoja control esterilidad medios de cultivo laboratorio 339 RG-712.00-098.





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ANEXO N° 1-PRT-712.04-035

TABLA DIFRENCIAL GRUPO BACILLUS CEREUS Table 1. Differential characteristics of large-celled Group I Bacillus species

Feature B. cereus B. thuringiensis B. mycoides B. anthracis B. megaterium

Gram reaction +(a) + + + + Catalase + + + + + Motility +/-(b) +/- -(c) - +/- Reduction of nitrate + +/ + + -(d) Tyrosine decomposed + + +/- -(d) +/- Lysozyme-resistant + + + + - Egg yolk reaction + + + + - Anaerobic utilization of glucose + + + + - VP reaction + + + + - Acid produced from mannitol - - - - + Hemolysis (Sheep RBC) + + + -(d) - Known pathogenicity(e)/characteristic produces

enterotoxins endotoxin crystals pathogenic to

insects rhizoidal growth pathogenic to animals

and humans

a +, 90-100% of strains are positive. b +/-, 50-50% of strains are positive. c -, 90-100% of strains are negative. d -, Most strains are negative. e See Section H, Limitations of method for B. cereus.





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ANEXO N° 2-PRT-712.04-035

PREPARACION MEDIOS DE CULTIVO

Agar soya tripticase con sangre de cordero

Fórmula: Peptona tripticasa 15 g Peptona phytone 5 g Na Cl 5 g Agar 15 g Agua destilada 1 L

Calentar hasta disolver. Autoclavar 15 min a 121°C, pH final 7,3 ± 0,2°C. Enfriar a 50°C y añadir 5 mL de sangre de cordero desfibrinada a 100 mL de agar base. Mezclar y dispensar 20 mL en placas Petri de 15 x 100 mm.

Medio motilidad para Bacillus cereus

Fórmula: Tripticasa 10 g Extracto de levadura 2,5 g Dextrosa 5 g Na 2 HPO4 2,5 g Agar 3 g Agua destilada 1 L

Calentar con agitación hasta disolver. Dispensar 100 mL en frascos Schott de 250 mL. Autoclavar por 15 min a a121°C. El pH final 7,4 ± 0.2. Enfriar a 50°C. Dispensar asépticamente 2 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. Almacenar a temperatura ambiente 2 días antes de su uso.





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ANEXO N° 3-PRT-712.04-035

PREPARACIÓN REACTIVOS

Solución Lisozima

Disolver 0.1 g de lisozima en 65 mL de HCl 0,01 N estéril. Calentar hasta ebullición por 20 min. Diliur a 100 mL con HCl 0,01 N. Alternativamente, disolver 0,1 g de lisozima en 100 mL de agua destilada. Esterilizar por filtración a través de membrana filtrante de 0,45 µm. Confirmar esterilidad antes de usar. Añadir 1 mL de solución lisozima a 99 mL de caldo nutritivo. Mezclar y dispensar 2,5 mL a tubos estériles de 13 x 100 mm.

Suspensión Tirosina

Suspender 0,5 g de L- tirosina en 10 mL de agua destilada en tubos de 20 x 150 mm. Mezclar con Vortex. Autoclavar 15 min a 121°C. A 100 mL de agar base agregar los 190 mL de la suspensión de tirosina. Mezclar bien invirtiendo el tubo 2 ó 3 veces. En forma aséptica dispensar 3,5 mL en tubos de 13 x 100 mm y mezclar. Tender los tubos y enfriar rápidamente para prevenir la separación de la tirosina.

Solución de Fucsina Básica

Disolver 0,5 g de fucsina básica en 20 mL de etanol al 95%. Diluir a 100 mL con agua destilada. Filtrar si es necesario con papel filtro Whatman N° 3 para remover colorante sin disolver.

También se puede usar TB carbolfucsina ZN.

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