INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTLA GUTIRREZ ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA EXAMEN A LIBRO ABIERTO No. 1 5to. SEMESTRE - ING. BIOQUIMICA

ELABORADO POR: 1.- CABRERA FLORES ESTEFANA 2.- LOPEZ PEREZ JAENI MIBETH 3.- PREZ JIMNEZ SANDRA KARINAEQUIPO 7. Cintica de produccin de acido lctico por fermentacin sumergida con el Lactosuero como sustrato.

CATEDRTICO Q.B.P. Aura Flores Prez

TUXTLA GUTIRREZ, CHIAPAS.

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IndiceI. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................... 3 1.1 Objetivos especficos. ........................................................................................................ 3 II. INTRODUCCION .......................................................................................................................... 4 III. MARCO TERICO...................................................................................................................... 5 2. Bacterias lcticas y fermentos........................................................................................... 5 2.1 Bacterias Lcticas. .......................................................................................................... 5 2.1.2 Aspectos ecolgicos. ................................................................................................. 8 3. Propiedades generales de las bacterias lcticas. .......................................................... 8 3.1. Importancia de las bacterias lcticas. ........................................................................ 8 3. 2. Caracteres esenciales. .................................................................................................... 9 4. Microorganismos Lactobacillus ........................................................................................... 10 4.1 Lactobacillus bulgaricus. ................................................................................................ 10 4.1.1 Blgaros......................................................................................................................... 11 4.2. Usos industriales................................................................................................................. 13 4.3 Beneficios............................................................................................................................. 15 5. Lactosuero ................................................................................................................................. 17 6. Medios artificiales para aislacin e identificacin de Lactobacillus. ..................... 17 6.1 Agar MRS ............................................................................................................................. 18 IV. METODOLOGIA ....................................................................................................................... 20 V. RESULTADOS .............................................................................................................................. 26 VI. CONCLUSIN .......................................................................................................................... 29 VII. ANEXOS .................................................................................................................................... 30 VIII. BIBLIOGRAFIA......................................................................................................................... 33

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I. OBJETIVO GENERAL Demostrar la Cintica de crecimiento de Lactobacillus bulgaricus en suero de leche mediante la fermentacin y la produccin de cido lctico.

1.1 Objetivos especficos. Identificar la morfologa del Lactobacillus bulgaricus en agar MRS. Conocer las rutas metablicas que utiliza el Lactobacillus bulgaricus en su medio.

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II. INTRODUCCION En el siguiente trabajo presentamos la importancia y las caractersticas del Lactobacillus, al realizar la fermentacin con sustrato de Lactosuero, se estudi la cintica de produccin de cido lctico a partir del suero de leche en tres concentraciones distintas, mas adelante presentamos diagramas en donde se muestra paso a paso el procedimiento que se utiliz, desde el inoculo hasta llegar a la fermentacin de la bacteria mencionada.

La medicin del crecimiento del microorganismo Lactobacillus Bulgaricus, el consumo del sustrato y la produccin del cido fundamenta la determinacin de los parmetros que describen el bioproceso. Los resultados obtenidos fueron datos relativamente importantes por la concentracin de la lactosa.

La produccin del cido lctico origina una disminucin del pH en el medio, este bajo pH afecta al crecimiento del microorganismo, el consumo y la misma produccin, lo que explica el comportamiento del Lactobacillus bulgaricus durante el proceso de fermentacin al cual fue sometido.

De igual forma, para tener una explicacin detallada describimos la composicin del medio de cultivo, e integramos rutas metablicas para demostrar como la bacteria va asimilando sus nutrientes a partir de azcares, peptonas, vitaminas, etc.

En el trabajo se resalta la morfologa colonial de la Bacteria Lactobacillus bulgaricus y la produccin de cido lctico como producto metablico clave para ste gnero de Lactobacillus.

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III. MARCO TERICO 2. Bacterias lcticas y fermentos. 2.1 Bacterias Lcticas. Clasificacin: La presencia de una cantidad elevada de acido lctico en los productos de la fermentacin anaerobia de los azucares, es un carcter bioqumico importante que justifica la integracin, dentro de un mismo grupo, de bacterias que causan grandes diferencias en su morfologa. Las bacterias lcticas esfricas se encuentran en la familia de las Streptococcaceae, y las bacterias en forma de bacilos en la de las Lactobacillaceae. Es necesario tener en cuenta que en el momento actual no existe una clasificacin plenamente satisfactoria de estos microorganismos. La antigua clasificacin de Orla-Jensen (Cuadro 1), a pesar de no estar conforme con las normas actuales, no han cado en desuso; los especialistas en bacterias lcticas emplean siempre los nombres de los grupos creados por dicho autor. Cuadro 1.Clasificacion de las bacterias lcticas segn ORLA-JENSEN (1924).

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a)

b)

Figura 1. a) Lactobacillus en Yogur (tincin). b)

Lactobacilos al microscopio

ptico.

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El cuadro 2 muestra las dos familias segn Bergeys Manual. Los estreptococos y los Leuconostoc, o Betacocos, forman una de las tres familias de los cocos gram +, con tres gneros secundarios. Los Lactobacilos son los nicos representantes de los bacilos asporgenos gram +. Cuadro 2. Clasificacin del Bergeys Manual (partes que comprenden las bacterias lcticas) Familia 1) Micrococcaceae (catalasa positiva) Gnero: 1) Micrococcus: Aerobia estricta; exigencias dbiles; tolera 5% NaCl; hbitat: el suelo, el agua; no patgeno. Gnero: 2) Staphylococcus: aero- anaerobio , grandes exigencias; tolera el 15% de NaCl; hbitat: la piel y mucosas animales; patgeno; intoxicaciones alimentarias. Gnero: 3) (Planococcus) Familia 2) Streptococcaceae (catalasa negativa)Gnero: 1) Streptococcus: anaerobios facultativos, homofermentativos, cido lctico D; cultivo a 37C, grandes exigencias; hbitat muy variable (algunas especies parecen restringidas a los productos lcteos); algunas de las especies son patgenas. Gnero: 2) Leuconostoc: anaerobios facultativos, heterofermentativos; cido lctico D y otros productos; cultivo 20-30C; grandes exigencias; Hbitat: Productos azucarados y productos lcteos; no patgenos.

Gneros: 3) Pedicoccus; 4) Aerococcus;5) Gemella.Familia nica: Lactobacillaceae (catalasa negativa)

Bacilos Grampositivos

Gnero nico: Lactobacillus: anaerobios facultativos, homo o heterofermentativos; acido lctico variable; exigencias complejas; hbitat: productos animales y vegetales en fermentacin y ciertas partes de los animales de sangre caliente; no patgeno (subdivisible en dos grupos segn su temperatura optima 35 o 45C ).

*Exigencias fuertes: necesidad de aminocidos, vitaminas o factores de crecimiento.

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2.1.2 Aspectos ecolgicos. Las bacterias lcticas tienen numerosos hbitats. Independientemente de los productos lcteos, se las encuentra abundantemente en los productos vegetales: ensilados, choucroute, granos, jugos y mostos en fermentacin, etc. Tambin estn presentes en los tubos digestivos del hombre y los animales, y en las cavidades naturales. Sin embargo, muchas especies individuales estn adaptadas a un ambiente especfico y no se las encuentra, habitualmente, fuera de l. La facilidad con que estas bacterias pueden aislarse en materiales de la misma naturaleza demuestra que se trata de su hbitat natural. Simplificando es posible hacer las siguientes distinciones: Los estreptococos estn fundamentalmente ligados a la vida animal, la mayor parte como saprfitos, otros como patgenos y pocas especies estn ligadas al reino vegetal. Los lactobacilos son un poco menos restrictivos, ya que las fuentes no animales son importantes; adems son raramente patgenos para el husped. (Alais, 1985)

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3. Propiedades generales de las bacterias lcticas. 3.1. Importancia de las bacterias lcticas. La importancia prctica de las bacterias pertenecientes a esta familia es considerable, por varias razones: 1. Produccin de acido y descenso del pH (es la principal razn): - Proteccin de las sustancias alimenticias debida a la inhibicin de las bacterias de la putrefaccin en medio cido. - Establecimiento de las condiciones fisicoqumicas favorables a diversas transformaciones en la industria lctea; desuerado de las cuajadas de quesera, elaboracin de mantequilla. - Fermentacin lctica aromatizante que permite la obtencin de productos cidos con un sabor deseado: nata, mantequilla, yogurt, etc. - Propiedades higinicas resultantes de la accin antisptica del acido lctico en el intestino. - Produccin industrial de cido lctico. 2. Otras actividades que pueden tener efectos tiles o perjudiciales: - Produccin de enzimas que invierten en la degradacin de las protenas, en especial de la casena en el curso de la maduracin de los quesos.

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-

Produccin de sustancias inhibidoras responsables de la seleccin de las especies. Produccin de viscosidad, de gas (hinchamiento), de manchas de moho, etc.

3. Poder patgeno desarrollo por determinadas especies. 4. Valoraciones microbiolgicas de las vitaminas o de los aminocidos, aprovechando las exigencias nutritivas de las bacterias lcticas. 3. 2. Caracteres esenciales. Son bacterias esfricas o alargadas aisladas o agrupadas en cadenitas, Gram +, catalasa. No poseen citrocromo- oxidasa. Anaerobios facultativos, soportan tensiones de oxigeno reducidas; poco crecimiento en la superficie de los medios de cultivo usuales; crecimiento mas fcil n profundidad; en general, la coagulacin de la leche comienza por el fondo. No reducen los nitratos. Muy exigentes en nutricin nitrogenada y vitamnica; por ello, el medio debe aportar una mezcla compleja de aminocidos y factores de crecimiento, especialmente vitaminas B. no existe crecimiento con las sales de amonio como nica fuente nitrogenada. La actividad proteoltica en la leche es, para muchas especies, dbil y no se manifiesta ms que lentamente. (Alais, 1985)

a) Aspecto normal, bastoncitos regulares. Figura 2. Aspecto microscpico (Lactobacillus acidophilus) de

b) Formas atpicas, clulas hinchadas. un Lactobacilo homofermentativo

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4. Microorganismos Lactobacillus Lactobacilo, Lactobacillus o bacteria del cido lctico es un gnero de bacterias Gram positivas anaerobias facultativas, denominadas as debido a que la mayora de sus miembros convierte lactosa y otros monosacridos en cido lctico. Normalmente son benignas e incluso necesarias, habitan en el cuerpo humano y en el de otros animales, por ejemplo, estn presentes en el tracto gastrointestinal y en la vagina. Muchas especies son importantes en la descomposicin de material vegetal. La produccin de cido lctico hace que su ambiente sea cido, lo cual inhibe el crecimiento de bacterias dainas. Algunas bebidas de yogur contienen Lactobacillus como suplemento diettico. Muchos Lactobacillus son los nicos seres vivos que no requieren hierro para vivir y tienen una tolerancia extremadamente alta al perxido de hidrgeno. Muchos Lactobacillus son inusuales en que ellos operan usando un metabolismo homofermentativo (es decir, slo producen cido lctico a partir de azcares) y son aerotolerantes a pesar de la ausencia de cadena respiratoria. Esta aerotolerancia es dependiente del manganeso y ha sido estudiada y explicada en Lactobacillus plantarum (Cayr, 2000). Observados bajo el microscopio se ve que L. bulgaricus presenta forma de bastoncillo relativamente largo con tendencia a formar cintas (Cayr, 2000; Briceo, 2001; Holt, 2000). 4.1 Lactobacillus bulgaricus. Lactobacilos blgaros, nombre comn con el que se conoce a las colonias de las bacterias Lactobacillus bulgaricus, las cuales son conglomerados de bacterias lcticas y levaduras de asociacin simbitica estable embebidas en una matriz de polisacridos, cuyo tamao vara de entre 5mm y 2.5 mm; de consistencia elstica y de color blancoamarillento (Ulloa- Lappe, 1993).Figura 3. Lactobacillus bulgaricus (microscpico electrnico.)

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Los lactobacilos blgaros presentan tres diferentes formas estructurales: laminar, enrollada y convulta; los microorganismos que las constituyen presentan una disposicin de estratos definida. La forma laminar presenta dos superficies, una lisa, colonizada por lactobacilos cortos y una rugosa, en la que predominan las levaduras; entre ambas se encuentra una porcin intermedia, en donde existe una sustitucin de bacilos cortos por levaduras. La forma de convoltura presenta tres capas: la externa, con predominancia de lactobacilos cortos, la media con lactobacilos largos rectos, lactobacilos largos curvos y algunas levaduras y la interna con lactobacilos excrementus y abundantes levaduras embebidos en una matriz cavernosa (Aguilar, 1997). Se utiliza una tecnologa tradicional de la fermentacin de la leche empleando estas bacterias como cultivo iniciador, que puede recuperarse por filtracin y usarse infinitamente, siempre y cuando se observen algunas medidas mnimas de higiene. Estos productos han sido importantes en la historia del hombre, las fermentaciones han sido utilizadas por siglos en muchos pases y su origen se pierde en los albores del tiempo. Se cree aparecieron como resultado del crecimiento espontneo de microorganismos bajo condiciones adecuadas para efectuar la fermentacin y as evitar la descomposicin (Bourgeois, 1995). En la bibliografa y pginas de Internet consultadas el medio de crecimiento mas comnmente usado es la leche (Bourgeois, 1995; Ramos, 2002; Beltran; Garca Lpez; Valbuena, 2005). Las temperatura ptima de crecimiento son de 42-45C para L. bulgaricus. 4.1.1 Blgaros Es el nombre comn con que se conoce en Mxico a las colonias de Lactobacillus bulgaricus, las cuales son conglomerados de bacterias lcticas y levaduras de asociacin simbitica estable, embebidas en una matriz de polisacridos (Onofre, 2011).

Figura 4. Lactobacillus Bulgaricus en fabricacin de yogur casero.

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Su cuidado y preparacin es fcil si se cuenta con el cultivo. Se le pone leche hervida o pasterizada al cultivo y se deja a temperatura ambiente, o bien, en el refrigerador, con el recipiente tapado. Posteriormente se pasa por un colador fino para obtener la leche fermentada. Los blgaros se lavan con agua y se cubren nuevamente con leche; si sta se cambia a diario se obtiene una leche no tan acida. En cada gramo contiene ms de un milln de colonias de bacilos blgaros vivos, muy benficos para la salud El yogurt existe desde hace ms de cuatro mil aos, incluso aparece mencionado en la Biblia. A principios del siglo XX se venda en las farmacias porque se recetaba por sus cualidades teraputicas, y actualmente se consume en todo el mundo.

Figura 5. Blgaro (yogurt)

Este alimento es leche fermentada con bacilos bulgaricus y pasteurizados para prolongar su duracin. En cada gramo contiene ms de un milln de colonias de microorganismos vivos, benficos para la salud. Es ideal consumirlo en el desayuno porque prepara el intestino para recibir los alimentos del resto del da, pero tambin como postre, en la merienda o como colacin entre comidas. Su suave sabor gusta a todas las edades y est indicado especialmente para las personas intolerantes a la leche. Hay numerosos estudios que demuestran que este excelente producto tiene muchas virtudes si se consume diariamente: Digestin: Es el mejor aliado del aparato digestivo porque protege contra la acidez natural del estmago y previene y controla infecciones, diarrea, estreimiento y colitis. Flora intestinal:

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Frecuentemente se recomienda despus de un tratamiento con antibiticos, porque ayuda a recuperar la flora intestinal afectada por estos medicamentos. Sistema inmunolgico: Sus bacterias vivas protegen contra infecciones y enfermedades de la piel. Energa: Proporciona energa porque contiene carbohidratos, protenas, vitaminas A y B, cido flico y minerales (calcio, fsforo, potasio, magnesio, zinc y yodo). (Onofre, 2011).

4.2. Usos industriales Algunas especies de lactobacillus son usadas industrialmente para la produccin de yogurt y otros alimentos fermentados. Por otra parte los lactobacillus llevan un papel fundamental en el cuerpo humano de tal forma que ellos actuan en la regeneracion de la flora intestinal, hay varios medicamentos uno de ellos es el Liolactil (lactobacillus liofilizados), (murray, 1997). Los lactobacilos desarrollan actividad lipoltica, por lo que se liberan cidos grasos y producen adems acetaldehdo, constituyndose as en los principales productores de aroma del yogurt.

Figura 6. Alimentos Elaborados de Lactobacillus.

Una gran cantidad de estudios evidencian los beneficios de las leches fermentadas mediante bacterias de origen intestinal tambin llamados probiticos. La industria alimentaria ha aprovechado sus cualidades, para llegar hasta el consumidor ofreciendo diversas presentaciones y modalidades, como leches bajas en lactosa, grasas y caloras, lcteos en forma de quesos (cottage), tabletas, polvos y supositorios (Schlegel, 1997).

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El grupo de los probiticos se inscribe entre los llamados alimentos funcionales, los cuales disminuyen el riesgo de contraer enfermedades porque los cultivos microbianos vivos actan como reguladores biolgicos que mantienen estable y equilibrada la flora intestinal, lo cual garantiza la salud al evitar la colonizacin y el desarrollo excesivo de microorganismos causantes de enfermedades. Para ello se valen de diversos mecanismos, como la competencia y la sntesis de bacteriocinas y bacterifagos. Un requisito que debe cubrir un microorganismo probitico para garantizar su efecto benfico en el organismo es permanecer viable y activo tanto en el alimento como durante su paso por el aparato digestivo. La principal caracterstica de las bacteria lctica del yogurt Lactobacillus bulgaricus y a la cual deben su gran importancia en la industria alimenticia es la acidificacin que producen en el medio debido a la produccin de cido lctico (Becker ,1999; Tamime, 1991); propiedad que fue usada en este trabajo para seguir su crecimiento. Las cepas que ms utiliza esa industria son: L. casei, L. acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Leuconostoc, enterococos, propionibacterias y levaduras.(Garcia Lopez, 2000) Jocoque Es un producto lcteo fermentado, nutritivo, saludable, muy semejante al yogurt, de gran tradicin en Mxico, aunque se ha estudiado poco. El jocoque se obtiene por tratamiento con microorganismos lcticos, leche pasteurizada, fresca, limpia y sana, semidescremada o descremada. El nmero de microorganismos que se utiliza para prepararlo es ilimitado, pero no deber contener cepas patgenas (Tamime,1991). Yogurt El yogurt es un producto alimenticio de consistencia semislida que procede de la leche, generalmente de vaca, la cual se somete a un proceso de fermentacin, por lo que tambin se le suele denominar leche fermentada o acidificada. Para obtenerlo se aaden a la leche, previamente pasteurizada y homogeneizada, ciertas bacterias o microorganismos; cuando se encuentra a una temperatura de unos 40 o 45 C, se transforman sus componentes nutritivos:

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La lactosa (azcar propio de la leche) pasa a ser cido lctico, lo que produce una acidificacin y hace que las protenas de la leche se coagulen. Las grasas y las protenas sufren una predigestin, transformndose en sustancias ms sencillas y digeribles para el organismo. Todos estos procesos, adems de hacer que el yogurt sea un producto ms digerible que la leche lquida, tambin determinan su sabor, aroma y consistencia final (Tamime, 1991).

4.3 Beneficios

Figura 7. Productos de la leche con Lactobacillus Bulgaricus.

Algunas de las bacterias que se emplean en la actualidad tienen efecto contra la Helicobacter pylori, el bacilo que causa gastritis, lcera gastroduodenal y cncer de estmago. Sin embargo, las bfidobacterias son habitantes naturales del intestino de los bebs lactantes y predominan cuando son alimentados con leche materna. Otras cepas inhiben el crecimiento y la adhesin de bacterias como la E. coli, e incrementan el nmero de clulas secretoras de anticuerpos, por lo que la recuperacin es ms rpida en los nios con diarrea por rotavirus o bacterias, pues inhiben el desarrollo de grmenes oportunistas. En el caso del exceso de colesterol en la sangre, el cual es un factor de riesgo en el desarrollo de aterosclerosis y otras enfermedades coronarias, algunas bacteria aumentan la excrecin de sales biliares y utilizan el colesterol en intestino, reduciendo as su absorcin produciendo cidos grasos voltiles en el colon, que pueden ser absorbidos e interferir con el

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metabolismo le los lpidos en el hgado. Tambin son utilizadas en enfermedades inflamatorias intestinales. El yogurt es bien soportado por las personas con intolerancia a la lactosa (quienes presentan dicha intolerancia presentan diarrea, dolor intestinal e incluso fiebre posteriores al consumo de la leche), ya que los probiticos que actan en la fermentacin del yogurt poseen un efecto favorecedor en la digestin de la lactosa, logran estimular el sistema inmunitario y facilitan la eliminacin de patgenos del intestino. Tambin tienen accin contra las alergias alimentarias (rinopata de tipo alergnico) con una ingesta de 450 g de yogurt diarios. La microflora intestinal sintetiza vitaminas Bl, B2, B6, B12, cido flico, biotina, niacina, cido pantotnico y vitamina K. Como consecuencia de la putrefaccin intestinal se produce nitrosamina, sustancia que demostr ser carcinognica. La E. coli y los lactobacilos, seguidos por bfidobacterias y bacteroides, son los ms activos en la degradacin de las nitrosaminas; disminuyen el crecimiento de tumores malignos si adems se suministra cido lctico. En cuanto al estreimiento, estas bacterias metabolizan el azcar y lo transforman en lactato y acetato. Si la poblacin de las bfidobacterias es alta, se formarn mayores cantidades de cido, volviendo el interior del intestino ms cido, lo cual suprime la fermentacin anormal debida a los microorganismos patgenos y estimula los movimientos peristlticos del intestino. Una de la funciones del hgado es descomponer y desintoxicar las sustancias venenosas absorbidas por el intestino delgado. La microflora intestinal hace parte de este trabajo, pero si se llega a presentar un desequilibrio microbiano, aumentar el trabajo del hgado, de forma que si predominan las bfidobacterias se inhibe el crecimiento anormal de los patgenos, reduce el trabajo heptico, y lo protege. Tambin disminuyen los niveles de amoniaco y fenol presentes en la sangre de pacientes con enfermedades crnicas del hgado. Es deseable que los microorganismos benficos sean dominantes en la flora intestinal. Al utilizar una terapia con antibitico para eliminar los microorganismos patgenos, se elimina la flora intestinal; por eso es esencial asegurar el desarrollo de las cepas benficas y la inhibicin de los patgenos. (Onofre, 2011)

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5. Lactosuero El suero de quesera es un buen medio de cultivo para las bacterias lcticas. Contiene las sustancias solubles de la leche junto con sustancias nitrogenadas no proteicas resultantes de la accin de la enzimas coagulantes o del metabolismo de las bacterias que se desarrollan en la leche o en el coagulo. Alguna de estas sustancias entre las que se encuentra el caseino - glicopptido, tiene propiedades estimulantes frente a las bacterias lcticas. Una dificultad para la utilizacin del suero, cuando debe de ser pasteurizado o esterilizado, es la floculacin de las albuminas y globulinas. Segn las condiciones del tratamiento trmico y el valor del pH, el suero es desproteinizado ms o menos. El Lactosuero completamente desproteinizado disminuye sustancialmente sus propiedades como medio de cultivo. Puede hacerse un pretratamiento con una proteasa como en la leche, con lo que la fluctuacin de las protenas se puede reducir o evitar y el medio se enriquece en nitrgeno soluble. 6. Medios artificiales para aislacin e identificacin de Lactobacillus. La leche no es conveniente para todos los trabajadores de investigacin referentes a las lcticas, en especial con miras a su identificacin, es necesario disponer de un medio de composicin mas constante y que permita un amplio cultivo de todas las cepas. El empleo de medios diversos, en los que no se desarrolla plenamente todos los germenes, explica las divergencias en la clasificacin. Las dificultades son mayores con los lactobacilos, sobre todo los heterofermentativos (L.brevis y L. fermenti, cuyo cultivo es tedioso) que en los estreptococos. Se han empleado diversos medios artificiales, concebidos especialmente para los lactobacilos: caldo con jugo de tomate (de briggs) medio de ATPG (Autoautolizado de levadura, peptona y triptona y glucosa de Raibaud), caldo MRS (De Man, Rogosa y Sharpe). La fuente glucidica es, en general, la glucosa; el alimento nitrogenado est asegurado por el extracto de carne, peptona etc., los factores de crecimiento se aporta principalmente con extracto de levadura. Los trabajos mas recientes sobre la clasificacin de los lactobacilos se han realizado con caldo MRS, que se caracterizado por la presencia de sales en cantidades relativamente importantes, especialmente en sulfato de manganeso. Se ha comprobado

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que este metal estreptobacterias.

estimula

considerablemente

el

crecimiento

de

Cuando el medio de cultivo se utiliza para el aislamiento de bateras lcticas a partir de sepas contaminadas, es bueno aadir una sustancia que inhibida a las bacterias gram negativas especialmente al escherichia coli y otras especies con ella emparentadas, as como diversas pseudomas, alcaligenes, bacillus, etc. En el MRS reseado, el acetato de sodio en proporcin bastante elevada y la sustancia tensoactivo tween-80, tiene una accin selectiva. 6.1 Agar MRS Se emplea para el cultivo y recuento de Lactobacilos, tanto en productos lcteos como en productos alimenticios en general. Si se acidifica a pH=5,5 0,1 permite el recuento de los Lactobacilos propios del yogur. Historia Man, Rogosa y Sharpe desarrollaron este medio con el propsito especfico de emplearlo para el cultivo de Lactobacilos en productos derivados de la leche, aunque no por esto deja de estar indicado en otras aplicaciones. Fundamento Por la presencia de la peptona, glucosa, manganeso y magnesio se aportan los componentes nutritivos y energticos para el crecimiento de los Lactobacilos. El di-Amonio Hidrgeno Citrato inhibe el crecimiento de la mayor parte de grmenes contaminantes. El di-Potasio Hidrgeno Fosfato se emplea para estabilizar el pH del medio, mientras que el Tween constituye su fuente de cidos grasos. De esta manera este medio es ideal para el crecimiento masivo de todas las cepas de Lactobacilos, incluso aquellas de crecimiento lento y difcil. El crecimiento tambin puede mejorarse reduciendo el pH hasta 5,5 aproximadamente, sin embargo, se dificulta la gelificacin del medio.

Frmula (por litro) Composicin (g/l): di-Amonio Hidrgeno Citrato............................... 2,0 Extracto de Carne................................................. 8,0 Extracto de Levadura............................................ 4,0 D(+)-Glucosa......................................................... 20,0

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Magnesio Sulfato................................................... 0,2 Manganeso(II) Sulfato............................................0,05 Peptona Bacteriolgica........................................10,0 di-Potasio Hidrgeno Fosfato................................2,0 Sodio Acetato.........................................................5,0 Tween 80..................................................................1,0 Agar........................................................................10,0 pH: 6,20,2 (CULTIMED; I.C.T., SL)Figura 8. Agar MRS se utiliza para el crecimiento y la enumeracin de los cultivos de Lactobacillus en los productos lcteos y otros productos alimenticios. El medio puede ser utilizado para el crecimiento lentamente de lactobacilos como Lactobacillus brevis y Lactobacillus fermentum. Acidificado a un pH bajo, se puede utilizar para enumerar Lactobacillus bulgaricus en el yogur. Si la contaminacin por levaduras y moho en la muestra a ensayar es de inters (por ejemplo, en embutidos secos), es conveniente aadir cido srbico en el medio con el fin de mejorar la inhibicin. Mediante la adicin de 0,1 mg de Clindamicina y 10 mg de ciprofloxacino por litro, un medio conocido como MRS / CLC / CIP Agar se puede obtener, este medio se utiliza para el recuento selectivo de Lactobacillus acidophilus en los productos lcteos, de acuerdo con los estndares ISO 20128 / FIL 192.

Figura 9. Lactobacillus Bulgaricus en MRS agar.

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IV. METODOLOGIA Preparacin del Lactosuero enriquecido:

Se suplemento con: Se desproteinizo bajando pH a 4.5 y calentndose por 20min.

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20g/l extracto de levadura. 10g/l peptona trpsica de casena. 1g/l Tween 80 como antiespumante

Microorganismo.

Lactobacillus bulgaricus liofilizado del Chr. Hansens Laboratorium A/S de Dinamarca

Se reactiv en leche durante 2 das a 40C.

Se tomo 1ml. de los tubos de reactivacin transfirindose a tubos con 9ml. de agar de leche descremada.

Se dej crecer durante 24 hrs. Refrigerndose 4C para su conservacin.

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Medio de cultivo.- Se midieron los slidos totales, cenizas, nitrgeno, protenas, fosforo y lactosa. - Se desproteinizo bajando el pH a 4.5 con acido fosfrico y calentando a 90 C durante 2min.

Se enfri y filtr en papel Whatman No. 42

Concentracin 49.89g/l de lactosa, es la concentracin de lactosa del suero fresco Con adiccin de lactosa hasta una concentracin de 90.64g/l

Diluido con agua destilada para obtener una concentracin de 27.98 g/l de lactosa.

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Fermentacin.Se hicieron fermentaciones por carga y por duplicado en un Fermentador new Brunswick modelo Bioflo 400

3 litros de medio de cultivo esterilizado a 115 C por 20 minutos

Sin aireacin Sin control de pH manteniendo la temperatura a 42 C Agitacin a 100 rpm Con tween 80(1 g/L) como antiespumante

Inoculacin bajo condiciones aspticas

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A partir de cultivo bacteriano refrigerado

Se dejo reproducir durante 12 horas en estufa a 42 C sin agitacin

A cada inculo se le realiz un contaje en placas

Se garantizo entre y unidades formadoras de colonias por mL de inculo

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Lactobacilos aislados en agar MRS.

COMPOSICION DEL AGAR:Frmula (por litro) Composicin (g/l): di-Amonio Hidrgeno Citrato............................... 2,0 Extracto de Carne.................................................8,0 Extracto de Levadura............................................4,0 D(+)Glucosa.......................................................20,0 Magnesio Sulfato................................................. 0,2 Manganeso(II) Sulfato.........................................0,05 Peptona Bacteriolgica....................................... 10,0 di-Potasio Hidrgeno Fosfato..............................2,0 Sodio Acetato...................................................... 5,0 Tween 80.............................................................1,0 Agar.....................................................................10,0 pH: 6,20,2

Preparacin: El instructivo del agar dice que se debe poner 62g de agar en 1 litro de agua destilada; por lo tanto se coloco 15.5g de agar en 250ml de agua destilada y otro matraz con 100 ml de agua y 6.2 de agar , calentamos y agitamos hasta ebullicin. Esterilizamos a 121C durante 12 minutos.

Se espero que el medio estuviera a 46C para poderlo vaciar en placas de petri estriles. El vaciado lo repetimos para 5 placas y se hizo en las condiciones aspticas adecuadas. Una vez que solidificaron las placas las colocamos con las tapas hacia abajo para que el agua no afectara al medio, posteriormente las dejamos durante 24 horas dentro de la cmara de incubacin.

Despus de las 24 horas la placas de petri se colocan en el refrigerador junto con el otro matraz con medio de cultivo hasta el da de uso. El da que se que se realice la inoculacin se observa que las cajas no estn contaminadas.

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El da del experimento realizamos la tcnica de estra cruzada con las 5 placas de petri; mientras el matraz con agar se pone en el bao mara para despus usarlo en la tcnica de vaciado

Tambin se realizo la tcnica de vaciado con diluciones 10-6 tomando un mililitro de las cepa reavivada y as hasta hacer 6 diluciones de la ultima se tomo 1 mililitro y se puso en la placa de petri, se le vaci el medio MRS despus de colocar el medio se homogenizo para que la bacteria se distribuya de manera homognea en la caja de petri.

Una vez inoculadas las cajas se colocan dentro de una cmara de incubacin para que la bacteria tenga las condiciones necesarias, como la temperatura a 42 para poder desarrollarse y crecer.

Despus de 24 horas retiramos las cajas petri y observamos el crecimiento de la bacteria, si las UFC se encuentran sobre la estra y describimos su morfologa, para comprobar que verdaderamente estamos hablando de una cepa pura.

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V. RESULTADOS Tabla 1 Composicin del suero. Suero fresco Suero Desproteinizado 45,95 46,94 52,5 61,0 4,5 3,0 0,147 0,005 0.94 0,03 5,11 0,357 -

Lactosa (g/L) Slidos totales (g/L) Cenizas (g/L) Nitrgeno (%) Protenas (%) pH Fosforo (g/L)

En el suero desproteinizado se obtuvo una composicin ligeramente superior en lactosa, slidos totales y cenizas que el suero sin desproteinizar. El pH del suero (5,11) lo define como un suero cido. La desproteinizacin fue efectiva, ya que se bajo el contenido de protenas 0.94% a 0.03%, es decir se precipitan el 96,8% de las protenas remanentes. El la grafica No.1 se muestra el mximo crecimiento microbiano a las 8 horas, independientemente de la concentracin inicial de lactosa. Se obtuvo una mayor cantidad de biomasa y una mayor velocidad de crecimiento a la mayor concentracin inicial del sustrato. En la grafica No. 2 se muestra la produccin de cido lctico. Muestran que la mayor concentracin de cido se obtiene para el suero desproteinizado suplementado sin adicin de lactosa, el rendimiento de acido lctico fue de un 10.3%, el rendimiento en el suero desproteinizado suplementado con latosa a 90.64 g/L fue de 5.2% y el del suero desproteinizado diluido fue de 1.3%.

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Grafica 1. Cintica de Crecimiento de L. bulgaricus a distintas concentraciones de lactosa. Fermentacin en el Bioflo 4000. T: 42 C y 100 RPM.

Grafica 2. Cintica de la produccin de cido Lctico.

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MORFOLOGIA COLONIAL DE Lactobacillus bulgaricus. 1. Medio de cultivo: lactosuero

Los lactobacillus bulgaricus son bacterias anaerobias facultativas y se observan como conglomerados de bacterias lcticas de color blaquecinas con bordes ondulados con un olor suave.

2. Medio de cultivo sinttico: agar Mrs.

Los Lactobacillus bulgaricus son bacterias anaerobias facultativas y en el sembrado en placa se observan colonias pequeas de una manera circular, redondeada, convexa, de una tonalidad blanquecina con un olor suave.

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VI. CONCLUSIN Al final del trabajo realizado concluimos los siguientes puntos: El cido lctico puede ser obtenido por fermentacin del suero de leche con bacterias del gnero Lactobacillus, entre estas el Lactobacillus Bulgaricus. La concentracin de lactosa en el Lactosuero es un elemento clave para la produccin de cido lctico con el Lactobacillus Bulgaricus. El mejor rendimiento para la produccin del cido lctico en el suero de leche desproteinizado fue en el que no se suplemento con lactosa. El Lactobacillus Bulgaricus creci con un alto rendimiento en el suero de leche, este rendimiento disminuy al incrementar la concentracin de cido lctico en el medio de produccin. El microorganismo Lactobacillus bulgaricus no consumi totalmente la lactosa del medio en la concentracin mal alta de lactosa. Lactobacillus bulgaricus causa gran impacto en la industria alimenticia como en la salud, en probiticos y personas no tolerantes a la lactosa.

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1FVII. ANEXOS

Integracin de rutas metablicas.COMPOSICION DEL MRS AGAR:Frmula (por litro) Composicin (g/l): Di-Amonio Hidrgeno Citrato............................... 2,0 Extracto de Carne.................................................8,0 Extracto de Levadura............................................4,0 D (+)-Glucosa.......................................................20,0 Magnesio Sulfato................................................. 0,2 Manganeso (II) Sulfato.........................................0,05 Peptona Bacteriolgica....................................... 10,0 Di-Potasio Hidrgeno Fosfato..............................2,0 Sodio Acetato...................................................... 5,0 Tween 80.............................................................1,0 Agar.....................................................................10,0 pH: 6,20,2

GLUCOLISIS

2 ATP

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Peptonas

CICLO DE KREBSProteasas

Aminoacidos Lisina Triptofano Fenilalanina Tirosina Cisteina Serina Glicina Alanina Triptofano

Acetoacetil-coA

Piruvato Acetil-coACo2

Acido lacticoArginina Prolina Histidina

Asparagina

Aspartato

Oxalacetato

Alfa-cetoglutarato Co2

Glutamato Glutamina

Succinil-coA

Metionina

Propionil-coA

Valina

Isoleucina

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RUTA DE LAS PENTOSAS FOSFATO GLUCOSA- 6-FOSFATO

Acetil-coA

6-fosfoglucono lactona

BIOSINTESIS DE ACIDOS GRASOS

Ribulosa-5-fosfato

FORMACION DE MEMBRANAS

Ribosa-5-fosfato

BIOSINTESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

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VIII. BIBLIOGRAFIA Jeffrey M. Becker, Guy A. Caldwell y Eve Ann Zachgo. (1999) Biotecnologa: Curso de prcticas de laboratorio. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza (Espaa). C.M. Bourgeois y J.P. Larpent. (1995). MICROBIOLOGIA ALIMENTARIA. VOLUMEN 2: FERMENTACIONESALIMENTARIAS. Acribia. Ana Graciela Briceo, Ral Martnez y Karely Garca (2001) Tecnologa de Alimentos. Viabilidad y Actividad de laFlora Lactica (Streptococcus salivarius ssp thermophilus y Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus) del yogurt en Venezuela. Acta Cientfica Venezolana, 52:4654 Mara E Cayr,.Graciela Vignolo,. Oscar Garro. (2004).- Modelo dinmico para el crecimiento de bacterias lcticas sobre emulsiones crnicas. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE. Comunicaciones Cientficas y Tecnolgicas Mara Dolores Garca Lpez y Federico Uruburu Fernndez. LA CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANAS.Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de Valncia. 46100 Burjassot (Valencia). Maria E Cayr, Oscar A Garro. (2000). Gua de Trabajos Prcticos de Laboratorio de la ctedra Microbiologa de losAlimentos. Facultad de Agroindustrias. UNNE. Hans G. Schlegel en colaboracin con Christiane Zaborosch, (1997) MICROBIOLOGIA GENERAL. Ediciones OMEGA, S.A. Barcelona. Patrck R. Murray, Ken S. Rosenthal, MichaelA. Pfaer. (1999) MICROBIOLOGIA MEDICA. Editorial Elsevier, Madrid Espaa Onofre Vargas vernica, (2011), http://bulgarosweronik.blogspot.com CULTIMED. Manual bsico de microbiologa. Alais, C. (1985). Ciencia de la leche: Principios de tcnica lechera. Espaa: Reverte. Artculos Relacionados

Rivas, Franco; Garro, Oscar. Preparacin de cultivos iniciadores. Optimizacin del sustrato de crecimiento. Universidad Nacional de Nordeste. 2006

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