AVANCES EN EL METABOLISMO

DEL NITRÓGENO

AVANCES EN EL METABOLISMO DEL NITRÓGENO

DE LA GENÓMICA Y LA PROTEÓMICA A LAS APLICACIONES AGRONÓMICAS, INDUSTRIALES Y

MEDIOAMBIENTALES

Coordinadoras: María José Bonete Rosa María Martínez-Espinosa

Título: Avances en el metabolismo del Nitrógeno.Coordinadores: © María José Bonete Rosa María Martínez-Espinosa

I.S.B.N.:978-84-8454-806-5Depósito legal: A-793-2009

Edita: Editorial Club UniversitarioWeb: www.ecu.fm

Printed in SpainImprime: Imprenta Gamma Telf.: 965 67 19 87C/. Cottolengo, 25 - San Vicente (Alicante)E-mail: gamma@gamma.fmWeb: www.gamma.fm

Reservados todos los derechos. Ni la totalidad ni parte de este libro puede reproducirse o transmitirse por ningún procedimiento electrónico o mecánico, incluyendo fotocopia, grabación magnética o cual-quier almacenamiento de información o sistema de reproducción, sin permiso previo y por escrito de los titulares del copyright.

Dedicado a quienes invierten su tiempo y esfuerzo en formar a las nuevas

generaciones de científicos españoles.

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INDICE

LISTA DE CONTRIBUIDORES 13PRÓLOGO 21

PRIMERA PARTETRANSPORTE Y REDUCCIÓN DE NITRATO Y NITRITO

CAPITULO 1. TRANSPORTE Y REDUCCIÓN DE NITRATO Y NITRITO EN Chlamydomonas 25Fernández Emilio, Llamas Ángel, Tejada-Jiménez Manuel, Camargo Antonio, Mariscal Vicente, de Montaigu Amaury, Sanz-Luque Emanuel, Higuera José Javier, González-Ballester David, Galván AuroraCAPITULO 2. UNA GUANILATO CICLASA DEPENDIENTE DE ÓXIDO NÍTRICO IMPLICADA EN LA REGULACIÓN DE LA ASIMILACIÓN DE NITRATO 29Sanz-Luque Emanuel, de Montaigu Amaury, Galván Aurora, Fernández Emilio.CAPÍTULO 3. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA NITRORREDUCTASA NPRB DE Rhodobacter capsulatus 37Gómez-Cruz Rodolfo, Pérez-Reinado Eva, Roldán María Dolores, Castillo Fran-cisco, Moreno-Vivián Conrado.CAPÍTULO 4. CARACTERIZACIÓN DEL GEN PIPX, IMPLICADO EN LA TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES DE NITRÓGENO EN Synechococcus sp. PCC 7942 45Espinosa Javier, Laichoubi Karim, Castells Miguel Ángel, Contreras AsunciónCAPÍTULO 5. EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS EN Haloferax mediterranei ASOCIADA A LA FUENTE DE NITRÓGENO 51Bravo-Barrales Gloria, Pedro-Roig Laia, Camacho Mónica, Pire Carmen, Díaz Susana, Bonete María José.CAPÍTULO 6. ESTUDIO DE LOS PARÁMETROS ASOCIADOS AL DESARROLLO DE LA HOJA EN PLANTAS DE GIRASOL CRECIDAS CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE NITRATO. 57Agüera Eloísa, Cabello Purificación, de la Haba Purificación

SEGUNDA PARTE: TRANSPORTE Y ASIMILACIÓN DE AMONIO, AMINOÁCIDOS Y UREIDOS.

CAPÍTULO 7. CARACTERIZACIÓN, REGULACIÓN Y EXPRESIÓN DE LA GLUTAMATO DESHIDROGENASA DE Prochlorococcus MIT9313 65

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Rangel Oriol Alberto, Gómez Baena Guadalupe, López Lozano Antonio, García Fernández José Manuel, Díez JesúsCAPÍTULO 8. EFECTO DE LA DEFICIENCIA EN BORO SOBRE LA EXPRESIÓN DEL GEN DE LA ASPARRAGINA SINTETASA EN PLANTAS DE TABACO. REGULACIÓN POR LOS NIVELES DE CARBOHIDRATOS. 73Rexach Jesús, Beato Víctor M, Navarro-Gochicoa M Teresa, Camacho-Cristóbal Juan J, Herrera-Rodríguez M Begoña, Maldonado José María, González-Fontes AgustínCAPÍTULO 9. METABOLISMO DE UREIDOS DURANTE EL DESARROLLO DE LA PLÁNTULA DE JUDÍA (Phaseolus vulgaris) 83Quiles Francisco Antonio, Pineda Manuel, Piedras Pedro CÁPITULO 10. FUNCIÓN DE LA FOSFOENOLPIRUVATO CARBOXILASA Y OTRAS RUTAS ANAPLERÓTICAS EN LA ASIMILACIÓN DEL AMONIO EN Arabidopsis thaliana 89Ariz Idoia, Lantero Aquilino, Artola Ekhiñe, Cruchaga Saioa, Lamsfus Carmen, Moran José Fernando, Vidal Jean, Aparicio-Tejo Pedro MaríaCAPÍTULO 11. EFECTO DEL NBPT SOBRE LA ACTIVIDAD UREASA EN PLANTAS DE TRIGO 97Artola Ekhiñe, Cruchaga Saioa, Áriz Idoia, Morán José Fernando, Garnica María, Houdusse Fabrice, García Mina José María, Lamsfus Carmen, Aparicio Tejo PedroCAPÍTULO 12. EFECTO DEL IÓN NO3

- SOBRE EL INFLUJO DEL IÓN NH4

+ Y LA EXPRESIÓN DEL GEN CitAMT1 EN PLANTAS DE CÍTRICOS 105Camañes Querol Gemma, Cerezo García Miguel, García-Agustín PilarCAPÍTULO 13. EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA UREASA (AHA Y NBPT) SOBRE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE Pisum sativum 113Mezquíriz Jesús, Cruchaga Saioa, Artola Ekhiñe, Áriz Idoia, Morán José Fernan-do, Aparicio-Tejo Pedro, Lamsfus CarmenCAPÍTULO 14. EFECTO DE LOS INHIBIDORES DE LA UREASA (AHA Y NBPT) SOBRE EL METABOLISMO UREICO EN Pisum sativum 119Cruchaga Saioa, Artola Ekhiñe, Mezquíriz Jesús, Áriz Idoia, Morán José Fernan-do, Lamsfus Carmen, Aparicio-Tejo PedroCAPÍTULO 15. ANÁLISIS DE LAS ENZIMAS ASPARTATO AMINOTRANSFERASAS DE PLANTAS 125Lucas-Reina Eva, Suárez María Fernanda, Cánovas Francisco MCAPÍTULO 16. EL METABOLISMO DEL NITRÓGENO EN Haloferax medite-rranei DESDE EL PUNTO DE VISTA DE LA PROTEÍNA PII. 131Pedro-Roig Laia, Camacho Mónica, Bravo Gloria, Bautista Vanesa, Llorca Francisco, Bonete María José

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CAPÍTULO 17. SECUENCIACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE GLUTAMATO SINTASA DE Haloferax mediterranei 137Pire Carmen, Martínez-Espinosa Rosa María, Esclapez Julia, Pérez-Pomares Francisco, Bonete María José.CAPÍTULO 18. REGULACIÓN DIFERENCIAL DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE GLUTAMINA SINTETASA DE PINO POR DOF 5 145Rueda Marina, Crespillo Remedios, Cánovas Francisco Miguel, Ávila Concepción.CAPÍTULO 19. METABOLISMO DE UREIDOS DURANTE EL DESARROLLO DEL FRUTO DE JUDÍA (Phaseolus vulgaris) 153Piedras Pedro, Lambert Rocio, Raso María José, Pineda Manuel

TERCERA PARTE: FIJACIÓN DEL N2 Y DESNITRIFICACIÓN.

CAPÍTULO 20. NO DETOXIFICATION ENZYMES IN ENTERIC BACTERIA 161Mills PC, Richardson DJCAPÍTULO 21. RESPIRACIÓN Y DESNITRIFICACIÓN EN Thermus thermophilus 173Cava Felipe, Chahlafi Zahra, Álvarez Laura, Berenguer JoséCAPÍTULO 22. IMPLICACIÓN DEL CITOCROMO C550 EN LA EXPRESIÓN Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO REDUCTASA DE Bradyrhizobium japonicum 187Bueno Emilio, Bedmar Eulogio J., Richardson David J., Delgado María J.CAPÍTULO 23. EXPRESIÓN DE LA NITRATO REDUCTASA DE LOS BACTEROIDES DE NÓDULOS DE SOJA EN RESPUESTA A ENCHARCAMIENTO 195Sánchez Cristina, Uchiumi Toshiki, Bedmar Eulogio J., Richardson David J., Del-gado María J.CAPÍTULO 24. HALOARQUEAS DESNITRIFICANTES: ¿BIORREMEDIA-DORES O CONTRIBUIDORES AL CAMBIO CLIMÁTICO? 203Martínez-Espinosa Rosa María, Richardson David J., Bonete María José.CAPÍTULO 25. CARACTERIZACIÓN DE LA PROTEÍNA NNRR COMO ACTIVADOR TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES DE LA DESNITRIFICACIÓN DE Bradyrhizobium japonicum. 211Robles Eloy, Krell Tino, Cutruzzolá Francesca, Delgado María Jesús, Bedmar Eulogio J.

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CUARTA PARTE: RELACIÓN ENTRE EL METABOLISMO DEL CARBONO,

NITRÓGENO Y AZUFRE.

CAPÍTULO 26. REGULACIÓN DE LA INTERACCIÓN CARBONO/NITRÓGENO EN Prochlorococcus 219García Fernández José Manuel, López Lozano Antonio, Gómez Baena Guadalupe, Rangel Oriol Alberto, Díez JesúsCAPÍTULO 27. TRANSPORTE DE GLUCOSA EN Prochlorococcus. 227Gómez-Baena Guadalupe, López-Lozano Antonio, Gil-Martínez Jorge, Lucena José Manuel, Diez Jesús, Candau Pedro, García-Fernández José ManuelCAPÍTULO 28. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES E INTERACCIONES MEDIA-DAS POR LOS REGULADORES DE LA CLOROSIS SIPA, NBLS Y NBLR 233Ruiz Diego, Salinas Paloma, Cantos Raquel, Contreras AsunciónCAPÍTULO 29. PAPEL DEL OXALACETATO Y SU CIANHIDRINA EN LA ASIMILACIÓN DE CIANURO EN Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 241Luque-Almagro Víctor M, Huertas María José, Martínez-Luque Manuel, Blasco Rafael, Moreno Vivián Conrado, Castillo Francisco, Roldán María DoloresCAPÍTULO 30. COORDINACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DURANTE LA SÍNTESIS DE LIGNINA EN ÁLAMO (Populus sp) 247Castro-Rodríguez Vanessa, Cánovas Francisco M., García-Gutiérrez ÁngelCAPÍTULO 31. INTERACTION OF CARBON AND NITROGEN IN A C4 PLANT (Sorghum bicolor L) 255El Omari Redouane, Rueda Marina, Crespillo Molina Remedios, Avila Concep-ción, Cánovas Francisco M, Nhiri MohamedCAPÍTULO 32. REGULACIÓN DE LA ISOCITRATO DESHIDROGENASA Y OTROS GENES RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DEL CARBONO Y EL NITRÓGENO EN Prochlorococcus 261López Lozano Antonio, Gómez Baena Guadalupe, Rangel Oriol Alberto, Díez Jesús, García Fernández José ManuelCAPÍTULO 33. FUNCIÓN DEL COMPLEJO PII-PIPX Y ANÁLISIS DE LOS DETERMINANTES DE LA INTERACCIÓN 269Castells Miguel Ángel, Espinosa Javier, Contreras Asunción

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QUINTA PARTE: APLICACIONES AGRONÓMICAS, INDUSTRIALES

Y MEDIOAMBIENTALES.

CAPÍTULO 34. CIANOTROFIA: BIODEGRADACIÓN Y ASIMILACIÓN DEL CIANURO Y SUS DERIVADOS POR Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 279Moreno-Vivián Conrado, Luque-Almagro Víctor Manuel, Huertas María José, Sáez Lara Paloma, Escribano María de la Paz, Martínez-Luque Manuel, Blasco Rafael, Roldán María Dolores, Castillo FranciscoCAPÍTULO 35. DETECCION IN VITRO E IN VIVO DE NITRACIÓN DE PROTEÍNAS 287Urarte Estíbaliz, Larrainzar Estíbaliz, Ariz Idoia, Lantero Aquilino, Arrese-Igor César, González Esther M, Moran Jose FCAPÍTULO 36. ESTUDIO DEL ESTRÉS NUTRICIONAL POR AMONIO EN Pinus pinaster AIT. MEDIANTE UNA APROXIMACIÓN DE GENÓMICA FUNCIONAL 295Canales Carrasco Javier, Ávila Sáez Concepción, Pacheco Villalobos David, Díaz Moreno Sara, Ariza Mateos David, Navarro Cerrillo Rafael María, Ruiz Cantón Francisco Javier, Suárez Marín María Fernanda, Claros Díaz Manuel Gonzalo, Cánovas Ramos Francisco MiguelCAPÍTULO 37. ESTUDIO PROTEÓMICO Y APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LA BIODEGRADACIÓN DE CIANURO POR Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 301Huertas María-José, Luque-Almagro Víctor, Escribano María-Paz, Martínez-Luque Manuel, García Isidoro, Blasco Rafael, Moreno-Vivián Conrado, Roldán María-Dolores, Castillo FranciscoCAPÍTULO 38. EFECTO DEL MANEJO DE LA FERTILIZACIÓN NITROGENADA SOBRE LA SENESCENCIA EN PLANTAS DE TRIGO. 309Fuertes de Mendizábal Teresa, González Azucena, González-Murua C., Zamarreño Angel Mª, García-Mina José Mª, Estavillo José Mª, González-Moro Mª BegoñaCAPÍTULO 39. ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DEL GENOMA DEL Pinus pinaster: GS1A, GS1B Y FD-GOGAT. 317Bautista Rocío, Pacheco David, Díaz-Moreno Sara, Cantón Francisco R, Cánovas Francisco M, Claros M GonzaloCAPÍTULO 40. COMPOSICIÓN ISOTÓPICA DE PLANTAS DE PIMIENTO CULTIVADAS CON DIFERENTES DOSIS Y FUENTES DE NITRÓGENO 323Flores Pilar, Murray Phil, Davó María del Mar, López Alicia, Herrera Ester, Hellín Pilar, Fenoll José.

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CAPÍTULO 41. SOLUTOS COMPATIBLES NITROGENADOS VS. CARBONADOS EN LA ADAPTACIÓN AL ESTRÉS SALINO DE Lotus japonicus EN SIMBIOSIS CON Mesorhizobium loti. 329López Gómez Miguel, Lluch Plá CarmenCAPÍTULO 42. METABOLISMO DE PROLINA EN CULTIVARES DE Trifolium pratense CON DIFERENTE PRODUCCIÓN ESTIVAL 337Borsani O, Casaretto E, Márquez AJ, Rebuffo M, Díaz P, Monza JCAPÍTULO 43. PAPEL DE LA NITRORREDUCTASA NPRA DE Rhodobacter capsulatus EN LA BIOSÍNTESIS DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS 343Roldán María Dolores, Pérez-Reinado Eva, Castillo Francisco, Moreno-Vivián ConradoCAÍTULO 44. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES DE ESTRÉS POR EL REGULADOR DE RESPUESTA NBLR EN LA CIANOBACTERIA Synechococcus SP. PCC7942 349Ruiz Diego, Salinas Paloma, Moronta Félix, Cantos Raquel, Contreras AsunciónCAPÍTULO 45. GENES IMPLICADOS EN LA UTILIZACIÓN DE CIANATO POR Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 355Sáez Lara P, Huertas Mª José, Luque-Almagro Víctor M, Martínez-Luque Manuel, Blasco Rafael, Moreno-Vivián Conrado, Roldán Mª Dolores, Castillo Francisco

SEXTA PARTE: HOMENAJES.

CAPÍTULO 46. VIVENCIAS CON PEDRO J. APARICIO ALONSO EN SEVILLA Y RESTO DEL MUNDO 365Vega Piqueres José M.CAPÍTULO 47. PEDRO JOSE APARICIO ALONSO. SEMBLANZA 375Paneque Guerrero AntonioCAPÍTULO 48. MIS ANDANZAS CON PEDRO. DESDE GELVES A LA SELVA NEGRA PASANDO POR SORRENTO Y JARANDILLA 379Castillo Francisco

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LISTA DE CONTRIBUIDORES

Álvarez Laura, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). C/ Nicolás Cabrera 1, Campus de la UAM, 28049-Madrid.Aparicio-Tejo Pedro María, Instituto de Agrobiotecnología, UPNA-CSIC-GN; 31192 Mutilva Baja (Navarra), España.Ariz Idoia, Instituto de Agrobiotecnología, Universidad Pública de Navarra-CSIC-Gobierno de Navarra, Pamplona. Ariza Mateos David, Departamento de Ingeniería Forestal, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y Montes, Universidad de Córdoba. EspañaArrese-Igor César, Departamento de Ciencias del Medio Natural, Universidad Pública de Navarra, Pamplona.Artola Ekhiñe, Departamento de Ciencias del Medio Natural, UPNA; 31006 Pamplona (Navarra), España. Ávila Sáez Concepción, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España. Bautista Rocío, Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.Bautista Vanesa, Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Beato Víctor M, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, España.Bedmar Eulogio J, Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín, CSIC, P. O. Box 419, 18080-Granada, Spain. Berenguer José, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). C/ Nicolás Cabrera 1, Campus de la UAM, 28049-Madrid.Blasco Rafael, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres.Bonete María José, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Borsani O, Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad de la República, Uruguay.Bravo-Barrales Gloria, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante.Bueno Emilio, Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos.Estación Experimental del Zaidín, CSIC, P. O. Box 419, 18080-Granada, Spain. Camacho Mónica, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante.Camacho-Cristóbal Juan J, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, España.Camañes Querol Gemma, Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología. Área de Fisiología Vegetal. Dpto. de Ciencias Agrarias y del Medio Natural. Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales. Universitat Jaume I, 12071 Castellón, España.

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Camargo Antonio, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Canales Carrasco Javier, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España. Candau Pedro, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla – CSIC. Avda. Américo Vespucio, s/n, 41092-Sevilla.Cánovas Francisco Miguel, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga. Campus de Teatinos s/n 29071-Málaga.Cantón Francisco R, Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.Cantos Raquel, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante. 03690 San Vicente del Raspeig, Alicante.Casaretto E, Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad de la República, Uruguay.Castells Miguel Ángel, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante.03690 San Vicente del Raspeig – Alicante. Castillo Francisco, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, 1ª Planta, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba. Castro-Rodríguez Vanessa, Laboratorio de Biología Molecular, Escuela de Biología, Universidad Industrial de Santander, AA 678, Bucaramanga, Colombia. Cava Felipe, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). C/ Nicolás Cabrera 1, Campus de la UAM, 28049-Madrid.Cerezo García Miguel, Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología. Área de Fisiología Vegetal. Dpto. de Ciencias Agrarias y del Medio Natural. Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales. Universitat Jaume I, 12071 Castellón, España.Chahlafi Zahra, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC). C/ Nicolás Cabrera 1, Campus de la UAM, 28049-Madrid.Claros Díaz Manuel Gonzalo, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España. Contreras Asunción, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante.03690 San Vicente del Raspeig – Alicante. Crespillo Molina Remedios, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de Teatinos s/n, 29071- Málaga, España.Cruchaga Saioa, Departamento de Ciencias del Medio Natural, UPNA; 31006 Pamplona (Navarra), España.Cutruzzolá Francesca, Dipartimento di Science Biochimiche A. Rossi Fanelli, Universitá di Roma La Sapienza, P. le A. Moro 5, I-00185-Roma, Italia.Davó María del Mar, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain. de Montaigu Amaury, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Delgado María J, Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín, CSIC, P. O. Box 419, 18080-Granada, Spain. Díaz Moreno Sara, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España.

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Díaz P, Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad de la República, Uruguay.Díaz Susana, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante.Díaz-Moreno Sara, Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga.Díez Jesús, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Edif. Severo Ochoa, 1ª Planta. Campus Rabanales. Universidad de Córdoba. 14071- Córdoba. El Omari Redouane, Laboratoire de Biologie Appliquée, Faculté des Sciences et Techniques, Tanger principale BP 416, Maroc. Esclapez Julia, Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Escribano María de la Paz, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba.Espinosa Javier, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante.03690 San Vicente del Raspeig – Alicante. Estavillo José Mª, Dpto Biología Vegetal y Ecología,UPV-EHU, Apdo 644, 48080 Bilbao. Fenoll José, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain.Fernández Emilio, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Flores Pilar, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain.Fuertes de Mendizábal Teresa, Dpto Biología Vegetal y Ecología,UPV-EHU, Apdo 644, 48080 Bilbao. Galván Aurora, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. García Fernández José Manuel, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Edif. Severo Ochoa, 1ª Planta. Campus Rabanales. Universidad de Córdoba. 14071- Córdoba. García Isidoro, Departamento de Ingeniería Química, Edificio Marie Curie, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba. García Mina José María, Departamento de I + D, Timac Agro-Grupo Roullier, Polígono Arazuri-Orcoyen, C/C Nº32, 31160, Orcoyen, Navarra.García-Agustín Pilar, Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología. Área de Fisiología Vegetal. Dpto. de Ciencias Agrarias y del Medio Natural. Escuela Superior de Tecnología y Ciencias Experimentales. Universitat Jaume I, 12071 Castellón, España.García-Gutiérrez Ángel, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga, 29071. Málaga. Spain.Garnica María, Departamento de I + D, Timac Agro-Grupo Roullier, Polígono Arazuri-Orcoyen, C/C Nº32, 31160, Orcoyen, Navarra.Gil-Martínez Jorge, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla – CSIC. Avda. Américo Vespucio, s/n, 41092-Sevilla.Gómez Baena Guadalupe, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Edif. Severo Ochoa, 1ª Planta. Campus Rabanales. Universidad de Córdoba. 14071- Córdoba.Gómez-Cruz Rodolfo, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, 1ª Planta, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba.

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González Azucena, Dpto Biología Vegetal y Ecología,UPV-EHU, Apdo 644, 48080 Bilbao. González Esther M, Departamento de Ciencias del Medio Natural, Universidad Pública de Navarra, Pamplona.González-Ballester David, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. González-Fontes Agustín, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, EspañaGonzález-Moro Mª Begoña, Dpto Biología Vegetal y Ecología,UPV-EHU, Apdo 644, 48080 Bilbao.González-Murua C, Dpto Biología Vegetal y Ecología,UPV-EHU, Apdo 644, 48080 Bilbao. Hellín Pilar, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain.Herrera Ester, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain.Herrera-Rodríguez M Begoña, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, España.Higuera José Javier, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Houdusse Fabrice, Departamento de I + D, Timac Agro-Grupo Roullier, Polígono Arazuri-Orcoyen, C/C Nº32, 31160, Orcoyen, Navarra.Huertas María José, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba, Córdoba. Krell Tino, Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Apartado Postal 419, 18080-Granada.Laichoubi Karim, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante.03690 San Vicente del Raspeig – Alicante. Lambert Rocio, Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Grupo de Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas. Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba.Lamsfus Carmen, Departamento de Ciencias del Medio Natural, UPNA; 31006 Pamplona (Navarra), España.Lantero Aquilino, Instituto de Agrobiotecnología, Universidad Pública de Navarra-CSIC-Gobierno de Navarra, Pamplona. Larrainzar Estíbaliz, Departamento de Ciencias del Medio Natural, Universidad Pública de Navarra, Pamplona.Llamas Ángel, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Llorca Francisco, Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Lluch Plá Carmen, Departamento de Fisilogía Vegetal. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. Campus de Fuentenueva s/n 18071 Granada (España).

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López Alicia, Dpto.de Calidad y Garantía Alimentaria, IMIDA, Estación Sericícola, 30150 La Alberca, Murcia, Spain.López Gómez Miguel, Departamento de Fisilogía Vegetal. Facultad de Ciencias. Universidad de Granada. Campus de Fuentenueva s/n 18071 Granada (España).López Lozano Antonio, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Edif. Severo Ochoa, 1ª Planta. Campus Rabanales. Universidad de Córdoba. 14071- Córdoba. Lucas-Reina Eva, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Málaga. Campus de Teatinos s/n 29071 Málaga.Lucena José Manuel, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla – CSIC. Avda. Américo Vespucio, s/n, 41092-Sevilla.Luque-Almagro Víctor M, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba, Córdoba. Maldonado José María, Departamento Biología Vegetal y Ecología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, E-41012 Sevilla, España.Mariscal Vicente, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Márquez AJ, Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular. Facultad de Química. Universidad de Sevilla. España. Martínez-Espinosa Rosa María, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Martínez-Luque Manuel, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba, Córdoba. Mezquíriz Jesús, Dpto. Ciencias del Medio Natural. Universidad Pública de Navarra. Campus de Arrosadía s/n, 31006 Pamplona.Mills PC, School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, NR4 7TJ, United Kingdom.Monza J, Laboratorio de Bioquímica, Depto. de Biología Vegetal. Facultad de Agronomía. Universidad de la República, Uruguay.Morán José Fernando, Instituto de Agrobiotecnología. UPNA-CSIC-GN. Campus de Arrosadía s/n, 31192 Mutilva Baja, Navarra. Moreno-Vivián Conrado, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba.Moronta Félix, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante. 03690 San Vicente del Raspeig, Alicante.Murray Phil, Cross-Institute Programme for Sustainable Soil Function, North Wyke Research, Okehampton, Devon, EX20 2SB, UKNavarro Cerrillo Rafael María, Departamento de Ingeniería Forestal, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y Montes, Universidad de Córdoba. EspañaNavarro-Gochicoa M Teresa, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, España.Nhiri Mohamed, Laboratoire de Biologie Appliquée, Faculté des Sciences et Techniques, Tanger principale BP 416, Maroc. Pacheco Villalobos David, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España.

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Pedro-Roig Laia, Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Pérez-Pomares Francisco, Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Apartado 99. 03080 Alicante. España.Pérez-Reinado Eva, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, 1ª Planta, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba. Piedras Pedro, Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Grupo de Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas. Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba.Pineda Manuel, Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Grupo de Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas. Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba.Pire Carmen, Departamento de Agroquímica y Bioquímica. División de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante.Quiles Francisco Antonio, Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Grupo de Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas. Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba.Rangel Oriol Alberto, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular. Edif. Severo Ochoa, 1ª Planta. Campus Rabanales. Universidad de Córdoba. 14071- Córdoba. Raso María José, Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal. Grupo de Fisiología Molecular y Biotecnología de Plantas. Campus de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 1ª planta, Universidad de Córdoba.Rebuffo M, Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) La Estanzuela, Uruguay. Rexach Jesús, Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad Pablo de Olavide, E-41013 Sevilla, España Richardson David J, School of Biological Sciences, University of East Anglia, Norwich, NR4 7TJ, United Kingdom.Robles Eloy, Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín, CSIC, P. O. Box 419, 18080-Granada, Spain. Roldán María Dolores, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, 1ª Planta, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba. Rueda Marina, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de Teatinos s/n, 29071- Málaga, España.Ruiz Diego, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante. 03690 San Vicente del Raspeig, Alicante.Ruiz Cantón Francisco Javier, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. España. Sáez Lara Paloma, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba.Salinas Paloma, Dpto. Fisiología, Genética y Microbiología. Universidad de Alicante. 03690 San Vicente del Raspeig, Alicante.Sánchez Cristina, Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos. Estación Experimental del Zaidín, CSIC, P. O. Box 419, 18080-Granada, Spain. Sanz-Luque Emanuel, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba.

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Suárez Marín María Fernanda, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga. Campus de Teatinos s/n 29071 Málaga. España. Tejada-Jiménez Manuel, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba. Uchiumi Toshiki, Department of Chemistry and Bioscience, Faculty of Science, Kagoshima University, Japan. Urarte Estíbaliz, Instituto de Agrobiotecnología, Universidad Pública de Navarra-CSIC-Gobierno de Navarra, Pamplona. Vega Piqueres José M., Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular. Facultad de Química. Universidad de Sevilla. Vidal Jean, Institut de Biotechnologie des Plantes (IBP) CNRS-Université Paris-Sud XI. UMR 8618. Orsay. France.Zamarreño Angel Mª, Inabonos SA- Grupo Roullier, Polígono Arazuri-Orcoyen, C/C, nº 32, 31160 Orcoyen (Navarra).

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PRÓLOGO

El grupo de Metabolismo del Nitrógeno, creado en 1986, ha supuesto una vía de comunicación y coordinación de eventos entre grupos de investigación españoles cuyas líneas de trabajo están relacionadas con los procesos invo-lucrados en las reacciones del ciclo del nitrógeno. Al amparo de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) tuvo su primer encuentro científico en 1992 (organizado por el profesor Francisco Castillo), momento en el que se incorporaron al grupo miembros de la Sociedad Espa-ñola de Fisiología Vegetal (SEFV). Desde entonces y hasta la fecha en la que se escribe el presente libro, un total de 9 Reuniones han tenido lugar. Éstas han sido promovidas por científicos de destacado prestigio en el área como José María Vega, Francisco Cánovas, Pedro Aparicio-Tejo, Carlos Vílchez, Antonio J. Márquez, José M. Siverio y más recientemente María José Bonete Pérez. Asimismo cabe destacar la labor incansable de todos los colaboradores y coordinadores que ha tenido el grupo desde su aparición.

La novena edición de la reunión nacional del Metabolismo del Nitrógeno tuvo lugar entre los días 23-25 de Abril de 2008 en el marco incomparable de una de las ciudades más carismáticas del litoral Mediterráneo: Alicante. Su Universidad, una de las más jóvenes y dinámicas del país, ofrece un escenario espléndido para la discusión y el intercambio de resultados científicos. Como ocurriera en ediciones anteriores, jóvenes y expertos han tenido la oportuni-dad de compartir, discutir, analizar, planificar y plantear resultados y nuevas líneas de trabajo en el vasto y extenso campo que supone el metabolismo del nitrógeno, sin olvidar las alegrías y sin sabores que ofrece la ciencia a pie de bancada en el laboratorio.

Al encuentro acudieron un total de 104 participantes provenientes de todos los rincones de la geografía española, y tuvimos la oportunidad de disfrutar de la presencia del profesor David J. Richardson (Universidad de East Anglia, Norwich, UK) encargado de impartir la sesión inaugural. Las comunicaciones, un total de 71, han estado divididas en 4 grandes secciones: 1) Transporte y reducción de nitrato y nitrito (con 7 comunicaciones orales y 6 paneles); 2) Transporte y asimilación de amonio, aminoácidos y urenidos (con 6 comuni-caciones orales y 13 paneles); 3) Fijación de N2 y desnitrificación (6 comuni-caciones orales y 3 paneles); 4) Relación entre el metabolismo del carbono, nitrógeno y azufre (7 comunicaciones orales y 6 paneles) y 5) Aplicaciones

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agronómicas, industriales y medioambientales (con 8 comunicaciones orales y 10 paneles. Este manual recopila los trabajos allí presentados siendo así un material indispensable para la actulización del conomiento relacionado con el metabolismo del nitrógeno en todos los dominios de la vida.

No podemos olvidar, el marco humano y emotivo en el que se ha desarrollado este encuentro donde el recuerdo y homenaje a nuestros compañeros Antonio Palomares y Pedro J. Aparicio Alonso han ocupado un lugar destacado en las actividades programadas. Los más veteranos recordaban con añoranza viejos tiempos en los que el fracaso y el éxito podían darse la mano en determinados momentos, mientras que los más jóvenes valoraban la calidad científica y humana de los homenajeados.

Por último, cabe mencionar a los organismos, instituciones y entidades tanto públicas como privadas sin los cuales la organización y celebración de esta IX Reunión hubiera sido inviable, así como al grupo de personas que ha trabajado con entusiasmo para conseguir que este evento tuviera lugar.

A todos, muchas gracias,

Comité organizador IX Reunión Nacional delMetabolismo del Nitrógeno

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PRIMERA PARTE

TRANSPORTE Y REDUCCIÓN DE NITRATO Y NITRITO

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CAPITULO 1

TRANSPORTE Y REDUCCIÓN DE NITRATO Y NITRITO EN Chlamydomonas

Fernández Emilio, Llamas Ángel, Tejada-Jiménez Manuel, Camargo Antonio, Mariscal Vicente, de Montaigu Amaury, Sanz-Luque Emanuel, Higuera José Javier, González-Ballester David, Galván Aurora.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus Universitario de Rabanales, Edif. Severo Ochoa, planta baja. 14071 Córdoba.

La ruta de asimilación de nitrato en Chlamydomonas es estructuralmente sencilla y similar a la de plantas: Dos pasos de transporte a través de membrana y dos de reducción. La expresión de los elementos estructurales se encuentra finamente regulada a nivel transcripcional, positivamente por nitrato y negativa-mente por amonio o los productos de su asimilación. No obstante, se desconocen molecularmente los genes que participan en estas regulaciones. El transporte de nitrato y nitrito de alta afinidad está mediado por NRT2/NAR2 a través de la membrana plasmática y NAR1 a través de la membrana del cloroplasto. Asimismo, se ha identificado un transportador de molibdato necesario para la biosíntesis del cofactor de molibdeno de la nitrato reductasa. Hemos obtenido una colección de mutantes insercionales del alga. Entre ellos hemos demostrado que NIT2 es un gen esencial para la regulación positiva mediada por nitrato. A continuación se describen los avances recientes en los temas mencionados en el alga verde eucariota Chlamydomonas.

SISTEMAS DE TRANSPORTE FUNDAMENTALES PARA LA ASIMILACIÓN DE NITRATO EN ChlamydomonasEn primer lugar, resulta sorprendente que la complejidad de los sistemas

de transporte de nitrato y nitrito en un organismo unicelular eucariota como Chlamydomonas sea comparable a la de plantas como Arabidopsis. En Chla-mydomonas existen 14 genes que codifican para transportadores relacionados con estos aniones: uno de la familia NRT1, 6 NRT2, 1 NAR2, y 6 NAR1; mientras que en Arabidopsis son 16: 7 NRT1, 7 NRT2 y 2 NAR2 y en Ostreococcus son 4: 1 NRT1, 1 NRT2, 1 NAR2, y 1 NAR1 (Fernández y Galván, 2007).

Los transportadores de nitrato/nitrito pueden funcionar como sistemas de un componente (NRT2) o bien de dos componentes (NRT2+NAR2). NRT2.3 corresponde a un sistema de alta afinidad para nitrito y baja afinidad para nitrato (Quesada et al., 1998a; Rexach et al., 1999), mientras que NRT2.1+NAR2 es un

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sistema de alta afinidad para nitrato y nitrito y NRT2.2+NAR2 de alta afinidad para nitrato (Galvan et al., 1996; Zhou et al., 2000). El papel de NAR2 no está bien aclarado, si bien se ha concluido que tanto en Chlamydomonas como en Arabidopsis, NAR2 es esencial para la actividad de transporte de nitrato y, en Arabidopsis, NAR2 se ha mostrado su interacción física con la proteína NRT2 (Orsel et al., 2006; Okamoto et al., 2006).

Estos sistemas de dos componentes constituyen tanto en Chlamydomonas como en plantas los sistemas que permiten la entrada de nitrato con alta capa-cidad para mediar el crecimiento del organismo (Galván y Fernández 2007).

Se ha determinado que NRT2.1+NAR2 permite además la acumulación intracelular de nitrato desde concentraciones indetectables del anión en medios teóricamente desprovistos de nitrógeno, dando lugar a los efectos de “sensing” en dichos medios (Llamas et al., 2002; Rexach et al., 2002).

La entrada de nitrito al cloroplasto con alta afinidad está mediada por el sistema NAR1.1, cuya localización en la membrana interna de este orgánulo fue demostrada mediante el uso de anticuerpos específicos (Rexach et al., 2002). NAR1.1 media la entrada de nitrito dependiendo de la disponibilidad de carbono (Mariscal et al., 2004). Se demostró que este no era el único sistema de transporte de nitrito al cloroplasto sino que existen además otros dos sistemas para este anión, NAR1.2 que es un sistema bifuncional de alta afinidad para nitrito y baja para bicarbonato, y NAR1.6 que parece funcionar para nitrito (Mariscal et al., 2006). La funcionalidad de los otros sistemas NAR1.3-5 pudiera estar relacionada con el transporte de otros aniones monovalentes, en lugar de nitrito o bicarbonato, ya que su patrón de expresión no se afecta en diversas condiciones nitrogenadas o de fuente de carbono, ni depende de los genes reguladores NIT2 para el nitrato, caso de NAR1.1 y NR1.6, o CCM1 para el carbono, caso de NAR1.2 (Mariscal et al., 2006).

El molibdato es esencial para la biosíntesis de cofactor de molibdeno que participa en el sitio activo de reducción de nitrato (Fischer et al., 2006). Por ello, el transporte de este anión resulta crítico para una asimilación eficiente de nitrato. Si bien los transportadores de molibdato de la familia ABC son bien conocidos y están bien caracterizados en bacterias (Grundem y Shanmugam, 1977), se desconocían estos transportadores en eucariotas. Simultáneamente con el grupo de Fujiwara (Tomatsu et al., 2007), hemos identificado MOT1 como el primer transportador de molibdato de eucariotas (Tejada-Jiménez et al., 2007). Se trata de una nueva familia de transportadores relacionada dis-tantemente con la de los transportadores de sulfato y que poseen dos motivos conservados en la proteína. Una estrategia de RNA antisentido para MOT1 llevó a la interferencia con el transporte de molibdato en una estirpe del alga,

Fernández E. et al.

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21 gr, que sólo posee este sistema de transporte (Llamas et al., 2000), y además con la biosíntesis del cofactor de molibdeno y de la nitrato reductasa. La fun-cionalidad de MOT1 se ha demostrado además mediante expresión heteróloga en Saccharomyces (Tejada-Jiménez et al., 2007). MOT1 se expresa de modo importante en presencia de nitrato y no así de amonio, lo que está de acuerdo con su papel fundamental en la asimilación de este anión.

REGULACIÓN DE LA ASIMILACIÓN DE NITRATOEN ChlamydomonasMuchos de los genes estructurales para la asimilación de nitrato se encuen-

tran agrupados en Chlamydomonas (Quesada et al., 1993), de modo similar a lo que ocurre en hongos y levaduras (Crawford and Arst, 1993; Marzluf, 1997; Siverio, 2002). La regulación de estos genes se encuentra controlada positivamente por nitrato y negativamente por amonio. Si bien los genes regu-ladores para la asimilación de nitrato son bien conocidos en hongos y levaduras (Crawford y Arst, 1993; Marzluf, 1997; Siverio, 2002), los diversos intentos para identificarlos en eucariotas fotosintéticos han sido infructuosos.

Para identificar genes reguladores de la ruta en Chlamydomonas hemos utilizado la estrategia de interferir con la función de los mismos mediante mutagénesis insercional y utilizando como informador de una señalización defectuosa una construcción quimérica del gen de arilsulfatasa bajo control del promotor del gen de nitrato reductasa (NIA1). De esta manera, la selección de los mutantes se basó en la insensibilidad a las señales positiva por nitrato, negativa por amonio y crecimiento en nitrato. De esta manera se aislaron 145 mutantes de una colección de unos 22000 mutantes insercionales (González-Ballester et al., 2005). Se ha demostrado que el gen de regulación positiva que media los efectos del nitrato (NIT2) es esencial para el crecimiento en nitrato. NIT2 corresponde a un factor transcripcional con un motivo RWP-RK en otro de cremalleras de leucina, no relacionado estructuralmente con los factores transcripcionales para la asimilación de nitrato de hongos y levaduras (Camargo et al., 2007;). El transcrito de NIT2 se expresa a niveles basales, que aumenta significativamente no por la presencia de nitrato sino en ausencia de amonio en el medio. Asimismo, la presencia de amonio lleva a una rápida caída de los transcritos de NIT2, que sin embargo permanecen a altos niveles en medios con nitrato o sin nitrógeno. NIT2 se une específicamente a secuencias del promotor de NIA1 según muestran los experimentos de “footprinting” (Camargo et al., 2007;).

También se han identificado otros genes para regulación positiva por nitrato y negativa por amonio, que señalan a un importante grado de complejidad en la regulación de la ruta (González-Ballester et al., 2005).

Transporte y reducción de nitrato y nitrito en Chlamydomonas

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Financiado por MEC (BFU2005-07521)

BIBLIOGRAFÍACamargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, Gonzalez-Ballester D, Lefebvre PA, Fernandez

E, Galvan (2007) Plant Cell 19:3491-3503.Crawford NM, Arst HN Jr (1993) Annu. Rev. Genet. 27:115-146.Fernandez E, Galvan A (2007) J. Exp. Bot. 58(9):2279-87 Fischer K, Llamas A, Tejada-Jimenez M, Schrader N, Kuper J, Ataya FS, Galvan A, Mendel

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433.Marzluf G A (1997) Annu. Rev. Microbiol. 51:73-96.Okamoto M, Kumar A, Li W, Wang Y, Siddiqi MY, Crawford NM, Glass AD (2006) Plant

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Sci. USA. 104:20126-20130.Tomatsu H, Takano J, Takahashi H, Watanabe-Takahashi A, Shibagaki N, Fujiwara T (2007)

Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:18807-18812. Zhou JJ, Fernandez E, Galvan A, Miller AJ (2000) FEBS Lett. 466: 225-227.

Fernández E. et al.

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CAPITULO 2

UNA GUANILATO CICLASA DEPENDIENTE DE ÓXIDO NÍTRICO IMPLICADA EN LA REGULACIÓN DE LA

ASIMILACIÓN DE NITRATO

Sanz-Luque Emanuel, de Montaigu Amaury, Galván Aurora, Fernández Emilio.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, Campus de Rabanales, Facultad de Ciencias, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, España.

RESUMENChlamydomonas utiliza fundamentalmente el nitrógeno inorgánico (amonio,

nitrito y nitrato) como fuente de nitrógeno, siendo el amonio la forma preferida por la célula. La regulación negativa por amonio de la asimilación de nitrato es un hecho bien conocido (Fernandez et al. 2007), sin embargo, no se conocen los mecanismos de regulación ni los efectores implicados.

En este trabajo nos centramos en un mutante, aislado de una colección de 22000 mutantes insercionales obtenidos en nuestro laboratorio (González-Ballester et al. 2005), en el cual la etiqueta se ha integrado en un gen que codifica para una guanilato ciclasa (GC). Esta proteína presenta dos dominios conservados, uno catalítico de guanilato ciclasa, y otro HNOB de unión de óxido nítrico propio de GCs de tipo soluble. Este gen presenta una regulación por nitrógeno siendo su expresión óptima en medios con nitrato más amonio.

La implicación de esta GC en la regulación de la expresión de la nitrato reductasa y la presencia de un dominio GAF en NIT2, el único regulador posi-tivo conocido del gen Nia1 (Camargo et al. 2007), sugiere una posible función del óxido nítrico y del GMPc como efectores en la señalización negativa de la asimilación de nitrato.

INTRODUCCIÓNLos genes implicados en la asimilación de nitrato están regulados por la

fuente de nitrógeno presente en el medio. La presencia de nitrato induce los genes responsables de su asimilación (Daniel-Vedele et al., 1998; Llamas et al., 2002; Rexach et al., 2002), mientras que el amonio, o algún metabolito de la asimilación de éste, posee un efecto represor sobre los mismos (Stitt, 1999; Crawford and Forde, 2002). La nitrato reductasa (NR) es la primera enzima encargada de llevar a cabo la asimilación de nitrato tras su transporte al interior

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celular. Esta enzima se encarga del primer paso de reducción de nitrato para su asimilación y presenta una regulación compleja tanto a nivel transcripcional como a nivel postraduccional. En Chlamydomonas, el gen Nia1 que codifica la NR está regulado por el factor transcripcional NIT2 (Camargo et al., 2007). A nivel postraduccional se ha demostrado en plantas que la actividad de la enzima está regulada por fosforilación y se inactiva por unión de proteinas tipo 14-3-3 a esta forma fosforilada (Lillo et al., 2004). En Chlamydomonas la actividad de la NR no se regula por proteínas 14-3-3 sino por el estado redox de la proteína, siendo su forma oxidada la activa (Fernández y Cárdenas, 1982). En cuanto a la represión transcripcional de la NR por amonio no se conoce nada. En nuestro laboratorio se ha construido una colección de unos 22000 mutantes insercionales entre los que se han conseguido identificar 40 estirpes insensibles a amonio (González-Ballester et al., 2005a). Como estirpe parental se usó la 704 que posee en su genoma el gen reportero de la arilsulfatasa bajo control del promotor de Nia1 (Ohresser et al. 1997). Se identificaron mutantes insensibles a amonio por selección de aquellos que presentaban actividad del gen reportero en presencia de amonio. El hecho de que se hayan identificado tal cantidad de mutantes parece indicar que la ruta de señalización negativa de la asimilación de nitrato es compleja. Además dichos mutantes muestran distinto grado de insensibilidad a amonio dependiendo de su concentración, lo que lleva a pensar que podrían existir diferentes rutas que actuarían a diversas concentraciones de amonio y que tendrían un efecto aditivo en la represión de la asimilación de nitrato.

En este trabajo se estudia uno de estos mutantes M20.73 que está afectado en un gen 20.73RT que codifica para una GC y se propone un modelo de cómo se podría llevar a cabo la señalización negativa.

MATERIALES Y MÉTODOSIdentificación de la región genómica que flanquea la inserción.Esta identificación es diferente para los dos bordes de la inserción. El “borde

derecho” se obtuvo mediante la técnica de RESDA-PCR (Restriction Enzyme Site Directed Amplification-PCR) (Gonzalez-Ballester et al., 2005b), mientras que el “borde izquierdo se identificó mediante PCR de largo alcance para la que se utilizó el “CERTAMP Long Amplifications Kit” (Biotools B&A Labs S.A.). El cebador específico que ancla en el genoma se usó en combinación con los cebadores del pSI104. El cebador específico fue 20.73-6 cuya secuencia es 5’-GGGTAAAAGGTCAGGTTGCGATGTTG-3’ Las secuenciaciones se realizaron en el Servicio Central de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Córdoba.

Sanz-Luque E. et al.

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Determinación de la actividad ARS en medio sólido.Previo al análisis se eliminaron las células de la superficie de las placas de

cultivo cultivadas en los diferentes medios. A continuación, sobre cada placa se añadió un volumen saturante de una solución que contenía: 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 10 µM de imidazol; 0,1 mg/ml de naftilsulfato; y 1 mg/ml de orto-dianisidina-tetrazotizada, según Ohresser et al. (1997).

Determinación de la actividad NR.La actividad BVH-NR se determinó in vitro con extractos obtenidos por

congelación/descongelación en Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, o por tratamiento de 100µl de células con 5µl de tolueno 100% (Fernández y Cárdenas, 1982), y según descrribe Paneque et al. (1965). El nitrito producido se determinó colorimétricamente (Snell y Snell, 1949).

PCR en Tiempo Real.Las reacciones de PCR en Tiempo Real se llevaron a cabo en un termo-

ciclador LightCycler (BioRad iCycler iQ Real-Time PCR Detection System) empleando SYBR Green I (10,000 X en DMSO, Molecular Probes/ Leiden, The Netherlands) como marcador de fluorescencia. Cada reacción individual se realizó en un volumen de 25 µl usando placas para PCR en Tiempo Real de 96 pocillos (PCR Microplate 96M2-HS-C, Axygen; PCR Plates, 96 well, BIO-RAD), con los siguientes componentes por reacción: 0,2 pmoles de cada cebador, 0,2 mM de dNTPs, 0,5 U de Taq DNA polimerasa de Biotools (B&M Labs, S.A, Madrid), 2,5 mM de MgCl2, 1-2 µl de cDNA de simple cadena (dilución 1:5), 1,25 µl de SYBR Green (diluido 10-4 veces en DMSO), 1 X de tampón específico, y agua MilliQ hasta 25 µl. El protocolo del termociclador fue: desnaturalización a 95ºC, 5 min; 40X (desnaturalización a 95ºC, 30 s; alineamiento a 60ºC, 30 s; amplificación a 72ºC, 20 s; y medida, 10 s). Las medidas de fluorescencia se hicieron a 84ºC para eliminar la fluorescencia que resulta de la formación de dímeros y el ruido de fondo. El cDNA utilizado para las medidas de expresión se sintetizó utilizando la SuperScript II RNaseH- Reverse Transcriptase (Invitrogen).

RESULTADOS Y DISCUSIÓNIdentificación de una guanilato ciclasa como un gen responsable del

fenotipo de insensibilidad a amonio.El mutante M20.73 fue obtenido a partir de una colección de 22000 mutan-

tes insercionales, formando parte de un grupo de 40 mutantes con fenotipo de insensibilidad a amonio. Este mutante presentó actividad ARS en medios que

Una guanilato ciclasa dependiente de óxido nítrico implicada en la regulación de la asimilación de nitrato

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contenían amonio en concentraciones suficientes como para inhibir la actividad del gen reportero en la estirpe parental. Cuando se comprobó la actividad nitrato reductasa (NR), se vio que en condiciones de inducción de 3 horas en presencia de nitrato 4mM la actividad era similar en mutante y silvestre, mientras que en condiciones de inducción de nitrato 4mM y amonio 1mM la actividad NR en la estirpe parental 704 estaba totalmente inhibida y el mutante presentaba aún una actividad del 40% con respecto a la obtenida en nitrato. Este mutante debía estar afectado en un gen implicado en la ruta de señalización negativa por amonio de la asimilación de nitrato.

Estudios moleculares mediante RESDA-PCR y PCR de largo alcance (ver Materiales y Métodos) del mutante M20.73 mostraron que la inserción del marcador en esta estirpe afectaba la región 5’ de un gen que poseía una alta homología con enzimas de la familia de las GC de tipo III. La proteína codifi-cada por este gen presenta un dominio GC conservado en su región central y un dominio HNOB de unión de óxido nítrico en su región amino terminal.

Expresión del gen 20.73RT en la estirpe parental y mutante.Se estudió la regulación de la expresión del gen de GC mediante PCR en Tiempo Real en presencia de diferentes fuentes de nitrógeno en la estirpe parental. Se comprobó que su expresión era máxima en medios con nitrato más amonio lo cual parece lógico por ser en con estas dos fuentes de nitrógeno donde su función parece más importante, teniéndose que producir la represión de los genes de la asimilación de nitrato en condiciones de inducción. De manera sorprendente, se determinó que este gen de GC presentaba una sobreexpresión en el mutante pero mantenía el mismo patrón de regulación por la fuente de nitrógeno que en la estirpe parental.

Aunque esta sobreexpresión parece indicar que el fenotipo es consecuencia de una ganancia de función, otros datos indican que se debe a una pérdida de función. Así, la inserción ha ocurrido después del codón de inicio afectando a la región codificante y posiblemente al dominio HNOB produciéndose un transcrito quimérico que posee parte del marcador de mutagénesis. Además, existen otros mutantes afectados en genes diferentes que poseen el mismo fe-notipo de insensibilidad a amonio y que presentan una importante represión del gen de la GC. Los genes afectados en estos mutantes podrían estar regulando la expresión del gen identificado en una posible ruta para la señalización negativa por amonio. La sobreexpresión se puede explicar considerando que el transcrito se está produciendo desde el promotor propio potenciado por el “enhancer” del promotor de la rubisco en el vector insertado, o bien, desde el promotor de la rubisco regulado por los elementos reguladores de promotor endógeno.

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Efecto del ionóforo de calcio sobre la expresión de Nia1 y GC en la estirpe parental 704.

Que una guanilato ciclasa esté implicada en la regulación negativa de la asimilación de nitrato nos lleva a proponer un modelo de regulación negativa. La arginina generada por la asimilación de amonio produciría la represión de Nia1 mediante la generación de óxido nítrico que a su vez activaría a la GC para producir GMPc a través del dominio GAF presente en NIT2, regulador positivo de Nia1 (Camargo et al. 2007), impidiendo la expresión de Nia1. Este hipotético modelo se ha contrastado a partir del efecto de algunos compuestos farmacológicos sobre la expresión de Nia1 de 20.73 y la actividad de la NR.

Figura 1. Modelo de regulación de la expresión de Nia1. Las flechas rojas indican represión o inhibición, mientras que las flechas negras indican activación.

El primer compuesto utilizado fue el ionóforo de calcio A23187, puesto que el calcio es un cofactor indispensable para la actividad de la óxido ní-trico sintasa (NOS) (Pressman et al., 1976) que presumiblemente utilizaría la arginina para producir citrulina y NO. Las células se incubaron durante 3 horas en presencia de nitrato 4mM e ionóforo de calcio 2µM y se observó que la expresión de Nia1 disminuyó un 40% mientras que la expresión de GC aumentó un 75% respecto a los valores obtenidos en el control sin ionóforo, lo que en principio, estaría de acuerdo con nuestro modelo. Cuando se estudió la actividad NR en las mismas condiciones se observó que la actividad en la estirpe parental disminuyó un 90% en presencia del ionóforo, mientras que en la estirpe mutante se redujo la actividad menos de un 80%.

Una guanilato ciclasa dependiente de óxido nítrico implicada en la regulación de la asimilación de nitrato

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Figura 2. Expresión relativa de los genes Nia1 y 20.73RT(GC) en presencia de nitrato 4mM (N) y nitrato + ionóforo de calcio 2 microM.

Estos datos concuerdan con el modelo teniendo en cuenta que si afectamos la vía a nivel de la GC el impacto de cualquier compuesto que produzca su efecto a un nivel superior de la GC en la ruta será menor. El hecho de que aún así tengamos una fuerte inhibición en el mutante puede deberse a que existi-rían más GCs, no afectadas e implicadas en esta ruta, ya que Chlamydomonas presenta 56 dominios GC en su genoma (Merchant et al., 2007), asimismo el calcio podría estar también ejerciendo efectos sobre la actividad a otros niveles independientes de la GC.

Efecto del NO sobre la expresión de 20.73RT en la estirpe parental 704.Además del Iónoforo de calcio se ha estudiado el efecto de dos donadores

de NO diferentes (SNAP y Nitroprusiato) sobre la expresión del gen 20.73RT en la estirpe parental. En ambos casos se observó que la expresión del gen 20.73RT aumentaba de manera dependiente de la concentración (SNAP 100 y 200 µM y Nitroprusiato 50 y 100 µM). Esto parece indicar que el NO provoca no sólo la posible activación de la GC sino también un efecto positivo sobre la expresión del gen.

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Una guanilato ciclasa dependiente de óxido nítrico implicada en la regulación de la asimilación de nitrato

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CAPÍTULO 3

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA NITRORREDUCTASA NprB DE Rhodobacter capsulatus

Gómez-Cruz Rodolfo, Pérez-Reinado Eva, Roldán María Dolores, Castillo Francisco, Moreno-Vivián Conrado.Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Edificio Severo Ochoa, 1ª Planta, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba. 14071-Córdoba.

RESUMEN Las nitrorreductasas (NR) son flavoenzimas que utilizan NAD(P)H como

donador de electrones y que reducen el(los) grupo(s) nitro de compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos. Se han descrito aplicaciones biotecno-lógicas y biomédicas de las nitrorreductasas destacando la biorremediación de nitroaromáticos por compostaje, la fitorremediación usando plantas transgénicas y las terapias antitumorales. En la bacteria Rhodobacter capsulatus se han iden-tificado dos genes que codifican posibles NR. Estudios de mutagénesis dirigida han permitido establecer que ambos genes, nprA y nprB, son necesarios para el proceso de reducción de compuestos nitroaromáticos. El gen nprA codifica una NR dependiente de NADPH que es inducible por diversos compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos y se regula negativamente por amonio. El gen nprB codifica una NR cuya expresión parece ser constitutiva. La nitro-rreductasa NprB de Rhodobacter capsulatus se ha hiperexpresado fusionada a una cola de histidinas y se ha purificado hasta homogeneidad. La proteína His6-NprB presenta actividad nitrorreductasa con NAD(P)H como donador de electrones y utiliza los substratos 2,4,6-trinitrotolueno (TNT), ácido pícrico (2,4,6-trinitrofenol) y furazolidona, entre otros.

INTRODUCCIÓNLa mayoría de los compuestos nitroaromáticos se generan por diversas

actividades industriales, tales como síntesis de plaguicidas, explosivos, plásticos, tintes, disolventes y fármacos. Algunos compuestos nitroaromáticos han sido utilizados como explosivos, como el 2,4,6-trinitrotolueno (TNT) y el ácido pícrico (2,4,6-trinitrofenol), por lo que existen grandes áreas que sufren este tipo de contaminación. La presencia de los grupos nitro en el anillo aromático le confiere un carácter recalcitrante a estos compuestos xenobióticos, lo que hace que la mayoría de ellos sean persistentes en el medio ambiente y afecten a

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los sistemas nervioso y endocrino, con efectos cancerígenos en algunos casos. A pesar de estas características, los microorganismos han desarrollado rutas de degradación para este tipo de compuestos, las cuales son de tipo oxidativo o reductivo (Spain, 1995). El ataque oxidativo está realizado por oxigenasas que introducen grupos hidroxilo en el anillo para su desactivación. Estas en-zimas normalmente actúan sobre compuestos mononitroaromáticos. El ataque reductivo está realizado por nitrorreductasas o por transferasas de iones hidruro, dependiendo de si la reducción se realiza sobre el(los) grupo(s) nitro del anillo aromático o bien sobre el propio anillo aromático, respectivamente (Spain, 1995; Rieger et al., 2002; Ramos et al., 2005, Roldán et al., 2008). Las nitro-rreductasas son homodímeros, con monómeros de aproximadamente 25 kDa que contienen generalmente FMN (flavin mononucleótido) como cofactor y usan NAD(P)H como donador fisiológico de electrones (Roldán et al., 2008). Las nitrorreductasas utilizan como substratos una gran variedad de compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos, entre los cuales se encuentran el 2,4-di-nitrofenol (2,4-DNP), ácido pícrico, TNT, nitrofurazolidona y nitrofurantoina. Las nitrorreductasas se pueden clasificar en dos tipos dependiendo de cual sea su mecanismo de reacción. Así, las nitrorreductasas sensibles al oxígeno o de tipo II catalizan la transferencia de un único electrón en un primer paso produ-ciendo un radical nitro-anión que puede ser reoxidado en un ciclo fútil con la consecuente formación del anión superóxido, mientras que las nitrorreductasas insensibles al oxígeno o de tipo I participan en la transferencia de dos electrones para generar directamente el intermediario nitroso. En otros dos pasos se trans-fieren el resto de electrones (dos en cada paso) para formar los intermediarios hidroxilamino y amino, aunque hay nitrorreductasas que forman exclusivamente intermediarios hidroxilamino (Spain, 1995; Roldán et al., 2008; Caballero et al., 2005; Race et al., 205). Las nitrorreductasas mejor estudiadas han sido las insensibles a oxígeno. Así, se han purificado y caracterizado diversas nitrorre-ductasas bacterianas, sobre todo de microorganismos entéricos (Roldán et al., 2008; Caballero et al., 2005; Race et al., 2005; Koder et al., 2002, Watanabe et al., 1998; Zenno et al., 1998). En particular, las nitrorreductasas insensibles al oxígeno NfsA y NfsB (o NfnB) de Escherichia coli se han tomado como modelo. Además, también se han determinado las estructuras cristalográficas de estas dos nitrorreductasas, entre otras (Race et al., 2005; Kobori et al., 2001; Lovering et al., 2001; Haynes et al., 2002). Por otro lado, las aplicaciones biotecnológicas y biomédicas que han tenido las nitrorreductasas bacterianas en los últimos años han sido muy diversas, destacando la biorremediación de compuestos polinitroaromáticos, la síntesis de materiales importantes desde el punto de vista comercial, y dentro de la biomedicina, los tratamientos de

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determinado tipos de procesos tumorales (Roldán et al., 2008). El TNT es uno de los compuestos xenobióticos más recalcitrantes que existe por el número y localización de sus grupos nitro. Además, debido a su uso como explosivo existen múltiples y extensas áreas contaminadas por este compuesto. Se han descrito algunos casos de degradación aeróbica de TNT realizada por algunas bacterias y hongos que implican la salida de grupos nitro en forma de nitrito y la formación de complejos de Meinsenheimer. Por otro lado, bacterias anae-róbicas estrictas de los géneros Clostridium y Desulfovibrio degradan TNT via triaminotolueno. Algunos clostridios son capaces de producir derivados del TNT con grupos hidroxilaminos que por un reagrupamiento Bamberger generan aminofenoles. Se ha descrito que la estirpe Pseudomonas sp. JLR11 presenta una ruta de degradación de TNT que implica la formación de nitrito y su posterior reducción a amonio, y además, esta estirpe podría usar el TNT en un proceso respiratorio como aceptor terminal de electrones (Esteve-Núnez et al., 2001). Rhodobacter capsulatus presenta dos genes, nprA y nprB, que codifican dos nitrorreductasas insensibles a oxígeno. Mientras que nprB presenta una expresión constitutiva, nprA se induce por una gran variedad de compuestos nitroaromáticos y nitroheterocíclicos (Pérez-Reinado et al., 2005). Recientemente se ha purificado y caracterizado la nitrorreductasa NprA de R. capsulatus (Pérez-Reinado et al., 2008). En este trabajo se describe la hiperex-presión en Escherichia coli de la proteína NprB de R. capsulatus fusionada a una cola de seis histidinas, lo cual ha permitido su purificación y caracterización bioquímica, comprobándose que ambas nitrorreductasas presentan propiedades bioquímicas diferentes, incluyendo especificidad de substratos.

MATERIALES Y MÉTODOSGeneración de la construcción de pQE32-nprB.Mediante oligonucleótidos se ha amplificado por PCR un fragmento de

0,7 kb que contiene el gen nprB de R. capsulatus. Los oligonucleótidos usados han sido HISNPRB1 5’- TAGGATCCATGAGAATCTGTATTTCCAAGGC-3’ (BamHI) y HISNPRB2 5’- AGAAGCTTAGCAGCAGAAGGATGGCGAGGC-3’ (HindIII) que han introducido dos secuencias de corte para las enzimas anteriormente indicadas en los extremos 5’ y 3’, respectivamente, de dicho gen (marcadas con subrayado en las secuencias). Este fragmento previamente digerido con BamHI/HindIII se clonó en el vector de expresión pQE32 (Qiagen) introduciendo seis histidinas en el extremo N-terminal de NprB. La construcción pQE32-nprB se introdució por transformación en E. coli.

Purificación y caracterización de la nitrorreductasa NprB de Rhodobacter capsulatus

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Medios de cultivo, determinación del crecimiento bacteriano e inducción de la proteína NprB.

Escherichia coli portadora de la construcción pQE32-nprB se cultivó en medio rico LB (Sambroook et al., 1989) en presencia de amplicilina (100 µg.ml-1). Para determinar el crecimiento de los cultivos de E. coli se determinó la turbidez a 600 nm. Para la inducción de la proteína NprB, la estirpe E. coli/pQE32-nprB se cultivó en LB a 37 ºC y 250 rpm de agitación hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm aproximada de 0,5. Posteriormente, se añadió al cultivo 2 mM de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido) y se cultivó durante tres horas más, tras las cuales se recogieron las células y se congela-ron en nitrógeno líquido hasta su uso posterior. Para la obtención del extracto crudo las células se resuspendieron en tampón Tris-HCl (50 mM, pH 8,0) y se lisaron por sonicación (3 pulsos de 5 segundos) a 90 W. Posteriormente, se centrifugaron y el sobrenadante se utilizó como fuente de NprB.

Purificación de NprB y determinación de la actividad nitrorreductasa de NprB.

La proteína His6-NprB se purificó por cromatografía en una columna NTA-Niquel. Una vez unida a la columna, se separó con altas concentraciones de imidazol (250 mM). La actividad nitrorreductasa de NprB se determinó espec-trofotométricamente siguiendo la desaparición de NADH a 320 nm para todos los substratos probados, que se han usado a una concentración 200 µM.

Tincion por Coomassie y Western-blots.Extractos crudos de E. coli/pQE32-nprB o bién la proteína NprB pre-

viamente purificada se cargaron en geles de poliacrilamida (al 15%) que se sometieron a tinción Coomassie o se usaron para Western-blots con los anticuerpos desarrollados frente al motivo de seis histidinas como anticuerpo primario (Olmo-Mira et al., 2004).

RESULTADOS Y DISCUSIONHiperexpresión y purificación de la nitrorreductasa NprB de

Rhodobacter capsulatus. La proteína NprB de R. capsulatus se ha expresado como proteína recombi-

nante en E. coli. Mediante la adición de IPTG al cultivo de E. coli/pQE32-nprB se indujo la expresión del gen nprB. Una vez obtenido el sobrenadante aislado a partir de la estirpe de E. coli portadora de la construcción anterior, una parte alíquota de éste se cargó en un gel de poliacrilamida que se sometió a tinción Coomassie y análisis mediante Western-blot (Fig. 1). El resto del sobrenadante

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