U N I V E R S I D A D A U T O N O M A M E T R O P O L I T A N A

U N I D A D I Z T A P A L A P A

c. 6. s .

- .

S E R V I C I O S O C I A L

ASESORES: Dr. JOSE LUIS ROSALES E. M. en C. ENRIQUE MENDIETA M.

ALUMNA: ALMA DELIA SIMON ROMERO 1 ( 3 r o I *

JUNIO. 1995

I N D I C E

INTRODUCCION Variation antiggnica en tripanosomas Antígenos de superficie de T. cruzi Diagnostico

OBJETIVOS

METODOLOGIA Aislamiento de plásmido Extracci6n Purificación Transformación Electroelución Produccidn de anticuerpos

RESULTADOS

DISCUSION

CONCLUSION

2 4 5 5

7

8 8 8 9 10 12 12

13

21

22

BIBLIOGRAFIA 23

I N T R O D U C C I O N

La enfermedad Chagas, es uno de los mayores problemas de salud en America Latina, se estima que que existen 100 millones de personas con riesgo de infección de los cuales 16 a 18 millones estan infectados. El porcentaje de mortalidad que se presenta por esta enfermedad es del 10% _ _ .

. ~-

La tripanosomiasis Americana, es una enfermedad cr6nica parasitaria causada por por el protozoario flagelado: Trypanarroma C r u x i siendo trasmitido a humanos por el insecto triatomino de la familia Reduviidae. La forma de contagio es a través de lesiones contaminadas con heces fecales, por transfusión sanguínea, transplantes de organos, vias congenitas, y leche materna.

El ciclo de vida del pardsito es largo y complejo, con varios estados de desarrollo en el vector triatomonino y en el huésped vertebrado. Se reconocen tres estadios en esta enfermedad y son: un estado agudo, un estado indeterminado y un estado crónico.

El ciclo de desarrollo de T. cruzi incluye distintos estados morfologicos, y son trypomastigotes, epimastigotes y amastigotes, cada uno se caracteriza por la posici6n del cinetoplasto con respecto al núcleo. E1 trypomastigote es la forma elongada del pardsito, en el que el cinetoplasto se encuentra en la parte posterior del núcleo y el flagelo tiene una longitud semejante a el pardsito completo, comunmente se presentan en la sangre del huesped 6 bien en el intestino del vector; en el caso de trypomastigotes es alargado, cuando la infeccidn inicia los trypomastigotes son delgados, pero cuando la infección progresa engrosan. El epimastigote desarrolla un- estado transicional en el huesped vertebrado, presenta un cinetoplasto cercano a la parte anterior del núcleo y el flagelo se origina cerca del cinetoplasto.El amastigote es la forma reproductiva intracelular de T. cruzí y se encuentra dentro de las celulas del humano o del huésped animal, esta forma tiene la capacidad de diferenciarse a epimastigote ó trypomastigote dependiendo del medio y de la temperatura a la que se encuentre. Cada amastigote posee un flagelo corto localizado cerca del cinetoplasto.Ocurren estadios intermedios durante la diferenciaci6n de una a otra forma del "pardsito, el estado esferomastigote mide aproximadamente 15-25 2 pm con un flagelo libre, los promastigotes son elongados, el cinetoplasto se encuentra en l a parte final posterior con un flagelo libre

El estadio agudo es relativamente corto, alcanzando de 4 a 5 semanas, se caracteriza por una variedad de manifestaciones clínicas. Los síntomas pueden ser muy leves y atípicos, como consecuencia de la enfermedad, no es del todo reconocida en esta fase, solo del 1% al 2% de pacientes chagdsicos son diagnosticados en esta etapa; las seiíales y síntomas son diferentes de acuerdo al sitio de infección, cuando la infección ocurre en la conjuntiva 6 en la piel del p6rpado se desarrolla una celulitis perioftalmica con dolor y enrojecimiento de

la zona lesionada, a la que se le nombra Chagoma ó bien seiial de Romaiia .

Se puede considerar la existencia de un patrón de síntomas como son fiebre, alargamiento de higado y bazo, edema generalizado, nodulos linfaticos hinchados, algunas veces salpullido generalizado, anorexia, diarrea y v6mito. Mas de 30% de los casos muestran anormalidades radiologicas y electrocardiograficas debido a miocarditis aguda en diferentes grados. En los nifios se presenta la meningoencefalitis, convulsiones, con 6 sin fiebre, perdida 'de conocimiento y mortalidad superior al 5 0 % .

En este estadio algunos amastigotes son encontrados en todos los tejidos, aunque en mayor proporción en celulas de músculo cardíaco.

Los amastigotes se multiplican en pseudoquistes intracelulares, las lesiones se caracterizan por infiltraci6n linfocítica y de macrófagos, se presenta edema y las fibras musculares se disocian y destruyen. Las celulas miocardiales intersticiales pueden ser sensibilizadas por absorción de antigenos de T. cruzi y ser dañadas al avanzar la infección.

El estado indeterminado inicia de 8 a 10 semanas despues del estado agudo, puede haber manifestaciones clínicas qu pueden persistir varios años ó bien indeterminadamente. Se caracteriza por la ausencia de síntomas clínicos. Los sujetos presentan actividad física normal, electrocardiogramas normales. Durante este estado muchos pacientes desconocen que estan infectados con T. cruzi y con esto forman parte de un importante resenrorio de infección y contribuyen a mantener el ciclo de vida del parasito.

En el estado crónico, la enfermedad se desarrolla despues del estado indeterminado, se ha estimado que m6s del 30% de las personas sufren daño neurologico, digestivoy cardiaco.

Los triatominos se alimentan en la noche succionando sangre de personas ó animales inactivos ó dormidos; el trypomastigote metaciclico infectivo es depositado con las heces y la drina durante ó después de alimentarse de la victima.

Los trypomastigotes metaciclicos entran en el mamifero a trav6o de la mucosa membranal, conjuntiva, piel lesionada, 6 por la herida causada por el piquete del insecto. A l invadir celulas cerca del punto de entrada pueden ser capturadas en vacuolas endociticas. Se da la fusión lisosomal, pero los pardsitos no mueren, mas bien se diferencian en amastigotes que son liberados al citoplasma de la célula. Se sugiere que posiblemente el pardsito secreta una hemolisina con un pH 5 . 5 , que causa ruptura de la membrana vacuolar. Los amastigotes se multiplican por fisión binaria, y la célula huésped se infesta de parásitos, después de aproximadamente 4 a 5 dias, algunos amastigotes se diferencian a tripomastigotes y se da una ruptura.

Durante las dos siguientes semanas; los trypomastigotes salen del sitio de inoculación, entran a flujo sanguíneo, circulan e invaden otras celulas tisulares. El reconocimiento y la union a la Célula

huésped parece darse por mol6culas de trypomastigote que se unen a receptores de glicoproteína presentes en la c6lula huésped; este proceso depende de iones calcio y también se requiere de moléculas de energía a1tame:nte fosforilante.

Investigaciones recientes con cultivos de monocitos y fibroblastos sugieren que hay un subciclo en el cual los amastigotes son endocitadas; despugs de la ingestión de multiples amastigotes indiferenciados y transformados a trypomastigotas de forma sanguinea. Los trypomastigotes no inician inmediatamente la sintesfs de DNA después de la invasi6n. Los trypomastigotes circulantes presentes en la sangre son ingeridos por el triatomino y transformados a epimastigotes en el intestino medio. Durante las pr6ximas 2 a 3 semanas, se multiplican y se diferencian en trypomastigotes metaciclicos en la ampula rectal del intestino, en el cual se desarrollan aproximadamente 10% de esferomastigotes y 10% de epimastigote en estadio intermedio.

Hay un numero mayor de trypomastigotes que epimastigotes en el recto del insecto. Muchos de los epimastigotes en el recto se adhieren a la pared, mientras que muchos trypomastigotes se liberan. Dandose formas intermedias de entre epimastigotes y trypomastigotes mataciclicos se dan en el lumen rectal y en la pared. Las heces y las excresiones rectales iniciales contienen grandes cantidades de flagelados. Las gotas de la orina que pasan después de las heces contienen mas trypomastigotes metaciclicos que las heces. Se dice que la orina promueve la liberacidn de trypomastigotes de la pared del

del excremento del insecto en la piel al mismo tiempo de la toma de alimento y la invasión del hugsped vertebrado por trypomastigote metaciclicos completa el ciclo del parasito.

" recto y se sugiere que la union afecta la diferenciaci6n. El dep6sito

V A R I A C I O N A N T I G E N I C A E N T R Y P A N O S O M A S

El parasitismo involucra sútiles interacciones entre el huésped y el invasor, el cual tiene mds oportunidad de evolucionar. Estas interacciones son después altamente complejas y generalmente dependen de la diferenciación del pardsito durante su ciclo de vida. La variación antigénica es un aspecto de estas -relaciones, la cual permite al pardsito, escapar a las defensas del huésped.

La variación antigénica en la superficie del parásito al haberse aislado diferentes antígenos superficiales y al compararlas en su extremo amino terminal fué parcialmente determinada.

. ..

Estudios a nivel molecular en la variaci6n' antigénica han mostrado varias características interesantes; los genes que expresan los antígenos estan localizados en telomeros, conteniendo genes VSG (variantes de glicoproteinas de superficie) , pero solo un telomero es activado. La razon de esto y la naturaleza de el mecanismo de activación es todavía oscuro, pero puede que esten relacionadas con la existencia de un sistema de modificaci6n de DNA, que distingue telomeros activados de inactivados, es posible que una DNA polimerasa particular sea capaz de unir secuencias telomericas, requeridas para

-1

4

i

transcribir genes VSG. Por otra parte,. esta conversi6n génica puede ser usada como un medio regulado para transferir medios VSG a un sitio telomerico activo; permitiendo al vasto repertorio de genes VSG puedan expresarse.

La Conversión genica parcial puede darse en en telomeros activos, esto entonces transforma el gen residente en uno nuevo. entonces en algunos ocasiones tales genes recombinantes pueden permanecer en el gena, este mecanismo participa en la evoluci6n de genes VSG.

A N T I G E N O S D E S U P E R F I C I E D E TRYFAXOSOMACRUZI.

Las membranas celulares de este parbsito, permiten el mantenimiento en el balance de los iones y transporte de nutrientes, junto con estas propiedades; la membrana del pardsito T cruzi es capaz de resistir el ambiente hostil del intestino del triatominos, llevan receptores que les permiten unirse a la celula huésped y penetrar, y son capaces de resistir o evadir la respuesta inmune del huésped. En la membrana se refleja sensibilidad diferencial a la lisis celular mediada por complemento, diferencias de carga, después de unirse a la lectina.

Las diferencias antigenicas entre cepas de T.cruzi han sido asociadas con glicoproteína de superficie celular.

Los carbohidratos han sido detectados en la superficie de todos lod estadios de T. cruzi, y por lo tanto parecen que estan implicados en la unión, en la penetración del huésped, protecci6n del pardsito a la fagocitosis y el control de diferenciación morfologica.

Un glicolípido complejo Lipopeptidofosfoglicano (LPPG) fué aislado de epimastigotes junto con tres glicoproteínas (GP37, GP31, y GP241, formando un complejo localizado en la superficie celular de los parásitos los cuales pueden ser localizados por marcaje.

La superficie celular de el parásito es el punto de contacto entre el pardsito y el huésped pero solo información preliminar se dispone de la estructura y la función de algunos glicoconjugados, principalmente involucrada en la relación huésped-parbsito.

D I A G N O S T I C O

El reconocimiento de la tripanosomiasis americana como una enfermedad humana por Carlos Chagas en Brasil en 1909, fué reconocida despues de varias decadas debido a la a la dificultad en el diagnostico específico

Este es dificil por la escases de pardsitos en las pernas infectadas, por la baja presencia de mas seaales clinicas, por su carencia de especificidad. En algunas dreas, la tripanosomiasis es ocasionalmente vista como una enfermedad exótica y su etiología puede no ser reconocida.

5

Examenes parasitologicos mas apropiados para la detectar y enfocar a grupos de poblaciones con infecciones de alto riesgo en fase inicial como son los bebes de madres seropositiva, en gente que recibe transfusión sanguinea, e infantes que habitan casas infestadas con triatominos aún no se han logrado.

El diagnostico se divide en dos tipos: El directo y el indirecto, en el directo encontramos al hemocultivo, xenodiagnostico y PCR; en el indirecto se encuentra el serodiagnostico.

Los métodos para el diagnostico directo de la enfermedad se basan en la detección del pardsito (xenodiagnostico y hemocultivo) , en la detección de antígenos circulantes, 6 mas común en la detección de anticuerpos contra el parásito en el suero de pacientes son altamente específicos pero son relativamente ineficientes con resultados muchas veces negativos debido a la cantidad tan baja.

En recientes años, la tecnología del DNA recombinante ha proporcionado un nuevo acercamiento al diagnostico inmunólogico de la enfermedad Chagas . Varios genes de T.cruzi han sido donados, y algunos de ellos ensayados para su uso en el diagnostico como Affrachino y Zingales.

El Diagnostico definitivo para la infeccidn de T. cruzi , como otras infecciones, requiere la demostraci6n de que el pardsito se encuentra en los individuos sospechosos de que portan a T. cruzi. Los pardsitos pueden ser encontrados en la sangre por inspección micrdscopica durante el estado agudo de la infeccidn, pero es muy dificil demostrar su presencia en el estado cr6nico.

Durante la fase invasiva aguda de infeccidn, los pacientes parasitados presentan una caracteristica constante y el diagnostico parasitologico puede ser logrado por examenes sanguine0 directo con tecnicas de hemoconcentraci6n simple, pero debido a la cantidad tan baja de parásitos la detección se hace muy dificil, durante la fase crdnica de infección, la parasitemia es detectada por xenodiagnostico solamente en la mitad de los pacientes. La eficiencia de la quimioterapia restringe a la primera fase de infección y consecuentemente depende de del diagnostico parasitólogico inicial.

Actualmente el exbmén diagnóstico m6s utilizado es el xenodiagnóstico, y es solo un examen parasitólogico para detectar la fase crónica de la infección, fué introducida por Brumpt en 1914, y consiste en alimentar triatominos con sangre de pacientes chagasicos, con esto se permite mantener el cardcter permanente de la infección, esto ayuda a monitorear pacientes chagasicos. Se alimentan de 14 a 20 ninfas del insecto por 3 dias consecutivos y se examinan sus heces una vez al mes en un período de tres meses, por este procedimiento el xenodiagnostico es positivo en mas de 67% de pacientes crónicos.

Los examenes parasitdlogicos apropiados para detectar y enfocar a grupos de poblaciones con infecciones de alto riesgo en fase inicial como son los bebes de madres seropositivas, en gente que recibe transfusión sanguínea, e infantes que habitan casas infectadas con triatominos aún no se ha logrado.

O B J E T I V O

Caracterización y aislamiento de una clona de cDNA de T. cruzi

Para abordar el objetivo general, se proponen los siguientes objetivos particulares:

1) Obtenere el producto de expresión de la clona.

2 ) Caracterizar mediante m6todos inmunologicos el producto de expresidn.

.. . . ". . . . ..

M E T O D g L O G I A

Se realizaron tamizados de bibliotecas de expresión con anticuerpos antiamastigote.

A i s l a m i e n t o d e p l a s m i d 0

A 25 ml de medio Luria (triptona log, extracto de levadura 5g, NaCl 59, glucosa 2g), Ampicilina (50 mg/ml), se inoculo la bacteria Y1090 de la bacteria Escherichia c o l i , que portaba el vector gtll con el inserto cl-1, se dejo crecer toda la noche a 37'C.

Se paso el medio de cultivo a u ~ i tubo de centrifugación corex y se procedio a centrifugar 10 min a 8,000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-SB.

Se resuspendió la pastilla en 1 . 5 m1 de TE-Sacarosa (Tris HCL 25mp.I pH 8 . 0 , EDTA lOmM pH 8 . 0 , Sacarosa 50mM) se agitó con vortex, eliminando sobrenadante.

Se adicionó una pizca de lisDzima y se incubo a temperatura ambiente por 15 min, después el tuba fu6 colocado en hielo 5 min.

Luego se adicionó 3ml de O .2M hidróxido de sodio/l% dodecil sulfato de sodio (NaOH/l% SDS); se incubó en hielo 15 minutos.

Se adicionó 2 - 2 5 ml de acetato de potasio 3M pH 4 . O y se mezclo por inversibn, se procedio a incubar en hielo 15 min. Se centrifugo durante 30 minutos a 12,OOOrpm a 4°C.

Se transfirió el sobrenadante en otro tubo de crntrifuga corex y se adicion6 3ml de isopropanol, se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente, despugs - .se centrifugó durante 15 minutos. a 1 2 , OOOrpm.

La pastilla fué resuspendida er, 270 m1 de a N a estéril, solución amortiguadora RNAasa, 1/J 1 de RNAasa (1Omg/ml) se transfirio a tubo eppendorf .

Se incubo lhora a 37"C,

E x t r a c c i ó n

Al tubo eppendorf se adicionó 300 pi de fenol; se centrifugo durante 1 minuto a 14,000 rpm.

Se guardo el sobrenadante y se adicionó 300 p l de clorofonno, se centrífugo durante 1 minuto a 14,000 rpm.

fenol y cloroformo. Se volvio a obtener el sobrenadante y se repite la adición de

P u r i f i c a c i ó n

Se corto una gas de 2 ' x 1' y se doblo 3 veces. Se retiró el embolo de una jeringa de 3 C.C. y se introdujo la gasa

en la jeringa con una pipeta Pasteur y a la vez en un tubo de 15 ml.

La jeringa fué llenada con sefarosa (GSO-80) hasta la marca 3 C.C.

Se centrifugo el tubo con la jeringa en una centrifuga Beckman Accu-Spin por 2 minutos a 1700 qm.

Se repitió la centrifugación en otro tubo limpio, lavandolo con TE pH 8 . 0 (tris HC1 25mM, EDTA l O m M ) , 2 veces.

La capa obtenida en la extracción se pasa a través de la jeringa introducida a la vez en un tubi limpio, cuidando que el pldsmido cayera en el centro de la columna.

Se centrífugo 2 minutos a 1,700 rpm. se obtuvo 50 pl de pldsmido purificado.

Se digirieron 0.5 pl de plásmido pMal en el volumen de 20 ml de disolucidn conteniendo la enzima de restricción Eco RI, después se sometieron a digestión diferencial en la misma enzima ; 20 pg de DNA de la clona gtll pero el volumen fu6 de 200 pl.

La digestión se verifico separando en geles de agarosa al 1%; 4 p1 de la reacción pMal y 15 pl de la reacci6n durante 1 hora a 100 volts.

La separacidn se evidenció al sumergir el gel en solucidn de' '

bromuro de Etidio (Img/ml) y despu6s se expuso en lampara U . V . de onda larga.

Una vez realizado todo esto, los fragmentos de restricción fueron extraídos con la utilización del equipo.Gen clean.

Para esto, el gen de agarosa conteniendo el fragmento de restricci6n elegido fue cortado con una cuchilla y fur5 transferido a un tubo eppendorf.

Se adicionarón 2.5 a 3 volumenes de solución de yoduro de sodio

Se agregó glassmilk y se agítd con vortex durante 5 segundos.

El sobrenadante fue transferido a otro tubo eppendorf, la pastilla

4M.

se lavo durante tres ocasiones con 200 p l de New frio.

Se adicionaron volumenes iguales de fenol, se centrífugo pasando la fase inferior a otro tubo eppendorf limpio, y se repitio el mismo procedimiento pero ahora con cloroformo.

A un volumen de ambas digestiones se les adicionaron 9 partes de acetato de sodio 3M; se mezclaron y se añadio un volumen igual de

9

isopropanol, luego fueron incubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Posteriormente se resuspendio cada muestra en 25 m1 de tris HC1 1OmM; EDTA 1mM a pH 8 . 0 .

Se mezclo :

2 pl del vector digerido 6 p1 del inserto digerido

Adicionando 10 pl de agua y se incubo la mezcla a 65°C durante 5 minutos.

Se coloco en hielo y se adicionaron: 2 p l de solucidn amotiguadora de ligasa 0 . 5 pl de ligasa T4.

Se incubo toda la noche

T r a n s f o r m a c i ó n

Se realizó este procedimiento en la cepa DH%de Escherichia coli.

En 100 pl de medio conteniendo celulas DH54 , se agregd 1 pl de pMal, colocandose en hielo por 20 minutos y se incubo a 37°C durante 5 minutos, se coloco en tubo eppendorf.

Se le añadio 1 m l de medio LB (luria) sin penicilina y se mezclo por inversión .

Después se incubaron durante 35 a 40 minutos a 37"C, se centrifugo por 1 minuto a 3,000 rpm y el sobrenadante se descarto por decantación, la pastilla fué resuspendida y se colocaron 500- p1 de ésta en cajas petri conteniendo medio de cultivo LB.

Se prepararon 100 pl de isopropil tiogalactosida (IPTG) 10 mM y 40 pl de Xgal al 10%.

Se colocaron 100 p l de IPTG a una caja petri que contenia medio LB, se dejo secar.

Posteriormente se agregaron 40 p1 de Xgal.

A la caja petri que tenia las celulas transformadas; se les puso una membrana de nitrocelulosa, la cual fue transferida a la caja petri con IPTG y Xgal.

Se incubo a 37°C durante toda la noche.

Se seleccionaron las colonias blancas y fueron crecidas en O - 2 ml de medio LB y ampicilina, durante 2 horas.

10

""̂

200 p l de éste medio fueron centrífugados durante 2 minutos a.3000 rpm, se descarto el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 50 , p l de solución amortiguadora de muestra conteniendo Tris HC1 pH 6 . 8 50 M; dithiotreitol 10 mM; SDS 10%; azúl de bromofenol 2 % ; y glicerol 10%.

Se coloco en baño Maria durante 5 minutos, y se corrio en gel de poliacrilamida con SDS al 10%.

Después se adiciono IPTG 0.:3 mM al cultivo, incubandose a 37°C durante 2 horas.

Se tomaron 200 pl de muestra y se repitió el procedimiento.

Con éste método se determinó peso molecular, el cual deberia aproximarse a 50.843.

La colonia seleccionada, la cual se denominó pMai-Cl1, se creció en 1 litro de medio LB con ampiculina Durante toda la noche.

El contenido celular se determinó por turbidez, para esto se crecieron las celulas hasta llegar a una absorbancia de O - 5 UD0 que correspondía a 2x10 celulas/ml; en un espectofotometro.

Entonces se adicionó 0.3 mM de IPTG.

Se centrifugo 14,000 rpm durante 20 minutos y se descarto el sobrenadante.

Se resuspendieron las celulas en 50 m l de solución amortiguadora de columna que contenia: Tris HC1 20 mM; NaCl 200 mM; EDTA ImM. Se incubaron en un bafio con etanol frio.

Las celulas se sometieron a sonicación en cortos pulsos de I.5 segundos hasta que la muestra dejo de estar espesa, se guardo una alicuota para determinar si existia proteína.

Se centrífugo a 8000 rpm durante 30 minutos.

El sobrenadante fué colectado y se obtuvo una alicuota.

A 50 m1 del sobrenadante, se agregaron 150 m1 de solución amortiguadora de columna y se coloco resina de amilosa en una columna de 7 . 5 cm x 10 cm.

. . - - _. .

Se lavo y se equilibro la columna con 8 volumenes de solución amortiguadora de columna, y se agregó el sobrenadante , se dejaron pasar 10 minutos,ó hasta que pase toda la muestra.

La proteína de fusión se eiuyo con 50 m1 de solución amortiguadora de columna y 10 mM de maltosa, se colectaron los eluidos a un flujo de 10 gotas por tubo, detectandose el contenido. de proteínas con espectofotometro a 280 nm.

11

.A

Se separaron las muestras de cada tubo en electroforesis preparativo; donde se detectaba banda era extraido el gel con una cuchilla, para su posterior electroeluci6n.

E l e c t r o e l u c i Ó n

A la c6mara de electroelución, se le agrego solución amortiguadota de corrida y muestra.

Se aplico un voltaje de 20 volts durante 5 horas; se extrajo la muestra cuidadosamente y se separo una alicuota por el mStodo de electroforesis de poliacrilamida al 10%.

Posteriormente, se realizó la inmunotransferencia con la proteína, obtenida en la electroelución, durante 2 horas a 40 volts en solución amortiguadora de transferencia que contenia fosfato monobdsico O . 2 M y fosfato dibdsico 0.2 M.

Se corto el papel de nitrocelulosa en tiras delgadas.

Se incubaron tres tiras en TBST leche conteniendo Tris HC1 10 mM pH 8 . 0 ; NaCl 150 mM; Twen 20 O -05% y leche descremada al 1%. Durante 3 0 minutos, para bloquear.

Se lavo tres vecescon TBST a intervalos de 5 minutos .

Se agrego anticuerpo contra la proteína recombinante electroeluida. y TBST leche durante 2 horas.

Se lav6 3 veces con TBST a intervalos de 5 minutos . Se agregaron anticuerpo IgG Conejo con 5 ml de TBST-leche durante

1 hora.

Se lavo 3 veces con TBST a intervalo de 5 min.

Se agrego solución reveladora que contenía 60 p l de nitro azúl de tetrazoluim/sustrato (NBT) y 3 3 p l de 5bromo-4-Cloro-3indolfosfato 500 m g / m l en dimetilformamida (BCIP50), Así de este modo verificamos si existía reconocimiento.

P r o d u c c i 6 n d e a n t i c u e r p o s

Con la proteína recombinante se inmunizaron 2 ratones, despues de dos semanas se verifico titulo de anticuerpo con tiras anteriores.

Con el mismo método pero con la variante del primer anticuerpo que fué suero de ratón, el cual se obtuvo por sangrado y posterior centrifugación a 3,000 rpm durante 10 minutos.

Se hizo inmunotransferencia con estadios: amastigotes, trypomastigote y epimastigote para verificar si existía reconocimiento.

Tiras de inmunotransferencia con proteína recombinante y estadios de T. cruzi fueron expuestas a sueros chag6sicos.

12

. . .. . . ,

R E S U L T A D O S

FIG. 1

PATRON ELECTROFORETICO DE DIGESTION DE Pmal CON Eco RI.

En la figura 1 se muestra el patr6n electrofóretico obtenido de las digestiones con Eco-RI. ; separados en gel de agarosa (1%) y localizada con bromuro de etidio; de donde se determind que pMal tuvo

z un peso aproximado de 6,646 KDa y el inserto C1-1 de 1 ,800 KDa.

13

"""

FIG. 2

ELECTROFORESIS DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA SELECCIONAR LA COLONIA QUE PORTA EL INSERTO.

200,000-

11 6,250- 97 , 400-

36,200-

Muestras crecidas en O .2 m1 de LB con penicilina 2hOras y posterior adición de IPTG. Cada carril tiene proteina recombinante expresada de varias colonias blancas obtenidas

de W,bbb m a . Se seleccionó la m6s idonea, la cu61 debe tener un peso aproximado

La colonia seleccionada es señalada con una flecha. t

FIG. 3

ELECTROF&¿ESIS DE GELES DE POLIACRILAMIDA. PARA EVIDENCIAR LA PROTEQNA DESPUÉS DE LA SONICACIÁN

Carril 5 4 3 2 1

20,000

11 S, ?.Sr? 97,400

66,200

45,000

L I

Muestras corridas en gel de poliacrilamida al 10%.

Carril 1 Marcadores de peso molecular Carril 2 Pastilla de sonicación 1' centrifugación Carril 3 Sobrenadante de la sonicación Carril 4 Pastilla de sonicación 2' centrifugación Carril 5 Sobrenadante de la sonicación

En esta figura se mubstra productos de sonicación, con esto se determin6 la expresión de la proteína recombinante

15

.,. . *."""_ , .

FG. 4

ELECTR~FORESIS DE GELES DE POLIACRILAMIDA PARA OBTENER LA PROTE~NA ELUIDA.

Muestras corridas en gel de poliacrilamida al 10% de tubos colectados después de la elución.

En este gel los carriles Jienen diferentes tubos eluidos obtenidos de elucih, los cuales contenian 1 0 gotas

Se muestra el patrón de separación en gel de poliacrilamida de muestras eluidas, en donde se observa en el carril 7, el grado de pureza de la proteína recombinante producida.

16

I- "".~""-.. 1.

INMUNOTRANSFERENCIA

Suero preinmune

FIG 5

CON PROTEINA RECOMBINANTE.

Suero

inmune

Una vez determinada la pureza, se re:.:alizó una prueba de imunoreactividad; como se muestra en la figura 5. Los anticuerpos policlonales producidos contra ella, si la reconoc-2n antigénicamente

FIG 6

INMUNOTRANSFERENCIA CON PROTEbNA

6a

Carril 2 3 4 5 r

Preinrnune 1 : l O O 1 :SOO 1:lOO 6 : 5 0 0 lnrnlmizacion la 2

RECOMBINANTE Y SUERO INMUNE.

6b

Carril

I

Preinmune 1 : 1 O G J : S 0 0 1 : 100 I:Sob lnmunizacion 1 t

Al establecer que hubo .reconocimiento, se estableció el título de anticuerpos producidos, como se muestra en 6a en el suero de ratón , no hubo reconocimiento de la proteína recombinante, en tanto en la figura 6b , en los carriles 4 y 5 se muestra que el ratón 2, produjo anticuerpos capaces de reconocer la proteína recombinante en dilución 1:500.

18

"....- "". _.

FIG 7

. - --2YSFERENCIA CON ESTADIO AMASTIGOTE CON SUERO SANGUINE0 DE RATON

. - . . rpos contra la proteina recombinante fueron probados en la . .. .. ~ ,ad50 amastigote, y cow se observa -en la figura;. el m e r o

. . . . "- . . m a proteína e.xpresada en este estadio

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c - - : ?

F r r - *

. .

. .-

., I

FIG 8

INMUNOTRANSPERENCIA CON LOS TRES ESTADWS, AMASTIGOTE TRIPOMASTIGOTE, EPIMASTIGOTE Y IzxTRAcTo TOTAL DE T . C = Z i . '

Carril c

L

.r-, . .

1 2 3 4

Tambidn se probd con otros estadios, como se observa en la fig, el anticuerpo producido reconoce una proteina en los estadios del ciclo de vida de T.cruzi.

, Carril 1 epimastigote Carril 2 tripomastigote Carril 3 amastigote Carril 4 extracto total

d

, .

FIG 9 -. INMUNOTRANSFERENCIA CON SUEROS DE PACIENTES CHACASICOS Y

-:

i PROTEINA RECOMBfNANTE ". I

Suero -Sueral Suero 2 Suero 3 Suero 4 normal

Se prob6 tambihn con sueros de pacientes chaghsicos, se observa como recombinante fue reconocida por sueros chaghicos.

Se observa tahbiQn que no hay reconocimiento en suero normal (tira 1)

- "

c

D I S C U S I O N

La enfermedad Chagas presenta una gran variedad de caracterfstica clinicas. Se ha observado que existe relaci6n entre la localización

tipos de cepas. .- geogrdfica y sintomatología; esto se debe a la presencia de diversos

. .

Vera B. y col. han descubierto que diferentes cepas de Trypaposm

El hallazgo de autores como Vergara Bangertz y col, y de este estudio se ha podido evidenciar la posibilidad de detectar anticuerpos contra proteínas recombinantes de T. cruzi usando t6cnicas de DNA recombinante, la cual ha demostrado ser una herramienta útil y segura en la respuesta inmune de la infección de T. cruzi.

cruzi muestran composici6n antig6nica distintitiva.

Utilizando sistemas de donación altamente eficaces, se logro subclonar el segmento de DNA C1-1 en el sistema gal, el cual ya habia sido usado por Del Giudice, el cual se pudo comprobar por cortes de enzimas de restricción (fig 1).

La caracterización de antígenos de T. cruzi reconocidos por la respuesta inmune durante los estadios cr6nico 6 agudo, es un importante paso para entender la enfermedad Chagas.

La busqueda inmun6logica usada en este trabajo, nos permitid identificar una clona recombinante que codifica para antigenos de T. cruzi, La cual fue reconocida por el pardsito durante sus tres -

. I estadios de vida. (fig 8 ) . El trabajo trató de aislar y caracterizar una secuencia de DNA de

T. cruzi que por pruebas de hibridación pudieron ser evidenciadas.

La proteína recombinante pudo evidenciarse por su peso molecular ( 70,cccQa) obtenido (fig 2).

I

Estos resultados sugieren que esta proteina recombinante es un antígeno, que puede ser inmunodominante. Con la producción de anticuerpos policlonales se indicó que alguna proporción de la respuesta inmune a la infección de T. cruzi es dirigida contra epitopes en algún dominio del antígeno clonado (fig 9 ) .

Se sabe que T. cruzi es altamente polimorfico, por lo tanto, es posible la existencia de diferencias en la reaccidn antígeno- anticuerpo que puede ser debido a variaciones en el pardsito ó clonas que lleguen a infectar a diferentes pacientes.

Se podría suponer la existencia de regulacien gengtica de la respuesta inmune a la repetición del epitope de los antígenos de T.Cruzi, similar a la restricción en la producci6n de anticuerpos contra el epitope repetitivo sintético de la proteína que ya fu6

2 1

I - " - hecha en el parasito Plasmodium falciparum por Vergara y col; el cual esta bajo control de genes I

Si se lograra comprobar ésta regulaci6n gengtica de la respuesta inmunjlogica en T. cruzi, entonces se podría explicar el que algunos individuos respondan bien a antigenos particulares, y otros no.

Podriamos sugerir que la clona C1-1 codifico para un polipéptido recdinante reconocido por anticuerpos de la clase IgM e IgG, presentes en sueros chagdsicos. Se sabe que el perfil serologic0 en la fase aguda se representa como una respuesta inmune primaria cldsica (Lelchutk y col; e Israelski y col). La respuesta IgM aparece inicialmente en la enfermedad Chagas en fase aguda y puede ser usada en la detección de transmisión congdnita.

Nuestros resultados muestran que los pacientes chagdsicos montan una respuesta inmune humoral a C1-1 útil para el diagnóstico.

En este trabajo se trató de demostrar que es posible producir o aislar una proteína recombinante con epitope inmunodominante en diversos estadios.

C O N C L U S I O N

En el diagnostico de enfermedades parasitarias la tecnica del DNA recombinante, Ha sido uti1 por su grado de reproductividad y certeza.

Los resulatados obtenidos sugieren que el anigeno C1-1 podría se usado en el serodiagn6stico de la enfermedad Chagas.

Debido a la especificidad de proteínas recombinantes como antigenos, en pruebas ser6logicas, éste rn6todo de diagnostico podría aplicarse en: 1) Estudios epidemiologicos, en Pacientes Chagasicos en fase cr6nica

Y aguda; 2 ) En estudios epidemiologicos, en animales infectados y en insectos;

3 ) En vigilania de muestras sanguíneas, provenientes de bancos de sangre de donde se sospeche contaminacidn de T. cruzi;

4 ) Y en muestras ciínicas

-

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B I B L I O G R A F I A

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