Abstracto. Aunque existen numerosos métodos para la determinación cuantitativa de antioxidante vitaminas: C, E y A, no existen métodos favorables para el entendido ampliamente analítica la práctica - que tienen varias fallas y limitaciones o requieren aparatos caros. Modificaciones tanto, hemos elaborado de métodos espectrofotométricos valiosos para la determinación cada una de estas vitaminas, que en un principio no se podrían aplicar para el laboratorio la práctica de diversos aspectos. Se basan en: la vitamina C - reacción de color con forma periódica fosfotungstato reactivo preparado; para la vitamina E - reacción de color con batophenanthroline,FeCl3  y H3PO4 ; para la vitamina A - medición espectrofotométrica de extractos de probado muestras. Pruebas de control mostraron corrección completa de los parámetros analíticos obtenidos con esas modificaciones con preservación de ventajas de los métodos originales. Por lo tanto, se pueden implementar con éxito a los análisis clínicos de rutina. El elaborado modificaciones también se pueden utilizar para la determinación de los A / m vitaminas en los productos alimenticios, para ejemplo: en los zumos, leche y homogeneizados o extractos de alimentos sólidos. Palabras clave: vitaminas antioxidantes, espectrofotometría, alimentos, muestras biológicas

INTRODUCCIÓN

En ciencias de la nutrición y la medicina, hay mucho interés en los análisis de las vitaminas C, E y A, ya que, además de tener actividad de la vitamina, también se caracterizan por antioxidante de acción y por lo tanto se definen como vitaminas antioxidantes. Al neutralizar especies reactivas de oxígeno y radicales libres de oxígeno en el organismo, estas vitaminas juegan * El trabajo parcialmente presentado en la Conferencia Científica realizó en la Academia de Agricultura en Poznań, Facultad de Ciencias de la Alimentación y Nutrición (29-30.01.2007): "Los antioxidantes naturales – desde materia prima para el organismo ". El estudio ha sido apoyado por la Universidad de Medicina otorga No 502-17-019 y 502-17-552. Un papel significativo en la prevención de numerosas enfermedades degenerativas metabólicas [Przeciwutleniacze ..2007]. Como la comida es la principal fuente de las vitaminas para los seres humanos, la determinación de su contenido en los alimentos parece ser un elemento importante de nutritiva Evaluación valor de esos productos [Kompendium ... 2006]. Las pruebas clínicas que se realizan en el material biológico recogido de pacientes son igualmente importantes, porque ellos permitirá reconocer la deficiencia de las vitaminas y de introducir algunos cambios en el la dieta y / o aplicar la suplementación con preparados vitamínicos farmacéuticas cotidiana. Sin embargo, la realización de determinaciones de vitaminas antioxidantes es una difícil analítica tarea. Esto es en gran parte debido a la inestabilidad de estos compuestos que son susceptibles a la atmosférica oxígeno y otros agentes oxidantes, así como al calor, la luz, el pH alto y bajo valores, y la presencia de iones de metales transitorios [Kołodziejczyk 2004]. La elección apropiada métodos analíticos que sería lo suficientemente sensible, precisa, selectiva, y al mismo tiempo no excesivamente tiempo y el trabajo que consume, siendo también ajustado a

pequeña volumen de la muestra, disponibles para el análisis de rutina y financieramente asequible (costo del aparato y los reactivos) también pueden ser molestos. Aunque numerosos métodos para la determinación de vitaminas C, E y A están disponibles: titrometric o - en la actualidad usa más frecuentemente

- Instrumental: electroquímica, fluorométrico, espectrofotometría y cromatografía de [Moszczyński y PYC 1999], aún se vean abrumados con varios defectos y limitaciones. Informes con frecuencia no pueden describir importantes detalles metodológicos, lo que puede obligar a interpretaciones individuales propias e inhiben la implementación exitosa de los métodos en la práctica analítica.

Los autores elaboraron previamente sus propias modificaciones de algunas espectrofotométrico conocida métodos para la determinación de: vitamina C - acc. a Kyaw [1978], la vitamina E - Acc. a Tsen [1961] y la vitamina A - acc. a Bessey et al. [1946]. Estos métodos a pesar que son selectivos, rápido y fácil de realizar, así como la aplicable a la semimicro pruebas de escala y barato, no son adecuados para su aplicación general, debido a las razonesdado en la Discusión. Introducción de complementos, correcciones y cambios a esos métodos han llevado a subir de modificaciones, conveniente para el sentido amplio la práctica analítica.

Aunque las modificaciones anteriores se han desarrollado para la determinación de antioxidante vitaminas en la sangre, también se han aplicado para los ensayos en otra biológica muestras incluyendo el jugo gástrico altamente ácido y también tejidos [por ejemplo, Rutkowski et al. 1,999, 2,002]. Los autores desean proponer la posibilidad de aplicación de estas modificaciones en análisis de alimentos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Material

Comestible líquido o biológica, homogeneizado (o extracto) de una muestra de alimento o tejido.

Equipos

Una centrífuga y, dependiendo de la vitamina determinado: un agitador de tubos de ensayo, un agua baño, una nm lámpara UV 250-300, un espectrofotómetro VIS o UV, de vidrio o de cuarzo cubetas 1-1,5 ml. Las modificaciones de métodos espectrofotométricos ...

Reactivos

Determinación de la vitamina C: reactivo fosfotungstato (PR) - elaborado periódicamente, como se le agota (suspensión de 150 g de tungstato sódico-molibdeno libre y 60 g sodio anhidro hidrógeno fosfato en 240 ml desionizada (DI), mezclar con calefacción para disolver y añadir lentamente 145 ml de ácido sulfúrico 3,7 M (VI); calentar la solución para 2 hora con condensador de reflujo

no permitiendo que la ebullición; después de enfriar la solución de abajo, ajustar el pH a 1,0 añadiendo gota a gota ácido sulfúrico concentrado (VI) - El reactivo debe ser luz de color amarillo verdoso, uno más oscuro es inútil); 56,8 M de vitamina C (ácido L-ascórbico) solución estándar hecha con solución mM uso 50 de ácido oxálico como disolvente.

Determinación de la vitamina E: etanol anhidro; xileno (mezcla de isómeros); 6.02 solución mM de batophenanthroline * solución (estable durante tres semanas en un frigorífico), 0,98 mM de cloruro de hierro anhidro (III) (estable durante una semana en un refrigerador) y una solución de 40 mM de ácido ortofosfórico cristalino - todo en etanol anhidro; 23.2 M

estándar solución de vitamina E (como sustancia de Trolox *

 - En agua DI, o como α-tocoferol - en anhidroetanol). Determinación de la vitamina A: xileno (a / a); Solución de hidróxido de potasio 1 M en Etanol 90%. Realización de determinaciones Analizar muestras frescas, trabajando en el stand protegidos contra la lluvia directa ligero.

Determinación de la vitamina C [Rutkowski et al. 1998]:

- Medida 1 ml del líquido analizado en el tubo de ensayo de centrífuga, añadir 1 ml de la PR, mezclar bien y dejar en una temperatura ambiente durante 30 minutos

- Centrifugar el tubo (7.000 × g, 10 minutos), y recoger la totalidad de los separados sobrenadante con una pipeta - el sobrenadante es una muestra de ensayo espectrofotométrico para mediciones

- Preparar la muestra estándar como anteriormente (usando 1 ml de la solución estándar en vez del líquido analizado), sin centrifugación

- Medir la absorbancia de la Ax muestra de ensayo y de la muestra patrón Como en 700 nm en contra de la mezcla de PR: solución 50 mM de ácido oxálico = 1: 1 (v / v) como referencia muestra Concentración calcular cx de vitamina C (M) en el líquido analizado, utilizando el fórmula:

* Batophenanthroline es un nombre coloquial comúnmente usado para 4,7-difenil-1,10-fenantrolina. Trolox es un análogo sintético soluble, el agua de la vitamina E (precisamente de α-tocoferol – se se forma predominante), constituyendo el 6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethylchromano-2-carboxílico ácido.

Determinación de la vitamina E [Rutkowski et al. 2,005]:

- Medida de 0,5 ml del fluido analizado en el tubo de ensayo I (centrífuga) con un apretado tapón, añadir 0,5 ml de etanol anhidro y agitar vigorosamente la prueba enchufado tubo durante 1 minuto

- Añadir 3 ml de xileno, conecte el tubo de ensayo y agitar vigorosamente durante otro 1 minuto

- Centrifugar el tubo para separar el extracto (1.500 × g, 10 minutos); simultáneamente medir 0,25 ml de solución de batophenanthroline en un tubo de ensayo habitual II

- Recoger 1,5 ml del extracto (capa superior), traslado al tubo de ensayo II y mezclar el contenido

- Añadir 0,25 ml de FeCl3  solución al tubo de ensayo II, mezcla, añadir 0,25 ml de solución de H3PO4 y mezclar de nuevo - de esta manera una muestra de ensayo se obtiene para espectrofotométrico mediciones

- Preparar la muestra estándar (0,5 ml de la solución estándar en lugar de lo analizado líquido): usando Trolox - preparar como muestra de ensayo, utilizando α-tocoferol – añada 0,5 ml de agua DI en lugar de etanol anhidro al inicio del análisis; no centrifugar esta muestra

- Medida de absorbancia de la Ax muestra de ensayo y de la muestra patrón Como al 539 nm frente al ensayo en blanco (preparación - como muestra de ensayo, pero utilizando agua en vez del líquido analizado)

- Calcular la concentración cx de la vitamina E (M) en el líquido analizado, utilizando la a / a fórmula presentada.

Determinación de la vitamina A [Rutkowski et al. 2,006]:

- Medida 1 ml de líquido analizados para el tubo de ensayo I (centrífuga) con un apretado tapón y añadir 1 ml de la solución de KOH, conecte el tubo y agitar vigorosamente durante 1 minuto

- Calentar el tubo en un baño de agua (60 ° C, 20 minutos), y luego enfriarlo con agua fría

- Añadir 1 ml de xileno, conecte el tubo y agitar de nuevo vigorosamente durante 1 minuto

- Centrifugar el tubo (1.500 × g, 10 minutos), recoger la totalidad del extracto separado (capa superior) y la transfiere al tubo de ensayo II de vidrio "suave" (de sodio)

- Medir la absorbancia A1 del extracto obtenido a 335 nm frente xileno

- Irradiar el extracto en el tubo de ensayo II a la luz UV durante 30 minutos, luego medir la absorbancia A2

- Calcular la cx concentración de vitamina A (M) en el líquido analizado, utilizando el fórmula: cx = (A1 - A2) · 22.23  dónde: 22,23 - multiplicador recibidos sobre la base del coeficiente de absorción de la solución de 1% de vitamina A (como la forma retinol) en xileno a 335 nm en un medidor cubeta sobre espesor = 1 cm. Las modificaciones de métodos espectrofotométricos...

RESULTADOS

Nuestro propio estudio sobre modificación de los métodos seleccionados para la determinación cuantitativa de vitaminas C, E y A, proporcionándoles la

utilidad para la práctica analítica, constaba de tres etapas que se presentan en detalle en la discusión.

En la primera etapa, manteniendo sin cambios las bases analíticas que fue ejecutado el - los equipos y de procedimiento modificaciones - como resultado de los requisitos de la rutina análisis '- en la realización de formas de determinaciones definidas en los métodos originales. Los resultado de esta etapa de las investigaciones era atribución a los métodos modificados de una técnicamente forma útil para la práctica analítica.

La segunda etapa del estudio incluyó modificaciones de las bases analíticas para particulares métodos con respecto a los resultados obtenidos en la primera etapa con el fin de evitar las lagunas existentes descriptivos, inconsistencias y defectos encontrados experimentalmente, así como para adaptar el método por el Tsen [1.961] que fue diseñado exclusivamente para la determinación de la vitamina E en soluciones - para la determinación en material biológico. Los resultados conjuntos de ambos la primera y segunda etapa se convirtió propias modificaciones de los métodos originales seleccionados, que el control de la corrección analítica fue sometido en la tercera etapa del estudio. Las pruebas de control se realizaron de acuerdo con el desempeño de las determinaciones en biológica líquidos. Una serie de soluciones estándar - en el suero bovino como un disolvente - de vitamina C y Se han usado formas solubles en agua de las vitaminas E y A. Serie individual incluido concentraciones dentro del rango fisiológico para esos vitaminas (M): para la vitamina C (como L- ácido ascórbico): 14.2, 28.4, 56.8, 85.2, 113.6, para la vitamina E (como sustancia Trolox) 5.8, 11.6, 23.2, 34.8, 46.4, para la vitamina A (en forma de complejo de acetato de retinol y cyclodextrane) 0,465, 0,93, 1,86, 2,79, 3,72.

Las soluciones estaban sujetos a los procedimientos de acuerdo con los algoritmos desarrollados de determinaciones y medidas de absorbancia finales produjeron conjuntos de puntos determinar curvas de análisis en la A, C sistema que se presenta en la Figura 1. Basado coordinan en las curvas que encontramos como sigue:

- Cumplimiento de la ley de Lambert-Beer dentro del rango especificado de las concentraciones con la linealidad total resultante de las curvas y de su paso por el punto 0

- Alta precisión de los métodos modificados que fue determinado por el logro de los coeficientes de curvas de correlación casi hasta 1

- Muy buena sensibilidad de todos los métodos (. Límite de detección de la aplicación 0.05 M) resultante a partir de grandes ángulos de inclinación de las curvas

- Ningún efecto de las proteínas de suero en la A / m curvas que sugiere su desnaturalización completa durante los trabajos de análisis y la falta de injerencia de otros reductores presente en el suero. Precisión adecuada de los métodos modificados fue confirmada por pruebas de recuperación, los valores

medios de los cuales se obtuvieron a partir de tres veces repetidas pruebas y sólo fueron ligeramente diferente a 100%. Además, se confirmó la alta precisión de los métodos por su repetibilidad y reproducibilidad. Los parámetros se ensayaron para 5 consecutivo día: concentraciones de vitaminas C, E y A en soluciones de suero almacenados a -80 ° C (nominales concentraciones: 51.3, 21.6, 1.34 m, respectivamente) se determinaron. Intra-serie coeficiente de variación fue estimado a partir de las concentraciones medias obtenidas cada día (n = 10) y osciló entre 0,7% a 3,2%. Coeficiente de Inter-serie de variación calculada basado en los medios diarios individuales (n = 5) fue incluso 4.3-5.2% .values de parámetros analíticos para las modificaciones desarrolladas de todos los métodos que se obtuvieron durante los estudios de validación discutidos anteriormente, se presentan en la Tabla 1. Los autores de los métodos originales no realizó estudios similares, cualquier comparativa análisis tanto, es imposible.

DISCUSIÓN

Para ser capaz de determinar las vitaminas A, E y C en el material biológico en una precisa, rápida y barato manera espectrofotometría fue elegido. A pesar de la disponibilidad de numerosos métodos instrumentales, espectrofotometría parece ser utilizado con mayor frecuencia en analítica laboratorios. Esto es debido a una buena precisión del método, la disponibilidad de espectrofotómetros como aparatos no muy caros y el uso de fácil acceso, ya que relativamente reactivos baratos. Como resultado, los métodos espectrofotométricos son ampliamente utilizados, entre otros en análisis de los alimentos para la determinación de muchos compuestos naturales, incluyendo vitaminas. Numerosos métodos espectrofotométricos permiten la determinación cuantitativa de la reducida forma de vitamina C (ácido L-ascórbico) o, así llamado, la vitamina C total - una suma de la reducida y forma oxidada (ácido dehidro-L-ascórbico). Un método popular usando 2,4- dinitrofenilhidrazina [Roe y Kuether 1.943] se utiliza para la determinación del total vitamina C. La método, sin embargo no es suficientemente preciso, sus resultados están exageradas debido a la presencia de ácido 2,3-dioxo-L-gulónico (metabolito biológicamente inactiva de la vitamina C) en las muestras analizadas, además de que también requiere de incubación de 3 horas a 37 ° C y adición de H2SO4 concentrado a las muestras. Otro método bien conocido que utiliza soluciones acuosas de 2,2'-bipiridilo, FeCl3 y H3PO4 [Sullivan y Clarke 1,955], permite determinaciones selectivos de la vitamina C reduce, pero se caracteriza por una baja sensibilidad, curso lento de la reacción (1 hora) y la turbidez de las muestras analizadas que requiere su centrifugación final. Varias adaptaciones espectrofotométricos de titulación los Tillmans ' método que utiliza 2,6-diclorofenolindofenol (por ejemplo [Omaye et al. 1979]) son igualmente aplicada. Son fáciles de realizar, pero no totalmente selectiva y requieren separada mediciones de absorbancia para el color resultante y después de su retirada. La vitamina E puede determinarse espectrofotométricamente con dos métodos populares relativa a la llamada, la vitamina E total que es una mezcla de cuatro tocoferoles y cuatro tocotrienoles. De acuerdo con el primero

[Emmerie y Engel 1.938] La vitamina E es ex M. Rutkowski, K. Grzegorczyk extrajeron con bencina de petróleo a partir de las muestras analizadas y los extractos se exponen a soluciones de etanol de 2,2'-bipiridilo y FeCl3. El color resultante permite la absorbancia medición, pero es inestable y dura sólo durante 30 segundos; selectividad y sensibilidad a la baja determinación, también. En el otro método [Hashim y Schuttringer 1966] esos inconvenientes se han evitado mediante la sustitución de 2,2-bipiridilo con batophenanthroline y la introducción de H3PO4  para aumentar la estabilidad del color. La extracción de la muestra con heptano también fue adoptado en este método. Una modificación posterior [Desai y Machlin 1985] se diferencia en las concentraciones y volumen de soluciones de reactivos e intercambia heptano como el agente de extracción para el xileno menos inflamable. Nuestros intentos de aplicar la Este último método demostró que el color resultante es demasiado oscuro, y las lecturas de absorbancia fluctuar dentro de la gama de ± 0,002. Inestabilidad marcada del color resultante que se encontró para la versión modificada, hace resultados fiables imposible de obtener. Hay dos métodos espectrofotométricos conocidos para determinación de vitamina A que se utilizan para los extractos. El más ampliamente utilizado [Carr y Price 1926] se basa en el uso de la solución SbCl3 en cloroformo actuación sobre el extracto a base de cloroformo del la vitamina A. El método se caracteriza por una alta sensibilidad, sino también por carotenoide interferencia (correcciones analíticas son obligatorios) con el color que resulta extremadamente inestable (aprox. 10 segundos). Por otra parte, SbCl3  es susceptible de trazas de humedad y muestra propiedades corrosivas. La vitamina A también se puede determinar utilizando el método de medición espectrofotométrica directa en UV [Parrish 1977]. La muestra de ensayo mezclado con etanol y solución acuosa de KOH se calienta bajo nitrógeno hasta que se hierve durante 30 minutos para la desproteinización y la hidrólisis de los ésteres de vitamina A (retinol) principalmente acetato, para sus máximos de absorción son diferentes de las del retinol libre en UV. Los hidrolizado se extrae con éter etílico, se lavó con agua y el extracto separado es se evaporó bajo nitrógeno hasta seco. El residuo se disolvió en isopropanol se mide para absorbancia a varias longitudes de onda. Sin embargo, los carotenoides y otros polienos con la absorción picos cercanos a la de retinol interfieren con la vitamina A.

También hay que señalar que en el caso de la determinación cuantitativa de vitamina A usando El último método, los resultados se obtienen calculationally, a raíz de sustitución de la medido valores de absorbancia a dos fórmulas. En el caso de todos los demás métodos de determinación de vitaminas antioxidantes que se han discutido, los resultados se leen de las curvas de calibración (como se conoce la preparación es tiempo y trabajo a tarea que consume). Todas pero el último de los métodos presentados requiere también un poco de trabajo y el tiempo adicional para desproteinización en las muestras de prueba - con ácido tricloroacético, que puede actuar destructivamente en las vitaminas determinado (aquellos susceptibles a, entre otros, valores bajos de pH - véase la Introducción), ya que es un ácido fuerte.

Numerosos inconvenientes de los métodos populares para la determinación de vitaminas antioxidantes que se han mostrado aquí atrajo nuestro interés espectrofotométrico menos conocido métodos, que - según sus autores - están libres de defectos analíticos.

Hemos decidido introducir un método selectivo y rápido para la determinación de la reducción forma de la vitamina C, utilizando un PR preparado periódicamente [Kyaw 1978]. Este reactivo se reduce por el ácido L-ascórbico que está contenido en la muestra y produce el tungsteno azul, absorbancia de la cual se mide. Los denaturates PR también proteínas contenido en la muestra, eliminando así la necesidad de eliminación de proteínas como un separada paso. El método de determinación selectiva de vitamina E (total) [Tsen 1 961] que era elegido, tiene el mismo fondo que el batophenanthroline discutido previamente método con su modificación, pero utiliza diferentes concentraciones y proporciones de reactivo soluciones. A pesar del hecho de que el método fue desarrollado para el análisis de la vitamina E en soluciones, resultados correctos de los ensayos (usando las soluciones de α-tocoferol en etanol) Las modificaciones de métodos espectrofotométricos .nos animó a adaptarlo a la realización de determinaciones en líquidos biológicos. Para el determinación de vitamina A, hemos decidido aplicar un método espectrofotométrico directo medición en UV [Bessey et al. 1946], que se basa en otro principios que el método por Parrish [1.977]. La muestra de ensayo es la proteína-agotado y hidrolizado con la solución de KOH en etanol, lo que permite más suave y más corto de calentamiento (60 ° C, 20 minutos) sin la necesidad de usar la atmósfera de nitrógeno. El queroseno-xileno KOH mezcla en la que no se disuelve, se utiliza para la extracción que hace enjuagando con redundante agua. Además, debido a la mezcla de baja volatilidad del procedimiento no requieran ningún cambio de disolvente o cualquier evaporación asociada con este proceso. Los mediciones de absorbancia del extracto (en una sola longitud de onda) se combinan con la eliminación de la interferencia e incluir como sigue: I medición de la absorbancia suma de la vitamina A y las sustancias que interfieren, vitamina A liquidación con luz UV, la medición II de las sustancias de interferencia absorbancia, cálculo de la vitamina A determinada absorbancia siendo una diferencia entre los resultados de las mediciones I y II. El computacional resultado de la determinación totalmente selectiva se obtiene de una fórmula simple.

Los trabajos sobre la aplicación del método de determinación de la vitamina C de acuerdo con Kyaw [1.978] mostró sin embargo, que el reactivo de fosfotungstato cual se prepara según la descripción original, es inútil. Lagunas descriptivas y metodológico inconsistencias que se encontraron excluyen la posibilidad de aplicar el presentado procedimiento analítico como una guía para las determinaciones. La falta de una descripción detallada del procedimiento analítico puso un obstáculo grave en el proceso de adaptación del método por Tsen [1961] para las determinaciones realizadas en fluidos biológicos. Además, la adaptación debe preocupar - de acuerdo con el tema del estudio - el análisis de las soluciones de vitamina E. También parece imposible introducir un

método para la determinación de vitamina A según a Bessey et al. [1946] de una manera sencilla porque el método requiere el uso de highpurity queroseno que no es de fácil acceso, 20 × 0,3 cm tubos de ensayo con una forma inusual de centrifugación de las mezclas de post-extracción (utilizando un taladro eléctrico con un especial la cabeza; después de la centrifugación el autor agrietado los tubos precortadas en la frontera de la fase orgánica y acuosa y extractos recogidos con una pipeta), una especialmente construido

Lámpara UV para la irradiación de los extractos y cubetas espectrofotométricas estrechas atípicos. Nuestra modificación del método para la determinación de la vitamina C [Kyaw 1978] evita una transferencia problemática de las mezclas de reacción posterior de tubos de ensayo habituales a los centrífugos tubos de ensayo y presenta un tratamiento de laboratorio de los fluidos analizados en estos últimos.

Parámetros de centrifugación se cambiaron para recibir algunos sedimentos más compactos lo que facilita la separación y recogida de los sobrenadantes. Procedimientos que eran encontrado que falta o se describe en una forma incompleta se completaron. Cambios en la forma de la preparación de reactivo phosphotungsten eran de la mayor importancia para el modificación. Se utilizó Na2WO4 molibdeno libre (contenido de Mo ≈ 0,001%), Na2HPO4 · · 2H2O de someterse a la hidratación a 7, y 12-hidrato durante el almacenamiento y en el mencionado método original fue reemplazado por la sal anhidra y la solución de H2SO4 3,7 M se introdujo en lugar de la mezcla 15: 5 v / v de agua y H2SO4 (d = 1,84). El reactivo se preparó usando el agua DI para que el agua estaba libre de trazas de pesada metales y el reactivo se protegió de la ebullición durante el periodo de calentamiento de 2 horas. Un se adoptó fácil método de ajuste del pH al valor requerido de 1,0. Para desarrollar un procedimiento analítico que se adapta a las determinaciones que realizan en líquidos biológicos fue el tema clave al modificar el método para la determinación de vitamina E [Tsen 1961]. Nos pusimos de acuerdo para llevar a cabo el procesamiento en testtubes centrífugas, de la desnaturalización con etanol, ya que no introduce ningún iones extraños, hace no cambia el pH y no destruye la vitamina susceptibles E. La muestra también es parcialmente extraída, que se complementó con extracción con un xileno no polar. EL agitador se utilizó para mezclar el contenido de los tubos de ensayo durante la extracción de proteínas y extracción. Concentraciones originales de soluciones de reactivos fueron preservadas, pero era imposible aplicar las relaciones de volumen originales entre ellos y los líquidos analizados, para vitamina E que está presente en dichos líquidos se diluyó durante la extracción de proteínas y extracción por el etanol y xileno - antes de la reacción de color se llevó a cabo. Todo el volumen de proporciones fue corregido para lograr la concentración de vitamina E igual al método original. A garantizar la estabilidad de la reacción de color producido, se utilizaron todos los reactivos aplicados en anhidro formulario incluidas etanol. En lugar de la pequeña tabla original que se usó para un cálculo simplificado de las concentraciones en base a la absorbancia medida, una

fórmula era aplicada para calcular con precisión las concentraciones de la vitamina determinada.

En la modificación del método para la determinación de vitamina A [Bessey et al. 1946] equipos de fácil acceso se introdujo a los análisis: tubos de ensayo centrífugas

- Para el procesamiento y la centrifugación de los líquidos analizados, un agitador de tubos de ensayo – para mezcla de los tubos de contenido durante la desproteinización con la hidrólisis y extracción, una típica centrífuga de laboratorio, una lámpara UV analítica populares ("Emita", con un quemador de 6 W y el filtro de madera; Famosa, Łódź) y semi-microcubetas estándar. Las pruebas comparativasde extracción con la mezcla de queroseno-xileno y con xileno solo, basado en la espectros de absorción en las pruebas de UV y recuperación, permitió la retirada del highpurity disponible queroseno y el uso de xileno exclusivamente para los fines de determinación. Bessey etal. [1946] no demostrar la necesidad de utilizar queroseno para la extracción de la analizada muestras. Proporcionó simplemente una comparación teórica de cuatro disolventes: petróleo benzin, tolueno, xileno y queroseno, evaluando de esta manera su capacidad para disolver la vitamina A y su volatilidad - y él eligió los dos últimos como una mezcla 1: 1. Cabe señalar, que el queroseno disponible comercialmente disponible como grado "farmacopea" "puro" y de pureza y su purificación adicional es una tarea laboriosa que dura varios días. Teniendo xileno introdujo como el único agente de extracción en nuestros propios estudios, el período de tiempo de la extraer exposición a UV fue optimizado y el valor del coeficiente en el presente fórmula de cálculo se corrigió. Sobre la base de la absorción espectros La longitud de onda utilizada para las mediciones de absorbancia se corrigió para los dos últimos métodos (original: 534 nm para la vitamina E, 328nm para vitamina A), que fue causado por las modificaciones aplicadas y debido a usar pasado de moda, menos espectrofotómetros precisos por los autores originales (que utilizan el Lambda

14P aparato de Perkin-Elmer). Para facilitar los procedimientos analíticos, algoritmos para determinaciones se han desarrollado para todos los métodos modificados. Se presentan en

Materiales y métodos.

Las propias modificaciones presentadas por los métodos seleccionados para la determinación espectrofotométrica vitaminas antioxidantes, además de tener muy buenos parámetros analíticos (ver Resultados) y siendo plenamente utilizable para el análisis de rutina, asegurado preservación del ventajas de los métodos originales: adaptación para determinaciones semi-micro escala, y sus bajos costos y fácil, rápido rendimiento de laboratorio. Esa aplicación permitido del mencionado modificaciones en la práctica clínica, y numerosos científica estudios, donde fueron utilizados con éxito no sólo para análisis realizados en la sangre, sino también en otras muestras biológicas. En opinión de los autores que se pueden utilizar más de determinación de vitaminas C, E y A en los productos alimenticios, que - a partir de la analítica punto de vista - son también

los analitos de origen biológico, por ejemplo: en los zumos (siguiendo su decoloración con carbón activado), leche y productos sólidos (sus homogeneizados o extractos). Aunque las técnicas instrumentales equipmentically avanzado predominan en los análisis de alimentos, método espectrofotométrico también se utiliza y su facilidad de uso podría incrementarse en los métodos que se sugieren en este estudio. Las modificaciones de métodos espectrofotométricos...

CONCLUSIONES

1. Las modificaciones desarrolladas de métodos para la determinación de vitaminas antioxidantes permitidas para evitar fallos sustanciales asociados con los métodos originales y para conservar todas sus ventajas ser así, en contraste con los métodos anteriores, totalmente aplicable para determinaciones de rutina.

2. Todas esas modificaciones se caracterizan por la selectividad de las determinaciones, los altos precisión, muy buena sensibilidad y precisión; son rápidos, fáciles de realizar, barato y hecho con un equipo de fácil acceso.

3. Los efectos beneficiosos de la aplicación de las modificaciones mencionadas para determinaciones en diversas muestras biológicas que se realizan para la clínica y científica propósitos, proveen una oportunidad para su uso en análisis de alimentos.