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Aislamiento y selección de levaduras hiperproductoras de etanol a diferentes
tiempos de fermentación de los frutos de Vitis vinífera de los valles de La Libertad
– Perú.
Marlon Carlo Angeles Quiñones, Sandra Pierina Gonzalez Leon, Fernando Emilio
Fuentes Alzamora, Omar Antonio Patiño Hermoza
[email protected], [email protected], [email protected],
RESUMEN
Para el aislamiento y selección de levaduras hiperproductoras de etanol a
diferentes tiempos de fermentación 12, 24 y 36 horas de los frutos de la especie
de Vitis vinífera de los valles de Virú, Chao y Paiján del Departamento de la
Libertad, en relación con el cultivo de Saccharomyces cerevisiae MIT – L51; se
recolectaron los frutos, los cuales fueron lavados y sometidos a un proceso de
estrujado para cada valle en recipientes estériles acondicionados con una aguja
hipodérmica en la tapa, hasta observar signos de fermentación a los tiempos de
12, 24 y 36 horas. Del fermentado obtenido se realizó diluciones decimales en
agua destilada y se sembró en agar sabouraud sacarosado enriquecido (ASSe)
con gentamicina e incubado a temperatura ambiente durante 48 horas. Las
colonias con características macroscópicas similares a Saccharomyces cerevisiae
MIT – L51, fueron sembradas en ASSe con gentamicina, posteriormente se
realizaron observaciones microscópicas para confirmar la semejanza con las
levaduras productoras de etanol del tipo Saccharomyces, se aislaron 11 colonias
entre las 24 y 36 horas de fermentación de los valles de Chao y Paiján, las que se
conservaron como cultivos puros, después se evaluó la capacidad fermentativa
por el método de Davies – Griffith, Saccharomyces cerevisiae MIT – L51 tuvo una
productividad de 3.13 x 10-2 g etanol/g levaduras/horas, y de los 11 cultivos solo 10
fueron encontrados en un rango de 3.23 x 10-2 g etanol/g levaduras/horas y 6.02 x
10-2 g etanol/g levaduras/horas. Se concluye que si es posible aislar y seleccionar
levaduras hiperproductoras de etanol a las 24 y 36 horas de fermentación de los
frutos de la especie de Vitis vinífera en los valles de Chao y Paiján.
Palabras clave: Aislamiento, selección, levaduras hiperproductoras de etanol, uva.
ABSTRACT
For the isolation and selection of yeasts hyper-producers of ethanol to different
fermentation times 12, 24 and 36 hours of the fruits of the species of Vitis vinifera
in the valleys of Viru, Paijan and Chao the Department of La Libertad, in
connection with the cultivation of Saccharomyces cerevisiae MIT - L51; the fruits
were collected, were washed and subjected to a process of crushing for every
valley in sterile containers equipped with a hypodermic needle in the cap, until you
see signs of fermentation to the times of 12, 24 and 36 hours. The fruits were
collected, were washed and subjected to a process of crushing for every valley in
sterile containers equipped with a hypodermic needle in the cap, until you see
signs of fermentation to the times of 12, 24 and 36 hours. The fermented decimal
dilutions are performed in distilled water and was planted in Sabouraud agar
sacarosado enriched (ASSe) with gentamicin and incubated at room temperature
for 48 hours. The colonies with macroscopic characteristics similar to
Saccharomyces cerevisiae MIT - L51, were sown in ASSe with gentamicin,
subsequently microscopic observations were carried out to confirm the
resemblance with the yeast producing ethanol type Saccharomyces, colonies were
isolated 11 between 24 and 36 hours of fermentation of the valleys of Chao and
Paijan, which were retained as pure cultures, after we assessed the fermentative
capacity by the method of Davies – Griffith, Saccharomyces cerevisiae MIT - L51
had a productivity of 3.13 x 10-2 g ethanol/g lev.h., and 11 pure cultures only 10
were found in a range of 3.23 x 10-2 g ethanol/g lev.h and 6.02 x 10-2 g ethanol/g
lev.h. It is concluded that if it is possible to isolate and select yeast hyper-
producers of ethanol at 24 and 36 hours of fermentation of fruits of the species of
Vitis vinifera in the valleys of Chao and Paijan.
Key words: Isolation, selection, hyperproducing yeasts of ethanol, grape
INTRODUCCION
Desde la antigüedad las levaduras se han reconocido como protagonistas
en la producción de alimentos y bebidas por fermentación, teniendo una amplia
aplicación en la biotecnología tradicional y moderna. [1]
La caracterización de levaduras hasta el nivel de especie es de relevancia
desde el punto de vista industrial, debido a que muchos grupos forman parte de la
microflora natural de alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en el proceso
de obtención de éstos. [1]
Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo industrial importante. Esta
levadura se ha utilizado durante mucho tiempo en las panaderías para aumentar la
masa y también en la producción de bebidas alcohólicas, la fermentación de
azúcares derivados del arroz, el trigo, la cebada, el maíz y el jugo de uva. Más
recientemente, se ha utilizado como una fábrica de células para la producción de
productos farmacéuticos [2]
Entre las alternativas más viables, el bioetanol se destaca como un punto
de referencia de biocombustibles debido a que su producción se basa en una
plataforma tecnológica probada. El bioetanol se produce a través de la
fermentación microbiana de carbohidratos derivados de materias primas agrícolas,
principalmente almidón y sacarosa [3]
El bioetanol es un biocombustible producido principalmente a partir de la
fermentación de hidratos de carbono por la levadura Saccharomyces cerevisiae. [3]
Saccharomyces cerevisiae es una levadura de suma importancia en la
industria como por ejemplo: de alimentos, bebidas, y la biotecnología industrial. El
uso tradicional de la levadura Saccharomyces cerevisiae en la fermentación
alcohólica, con el tiempo, dio lugar a importantes conocimientos como la
fermentación. [4]
S. cerevisiae es la especie de levadura utilizada por excelencia para la
obtención de etanol a nivel industrial debido a que es un microorganismo de fácil
manipulación, en la fermentación produce bajos niveles de subproductos, capaz
de utilizar altas concentraciones de azúcares. [4]
La producción de etanol por la acción de levaduras sobre malta o extractos
de fruta ha sido llevada a cabo a gran escala por muchos años y fue el primer
proceso industrial para la producción de un metabolito microbiano. Es por la vía
fermentativa que se obtiene la mayor cantidad de etanol a nivel mundial. El 95%
del etanol en el mundo se obtiene por fermentación a partir de materias primas
que contengan carbohidratos [5]
En algunos casos, el jugo obtenido a partir de uvas tales contiene
concentraciones de azúcar muy altos, dando como resultado vinos con niveles
excesivos de alcohol. Esta situación es la antítesis de las actuales políticas de
salud pública y la prevención de la embriaguez. Además, el etanol de alto
concentración puede afectar a la calidad del vino, por ejemplo, mediante la
alteración la volatilidad de los compuestos y del aroma. [6]
La actividad metabólica de S. cerevisiae es también una característica
importante para sus múltiples aplicaciones industriales. Por ejemplo, la biomasa
de levadura hambrienta de glucosa durante el almacenamiento tiene que
adaptarse rápidamente a una concentración de azúcar muy alto cuando se agrega
a la masa del pan o la hierba. Idealmente, S.cerevisiae células deben ser capaces
de aumentar sus emisiones de CO 2 y las tasas de producción de etanol en
cuestión de minutos después de su introducción en un medio de cultivo de
frutas. [7]
Durante la fermentación de la levadura Saccharomyces cerevisiae produce
una amplia gama de activos aroma de las sustancias, que son vitales para el
complejo sabor de las bebidas fermentadas, como cerveza y vino. En particular,
los ésteres volátiles de interés industrial importante porque la presencia de estos
compuestos determina el aroma afrutado de cerveza y vino [8]
S. cerevisiae es relativamente tolerante a los valores de pH bajos y altos de
azúcar y las concentraciones de etanol, es decir, las propiedades que reducen el
riesgo de contaminación en la fermentación industrial. Además, esta levadura es
bastante resistente a los inhibidores presentes en los hidrolizados de biomasa y es
capaz de crecer anaeróbicamente. [5]
Se ha convertido cada vez más evidente que S. cerevisiae ocupa y florece
en numerosos hábitats que no están necesariamente relacionados con las
actividades humanas. Por supuesto, muchos aislados naturales se han obtenido
en los viñedos en asociación con las uvas. Mientras que es relativamente poco
común encontrar S. cerevisiae en la superficie de las bayas no dañados (<0,1%),
las especies se pueden encontrar fácilmente en las bayas dañadas por pájaros o
insectos (-24%), que representan aproximadamente 1 en 1000 uvas. Dentro de
cualquier fruta dañada, el tamaño de la población de S. cerevisiae oscila de 10 4 a
10 5 células. [9]
Todos los organismos vivos crecen y se desarrollan de manera óptima bajo
ciertas condiciones ambientales. Las condiciones de temperatura, humedad,
salinidad, etc. en el medio ambiente varían en el espacio y el tiempo alejándose
muchas veces de las condiciones óptimas para el crecimiento y reproducción del
organismo en cuestión. Esto explica en gran medida la distribución geográfica y
estacional de las distintas especies vivientes. El medio ambiente es un factor
determinante en la evolución de los organismos. [10]
El apreciable consumo de los mismos y la producción de etanol durante la
fermentación a 10ºC y pH 4,0 hacen suponer que éstos son el pH y temperatura
óptimos de proceso para la levadura autóctona. [11]
Actualmente, el bioetanol es producido por fermentación alcohólica de los
azúcares presentes en materiales renovables [1, 2]. Dicha fermentación está
influenciada por factores como la concentración de azúcares del sustrato y el
microorganismo fermentador que se emplee. De acuerdo con reportes previos [3,
4] cuando S. cerevisiae se encuentra cultivada a altas concentraciones de azúcar
(menores a 30 – 40%) se incrementa la producción de etanol. Adicionalmente,
cuando S. cerevisiae se encuentra bajo condiciones de alta concentración de
oxígeno disuelto [5] y la concentración de azúcares supera 0,16g/L [6] o 9g/L [7],
la levadura convierte su metabolismo oxidativo a oxidoreductivo o fermentativo
incrementándose la producción de etanol. Dicho fenómeno se conoce como efecto
Crabtree. [12]
El etanol tiene innumerables aplicaciones: Bebidas fermentadas para
consumo humano como vinos, aguardiente, vodka, ron, brandy, etc, En la industria
se emplea en gran cantidad de procesos como: disolución de la nitrocelulosa,
disolvente de colorantes en las industrias alimenticias y textil, etc. Asi también se
puede mezclar con la gasolina, para mejorar sus propiedades, se recomienda una
mezcla en proporción del 10 al 25%, ya que se logra un índice de octano entre 70
y 75, mayor que el de la gasolina sin mezclar. Las mezclas de etanol – gasolina
permiten aumentar la compresión en el motor, dan un funcionamiento más regular,
su recalentamiento es menor y por tanto se puede utilizar a un mayor número de
revoluciones. [13]
La importancia de este trabajo es poder aislar levaduras hiperproductoras
de etanol a partir del fruto de Vitis vinífera de una manera muy sencilla y
económica, lo cual nos permitirá en un futuro realizar trabajos en la producción de
bioetanol como combustible natural y mezclado con gasolina.
MATERIAL Y METODO
Material: Vitis vinífera
Procedimiento:
Obtención de “uva”
Se adquirió de los valles mencionados, aproximadamente 3 kg de uva por
valle, eligiendo cuidadosamente la variedad de la materia prima, así mismo el nivel
o grado de madurez y estado de sanidad, debido a que influyen en la calidad del
producto final; se trasladó el producto adquirido en bolsas de primer uso al
laboratorio de Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la
Universidad Nacional de Trujillo.
Procesamiento de “uva”
Las muestras de cada valle fueron trabajadas por separados, estando las
uvas en el laboratorio se inició el proceso con el lavado, enjuagado con agua
destilada estéril, despalillándolas y eliminando los frutos en mal estado, después
con ayuda de unas espátulas se hizo el estrujado, el cual fue colocado en
recipientes con tapas estériles, a las cuales le acondicionamos una aguja
hipodérmica para facilitar la salida del CO2. Todos los depósitos fueron llevados a
incubación a temperatura ambiente hasta observar signos de fermentación.
Aislamiento de levaduras productoras de etanol
De los recipientes que presentaron fermentación se sacó del fondo del
depósito 0.5 ml y se realizó diluciones al décimo en Agua Destilada Estéril (ADE),
después se sembró por superficie en placas conteniendo Agar Sabouraud
Sacarosado enriquecido (ASSe) con gentamicina, las cuales se incubaron a 30°C
durante 24 a 48 horas.
Estudio morfológico y verificación de la pureza
Cumplido el tiempo de incubación se realizó un estudio macromorfológico
de las colonias desarrolladas como forma, color y aspecto, después se realizó
observaciones en fresco a 400 aumentos utilizando un microscopio compuesto, se
aisló las colonias con morfología de levaduras en frascos conteniendo ASSe con
gentamicina incubar a 30°C durante 24 horas, para verificar su pureza se le realizó
una coloración Gram.
Capacidad Fermentativa
Esto se logró con el método de Davies Griffith en donde primero los cultivos
puros fueron sembrados en ASSe con gentamicina e incubó a temperatura
ambiente por 48 horas, después se realizó la cosecha y lo obtenido fue
centrifugado, de ahí se obtuvo su peso húmedo y con la ayuda de la solución
azucarada bufferada (Sab) se hizo una suspensión con la biomasa en una jeringa,
luego fue sellada con silicona para evitar la fuga de gas, en la parte del embone de
la hipodérmica se conectó una manguera de venoclisis y el otro extremo se
introdujo en una probeta llena de solución de NaCl al 23 % coloreado con azul de
metileno y de ahí se inició a medir la cantidad de CO2 producido por cada media
hora. El volumen de CO2 producido al final de las tres horas fue convertido a
gramos de etanol y luego se calculó la productividad para cada cultivo.
RESULTADOS
Del aislamiento y selección se obtuvieron 10 cultivos puros de levaduras
hiperproductoras de etanol a las 24 y 36 horas de fermentación de los frutos de
Vitis vinífera de los valles de Chao y Paiján del departamento de La Libertad –
Perú, en relación con el cultivo de S. cerevisiae MIT L 51.
La tabla 1, muestra el número de colonias de levaduras encontrado a
diferentes tiempos de fermentación de frutos de Vitis vinífera.
La tabla 2, muestra el valor del peso húmedo y cantidad de CO2 producido
de cada cultivo para la medición de la capacidad fermentativa.
Tabla 1. Números de colonias de levaduras aisladas en Agar Sabouraud
Sacarosado enriquecido (ASSe) con gentamicina a las 12, 24 y 36 horas de
fermentación de los frutos de Vitis vinífera de los valles de Chao, Virú y Paiján del
Departamento de La Libertad.
Procedencia de
la muestra
(Valles)
Tiempos de fermentación
12 horas 24 horas 36 horas
Chao 22 36 -
Virú 99 22 -
Paiján 57 - 15
Tabla 2. Valores de peso húmedo y cantidad de CO2 (L) producido por cada cultivo
de levadura productoras de etanol de los valles de Chao y Paiján a las 24 y 36
horas de fermentación respectivamente para el cálculo de la capacidad
fermentativa evaluada a las tres horas en comparación con S. cerevisiae MIT –
L51.
PROCEDENCIA
DE LA
OBTENCION DEL
CULTIVO PURO
PESO HUMEDO CO2 (L) – 3
HORAS
Productividad de
etanol/gr de
levadura / hora
Chao 1 0,5 0.031 4,24 x 10-2
Chao 2 0,7 0.033 3,23 x 10-2
Chao 3 0,7 0.044 4,30 x 10-2
Paiján 1 0,7 0.046 4,50 x 10-2
Paiján 3 0,5 0.041 5,61 x 10-2
Paiján 4 0,6 0.047 5,36 x 10-2
Paiján 5 0,7 0.041 4,01 x 10-2
Paiján 6 0,5 0.044 6,02 x 10-2
Paiján 8 0,5 0.043 5,90 x 10-2
Paiján 9 0,7 0.049 4,79 x 10-2
S. cerevisiae MIT
L51
0,7 0.032 3,13 x 10-2
DISCUSION
En este trabajo la levadura control fue S. cerevisiae MIT – L51, la cual fue
aislada a partir de melaza de caña de azúcar en el Laboratorio de Microbiología
Industrial de la Universidad Nacional de Trujillo, obteniéndose en su primera
evaluación una productividad que alcanzó los 6.35 x 10-2 g de etanol/g de
levadura/hora, al ser trabajada en esta oportunidad su productividad llegó hasta
los 3.13 x 10-2 g de etanol/g de levadura/hora
En la región de La libertad, se cultivan frutos de interés económico como
Vitis vinífera “uva”. Estos frutos, debido a que contienen azucares fermentables,
son fuentes naturales a partir de los cuales se pueden aislar levaduras
productoras de etanol.
La selección primaria de las levaduras productoras de etanol a partir de
frutos de interés comercial y económico en la región de La Libertad, involucra una
detección y aislamiento en medios de cultivos específicos. En esta etapa, se aísla
un elevado número de diferentes levaduras que pueden o no ser productoras de
etanol llamadas indígenas, autóctonas o nativas como se muestra en la Tabla 1,
por lo que es necesario utilizar estrategias y medios adecuados que eviten
aislamientos innecesarios y un aumento en el costo de los insumos empleados.
Después de la selección primaria se continúa con la selección secundaria de
cultivos hiperproductores con miras a producciones a mayor escala, esto se logra
midiendo la producción de etanol del cultivo según el método planteado por Davies
Griffith.
Se evaluó la capacidad fermentativa de los 10 cultivos de levaduras
aislados de frutos fermentados de la especie de Vitis vinífera de los valles de Chao
y Paiján del departamento de La Libertad, los resultados obtenidos se presentan
en la Tabla 2, se puede observar que las productividades de etanol de las
levaduras varían entre 3,23 x 10-2 g de etanol/g de levadura/hora y 6,02 x 10-2 g
de etanol/g de levadura/hora.
CONCLUSIONES
1. Se aislaron y seleccionaron 10 cultivos puros de levaduras hiperproductoras
de etanol a partir de las 24 horas de fermentación de los frutos de Vitis
vinífera de los valles de Chao y Paiján del departamento de La Libertad.
2. De los viñedos de La Libertad la mayor cantidad y mejores levaduras
hiperproductoras de etanol provienen de los frutos obtenidos del valle de
Paiján del departamento de La Libertad
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