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Artículo original
1 Magíster en Gestión de la Producción y Desarrollo Sostenible, Ingeniero Agrónomo. Actualmente se desempeña
como Docente Universitario en la Universidad Nacional de San Martín. Tarapoto, Perú. 2 Dr. en Microbiología Agrícola, MSc. en Microbiología Agrícola, Biólogo. Actualmente se desempeña como Docente
Universitario en la Universidad Nacional de San Martín. Tarapoto, Perú. 3 Dr. en Microbiología de Suelos, MSc. en Producción Agrícola, Ingeniero Agrónomo. Actualmente se desempeña
como Docente Universitario en la Universidad Nacional de Barranca, Barranca, Perú.
Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque húmedo
tropical en San Martín
Obtaining metagenomic DNA from tropical humid forest soil in San Martín
Guillermo Vásquez Ramírez1 Winston Franz Ríos Ruiz2 Gregorio José Arone Gaspar3
RESUMEN
Objetivo
Consolidar un protocolo para la obtención
del ADN metagenómico de un suelo de
bosque húmedo tropical en San Martín.
Método
Es una investigación de tipo básica y nivel
descriptivo, desarrollado bajo el diseño
completamente al azar (DCA) con 3
repeticiones. Se empleó el kit y el
protocolo de extracción de ADN sugeridas
por el fabricante (Qiagen), con cambios en
el proceso disruptivo.
Resultados
Todas las muestras, presentaron bandas
íntegras de ADN superior a 20000 pb y sin
signos de degradación. En el gel, unido a la
banda predominante de ADN no se
apreció un barrido o smear, lo que
demuestra el éxito del protocolo utilizado.
Conclusiones
Los resultados obtenidos en la extracción
de ADN metagenómico presentan
características ideales como alta pureza e
integridad. Siendo así, el protocolo
consolidado para la obtención del ADN
metagenómico resulta altamente
eficiente.
Palabras Clave
ADN Metagenómico, suelo, bosque
húmedo.
ABSTRACT
Objective
Consolidate a protocol for obtaining
metagenomic DNA from tropical humid
forest soil in San Martín
Method
It is basic research and descriptive level,
developed under a completely random
design (DCA) with 3 repetitions. The kit
and the DNA extraction protocol
suggested by the manufacturer (Qiagen)
were used, with changes in the disruptive
process.
Results
All the samples showed complete DNA
bands greater than 20,000 bp and without
signs of degradation. On the gel, a sweep
or smear was not seen attached to the
predominant DNA band, which shows the
success of the protocol used.
Conclusions
The results obtained in the extraction of
metagenomic DNA present ideal
characteristics such as high purity and
integrity. Thus, the consolidated protocol
for obtaining metagenomic DNA is highly
efficient.
Keywords
Metagenomic DNA, soil, humid forest.
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos como algas, hongos,
actinomicetos y bacterias tienen en el
suelo un hábitat favorable, estos sumados
a los componentes de la microfauna
forman la microbiota del suelo. A su vez,
la fertilidad del suelo, la estabilidad y
funcionamiento de ecosistemas naturales
y los agroecosistemas está condicionada
por la actividad y diversidad de la
microbiota, para garantizar los ciclos de
los nutrientes y los procesos de
descomposición del material vegetal en
cualquier ecosistema terrestre debido a
los procesos biológicos como la oxidación,
la reducción, la descomposición de
materia orgánica y la mineralización, así
como, las interacciones interespecíficas e
intraespecíficas que se establecen en el
suelo, es esencial la diversidad
microbiana. (López, 2015; Mancilla,
2019).
Aun cuando las poblaciones microbianas
y sus actividades fueron ampliamente
estudiadas en el nivel de proceso, no se ha
dado mayor atención a la estructura de la
comunidad es decir al establecimiento de
comunidades microbianas que en los
ecosistemas del suelo depende de su
interacción con muchos factores
ambientales (Griffiths et al., 1997).
En la actualidad, las tecnologías
moleculares están disponibles para
detectar cambios en la comunidad
microbiana de diversos nichos
ambientales (Muyzer et al., 1993; Tebbe
et al., 2001). Sin embargo, no revelan toda
la información acerca de toda la
comunidad del suelo, en comparación con
los miembros seleccionados en la
comunidad que fueron amplificados por
PCR (Scow et al., 2001).
Por lo que, se plantea el desarrollo de
técnicas que permitan la extracción de
material genético (ADN), directamente de
los microorganismos del suelo
(metagenoma) sin necesidad de un cultivo
previo. Se discuten aquellas que permiten
la clonación de moléculas de ADN
provenientes de metagenomas y su
análisis, con el propósito de identificar
genes que codifican para enzimas con una
potencial aplicación biotecnológica.
(Escalante, et al., 2004).
La inclemente intervención del hombre en
los bosques húmedos de la Selva en el
Perú hará que muy pronto aquella vasta
diversidad se vea fuertemente afectada,
conllevando a la desaparición de algunas
de esas fuentes de diversidad, como por
ejemplo las comunidades bacterianas.
Frente a esta inevitable realidad, el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo
“Biodiversidad” de la Universidad
Nacional de San Martín (UNSM), que
cuenta con característica climatológica de
bosque húmedo y se encuentra dentro del
Área de Conservación Regional (ACR)
“Cordillera Escalera” (Instituto de
Investigaciones de la Amazonía Peruana,
2014); se presentó como importante
alternativa para ejecutar el presente
trabajo de investigación que forma parte
del estudio denominado “Análisis de la
comunidad bacteriana en un suelo de
bosque húmedo tropical en San Martín”
que el autor viene ejecutando en el marco
de la Tesis Doctoral en la Escuela de
Posgrado de la Universidad Nacional de
San Martín – Tarapoto. La intangibilidad
del ACR garantizará la permanencia de las
comunidades bacterianas allí presentes.
Siendo así, el conocimiento de las
poblaciones microbianas y su
funcionamiento puede contribuir
grandemente a resolver problemas
ambientales en diferentes ámbitos
geográficos en el país. La biogeografía
microbiana se presenta como una
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
prioridad en la investigación de la
diversidad biológica (Ruíz, 2002).
La metagenómica, es considerada como
una herramienta útil para analizar el
metagenoma, que es definido como el
ADN total perteneciente a distintos
microorganismos que componen una
población determinada (Cortés et al.,
2014), a su vez el análisis metagenómico
se inicia al extraer el ADN directamente de
una muestra ambiental (Mancilla, 2019).
A lo largo del tiempo en diversos
proyectos se han diseñado distintos
protocolos de extracción de ADN
metagenómico con la finalidad de obtener
una cantidad y calidad de ADN adecuados,
así como garantizar la eliminación de
inhibidores potenciales que dificulten el
tratamiento posterior de la molécula
(Bonilla-Rosso et al, 2008; Alejos et al.,
2014). Igualmente, casi siempre, los
principales problemas de rendimiento y
calidad del ADN se han asociado con la
falta de remoción de compuestos
húmicos, que comúnmente están
presentes en el suelo (Zhou et al., 1996),
de allí, la importancia de contar con un
protocolo que permita lograr una
concentración, cantidad total y la calidad
del ADN metagenómico (Cortés López et
al.,2014; Lewin et al., 2013), que permita
seguir diferentes rutas de análisis, como
las tecnologías de alto rendimiento y
otros.
MATERIALES Y MÉTODO
Extracción de ADN metagenómico de
suelo .
La extracción de ADN metagenómico, se
realizó entre los meses de noviembre y
diciembre del año 2019 en el Laboratorio
de Biología y Genética Molecular (LBGM)
de la Universidad Nacional de San Martín
(Tarapoto). Se emplearon muestras de
suelo colectadas entre los meses de junio
a setiembre del año 2019 en el bosque
húmedo de la Cordillera Escalera en el
Centro Académico, Investigación y
Ecoturismo Biodiversidad de la
Universidad Nacional de San Martín.
Para ello se seleccionaron por cada
muestra, tres submuestras, las cuales se
detallan a continuación:
Tabla 1
Muestras seleccionadas para realizar la extracción de
ADN
ZONA MUESTRA SUBMUESTRA
ALTA
A1
A1.1
A1.2
A1.3
A2
A2.1
A2.2
A2.3
A3
A3.1
A3.2
A3.3
MEDIA
M1
M1.1
M1.2
M1.3
M2
M2.1
M2.2
M2.3
M3
M3.1
M3.2
M3.3
BAJA
B1
B1.1
B1.2
B1.3
B2
B2.1
B2.2
B2.3
B3
B3.1
B3.2
B3.3
Fuente: muestras de suelo colectadas en el bosque
húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad
de la Universidad Nacional de San Martín, 2019.
Posterior a la extracción de ADN, se
seleccionaron aquellas submuestras con
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
concentraciones superiores a 7 ng/ µl
para ser secuenciadas.
Para realizar el procedimiento de
extracción se utilizó el kit DNeasy
PowerLyzer PowerSoil (QIAGEN),
siguiendo las instrucciones del fabricante.
A continuación, se detallan los
procedimientos realizados:
1. Inicialmente, pesar 250 mg de suelo
seco de cada muestra y colocar en
microtubos estériles 2 ml.
2. Adicionar 750 µl de la solución
PowerBead a cada microtubo. Este
reactivo cuenta con perlas de vidrio de
0.1 mm que golpean las muestras,
mediante el movimiento durante el
homogeneizado de las muestras
(disrupción), ya sea mediante
movimiento por vórtice o un ruptor de
tejidos.
3. Adicionar 60 µl de la solución C1 y
mezclar suavemente por inversión.
4. Homogeneizar utilizando el ruptor de
tejidos a 2500 RPM, durante 1 minuto.
Este paso es crucial, por esta razón en
el manual del fabricante, indica
diferentes revoluciones y depende del
tipo del suelo. Para suelos bajos en
biomasa y arcillosos, corresponde una
configuración de 4000 RPM durante 45
segundos y para suelos arcillosos como
suelos forestales, las configuraciones
varían entre 2500–2800 RPM y el
tiempo, puede ser mayor mientras
proporcionan los mayores
rendimientos sin comprometer la
integridad del ADN. En nuestro
experimento, utilizamos el equipo
Digital Disruptor Genie®, Models SI-
DD38 through SI-DD98 a 1000 RPM
durante 5 minutos.
5. Centrifugar el microtubo a 12200 RPM
durante 1 minuto.
6. Retirar entre 400 a 500 µl del
sobrenadante y colocar en un tubo
nuevo de 2 ml.
7. Adicionar 250 µl de la solución C2 al
nuevo tubo y mezclar mediante vórtex
durante 5 a 10 segundos.
8. Incubar de 2 a 8°C durante 5 minutos.
9. Centrifugar a 12200 RPM durante 1
minuto
10. Transferir hasta 750 µl del
sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml.
11. Adicionar 1200 µl de la solución
C4 al sobrenadante y agitar mediante
vórtex por 5 minutos.
12. Cargar 675 µl de la mezcla
obtenida a una columna provista por el
kit y centrifugar a 12200 RPM durante
1 minuto.
Esta columna, retiene el ADN, gracias a
las partículas de sílice que la
componen.
13. Descartar el producto eluido y cargar
675 µl de la mezcla restante en el tubo
del paso 11.
14. Centrifugar a 12200 RPM durante
1 minuto y descartar el producto
eluido.
15. Cargar por última vez el producto
restante del paso 11.
16. Centrifugar a 12200 RPM durante 1
minuto y descartar el producto eluido.
17. Adicionar a la columna 500 µl de
la solución C5. Este paso, consiste en
lavar el ADN obtenido.
18. Centrifugar a 12200 RPM durante 30
segundos y descartar el producto
eluido, por contener los productos
resultantes del lavado.
19. Centrifugar a 12200 RPM durante
1 minuto.
20. Colocar con cuidado la columna en
un microtubo limpio de 2 ml.
21. Adicionar 100 µl de agua grado
molecular e incubar durante 5 minutos
para hidratar el ADN capturado en el
filtro.
22. Centrifugar a 12200 RPM durante
30 segundos, para liberar el ADN del
filtro.
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
23. Descartar la columna y conservar
el producto eluido, el cual contiene el
ADN metagenómico.
24. Almacenar el producto entre -20 a
-80°C.
Cabe resaltar que este kit, es útil para
suelos con altos contenidos de ácidos
húmicos, ya que elimina los inhibidores
que afectan la reacción de PCR; lo que
permitió obtener un ADN de alta calidad y
pureza.
Posteriormente, se realizó la
cuantificación del ADN obtenido,
utilizando el espectrofotómetro nanodrop
One de la marca ThermoFisher. Para ello
se colocó 1 μl del producto eluido.
Asimismo, para observar la integridad del
ADN, se realizó una corrida
electroforética en la cubeta
electroforética horizontal de marca
Cleaver Scientific, en un gel de agarosa al
1%, con buffer TAE (Tris base 2-amino-2-
[hidroximetil]-1,3-propanodiol), ácido
acético y EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) 1X. La función
de este buffer fue permitir la migración
del ADN a través del gel, por estar
compuesto por una base y un ácido débil,
que transportan la corriente eléctrica.
Asimismo, posee un aditivo que retiene
los iones Mg2+, cofactor de algunas
nucleasas, por lo que son inactivadas
(Sanderson et al., 2014).
El producto para electroforesis, se
preparó utilizando 10 μl de ADN
metagenómico mezclado con 2.5 μl de
diamond y 2.5 μl de azul de bromofenol. El
primero es un tinte que se adhiere a la
superficie de la hebra del ADN,
otorgándole fluorescencia cuando se
somete a luz UV o azul (Haines, et al.,
2016). Por otro lado, el azul de
bromofenol, se utiliza como un buffer de
carga, ya que proporciona el peso
suficiente para la precipitación del ADN
en el fondo de los pocillos del gel, además
permite observar de forma directa la
migración de la muestra a través del gel.
Como marcador de tamaño, se utilizó el
generuler 1 kb plus DNA ladder de 75 a
20000 pb.
Por otro lado, las condiciones para la
corrida fueron: 100 V, 180 mA y durante
30 minutos.
Finalmente, para observar la migración de
los fragmentos, el gel fue colocado en el
sistema de foto documentación con
cámara integrada OmniDoci, de la marca
Cleaver Scientific, mediante la exposición
a luz azul (Fig. 1, 2, 3 y 4).
RESULTADOS
Cuantificación del ADN metagenómico
obtenido de suelo de bosque húmedo de
la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo
Biodiversidad de la Universidad Nacional
de San Martín 2019, utilizando el
espectrofotómetro nanodrop One.
Tabla 2
Concentración de ADN metagenómico de tres zonas
de muestreo
ZONA Muestr
a
Concentració
n de ADN por
muestra (ng/
μl)
Concentració
n de ADN
promedio (ng/
μl)
ALTA
A1.1 19.9
19.9 A1.2 16.5
A1.3 23.3
A2.1 10
10.17 A2.2 10.7
A2.3 9.8
A3.1 7.9
10.07 A3.2 10
A3.3 12.3
MEDIA
M1.2 12.8 14.85
M1.3 16.9
M2.2 8.3 9.8
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
M2.3 11.3
M3.2 7.4 8.35
M3.3 9.3
BAJA
B1.1 11.6
11.47 B1.2 13.4
B1.3 9.4
B2.1 8.7
8.97 B2.2 9.9
B2.3 8.3
B3.1 12.5
14 B3.2 13.7
B3.3 15.8
Fuente: ADN metagenómico obtenido de suelo de
bosque húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad
de la Universidad Nacional de San Martín, 2019.
Geles de agarosa
La calidad e integridad del ADN extraído,
se analizó por electroforesis en gel de
agarosa, donde todas las muestras de ADN
demostraron ser íntegras sin signos de
degradación, asimismo, no se observaron
el barrido o smear a lo largo del gel. El
tamaño del ADN fue superior a 20000 pb,
ya que el marcador indica un máximo de
20000 pb (Fig.1, 2, 3 y 4), así la
electroforesis en gel de agarosa nos
permite apreciar la integridad del ADN.
Figura 1 Corrida electroforética de las submuestras 1 de las muestras pertenecientes a las zonas alta (A) y media (M) Fuente: ADN metagenómico obtenido de suelo de
bosque húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad de la Universidad Nacional de San Martín 2019.
Figura 2
Corrida electroforética de las submuestras 2 y 3 de las
muestras pertenecientes a las zonas alta (A) y media
(M)
Fuente: ADN metagenómico obtenido de suelo de
bosque húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad
de la Universidad Nacional de San Martín 2019.
Figura 3
Corrida electroforética de las submuestras 1, 2 y 3 de
las muestras pertenecientes a la zona baja (B) y 2 y 3
pertenecientes a la zona media
Fuente: ADN metagenómico obtenido de suelo de
bosque húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad
de la Universidad Nacional de San Martín 2019.
Asimismo, las muestras homogeneizadas,
mostraron ser íntegras.
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Obtención del ADN metagenómico de un suelo de bosque Vásquez, G., Ríos, W., Arone, G. húmedo tropical en San Martín
Figura 4
Corrida electroforética de las muestras 1, 2 y 3
pertenecientes a las zonas alta (A), baja (B) y media
(M)
Fuente: ADN metagenómico obtenido de suelo de
bosque húmedo de la Cordillera Escalera en el Centro
Académico, Investigación y Ecoturismo Biodiversidad
de la Universidad Nacional de San Martín 2019.
DISCUSIÓN
En el estudio de la comunidad microbiana
del suelo es muy importante contar con
protocolos que originen ADN de suelo de
alta calidad con un rendimiento y pureza
adecuados para el secuenciamiento y
consecuente análisis para ITS (hongos) y
16S rRNA (bacterias) (Faria, Neelam, y
Smita, 2014); siendo la estandarización
del protocolo de extracción de ADN
metagenómico un requisito previo para
un estudio metagenómico exitoso con el
objetivo de detectar y explotar la variedad
de microorganismos que habitan un
entorno de suelo en particular (Sumit, et.
al. 2017).
El presente estudio se ha propuesto
consolidar un protocolo para la obtención
del ADN metagenómico de un suelo de
bosque húmedo, considerando los altos
contenidos de ácidos húmicos que los
caracteriza, a partir del cual se realizará el
análisis de las comunidades biológicas de
aquellos organismos que cumplen
diversas funciones específicas en el suelo
(Mancilla, 2019); considerando las
experiencias citadas y los resultados
obtenidos con el Kit DNeasy PowerLyzer
PowerSoil confirmamos su eficiencia para
las condiciones de la zona estudiada (Lear
et al., 2018).
CONCLUSIONES
El Kit de extracción DNeasy® de QIAGEN
permite aislar con calidad y pureza el ADN
metagenómico de las muestras de suelo
procedente del bosque húmedo de la
Cordillera Escalera, Tarapoto, San Martín.
Los cambios realizados en el proceso
disruptivo no afectaron la calidad del ADN
metagenómico, no se apreció el barrido o
smear.
Se logró consolidar el protocolo para la
obtención del ADN metagenómico de
muestras de suelo de bosque húmedo
tropical.
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Recibido 22 octubre 2020 Aceptado para publicación:
28 octubre 2020
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