desarrollo de un proceso de purificación y obtención del...

Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología Departamento de Desarrollo de Purificación

Desarrollo de un proceso de purificación y obtención del Ingrediente Farmacéutico Activo de la Eritropoyetina

humana recombinante

Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Farmacéuticas

Autor: Ing. Rolando Páez Meireles

Tutor: Dr.Raul Diaz Betancourt Asesora: Dra. Ofelia Bilbao

Ciudad de la Habana

2003

Dedicatoria

A mis padres y hermano. A mi hija Jennifer

mi esposa

Mercedes

Texto escrito a máquina

Y a mi compañera en la vida,

Mercedes


Mercedes


Sumario

SUMARIO

Una de las etapas más importantes en el desarrollo de un producto biofarmacéutico,

específicamente el relacionado con las proteínas recombinantes lo constituye el

establecimiento de los procesos de purificación. En este trabajo se presenta una

estrategia para el desarrollo del proceso de obtención de la Eritropoyetina humana

recombinante, así como todos los aspectos que garantizan su calidad y seguridad como

producto farmacéutico. Como parte de este trabajo se estableció un proceso de

purificación nuevo y patentable a escala analítica, con una pureza final por SDS-PAGE

superior al 95%. El recobrado del mismo fue superior al 20 % con los valores del

contenido de ácido siálico y la actividad biológica adecuada. En este proceso se tuvo en

consideración los aspectos necesarios de validación viral y las necesidades de calidad de

este producto. Se realizó el escalado del mismo con resultados satisfactorios, lo cual

permitió la producción del material de referencia, el establecimiento de las

especificaciones de calidad y la producción de los primeros lotes de la materia prima

activa, empleada en los estudios de estabilidad. Además como parte del mejoramiento

del proceso establecido, se realizó por primera vez un estudio amplio de las variables que

influyen en la agregación de esta molécula. En este estudio se demostró que la

interacción de la Epohr con la matriz de hidrofobicidad y el etanol induce la agregación de

la misma. Además se presentaron los resultados experimentales que demuestran que los

agregrados se forman por interacciones no covalentes. Por ultimo se realizó un estudio

de prefactibilidad económica del proceso desarrollado, teniendo en consideración la

construcción de una planta en Cuba y otra en un país del tercer mundo donde se realiza

una transferencia tecnológica. Para ambos escenarios los valores del tiempo de

recuperación de la inversión, el valor presente neto y la tasa interna de retorno fueron los

adecuados.

índice

ÍNDICE GLOSARIO DE TÉRMINOS Páginas INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 1

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................................................... 4 1.1 Caracterización de la Eritropoyetina ........................................................................................................ 4 1.1.1 Fisiología de la Eritropoyetina ............................................................................................................... 4 1.1.2 Propiedades físicas y químicas ............................................................................................................... 5 1.1.3. Principales usos clínicos de la Epohr ................................................................................................... 7 1.1.4 Métodos de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante ............................................... 9 1.1.5 Agregación ............................................................................................................................................. 10 1.2 Generalidades de los Procedimientos Utilizados .................................................................................... 13 1.2.1 Técnicas Cromatográficas .................................................................................................................... 13 1.2.2 Cromatografía de Intercambio Iónico ................................................................................................. 13 1.2.3. Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas ................................................................................. 15 1.2.4. Cromatografía de Exclusión Molecular ............................................................................................. 17 1.3 Desescalado y escalado de procesos cromatográficos ............................................................................ 19 1.4 Control de Calidad del proceso de recobrado y purificación ................................................................ 21

2. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................................................................... 27 2.1 Condiciones del cultivo celular................................................................................................................ 27 2.2 Proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante a escala analítica .................... 27 2.3 Escalado del proceso de purificación .................................................................................................... 29 2.4 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación ..................................... 31 2.5 Técnicas analíticas ................................................................................................................................... 32 2.6 Estudio de prefactibilidad de la producción de la Eritropoyetina humana recombinante. . …........36

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 38 3.1. Diseño de la estrategia de desarrollo del ingrediente activo ................................................................. 38 3.1.1 Preparación de la estrategia de purificación ...................................................................................... 40 3.1.2 Desarrollo del proceso de purificación a escala analítica .................................................................. 41 3.1.3 Escalado del proceso de purificación ................................................................................................. 53 3.1.4 Producción del Material de referencia ............................................................................................... 56 3.1.5 Establecimiento de las especificaciones de calidad ............................................................................ 56 3.1.6 Producción de los primeros lotes del Ingrediente Farmacéutico Activo ......................................... 57 3.2 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación ..................................... 59 3.2.1 Parámetros que influyen en la agregación de la Epohr ................................................................... 62 3.2.2 Determinación de la influencia de la columna de hidrofobicidad sobre la agregación de la Eritropoyetina humana recombinante ........................................................................................................... 68 3.2.3 Influencia del Tween 20 sobre la agregación de la Eritropoyetina humana recombinante ........... 71 3.3 Estudios de Prefactibilidad de la producción de la Epohr.................................................................... 74

4. CONCLUSIONES ............................................................................................................................................. 79 5. RECOMENDACIONES.................................................................................................................................... 80 6. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................................. 81 7. AUTOBIBLIOGRAFÍA RELACIONADA CON LA TESIS ......................................................................... 92 8. AUTOBIBLIOGRAFÍA NO RELACIONADA CON LA TESIS .................................................................. 95 9. ANEXOS ............................................................................................................................................................. 97

Glosario de términos

GLOSARIO DE TÉRMINOS

ADN Ácido desóxirribonucleico

AS ácido siálico

Atm atmósfera

BPP Buenas Prácticas de Producción

CHO Células de Ovario de Hámster Chino

Cys cisteína

DC Dicroismo circular

CIGB Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

ELISA Inmunoensayo enzimàtico sobre fase sólida

Epoh Eritropoyetina humana

Epohr Eritropoyetina humana recombinante.

FDA del inglés, Food and Drug Administration.

FL Flujo lineal

FPLC del inglés, Fast performance liquid chromatography

AG diferencia de energía libre

GF Gel filtración

AH diferencia de entalpia

HPLC cromatografía líquida de alta resolución

kDa 1000 Da

min minutos

IFA Ingrediente Farmacéutico Activo

IRC Insuficiencia Renal Crónica

MM Miles de millones

NaAc Acetato de Sodio

Nm nanómetro

PBS solución salina tamponeada con fosfato

PM pesos moleculares

PPM parte por millón

RP fase reversa

rpm revoluciones por minutos

SA Sulfato de amonio

Introducción

1

INTRODUCCIÓN.

En la actualidad los mayores esfuerzos en la industria biotecnológica se concentran en transformar

los resultados científicos en éxitos comerciales. A diferencia de otras industrias, la Biotecnología

moderna es una industria relativamente joven y requiere de un largo período de tiempo (10-12

años) para desarrollar sus productos e introducirlos en el mercado. Adicionalmente, las barreras

regulatorias que garantizan la seguridad de los biofármacos y el costo de desarrollo de estos

productos, aumentan considerablemente cada día. En Cuba, desde finales de la década del 80, la

ciencia (y muy especialmente la Biotecnología moderna) se transformó vertiginosamente de una

ciencia que asimilaba el conocimiento mundial, a una ciencia que comenzó a generar tecnologías.

La política de gobierno con respecto a esta rama propició alcanzar un fuerte potencial científico

técnico, planteándose como retos importantes disminuir el tiempo de desarrollo de los productos y

buscar soluciones a los problemas de la gran tecnología, para así satisfacer necesidades técnicas,

económicas y sociales del país. Para que un nuevo producto farmacéutico pueda ser empleado en

seres humanos debe cumplir con un gran número de regulaciones nacionales e internacionales,

que garanticen la calidad y por consiguiente su seguridad y eficacia. Para lograr este objetivo, todo

nuevo fármaco debe transitar por diferentes etapas de desarrollo que garanticen su éxito final.

Una de las etapas más importantes es el desarrollo de los procesos de purificación, pues estos

garantizan en primer lugar la pureza final del principio activo y con ello la calidad del producto final,

su seguridad y eficacia.

La Eritropoyetina humana es uno de los factores imprescindibles para la homeostasia del

organismo. Las células de los riñones son capaces de detectar los cambios en la presión parcial

de oxígeno y desencadenar los mecanismos para la síntesis de dicha hormona (Guyton, 1992),

viéndose afectado los niveles en aquellos individuos con Insuficiencia renal crónica, los cuales

requieren tratamientos prolongados para revertir completamente la anemia (Gansewort y

colaboradores, 1996).

En el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología se aisló el gen de esta hormona y se clonó en

células de Ovario de Hámster Chino . En este sistema de expresión, la glicosilación de las

proteínas es altamente conservativa con el sistema de glicosilación del retículo endoplasmático de

las células humanas, lo cual garantiza una actividad

biológica adecuada, dada la relación que existe entre esta última y el patrón de glicosilación de la

molécula. (Morimoto,1996).

Teniendo en cuenta la necesidad de desarrollar una tecnología que garantice la obtención,

calidad, seguridad y eficacia de la Eritropoyetina humana recombinante (Epohr), se postuló la

siguiente hipótesis del trabajo:

Introducción

2

Es posible desarrollar un nuevo proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante

que sea escalable, que permita obtener un ingrediente activo con todos los atributos de calidad

requerido para el Registro Sanitario y que posibilite una producción comercial económicamente

rentable.

Para demostrar la validez de esta hipótesis se concibió el siguiente objetivo general:

Establecer un nuevo proceso de obtención de la Eritropoyetina humana

recombinante que permita su producción a escala comercial.

Para lograr el cumplimiento de este objetivo general se plantearon los siguientes objetivos

específicos:

1. Estudiar los diferentes pasos de purificación y seleccionar las condiciones de operación

que permitan obtener la Epohr con la calidad necesaria para su comercialización.

2. Realizar un estudio de prefactibilidad económica del proceso desarrollado para una planta

de producción construida en Cuba y otra en un país de tercer mundo.

3. Realizar los estudios de producción a escala piloto necesarios, que permitan el registro

sanitario del producto y faciliten la implementación del proceso desarrollado a escala

productiva.

Este trabajo tiene los siguientes aspectos novedosos

■ Se logró desarrollar un proceso de purificación de la Epohr, novedoso y diferente a los

reportados en la literatura (patentado), que permitió obtener un producto final con alta

calidad y actividad biológica.

■ Se logró demostrar por primera vez que el efecto conjunto de la cromatografía de

interacciones hidrofóbicas y el etanol producen la agregación de la Epohr, aspecto no

reportado en la literatura.

Los resultados obtenidos en este trabajo facilitaron la obtención de una patente (CU-

81/96, 1996) y del Registro Sanitario de la Epohr (Registro sanitario Epohr,CIGB,

Introducción

3

2002 ) y su aplicación práctica ha permitido que ya se esté produciendo por el Centro de Ingeniería

Genética y Biotecnología y comercializando y exportando por Heber Biotec S.A., lo cual posee un

importante significado social y económico para el país.

Revisión bibliográfica

4

1. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

1.1 Caracterización de la Eritropoyetina 1.1.1 Fisiología de la Eritropoyetina La producción de hematíes del sistema circulatorio es un sistema dinámico en el cual el oxígeno

tisular es capaz de desencadenar determinados mecanismos para la regulación de los eritrocitos

en sangre. En condiciones normales, una disminución de los niveles de oxígeno induce un

aumento de la producción de la hormona eritropoyética, la cual eleva los niveles de células rojas

eliminándose la hipoxia (Guyton, 1992).

Las células encargadas de la síntesis de la eritropoyetina humana responden a los cambios en la

capacidad de oxigenación, en la presión parcial de oxígeno y en la afinidad de la sangre por este

último. De manera general, la disminución de la capacidad de transporte de oxígeno provoca un

aumento en la producción y secreción de la Epoh, por otra parte, la disminución de la presión de

oxígeno inspiratoria aumenta exponencialmente su concentración sérica, mientras que la

disminución de la afinidad de la sangre por el oxígeno está eventualmente asociada a una

disminución de los niveles de la misma (Erslev y colaboradores, 1987; Jelkmann, 1986).

En una persona normal, entre el 80 % y el 90 % de toda la Epoh circulante es de origen renal, el

resto se produce principalmente en el hígado y en menor escala en los macrófagos de la médula

ósea (Vogt y colaboradores, 1989; Rich y colaboradores, 1982) y en el bazo (Jelkmann y

colaboradores, 1990). Además, en murinos se ha encontrado síntesis en las glándulas salivares

(Fava y colaboradores, 1979; Clemons y colaboradores, 1987).

Uno de los posibles sitios formadores de Epoh dentro del riñón son las células mesangiales de los

glomérulos, cuya localización adyacente a los capilares glomerulares asegura que se hallen

bañadas por sangre arterial. Esto es importante porque permite que se detecten los niveles de

oxígeno en la sangre arterial, no en la venosa. Otros experimentos sugieren que las células

epiteliales de los túbulos renales también secretan Epoh, en cuyo caso la sangre anémica sería

incapaz de entregar suficiente oxígeno a las células tubulares y ello estimularía la producción de

Epoh para aumentar los niveles de eritrocitos (Guyton, 1992).

Aún existen opiniones diferentes con respecto al sitio exacto de síntesis de Epoh en el riñón, los

estudios inmunohistoquímicos y los de hibridización in situ no han brindado una respuesta clara a

esta importante cuestión. La mayoría de los autores están a favor


5

de un origen peritubular en las células del endotelio, pero también existen evidencias para un

origen tubular (Jelkmann, 1986).

En el estadio fetal y hasta un poco después del nacimiento, el sitio de producción de la Epoh es el

hígado, quien luego se mantiene como principal productor extrarrenal de la hormona. La

producción hepática puede aumentar ante estímulos como hipoxia, recuperación de daño hepático,

hepatectomía parcial, intoxicación con tetracloruro de carbono o ligadura de los conductos biliares.

Se ha propuesto que la regeneración del hígado activa el llamado Factor Hematopoyético Hepático

que estimula la producción de Epoh en los hepatocitos (Fried y colaboradores, 1984; Cotes, 1989).

1.1.2 Propiedades físicas y químicas

La Eritropoyetina es una hormona glicoproteíca con características ácidas. Tiene una migración

aparente en geles de poliacrilamida de aproximadamente 34-37 kDa. La fracción proteica

comprende alrededor de un 60% y consta de 166 aminoácidos. El resto corresponde a la fracción

carbohidrática que está distribuida en cuatro cadenas de oligosacáridos, de los cuales tres son del

tipo N-glicosilada en las posiciones 24, 38 y 83 que corresponden al aminoácido asparagina (Asp).

La restante es del tipo O- glicosilada que aparece en la posición 126 en presencia de serina (Ser).

Además, la estructura presenta 2 puentes disulfuro formados entre los aminoácidos de Cys de las

posiciones 7-161 y 29-33 respectivamente (Lai y colaboradores, 1995).

Numerosos trabajos han sido realizados sobre la importancia de la composición y la estructura de

los azúcares para las glicoproteínas, los cuales han revelado que los mismos pueden estar

relacionados con la estabilidad conformacional, la susceptibilidad de la molécula a la actividad

proteolítica, sus características de unión a receptores, su cinética de transporte intracelular,

secreción y aclaramiento del plasma entre otras (Dordal y colaboradores, 1985; Tsuda,1990;

Takeuchi y colaboradores, 1990). En el caso de la Epoh se ha podido esclarecer que su elevado

contenido de azúcares le brinda una alta resistencia frente a agentes desnaturalizantes como el

cloruro de guanidinio y una gran estabilidad conformacional frente a condiciones extremas de pH y

temperatura, determinándose también que ninguna de estas características está correlacionada

con el contenido de ácido siálico de la molécula (Owers y colaboradores, 1991).

Las cadenas de carbohidratos presentan Fucosa, Mañosa, N-acetilglucosamina, Galactosa, y ácido

N-acetilneuramínico y tienen una gran importancia en la resistencia de la Epoh a la inactivación

térmica. La eliminación de las mismas resulta en una


6

agregación de la proteína, sin embargo no es necesaria su presencia para la unión al receptor y la

activación del progenitor eritrocítico (Lai y colaboradores, 1995).

Cada tipo de cadena de oligosacáridos presenta una composición de carbohidratos diferente, con

excepción del ácido siálico que constituye el residuo terminal de ambos. La carga negativa de este

residuo le confiere las características ácidas a la molécula, la cual presenta un punto isoeléctrico

entre 4,11 y 3,31, coincidiendo con el contenido de ácido siálico entre 9,5 y 13,8 moles de ácido

siálico / mol de proteína. Se ha observado una relación lineal entre la cantidad de ácido siálico y la

actividad biológica in vivo, pero el incremento no se cumple por encima de 12,4 moles de ácido

siálico /mol de proteína. Esto se comprobó al incubar Epoh con pocas cantidades de ácido siálico

con alfa 2,6 sialo transferasa la cual incrementó el contenido de ácidos con su respectivo aumento

de la actividad in vivo, pero no in vitro (Morimoto y colaboradores, 1996). También se ha sugerido

que la cantidad de antenas que presenta la molécula en la posición N garantiza una mayor

actividad in vivo (Misaizu y colaboradores, 1995). Sobre la base de estas características de

composición de carbohidratos, la Epoh se presenta en la naturaleza con muchas isoformas (o

glicoformas) diferentes. La desialilación de esta molécula resulta en una pérdida completa de su

actividad biológica in vivo, mientras que se mantiene idéntica e incluso mejora la actividad biológica

in vitro. Se ha sugerido que este comportamiento se debe a un mejor aclaramiento de la hormona

desialilada por el receptor asialoglicoproteina hepático, el cual reconoce los residuos galactosa

terminales que en condiciones normales están bloqueados por el ácido siálico. Por tanto la

presencia de este último es de vital importancia para la activación in vivo ya que la preserva de un

rápido aclaramiento del torrente sanguíneo (Fratantoní y colaboradores, 1994).Darling y

colaboradores (Darling y colaboradores, 2002) demostraron que el ácido siálico y la glicosilación

tienen un impacto directo sobre la cinética de unión al receptor. Moléculas con menor contenido de

ácido siálico tienen una menor afinidad por el receptor.

El patrón de N- y O-glicosilación ha sido profundamente estudiado, estando formado el primero por

oligosacáridos di, tri y tetrantena, predominando estos últimos, los cuales pueden estar total o

parcialmente sialilados (Hokke y colaboradores, 1995). Los residuos de ácido siálico se encuentran

hacia la periferia del complejo y están enlazados a Gal por enlace alfa 2-3. Pueden aparecer 3

tipos de ácido siálico [ácido N- acetil neuramínico (95 %), N-glicol neuramínico (2 %) y N-acetil 9-0

acetil neuramínico (3 %)] y en caso de sialilación parcial, la distribución de estos azúcares no es

aleatoria.


7

También se ha reportado la presencia de cadenas repetitivas de N-acetil lactosamina en la

superficie externa del complejo, no conociéndose la importancia que pueda éste tener, si tiene

alguna, constituyendo su presencia una característica singular para la molécula, pues dicho tipo de

glicosilación no es común en las glicoproteínas séricas.

La distribución de los azúcares ramificados en la molécula recombinante es de la siguiente

manera:

AZÚCARES TETRANTENA— 77-85% (de estos el 85% pueden estar fucosilados)

AZÚCARES TRIANTENA-— 13-17%

AZÚCARES BIANTENA ----------- 1-6%

La aparición de estos azúcares en los tres sitios de N-glicosilación es al azar (heterogeneidad del

sitio), solo encontrándose una cierta especificidad en el sitio Asn 38, donde no aparecen azúcares

biantenas. Se ha descrito que los sitio de N- glicosílación estabilizan la Epohr mediado por las

interacciones hidrofóbicas (Toyoda y colaboradores, 2002).

El patrón de O-glicosilación es sencillo y consta de los siguientes oligosacáridos:

Neu5Acα 2-3 Gaiβ 1-3 Gal Nac-ol y

Neu5Acα 2-3 Galβ 1-3(NeuAc 2-6) Gal Nac-ol

Una comparación realizada por Takeuchi y colaboradores (Takeuchí y colaboradores, 1988), entre

la molécula recombinante expresada en células de ovario de hámster chino y la molécula humana

colectada a partir de la orina de pacientes, concluyeron que no existen diferencias significativas en

las características de glicosilación de ambas moléculas. Se encontró solo pequeñas divergencias

en la Epoh, donde además de la unión α 2-3 del ácido siálico también se encontraron enlaces α 2-

6 pero en menor proporción.

Desde el punto de vista de la estabilidad de la molécula, se puede señalar que es generalmente

estable en soluciones acuosas en un rango de pH de 5 a 9 y a temperaturas entre 0 y 5 °C, aunque

resulta relativamente estable a pH ácido y mayores temperaturas (Keighly y Cowy, 1995).

1.1.3. Principales usos clínicos de la Epohr.

- Anemia de la Insuficiencia Renal Crónica.

El principal órgano que sintetiza la Epoh es el riñón. Cualquier lesión renal que afecte las células

responsables de la síntesis de Epoh causará una anemia hiporregenerativa. La anemia es una de

las complicaciones más frecuentes e importantes de la insuficiencia renal crónica y su intensidad

aumenta conforme empeora la función renal.


8

Clínicamente se manifiesta cuando el aclaramiento de creatina es menor de 30-40 mL x min-1x

(1,73 m2)-1. Normalmente es de tipo normocítico y normocrómico, en particular si no se asocian

otros factores como déficit de hierro o toxicidad por aluminio.

Más del 90 por ciento de los pacientes en diálisis crónica presentan anemia y la mayoría

suficientemente grave para requerir tratamiento. En los pacientes urémicos los niveles plasmáticos

de Epoh pueden ser bajos, normales o altos, pero son inapropiadamente bajos cuando se ajustan

al grado de anemia. En los pacientes anéfricos se observan niveles más bajos de Epoh y la

eritropoyesis está intensamente disminuida (Radtke y colaboradores, 1979).

Dado que el principal factor causal implicado en la anemia de la IRC es la inadecuada síntesis de

Epoh, el tratamiento de elección es la administración exógena de la Epohr. En la práctica se

dispone de dos vías de administración, la intravenosa y la subcutánea. La intravenosa fue la

primera en utilizarse y la más utilizada en la actualidad. Las dos vías han demostrado su eficacia y

seguridad, pero la vía subcutánea consigue resultados similares con una reducción de la dosis

entre el 26 y 30 por ciento y unas dosis de mantenimiento un 27-45 por ciento menores que las

que se precisan por vía intravenosa, con el consiguiente ahorro económico.

En el caso de la vía intravenosa es aconsejable comenzar con una dosis de 40-50 Ul / Kg tres

veces por semana y ajustar la dosis de mantenimiento según el ritmo de respuesta y el hematocrito

que se pretenda alcanzar en cada paciente. Cuando se usa la vía subcutánea se comienza con

una dosis de 20-30 Ul / Kg tres veces por semana y se ajusta la dosis según el ritmo de respuesta;

con el uso de esta vía la influencia del número de dosis en la eficiencia del tratamiento es menor y

puede conseguirse un buen control de la anemia con 1 ó 2 dosis semanales, si la dosis total

semanal no excede las 120 Ul / Kg. El hematocrito diana que se pretende alcanzar con el

tratamiento de Epohr es de 30 a 33 por ciento, aunque existe una tendencia de obtener valores

entre 35 y 36 por ciento. Antes de iniciar el tratamiento hay que descartar la existencia de factores

que induzcan mala respuesta al fármaco, así como otras causas de anemias y constatar la

ausencia de déficit de hierro. Cuando la anemia está agravada por déficit hierro y ácido fólico, es

necesaria la administración suplementaria del elemento correspondiente (Sanz y Botella, 1997).


9

- Uso clínico del la Epohr en Oncología.

La Eritropoyetina humana recombinante es capaz de corregir la anemia relacionada con el cáncer y

la quimioterapia aumentando los niveles de hemoglobina y reduciendo las necesidades de

transfusiones. La vía de administración recomendada es la subcutánea en dosis de 150 a 300 Ul /

Kg de peso, dependiendo de la respuesta obtenida (Díaz-Rubio, 1997, Oette y colaboradores,

2001, Egerer y colaboradores, 2003, Leyland, 2003).

- Uso clínico del la Epohr Diabetes mellitus

El tratamiento de la anemia con Epohr en pacientes con nefropatía diabética es bien tolerado y se

acompaña de escasas complicaciones. Los pacientes con diabetes e insuficiencia renal crónica

responden de manera similar que los pacientes no diabéticos (Sánchez y colaboradores, 1997).

- Uso clínico del la Epohr en pacientes quirúrgicos

La transfusión de sangre autóloga es una alternativa a la transfusión de sangre alogénica en los

procedimientos de cirugía electiva en los cuales se prevé la necesidad de transfundir una unidad

de sangre o más. La donación preoperatoria de sangre autóloga entraña el riesgo de que el

paciente desarrolle anemia, por lo que la administración de Epohr se ha convertido en un

complemento de este tipo de donación (Mercuriali, 1997).

- Uso clínico del la Epohr en el SIDA

En diversos países como Estados Unidos, Canadá y Austria, la Epohr está aprobada para el

tratamiento de la anemia moderada o grave asociada a la propia infección por el VIH o a la

administración de algún medicamento mielinotóxíco (Gatell, 1997).

1.1.4 Métodos de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante

Miyake y colaboradores (Miyake y colaboradores, 1977) realizaron 7 pasos para

purificar la Epoh, estos incluían tratamiento con fenol, precipitación con etanol, Cromatografía en

Intercambio Aniónico, Cromatografía en Filtración en Gel y cromatografía de adsorción. A partir de

este momento se desarrollaron muchos métodos para la purificación de Epoh (Sieber e Iscore,

1977; Krystal y colaboradores, 1986).

Sieber y colaboradores (1977) utilizaron en su procedimiento adsorción en ácido benzoico y

cromatografías en: DEAE sefarosa, ConA sefarosa, Sephadex G100 y PHA sefarosa. Krystal y

colaboradores (Krystal y colaboradores, 1986) purificaron la Epohr


10

utilizando cinco pasos cromatográficos: afinidad en CM afigel Azul, cromatoenfoque, WG lectina

sefarosa, RP-HPLC en columna fenyl y SDS-PAGE preparativo.

Hewick y Seehra (Hewick y Seehra, 1987) desarrollaron un procedimiento que permite purificar

tanto Epoh como Epohr. Ellos realizaron una purificación inicial utilizando el método de Miyake y

colaboradores; luego realizaron una cromatografía en RP-HPLC que les permitió obtener una Epoh

pura a partir de diferentes fuentes. La columna de RP-HPLC utilizada fue una columna C4 y la

elusión la realizaron utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo. Lai y Strickland (Lai y Strickland,

1987) patentaron un método para la purificación de Epohr. Estos autores realizaron una

Cromatografía de Intercambio Iónico en DEAE-agarosa y una cromatografía en RP-HPLC

(columna C4, elusión con gradiente lineal de etanol), finalmente realizaron una cromatografía en

filtración en Gel. Ghanem y colaboradores (Ghanem y colaboradores ,1994), purificaron Epohr

producida en células linfoblastoides utilizando dos pasos cromatográficos. El primero consistió en

una cromatografía de afinidad donde se utilizó un anticuerpo monoclonal anti-Epohr inmovilizado

en sefarosa y el segundo fue una cromatografía de intercambio iónico en DEAE sefacril.

1.1.5 Agregación

La Eritropoyetina humana recombinante como otros productos de uso terapéutico, debe estar en

condiciones tales en las que no se produzcan agregaciones solubles o insolubles de formas

oligoméricas, debido fundamentalmente a las implicaciones que esto podría tener en la actividad

biológica y en la antigenicidad.

Para ello investigadores como Yoshiyuki y colaboradores (Yoshiyuki y colaboradores, 1992) han

estudiado diferentes condiciones que influyen sobre el proceso de agregación de la Epohr.

En primer lugar está la influencia de la temperatura en distintas concentraciones de sales y pH. A

temperaturas por encima de los 60 °C se produce rápidamente un cambio determinando por

Dicroísmo Circular , atribuible a la formación de agregados irreversibles de hasta 20 moléculas de

Epoh (450 kDa). Por debajo de los 60 °C no se detectaron durante más de un mes de incubación,

aunque dímeros y oligómeros pudieron ser visibles tempranamente (específicamente a 40°C), los

cuales están asociados a un desplegamiento parcial de la molécula que originaría interacciones

intermoleculares.

Anneli y colaboradores (Anneli y colaboradores, 1995) plantearon que a 37°C, en un período de 4

a 13 días, hay un incremento de dímeros y conformaciones de alto peso


11

molecular con grupos tioles libres, jugando un papel importante el tiempo que fueron incubadas las

muestras.

A pH 7 no se produce la asociación de las moléculas debido a que la hormona está cargada

negativamente y se favorecen las repulsiones electrostáticas, no siendo así a valores de pH

alcalinos, donde se forman agregados covalentes; ni a pH ácidos, donde se forman agregados no

covalentes de hasta 1 700 kDa. Lo anterior es atribuible al decremento de la repulsión

electrostática entre las moléculas y el desplegamiento a causa de la desnaturalización, adquiriendo

las moléculas propiedades antipáticas que contribuyen a una estructura micelar. A altas

concentraciones de cloruro de sodio se produce la supresión de las repulsiones electrostáticas

intermoleculares causantes de los agregados (Davis y colaboradores, 1987).

El mecanismo de agregación covalente propuesto por Anneli y colaboradores (Anneli y

colaboradores, 1995) y Derby y colaboradores (Derby y colaboradores, 1996), en los tratamientos,

por calor indica que se produce una ruptura del puente disulfuro formado entre Cys 7 y Cys 161 y

no se afecta la unión Cys 29 y Cys 33, con una posterior reoxidación. Esto origina puentes

disulfuro intermoleculares entre Cys 7 y Cys 7, entre Cys 161 y Cys 161 y en menor proporción

entre Cys 7 y Cys 161, por lo que surgen homodímeros 7-7 y 161-161 y se puede encontrar entre

un 20 ~ 25 % de las Cys 7 y Cys161 libres, los que almacenados por tiempos largos a - 20 °C

pueden pasar a homodímeros. Quizás este sea uno de los pasos hacia la formación del multímero.

Además se demostró por tiol fluorescencia, que en los monómeros no tratados no aparecen

grupos tioles libres (Wang y colaboradores, 1985).

El dímero formado aún puede mantener alguna actividad biológica, aunque mucho más reducida,

cuando se compara con la actividad del monómero no tratado. Esta puede ser determinada por el

procedimiento de Cotes y Bangham (Cotes y Bangham, 1961) y resulta en 84 000 ± 6000 U / A

280 y en 25 000 ± 6000 U / A 280 respectivamente, indicando este valor algún daño inducido por el

calor, tal como una desialización parcial u otra modificación de la parte carbohidrática o una

alteración en la cadena peptídica (Derby y colaboradores, 1996)

El hecho que disminuya en un 30 % la actividad sugiere que la causa es el puente disulfuro 7 /

161, el cual es crítico para la actividad in vivo (Boissel y colaboradores, 1993) y no así el puente

disulfuro 29 / 33, además de que los residuos 151-161 se encuentran altamente conservados entre

mamíferos (Wen y colaboradores, 1993).


12

No obstante todo lo anterior, Arthur y colaboradores (Arthur y colaboradores, 1998) publicaron un

artículo en el que mostraron que modificaciones químicas convierten a la Epohr en un dímero con

una vida media de más de 24 horas con respecto a la Epoh circulante y un aumento del

hematocrito notable en ratones. Este dímero formado no utiliza las Cisteínas propias de la

molécula, si no que intervienen en el mismo los nuevos grupos tioles añadidos.

Esto permite que el dímero tenga 26 veces más actividad biológica y sea mucho más efectivo que

el monómero después de varias dosis, pudiendo jugar un importante papel en la terapia (Spivak y

Hogans, 1989).

El efecto de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas sobre la estructura de las proteínas ha

sido ampliamente reportado y estudiado (Wu y colaboradores 1986; Figueroa y colaboradores,

1986; Nelu y colaboradores, 1989; Tibbs y Fernandez, 2003). Se ha observado que en proteínas

como la (β -lactoglobulina, un incremento en el tiempo de incubación en matrices hidrofóbicas no

contribuye al aumento de la agregación de la molécula, pero a concentraciones mayores de 5 mg /

ml_ se forman precipitados en la elusión. Esto es a causa de la interacción hidrofóbica entre la

matriz y las zonas hidrofóbicas de la superficie de la proteína, que pudiera indisponer las

interacciones entre las proteínas, al actuar la superficie de la columna hidrofóbica como un

competidor en la formación de altos agregados (Nelu y colaboradores, 1989).La cromatografía de

interacciones hidrofóbicas también indujo cambio en la estructura terciaria de la Alpha-Lactalbumin

(Tibbs y Fernandez, 2003).

Se ha descrito que el etanol puede inducir agregación en biomoléculas como la fitohemaglutinina,

la p lactoglobulina y el pepsinógeno (Jirgensons, 1982; Dufour y colaboradores, 1994; Makarov y

colaboradores, 1995). Se ha revelado que la p lactoglobulina en agua presenta grandes cantidades

de estructuras de hojas p en su interior. En alrededor del 20 % de etanol la molécula se despliega y

se observan la formación de estructuras β aisladas, además el incremento del etanol hasta 50%

hace que estructuras a hélices juegan un mayor papel.

Renard y colaboradores (Renard y colaboradores, 1999) indicó que el alcohol al 50 % induce la

agregación de beta-lactoglobulina caracterizada por la formación de puentes de hidrógeno

intermolecular entre las estructuras de hojas β.

Se conoce que los procesos de agregación de las proteínas son fenómenos no deseados para los

productos farmacéuticos. Para esto, se han realizados numerosos estudios encaminados a su

eliminación o reducción empleando fundamentalmente el


13

efecto desagregante de algunos detergentes (Bam y colaboradores, 1998; Kerwin y colaboradores,

1998, Lotte y colaboradores, 1998). De forma más específica se ha estudiante el mecanismo de

acción del Tween 20 sobre los procesos de agregación, las cuales incluyen, en primer lugar, la

adsorción de este detergente a las moléculas de proteína, evitando la interacción proteina-proteina

y la competencia del mismo en la adsorción sobre la interfase aire-líquido o sólido-líquido (Tandon

y Horowitz, 1987; Sluzky y colaboradores, 1991; Timasheff, 1994).

1.2 Generalidades de los Procedimientos Utilizados 1.2.1 Técnicas Cromatográficas Dentro de los problemas actuales que confronta la bio-ingeniería moderna de proteínas

recombinantes está lograr la purificación de un producto con elevados niveles de pureza,

estabilidad, reproducibilidad y consistencia, los cuales ofrezcan respuesta a la creciente demanda

de productos farmacéuticos en el mundo.

Alcanzar este objetivo requiere más de una técnica de purificación cromatogràfica, la cual es un

eslabón final y en muchos casos forman parte de los pasos esenciales en la cadena de

recuperación de un producto determinado. La gran variedad de técnicas cromatográficas que

existen actualmente, se debe al desarrollo tecnológico alcanzado hasta el presente.

Entre las técnicas más utilizadas se puede encontrar una gran variedad de tipos, que además de

diferenciarse en el principio de separación, también pueden presentar distintos grados de

resolución y capacidad.

Un sistema cromatogràfico está constituido fundamentalmente por una columna, donde se empaca

el gel o matriz que consiste en un material inerte de elevado grado de hidratación llamado fase

estacionaria. Además, por una solución o muestra disuelta en un tampón apropiado nombrado fase

móvil, un monitor (de luz ultravioleta, conductividad o pH), un registrador y una bomba, que es la

encargada de suministrar la energía necesaria para poner en movimiento el proceso a través del

flujo.

1.2.2 Cromatografía de Intercambio Iónico

Actualmente, el intercambio iónico es la técnica cromatogràfica más frecuentemente usada para la

separación y purificación de proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, polinucleótidos y otras

biomoléculas (Levison y colaboradores, 1998; Kent, 1999; Yamamoto y Miyagawa, 1999; Gebauer

y colaboradores, 1999; Levison y colaboradores, 1999; Hallgren, 1999; Hallgren y colaboradores,

2000; Knudsen y colaboradores, 2001; Bai y colaboradores, 2000; Kim y Kuga, 2001; Li y

colaboradores, 2002; Holm y colaboradores, 2002; Sauter y colaboradores, 2003; Urban y


14

colaboradores, 2003). Las razones del éxito del intercambio iónico se deben a su alto poder de

resolución, su alta capacidad, simplicidad y el control que permite el método.

La separación en la Cromatografía de Intercambio Iónico depende de la adsorción reversible de

moléculas solubles cargadas que son inmovilizadas por un grupo de iones de intercambio que

tienen carga opuesta.

Un intercambiador iónico consiste de una matriz porosa insoluble la cual está cargada con grupos

que están enlazados a esta de forma covalente. Los grupos cargados se asocian a contraiones

móviles (la solución de equilibrio los debe contener). Los contraiones son intercambiadores

reversibles los cuales pueden ser intercambiados por otros iones de igual carga y mayor fuerza

iónica, sin que se altere la matriz. Existen intercambiadores catiónicos y aniónicos. En el caso de

los intercambiadores aniónicos la matriz está cargada positivamente y por tanto su contraión debe

tener carga negativa y la matriz intercambia solo aniones, mientras que en el caso de los

intercambiadores catiónicos la matriz está cargada negativamente y su contraión debe tener carga

positiva, por lo tanto, la matriz solo intercambia cationes.

Después de equilibrada la matriz el siguiente paso es la aplicación de la muestra y adsorción de

esta en la matriz de intercambio, en la cual las moléculas solubles poseen una carga adecuada

con la que desplazan al contraión y de esta manera se enlazan reversiblemente al gel. Las

moléculas que no se enlazan a la matriz pueden ser eluídas fuera del lecho de intercambio usando

el tampón de equilibrio.

En la siguiente etapa las moléculas solubles son removidas de la columna a través de un tampón

que contiene iones de mayor fuerza iónica, los cuales desplazan a estas moléculas solubles que

se desean separar y hace que esta eluya fuera de la columna. Esto normalmente se logra

incrementando la fuerza iónica a través del tampón o cambiando el pH. La elusión es llevada a

cabo estableciendo un mayor grado de concentración de sal y las moléculas solubles son

desadsorbidas de la columna en orden de su fuerza de enlace, las moléculas más débilmente

unidas a la matriz eluyen más rápidamente (Janson y Rydén, 1998).

Las etapas siguientes son la remoción de la columna de sustancias no eluídas bajo las condiciones

previas del experimento y volver a equilibrar la columna para dejarla en las condiciones iniciales

para el próximo proceso de purificación.

Los intercambiadores se seleccionan de acuerdo a la curva de titulación de la proteína. La matriz

puede estar formada por compuestos inorgánicos, resinas sintéticas, etc. La matriz determina

propiedades cromatográficas tales como resolución, capacidad,


15

recobrado y también determina propiedades físicas como fuerza mecánica y propiedades de flujo.

La naturaleza de la matriz puede afectar el comportamiento del material biológico y la preservación

de su actividad biológica.

En la cromatografía de intercambio iónico se puede escoger la forma de interacción de la sustancia

de interés. Se puede elegir que lo que se enlace a la matriz principalmente sea la proteína que

deseamos separar y que pasen a través de la columna la mayoría de los contaminantes

(cromatografía de adsorción negativa), o que la proteína eluya de la columna. El primer método es

generalmente el más usado pues permite un mayor grado de fraccionamiento y concentración de

la sustancia de interés (Scopes, 1994, Murray, 1990).

1.2.3. Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas

La separación se basa en las diferentes propiedades hidrofóbicas que presentan las proteínas y

péptidos en medio salino que permiten que se enlacen a una matriz hidrofílica sustituidas con

ligandos hidrofóbicos.

En la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas la muestra se aplica con una elevada

concentración de sal. Las biomoléculas que se enlazan pueden ser eluídas por un gradiente lineal

o escalonado del solvente. Para remover los componentes más hidrofóbicos se necesita de un

lavado final con agua pura, detergentes o un solvente miscible en agua (por ejemplo: isopropanol o

etanol) (Scopes, 1994).

Este es uno de los métodos más poderosos en la bioquímica preparativa, lo cual está justificado

por su amplio uso en los proceso de purificación actuales (Kato y colaboradores, 2003; Kunitani y

colaboradores, 2003; Zanette y colaboradores, 2003; Tibbs y colaboradores, 2003; Jobby y

Sharma, 2003; Xia y colaboradores, 2003). Su velocidad, resolución y capacidad compite con la

cromatografía de intercambio iónico y su selectividad es complementaria a la filtración por gel o

cromatografía de exclusión molecular. Su habilidad de limpiar endotoxinas, ácidos nucleicos y virus

hace de ella un instrumento indispensable para la purificación de proteínas de uso farmacéutico.

Las superficies de las proteínas contienen zonas o manchas hidrofóbicas, que es por donde ocurre

la reacción con los ligandos hidrofóbicos que posee la matriz (Anexo 1), pero solo es posible en un

medio que favorezca esa interacción.

El soluto no polar "fuerza" al agua a formar una cavidad en la que el soluto se fija o coloca. En este

proceso muchos puentes de hidrógeno se rompen y otros nuevos se forman. Las moléculas de

agua rodean o circundan la cavidad formada, lo que produce un cambio negativo de la entalpia de

reacción. El aumento en el nivel de ordenamiento


16

de las moléculas de agua próximo al soluto explica el cambio negativo en la entropía (Scopes,

1994).

El cambio en la entropía es mucho mayor que el de entalpia haciendo que la variación de energía

libre del proceso sea negativa (Scopes, 1994).

ΔG = ΔH - T ΔS

La interacción hidrofóbica entre la matriz (con ligandos hidrofóbicos) y las áreas homologas de una

proteína se explica de igual forma que la interacción entre solutos no polares en agua.

Si la variación de energía libre del proceso es negativa, entonces el mismo será

termodinàmicamente posible.

Tanto la entalpia como la entropía cambian con la temperatura en las interacciones hidrofóbicas.

La fortaleza de las interacciones hidrofóbicas se ve aumentada con el aumento de las

temperaturas de reacción (Herjertén, 1977).

Factores que influyen en la cromatografía de interacciones hidrofóbicas:

• Tipo de sal empleada en el tampón de aplicación.

• Concentración de la sal.

• Aditivos en el tampón, que afecten la polaridad.

• Temperatura.

• Ligando.

Iones que promueven las interacciones hidrofóbicas:

Aniones: S042- > Cl- > Br- > NO3- > CIO4- > I - > SCN-

Cationes: Mg2+ >Li+ > Na+ > K+ > NH4+

Se ha comprobado que la variación de la efectividad de las diferentes sales para promover las

interacciones hidrofóbicas puede explicarse mediante su contribución a la tensión superficial de la

solución. A mayor tensión superficial se provocan interacciones hidrofóbicas más fuertes, y una

mayor concentración de la sal implica interacciones más fuertes.

Otros factores que influyen son la hidratación de las proteínas y la interacción proteína- sal.

Geles

Los ligandos están compuestos por cadenas alifáticas de diferente longitud generalmente desde 2

hasta 12 carbonos. A diferencia de los geles de RP-HPLC , la distribución superficial del ligando en

la superficie del gel es baja, y las condiciones de elusión suaves (Hydrophobic

Interaction,Pharmacia Biotech, 2001)


17

Adsorción

La adsorción de proteínas es favorecida por altas concentraciones de sales. Producto de las

diferentes fortalezas de hidrofobicidad entre el gel y las proteínas, la concentración de sal

necesaria para la adsorción varía de un ejemplo a otro. La concentración de sales debe ser menor

que la concentración a la cual precipitan las proteínas en ese medio (Scopes, 1994).

Orden de fortaleza iónica de alguna de las sales más utilizadas:

Na2S04 > NaCI > (NH4)2S04 > NH4CI > NaBr > NaSCN > KSCN La sal

sulfato de amonio es la más usada en la práctica.

La elusión en esta cromatografía puede realizarse en forma de gradiente o en forma de paso

escalón. Existen tres formas de elusión fundamentales (Scopes, 1994 y Hydrophobic Interaction,

Pharmacia Biotech, 2001):

• Disminuyendo la concentración de sales, los solutos eluyen en orden creciente de

hidrofobicidad.

• Cambiando la polaridad del solvente. Se puede obtener una disminución de la hidrofobicidad

en el sistema adicionando solventes polares en el tampón de elusión (ejemplo: Alcoholes o

etilenglicol).

• Adicionando detergentes. Estos funcionan como disolventes proteicos.

También se puede cambiar la especie de sal hasta lograr una concentración caotrópica o

cambiando el pH, aunque esta última forma de elusión no tiene predicción posible. Después de

eluídos los componentes proteicos deseados los geles pueden ser reutilizados muchas veces si

son regenerados y conservados correctamente. La regeneración deber ser realizada con Urea 6 M

o cloruro de guanidio. A continuación el gel debe ser equilibrado con el tampón de equilibrio si va a

ser utilizado de inmediato o almacenado en 20 % de etanol a 4°C. Si se emplean detergentes en la

corrida, se deben hacer lavados con diferentes alcoholes previos al almacenamiento (Scopes,

1994; Murray, 1990).

1.2.4. Cromatografía de Exclusión Molecular

Las moléculas de proteínas entran a los poros que contiene la fase estacionaria. Las moléculas

más grandes no pueden entrar a la fase estacionaria y atraviesan la cama cromatogràfica más

rápidamente. Las moléculas pequeñas, que pueden entrar a los poros del gel, se mueven más

lentamente a través de la columna. Por tanto, las moléculas son eluídas en orden decreciente de

su tamaño molecular (Scopes, 1994; Murray, 1990, Gel Filtration, Pharmacia Biotech, 2001).


18

Separación por filtración en gel:

Existen dos tipos de separaciones principales:

Separación de grupo

Fraccionamiento de biomoléculas

I. Separación de Grupo:

Se emplea cuando existen grandes diferencias en los pesos moleculares de los componentes de la

mezcla a separar, por ejemplo: sales y proteínas. Las moléculas mayores (en el caso ejemplificado

son las proteínas) eluyen en el volumen muerto o vacío.

Ventajas de la Separación de Grupo:

• Rapidez del proceso: en 30 minutos el 100 % de la corrida.

• Recobrado: prácticamente el 100 %.

• Se pueden recobrar incluso 100% de moléculas pequeñas.

• Tiempo de vida alto del gel.

• Se puede aplicar un volumen grande de muestra (hasta aproximadamente 0,3 volúmenes de

columna).

• Alternativa industrial a la diálisis de proteínas.

Aplicaciones:

• Cambio de tampón: Las muestras son cambiadas a un tampón adecuado para realizar otra

técnica.

• Desalineación de proteínas, polipéptidos y polisacáridos.

• Eliminación de fenol de preparaciones de ácidos nucleicos.

• Terminación de reacciones entre macromoléculas y reactivos de bajo peso molecular.

• Eliminación de productos, cofactores, inhibidores de enzimas, etcétera.

II. Fraccionamiento de proteínas:

Se emplea cuando los pesos moleculares de los componentes de la mezcla a separar están en el

mismo rango. Ejemplo: proteínas - proteínas - polipéptidos - ADN, etc. Factores a considerar al

seleccionar un gel:

• Para favorecer altas cargas de muestra, la porosidad y la selectividad deben ser altas y el

diámetro de la columna adecuado para el volumen de muestra deseado.

• Se deben emplear geles que faciliten el escalado, que se puedan empacar de forma simple,

que puedan resistir un alto flujo y que tengan bajo costo.


19

• La estabilidad química del gel puede permitir la presencia de solventes orgánicos (Filtratíon Gel,

Pharmacia Biotech, 2001).

Teniendo en cuenta el amplio espectro de posibilidades de uso de la Cromatografía de Filtración en

Gel, se encuentra formado parte de casi todos los procesos de obtención de principios activos

biotecnológicos (Kaersgaard y Barington, 1998; Cox y Bunce, 1999; Kent, 1999; Cheng y

colaboradores, 2001; Dudkiewicz y colaboradores, 2002; Guo y colaboradores, 2003; Goa y


1.3 Desescalado y escalado de procesos cromatográficos

El desescalado de procesos industriales es una poderosa herramienta para minimizar el tiempo y

los costos en la investigación-desarrollo de bioprocesos y en los estudios de reto necesarios

durante la validación del desempeño de un proceso (PDA, 1992). Este permite el estudio y

evaluación de muchas opciones de procesos en pequeñas escalas permitiendo una rápida

identificación de los parámetros de operación y control más importantes. Este simple procedimiento

puede significar ahorro de tiempo y dinero (Sofer, 1996). El escalado-desescalado de un proceso

de purificación bien diseñado debe ser directo, considerando, por supuesto, determinados

parámetros, siendo los lineamientos generales relativamente simples (Sofer, 1996).

El nivel del escalado en procesos de purificación tiene que asegurar que todas las condiciones de

operación sean las mismas del proceso analítico en cuestión. En el caso particular de los sistemas

cromatográficos, parámetros tales como: altura y diámetro de la columna, flujo lineal, tiempo de

residencia, composición del tampón, tipo de matriz, valor de pH, temperatura, concentración de la

proteína y composición-concentración de sales son puntos relevantes a considerar (Sofer, 1996).

Siempre la naturaleza química de los componentes empleados en las cromatografías a pequeña

escala debe ser la misma que a escalas superiores. Esto no siempre es factible, pero debe tenerse

en cuenta que el no cumplimiento de ello puede repercutir en una posible afectación en el proceso

de separación igualmente. Deben tenerse en cuenta los cambios de tampones y temperaturas

durante el tiempo de residencia de algunas bombas a escala de laboratorio.(ej. temperatura y pH

bajos) (Sofer, 1996).

Lo más idóneo en el escalado de las columnas cromatográficas es mantener la altura del gel y

aumentar el diámetro de la columna. El factor más importante es el flujo lineal que da una medida

de la velocidad con que pasa el líquido a través de la columna expresada en centímetros por hora

(cm/h) (Sofer, 1996).


20

El sistema de distribución de una columna cromatogràfica es un elemento crítico en la separación,

siempre que sea posible, el sistema de distribución en pequeña escala debe ser similar al

industrial. Las características químicas de los componentes a emplear deben también ser ¡guales;

esto debe tenerse en cuenta durante la selección del material de construcción de las columnas que

varía desde el acero inoxidable hasta el vidrio pasando por las de plástico. En todos los casos se

requiere hacer un análisis del impacto de estos materiales sobre la pureza y calidad del producto

(Sofer, 1996).

Las soluciones tampones a emplear en el desescalado deben definirse previamente, ya que lo

contrario pudiera resultar inconsistente partiendo del hecho de que se preparen las soluciones por

métodos diferentes, es decir, con ajuste o no de pH. Esto pudiera afectar la fuerza iónica y por

ende el perfil de elusión del producto al posibilitar la migración de impurezas además de ocasionar

una sobrestimación de algunas de ellas. La calidad del tampón, las sales, y el agua empleada en la

preparación de los mismos deben también guardar similitud con las empleadas a escala industrial

(Sofer, 1996).

La temperatura puede tener un significativo efecto en el tiempo de retención. Los cambios de

temperatura pueden alterar la conformación de la proteína inactivándola. Si un proceso

cromatogràfico es corrido en frío, su desescalado tiene que efectuarse en igual condición.

Durante el proceso de desescalado se debe tener como premisa fundamental comprobar la

eficiencia verificando por ejemplo, que la cantidad de platos teóricos no se reduce al disminuir el

diámetro de la columna (Sofer, 1996).

Hay que tener definido qué recuperación total del producto de interés se obtendrá a escala de

laboratorio para determinar la cantidad total de material crudo necesario que permita obtener la

cantidad de producto final deseado. Debe estar definida la capacidad de los medios de separación

que se emplearán en la nueva escala, así como el tiempo de trabajo y el volumen de muestra en

las nuevas condiciones. Además tener trazada la estrategia de separación cromatogràfica (Sofer,

1996).

Por lo tanto, el desescalado en cromatografía significa:

• Un conjunto de factores proporcionalmente disminuidos.

• Modificaciones leves de los resultados.

• Definición final de los parámetros de escala.

Al llevar a cabo las operaciones de desescalado cromatogràfico se observarán los siguientes

criterios:

Se debe disminuir:


21

• Diámetro de columna hasta lograr el nuevo volumen de lecho.

• Proporcionalmente el flujo volumétrico.

• Proporcionalmente la carga de muestra.

• Proporcionalmente el volumen de gradiente.

Debe mantenerse constante:

• Altura de columna.

• Velocidad de flujo lineal.

• Carga de muestra / volumen de gel.

En resumen, la dimensión del desescalado puede ser hasta la más pequeña que reproduzca

realmente el proceso, aunque se recomienda que este sea entre el 0.1-5% de la escala real de

proceso (Sofer y Nystrom, 1991; Sofer y Hagel, 1997).

1.4 Control de Calidad del proceso de recobrado y purificación

El recobrado de la proteína se basa en la utilización de técnicas de alta eficiencia como

son: gel filtración, intercambio iónico, isoelectroenfoque, cromatografía de afinidad y el uso de

anticuerpos específicos. El proceso de recobrado comienza con el aislamiento de la proteína

deseada, a menudo en un estado bastante impuro. Los cultivos de células y algunas levaduras que

excretan el producto al medio de cultivo tienen mayor ventaja, ya que con un primer paso de

separación de las células del cultivo se facilita la purificación (Lombardero, 1988). En el caso de los

productos derivados de E.coli se necesita romper las células bacterianas para recobrar la proteína.

En todos los casos es muy importante desarrollar rápidamente la purificación, pues tanto los

lisados de la bacteria como los cultivos de células y levaduras liberan proteasas que pueden

degradar el producto deseado.

Los niveles de pureza establecidos para productos farmacéuticos parenterales recombinantes son

de 95% o más (USP XXIV, 2002), utilizando diferentes métodos. La pureza depende de un número

de factores. Se debe señalar que los productos para uso crónico tienen normalmente

requerimientos mayores de pureza que aquellos utilizados en dosis únicas o poco frecuentemente.

Los productos biotecnológicos tienen ciertas impurezas que es necesario minimizar o eliminar en el

proceso de purificación. Entre ellas están los virus, los ácidos nucleicos, y los materiales

antigénicos indeseables.

• Eliminación del ADN recombinante.

Los productos recombinantes deben cumplir con niveles de100 pg o menos de ADN por dosis. La

capacidad de eliminar el ADN durante el proceso de recobrado y purificación debe validarse (USP

XXIV,2002)


22

• Eliminación de antígenos de la célula hospedera.

Se aceptan niveles entre 10 y 100 ng por dosis, para el contenido de impurezas de proteínas de

hospedero, aunque ya aparecen en la literatura concentraciones más bajas, dadas en partes por

millón (ppm) (Chen, 1992).

• Eliminación o eliminación de agentes indeseables.

Debe validarse la capacidad de eliminarlos por el proceso, estos agentes son: bacterias, hongos,

micoplasmas y virus (White y colaboradores 1991)

- Caracterización del material activo purificado.

Deben mostrarse evidencias de identidad, pureza, potencia e integridad molecular del material activo

en comparación con preparaciones de referencia (USP XXIV, 2002). Prueba para identidad y

pureza.

• Análisis de Aminoácidos. Se deben realizar como mínimo 3 análisis comparativos con la

composición teórica del equivalente natural. El análisis de aminoácidos detecta solamente

cambios sustanciales entre un 10 y un 30 % en la estructura primaria proteica. La detección

de metionina oxidada o aminoácidos residuales que se conoce que no deben aparecer en esa

preparación puede indicar degradación o contaminación. El método no debe ser utilizado

como criterio de pureza, ya que presenta problemas con su exactitud.

• Mapeo peptídico: El mapeo peptídico puede demostrar diferencias discriminatorias entre un

producto obtenido por la vía de ADN recombinante y una muestra auténtica del producto

natural. Unido a la composición y análisis de secuencia de cada péptido, el mapeo peptídico

puede dar evidencias precisas de la identidad de una proteína. Está técnica puede ser usada

para verificar la presencia incorrecta de los puentes de disulfuro en la muestra final y

alteraciones o mutaciones en aminoácidos de la secuencia (Garnick, 1992).

• Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio: Esta técnica permite

separar proteínas individuales y polipéptidos de acuerdo con el peso molecular. El SDS

disocia, solubiliza y desnaturaliza proteínas contenidas en una mezcla heterogénea, y cada

polipéptido adquiere una carga constante por unidad de masa. Las muestras se preparan en

condiciones desnaturalizantes con y sin agentes reductores, esto permite detectar la

presencia de agregados en la preparación. En el paso de revelado, se recomienda utilizar dos

formas de tinción, por lo que las muestras se preparan por duplicado. La tinción con azul de

coomassie, se utiliza para medir con un densitómetro o un procesador de

Materiales y Métodos

23

imágenes el por ciento de pureza, los posibles agregados y material degradado de la preparación

(Laemmli, 1970).

• Isoelectroenfoque: Es una técnica electroforética que separa las proteínas sobre la base de su

carga. Este método es empleado para conocer la identidad y para asegurar la homogeneidad de

una proteína, comparando con el patrón de bandas definido por el punto isoeléctrico. También

puede ser usada para evaluar la estabilidad de los productos biológicos. Estas técnicas se

realizan con marcadores de calibración para punto isoeléctrico o preparaciones de referencia

(European Pharmacopeia, 2002).

• Cromatografía líquida de alta resolución: Este método es usado para determinar la pureza de una

proteína o péptido, detecta la presencia de modificaciones como acetilación, degradación y bajo

ciertas circunstancias confirma su identidad. El HPLC puede ser utilizado en el mapeo peptídico y

en la caracterización y cuantifícación de impurezas especificas en el producto final (European

Pharmacopeia, 2002).

• Espectrometría de masas: La espectrometría de masas con ionización por bombardeo con

átomos acelerados es un método establecido para el análisis de péptidos y proteínas. Mediante

esta técnica es posible conocer la presencia de modificaciones post-transduccionales como son:

acilación, glicosilación, formación incorrecta de puentes disulfuro y degradación de las proteínas,

entre otras (Besada y colaboradores, 1992).

• Dicroismo circular: Suministra información sobre la conformación estructural en comparación con

la molécula natural o preparaciones de referencia (Sutherland y colaboradores, 1992, Rodger y

Ismail, 2000).

El dicroismo circular es una técnica ideal para el estudio de moléculas quirales en solución. Se

define como la diferencia en absorción (A) de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la

izquierda.

DC = Ai- Ad

El espectro de DC puede ser medido en principio con cualquier frecuencia de radiación

electromagnética. En la práctica la mayoría de los espectroscopios de DC utilizan la región

ultravioleta visible (UV-visible) del espectro y la transición electrónica.


24

En la mayoría de los espectrómetros de DC comerciales el modulador fotoelástico produce una

luz alternada polarizada a la izquierda y hacia la derecha con un cambio de la frecuencia de 50 k

Hz.

Los aspectos que hay que tener en cuenta para el análisis de una muestra por DC son:

1. El equipo de DC

2. Características de la muestra

3. La cubeta

4. Rango de longitud de onda

a. Parámetros de operación: tiempo de respuesta, velocidad de barrido, ancho de

banda, número de lectura, etc.

El DC es comúnmente empleado para estudiar macromoléculas en los siguientes

ejemplos:

1. Para probar cambios en la conformación de la macromolecular

2. Para probar cambios en interacciones de con pequeñas moléculas.

A valores de longitud de onda entre 250 y 300 nm (UV cercano) el espectro de DC de las

proteínas es dominado por la contribución de los aminoácido aromáticos y de la cisternas.

Cualquier cambio del proceso que afecte esta región puede ser estudiado mediante el DC. Para

la estimación de la cantidad de las diferentes estructuras presentes en la proteína, se estudia el

espectro del DC en la región del lejano UV (Rodger y Ismail, 2000) •

• Dot-Blot: La determinación de trazas de ADN residual en estos productos se realiza mediante

técnicas de hibridación usando sondas radioactivas derivadas del ADN de la célula hospedera. La

sensibilidad del ensayo, determinada por el límite de detección visual, está de 10 a 250 pg. Este

método solo reconoce ADN complementario a la sonda radioactiva, por lo que otros tipos de ADN

no son detectados (Briggs y Paufeli, 1991).

• Inmunoensayos: Constituyen un gran grupo de ensayos que dependen de la reacción antígeno-

anticuerpo. Estos ensayos incluyen los radioinmunoensayos y ELISA, estos últimos presentan la

ventaja de no usar sustancias radioactivas en su desarrollo. Los ELISA tienen una sensibilidad

desde 1 hasta 100 ppm y se aplican para detectar las impurezas que están presentes a bajas


25

concentraciones y que no se obtienen por SDS-PAGE (Anicetti y colaboradores, 1986).

Estos métodos son utilizados para la identificación y cuantificación de las proteínas de interés, así

como para la cuantificación de impurezas, los cuales son incorporadas durante el proceso de

producción. La cuantificación de proteínas que provienen de la célula hospedero se realiza mediante

un ELISA multiantigénico, el cual requiere de un material de referencia representativo de estas

impurezas. En este caso es importante producir los anticuerpos utilizando una corrida de producción

sin la presencia del producto de interés (USP XXIV, 2002).

Las técnicas de western-blot, inmuno-dot y ELISA son utilizadas para medir el nivel de contaminantes

en el material purificado activo; ya sean contaminantes de la célula hospedera, agregados y productos

de degradación derivados del propio producto como los niveles de anticuerpos de ratón, cuando en el

proceso de purificación se hace uso de los anticuerpos monoclonales producidos a partir de ascitis de

ratón (USP XXIV,2002).

- Pruebas para la caracterización biológica del material activo.

Las pruebas de caracterización biológica del material activo son una de las más importantes del

producto. Estas garantizan que el producto final cumpla con la función biológica para la cual fue

diseñada.

• Actividad biológica: La actividad biológica se expresa por dosis o unidad. El ensayo debe

ser realizado en comparación con un estándar de referencia internacional. En el trabajo

de rutina se utilizan preparaciones de referencia de laboratorio calibradas con el estándar

internacional. La determinación de la actividad específica es utilizada como criterio de

pureza e integridad molecular (USP XXIV, 2002).

• Inmunogenicidad: Si el producto se va a usar como vacuna, la potencia debe

determinarse en términos de inmunogenicidad en animales experimentales adecuados.

En este caso es necesario referir el valor de la potencia de la vacuna, a una vacuna

estándar. Esto significa que ambas vacunas estándar y muestras se someten a ensayo

bajo las mismas condiciones (USP XXIV, 2002).

Los ensayos biológicos en anímales de experimentación adolecen de poca precisión y exactitud. Por

tal motivo se realizan estudios de correlación entre los resultados obtenidos con pruebas

fisicoquímicas y bioensayos realizados in vitro e in vivo, con el


26

fin de evaluar su posible sustitución en los análisis de control de la calidad (Vranlx, 1983).

Pruebas de Seguridad para Biológicos.

Las pruebas de seguridad del producto se deben realizar independientemente del tipo de producto. Se

puede plantear que el cumplimiento de las Buenas Prácticas de producción garantiza en gran medida

que el producto pueda ser liberado por Esterilidad y pirógeno. En el caso de las pruebas de seguridad

y estabilidad dependen fundamentalmente del desarrollo del producto.

• Esterilidad: Esta prueba es aplicada a las sustancias y preparaciones que de acuerdo a la

farmacopea debe ser estériles (European Pharmacopeia, 2002).Cuando la prueba es

satisfactoria indica solamente que no se ha encontrado ningún microorganismo contaminante.

• Pirogenicidad: Trazas o agentes como los microbios, sustancias pirogénicas, ácidos nucleicos

y agentes tóxicos, pueden afectar la seguridad de los productos biológicos. Hay dos caminos

para determinar la pirogenicidad: el ensayo en conejos y la prueba del LAL (lisado de limulus

amebocitus, específico para endotoxinas bacterianas). Este método se utiliza

fundamentalmente para el producto en forma de Materia Prima Activa Purificada.

• Toxicidad anormal (seguridad): Este ensayo se realiza al preparado final y se lleva a cabo en

dos especies de animales: en ratones y en curíeles. Un lote final del producto pasa la prueba

si no aparece ninguna de las siguientes situaciones: presencia de cualquier síntoma anormal

o tóxico que no sea específico del producto o no se espere del mismo, decremento o

mantenimiento de la masa total de los ratones en ensayo o de la masa individual de cada

curiel, muerte de alguno de los animales (USP XXIV, 2002).

• Estabilidad'. Es la vida media del producto en las condiciones de almacenamiento. Se

recomienda realizar ensayos de estabilidad como control para cada lote producido,

manteniendo el producto por un tiempo a una determinada temperatura (37°C) y demostrar su

estabilidad comparando los resultados de actividad biológica o potencia con el producto

almacenado en condiciones óptimas (4°C).


27

2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1 Condiciones del cultivo celular

Se empleó una línea celular de Células de Ovario de Hámster Chino desarrollada en el Centro de

Ingeniería Genética y Biotecnología que expresa la Epohr. Los cultivos celulares se crecieron en

frascos de 175 cm2 y 1750 cm2. Las células y la expresión de la proteína se mantuvieron en medio

"Dulbeco". Cada frasco fue cosechado en tres ocasiones con tiempos de recuperación de los

cultivos con 5 % de suero fetal bovino. Todas las cosechas se obtienen con medio líbre de suero

(250 mL). Las cosechas se almacenaron en frascos a -20°C y luego se mezclan para su posterior

purificación. 2.2 Proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante a escala analítica

a) Establecimiento de los parámetros de operación de la Cromatografía de

Exclusión Molecular

El estudio de los parámetros de operación se realizó mediante un diseño factorial 32. Se analizó la

influencia de la velocidad lineal (X1 y de carga (X2) sobre el recobrado del proceso (Y1. Los valores

límites de las variables y las variables codificadas se ilustran en la Tabla 2.1.

Para realizar las corridas experimentales, se empacó una columna XK 26/60 (PHARMACIA,

Suecia) con 160 mL de la matriz Sephadex G-25 (coarse). Esta columna fue equilibrada con 50

mM de NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y se le aplicó los diferentes volúmenes del

sobrenadante proveniente del cultivo (de acuerdo a la variante experimental), al cual se le añadió

previamente 0.01 % de Tween 20. El flujo lineal de trabajo usado fue de 30 cm/h y el equipamiento

consistió en una bomba peristáltica (BIORAD), un detector ultravioleta (PHARMACIA, Suecia) y un

registrador (PHARMACIA, Suecia). Las muestras correspondientes a la fracción de proteínas se

recolectaron hasta que la señal del registrador comenzara subir nuevamente.

Tabla 2.1. Valores límites y codificación de las variables en el diseño experimental de la del establecimiento de la C rom atoa rafia de Exclusión Molecular.

Variables Límite inferior Límite superior Punto Central Codificación -1 1 0 Carga (%) 10 30 20 Velocidad lineal (cm/h) 10 30 20

Materiales y Métodos28

28

Para establecer la escala analítica final de la Cromatografía de Exclusión Molecular, se empacaron

980 mL del gel Sephadex G-25 (PHARMACIA, Suecia) en una columna XK 50/60 (PHARMACIA,

Suecia). Esta columna fue equilibrada con 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y se le aplicó

250 mL del sobrenadante proveniente del cultivo, al cual se le añadió previamente 0.01 % de Tween

20. El flujo lineal de trabajo usado fue de 30 cm/h y el equipamiento consistió en una bomba

peristáltica (BIORAD), un detector UV (PHARMACIA) y un registrador (PHARMACIA, Suecia).

El diseño experimental fue procesado mediante el análisis de regresión existente en el programa

Statgraphics Plus.

b) Establecimiento de la Cromatografía de Intercambio Iónico.

Para realizar el estudio de determinación de la condición inicial de elusión se empacó 1 mL de la

matriz Q-Sefarosa FF (PHARMACIA, Suecia) en una columna XK16/20. Esta fue equilibrada con el

tampón 50 mM NaAc, 0,01 % Tween 20 a pH 5. Se realizó un lavado con el mismo tampón de

equilibrio pero a pH 4. La elusión se realizó mediante un gradiente ascendente de NaCI, empleando

como condición inicial el tampón de equilibrio y final el de equilibrio suplementado con 1 M de NaCI.

El volumen total del gradiente fue de 20 mL y la velocidad lineal de trabajo fue de 100 cm/h.

Las condiciones finales de la escala analítica se realizaron aplicando el eluato de la G- 25 a la

columna XK 26/20 (PHARMACIA, Suecia) empacada con 5 mL del Q-Sefarosa FF (PHARMACIA,

Suecia) y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % Tween 20 a pH 5. Este proceso fue

realizado a temperatura ambiente. Seguidamente se realizó un lavado con el mismo tampón de

equilibrio pero a pH 4. La elusión fue realizada con 50 mM NaAc, 75 mM NaCI a pH 5. El proceso fue

controlado mediante un detector UV a 280 nm (PHARMACIA, Suecia) y un registrador gráfico

(PHARMACIA, Suecia). Todos los eluentes fueron colectados hasta llegar a la línea base y el flujo

lineal de trabajo fue de 100 cm/h. Este paso se realizó en un FPLC (PHARMACIA, Suecia).

c) Establecimiento de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas

Al producto de intercambio iónico se le añadió sulfato de amonio hasta una concentración final del 20

% de saturación, se agitó hasta su completa disolución. Esta fracción fue aplicada a una columna XK

10/20 (PHARMACIA) previamente empacada con 1 mL de TSK-Butilo-650 (S) (Tosohaas, Japón) y

equilibrada con 50 mM NaAc, 20 % (NH4)2S04 a pH 5, a un flujo lineal de 50 cm/h. Un lavado fue

realizado con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5 y la Epohr fue eluída de la

columna con 50 %


29

de Etanol a -20 °C Este material se dejó en reposo durante 2 horas. El equipamiento utilizado fue el

mismo que el del paso anterior.

Para realizar los estudios de agregación se trabajó con 0.5 mL de matriz en vez de 1 mL. Las

condiciones de trabajo fueron las mismas que las descritas anteriormente.

d) Establecimiento de la Precipitación etanólica.

El producto de hidrofobicidad después de 2 horas en etanol al 50 % se sometió una precipitación al 90

% de etanol y posteriormente se centrifugó a 12 000 rpm (rotor 20- 12) durante 15 minutos. El

precipitado se resuspendió en tampón PBS (2,7 mM KCI, 0,25M NaCI, 7,9 mM Na2HP04, 1,7 mM

KH2P04 pH 7) en el mismo volumen inicial.

e) Establecimiento de la cromatografía de Filtración en Gel-HPLC.

Los estudios de agregación se realizaron mediante Filtración en Gel-HPLC (HPLC- MERCK

HITACHI), para lo cual se empleó una columna TSK 3000 PW, 7,5 x 600 mm, equilibrada con el

tampón PBS. El volumen de muestra aplicada fue de 50 µL en todos los casos y el flujo de trabajo fue

de 0,4 mL/min. La lectura fue realizada a una absorbancia de 226 nm (λ.).

f) Estudio comparativo entre las diferentes Eritropoyetinas humanas recombinantes

Se comparó la Epohr obtenida por el proceso de purificación desarrollado con las eritropoyetinas

comerciales RECORMOM y EPREX en cuanto a su patrón de isoformas en la focalización

isoeléctrica. Esta se desarrolló en el sistema Fast System utilizando el procedimiento descrito en

“Focalización Isoeléctrica”. Se utilizaron bulbos comerciales de RECORMON y EPREX donde se

consideró una concentración de 10 µg/mL. La Epohr de estos bulbos fue desalada y concentrada

hasta 1mg/mL.

2.3 Escalado del proceso de purificación.

Todos los pasos del proceso de purificación analítico fueron escalados 56 veces, exceptuando la

Cromatografía de Exclusión Molecular la cual se aumentó en 25,5 veces.

A continuación se exponen todos los diseños del escalado realizado para cada paso cromatográfico.


30

Tabla 2.2. Escalado en cuanto al volumen de muestra a procesar en el proceso de purificación de la Epohr del CIGB Escala analítica Escala piloto

Volumen de cosecha/lote 250 mL 14 L

Tabla 2.3. Parámetros del escalado de la etapa de G-25 del proceso de purificación de la Epohr del CIGB.

Parámetro Escala analítica Escala piloto Altura Lecho empacado 50 cm 80 cm Diámetro de la columna 5 cm 20 cm Flujo lineal 30 cm/h 30 cm/h Volumen del gel 980 mL 25 L Carga de la columna 25 25 No. Corridas/lote 1 2-3

Tabla 2.4. Parámetros del escalado de la etapa de intercambio iónico del proceso de purificación de la Epohr del CIGB

Parámetro Escala analítica Escala piloto Altura Lecho empacado 1 cm 2,8 cm Diámetro de la columna 2,5 cm 11,3 cm Flujo lineal 100 cm/h 100 cm/h Volumen del gel 5 mL 280 mL Carga de la columna 1 G-25 2 G-25 No. Corridas/lote 1 1

Tabla 2.5. Parámetros del escalado de la etapa de hidrofobicidad del proceso de purificación de la Epohr del CIGB

Parámetro Escala analítica Escala piloto Altura Lecho empacado 0,5 cm 1,28 cm Diámetro de la columna 1,6 cm 5 cm Flujo lineal 48 cm/h 48 cm/h Volumen del gel 0,5 mL 25 mL Carga de la columna 1 Intercambio Iónico 1 Intercambio Iónico No. Corridas/lote 1 1

Tabla 2.6. Parámetros del escalado de la etapa de Exclusión molecular-HPLC del proceso de purificación de la Epohr del CIGB

Parámetro Escala analítica Escala piloto Altura Lecho empacado 60 cm 60 cm Flujo lineal 3,2 cm/h 3,2 cm/h Volumen del gel 26,4 mL 217 mL Carga de la columna 2,5-3 % 2,5-3% No. Corridas/lote 1 2


31

2.4 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación

Para determinar los porcientos de agregados de cada variante estudiada, se emplearon las mismas

condiciones de corrida expuestas en el epígrafe 2.2 e). Se tomó como porciento (referente al área

bajo la curva de cada pico) lo reportado por el programa de procesamiento de los datos del equipo

HPLC.

2.4.1 Influencia del sulfato de amonio sobre la agregación de la proteína

A la muestra proveniente del intercambio iónico se le añadieron diferentes concentraciones de sulfato

de amonio (0, 5, 10, 20 y 30 % de saturación). Las muestras se mantuvieron en agitación durante 15

min a 4°C, posteriormente fueron filtradas y aplicadas en la columna de Filtración en Gel.

2.4.2 Estudio de la cinética de agregación

Para realizar el estudio de la cinética de agregación de la Epohr eluída de la matriz hidrofóbica se

empleó la Cromatografía de Exclusión Molecular en HPLC. Las condiciones de trabajo fueron

similares a las que se describen en el epígrafe 2.2 e). Una vez eluída la Epohr (tiempo 0 min) se

tomaron muestras a diferentes tiempos hasta las 2 horas: 0, 30, 60, 90 y 120 minutos. Además, a

cada variante anterior se le realizó una precipitación etanólica al 90 % y el producto resuspendido se

analizó también por Filtración en Gel-HPLC

2.4.3 Determinación de la influencia de la concentración de la proteína a la salida de la columna de

hidrofobicidad sobre la agregación de la molécula

- Estudio de dilución del eluato de la Cromatografía Hidrofóbica con etanol

Se realizó el proceso de purificación por la Cromatografía de Hidrofobicidad como se describe en el

epígrafe 2.2 c) de Materiales y Métodos. Seguidamente se realizan sucesivas diluciones del eluato

con etanol al 50 %: 0, 1/2, 1/4 y 1/8. Posteriormente se aplicaron a la columna de Filtración en Gel a

los tiempos 0 y 120 minutos.

- Influencia de la carga de la columna sobre la agregación de la molécula.

Diferentes cantidades de Epohr eluída de la Cromatografía de Intercambio Iónico le fueron aplicadas a

la columna de TSK-Butílo en las cantidades 0,2; 0,4; 1.0; 1,6 y 3,2 mg de proteína / mL de gel. Las

condiciones de lavado y elusión fueron realizadas como se describió en el epígrafe 3.2 c). El eluato de

cada una de las cargas fue aplicado en la columna de Filtración en Gel a los 0 y 120 minutos.


32

- Influencia de la concentración de la proteína sobre el recobrado de la precipitación etanólica

Para determinar el recobrado del paso de precipitación etanólica para cada variante de dilución con

etanol se calculó la cantidad de proteína total antes y después de la precipitación. Se dividió el valor

de concentración de proteína de la muestra producto de la resuspensión del precipitado con el

tampón PBS entre el valor de concentración de proteína de la muestra antes de precipitar. El valor

resultante se multiplicó por 100.

- Determinación de la influencia de la dilución con el tampón PBS del eluato de la columna de

hidrofobicidad

Al eluato de la columna de hidrofobicidad se le realizaron las siguientes diluciones con tampón PBS:

0,1/2,1/4, 1/8 y posteriormente se aplicaron a la columna de Filtración en Gel-HPLC al tiempo 0 y 120

minutos.

2.4.4 Influencia de la matriz de hidrofobicidad en la agregación de la proteína

Se tomó el eluato del intercambio iónico y se fraccionó en dos, uno de ellos se aplicó a la columna de

hidrofobicidad a 1 mg de proteína por mL de gel. La otra fracción se dializó contra agua y se

concentró al doble del volumen con que eluyó la muestra anterior de la columna de hidrofobicidad. A

esta fracción se le añadió etanol absoluto con agitación hasta una concentración final de 50 % de

etanol. Una vez hecho lo anterior se realizó la cinética en la columna de Filtración en Gel-HPLC a los

tiempos 0, 60 y 120 minutos para los dos casos. Para este experimento se realizaron tres réplicas.

2.4.5 Influencia del Tween 20 en la agregación de la proteína.

El eluato de la Cromatografía de Intercambio Iónico se fraccionó en dos volúmenes una de las partes

se aplicó a la columna de hidrofobicidad siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. El eluato

obtenido se aplicó a distintos tiempos a la columna de Filtración en Gel (0, 60, 120 minutos y el

precipitado a los 120 minutos). A la otra fracción se le realizó el mismo procedimiento anterior pero la

elusión en la columna de hidrofobicidad fue con etanol al 50 % y 0,01 % Tween 20.

2.5 Técnicas analíticas.

Con el objetivo de conocer las características cuantitativas y cualitativas de cada paso se realizaron

controles analíticos a las muestras resultantes de cada ensayo. Considerando los requerimientos

establecidos para productos biológicos para uso en humanos (USP XXIV/ 02) se emplearon las

siguientes técnicas.


33

a) Determinación de Concentración de Proteínas Totales.

La determinación de la concentración de proteínas totales en las muestras intermedias del proceso

fue realizada por el método descrito por Bradford (Bradford, 1976). Se utilizó en el ensayo una curva

patrón de albúmina de suero bovino en un rango de concentraciones comprendido entre 0,01 y 0,2

mg/mL. La lectura fue realizada en un espectrofotómetro Genesys 2 (modelo MSGENE01, EUA) a

una longitud de onda de 595 nm. Para las muestras finales se empleo el método descrito por Lowry

(Lowry y colaboradores, 1951).

b) Electroforesis desnaturalizante en gel de Poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio.

Las electroforesis en gel de poliacrilamida se realizaron al 15% siguiendo el procedimiento descrito

por Laemmli (Laemmli, 1970). En la preparación de las muestras se les adicionó un volumen de

tampón reductor compuesto por Tris-HCI pH 6,8, β- mercaptoetanol, SDS 20 % y Glicerol (20%),

utilizándose el bromofenol azul como marcador del frente de corrida.

En la corrida se utilizó una cámara de electroforesis y una fuente de corriente EPS 3500 XL

(PHARMACIA. Suecia). La tinción se realizó con azul brillante de Coomassie G-250 al 0,05 % y para

la destinción una mezcla de ácido acético (10%), metanol (10%)

c) Determinación de pureza.

Para el criterio de pureza, se procesaron los resultados de las SDS-PAGE por densitometría

utilizando el densitómetro (Model GS-700 (BioRad, USA). Las imágenes obtenidas se analizaron con

el paquete de programas ’’Molecular Analyst” (Bio-Rad, versión 1.4, USA 1992).

d) Técnica de inmunoidentificación por Western-Blot.

Las muestras fueron aplicadas a un gel de electroforesis para posteriormente ser transferidas las

bandas de proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante un equipo de transferencia (Biorad).

Se realizó el bloqueo de la misma con leche descremada al 5 %, posteriormente se incubó durante 2

h a 37 °C. Seguidamente se añadió por 1 hora el anticuerpo monoclonal anti-Epohr (obtenido en el

CIGB de Sancti Spíritus). Finalizado este paso se realizaron lavados con PBS al 1 % y PBS/Tween al

0,05 %, una vez concluidos los lavados se añadió el conjugado Proteína A/ Peroxidasa (50 mL de

PBS/Tween 20 + 6,25 µL de conjugado. Finalmente se realizó el revelado, utilizando para ello

Diaminobenzidina (0,05%) (Towbin y colaboradores, 1979).


34

e) Control de pureza por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Filtración en Gel (HPLC).

La Cromatografía Líquida de alta Eficacia en Filtración en Gel se basó en la relación entre la talla

molecular y el tiempo de retención de los diferentes componentes de la muestra. Este análisis

permitió determinar la homogeneidad molecular de las muestras de proteínas a analizar.

Todas las separaciones cromatográficas se realizaron utilizando una bomba de HPLC Merck-Hitachi

modelo L7110 (Merck-Hitachi, Alemania), un detector de longitud de onda variable UVL-7400 (Merck-

Hitachi, Alemania) y una interface D-7000, (Merck Hitachi). Para la adquisición y procesamiento de

los datos se utilizó LaChrom (Merck-Hitachi, Alemania). La absorbancia fue registrada a 280 nm. La

solución de trabajo fue Tampón D (0,13 M NaCI, 8 mM NaH2P04. 2H20, 8 mM Na2HP04, 6 mM EDTA

(Tritiplex III), pH 6,5).

Para separar las diferentes especies de proteínas se utilizó una columna TSK G3000PW (7,5 x 600

mm, TOSOHASS) manteniendo un flujo constante de 0,4 mL/min con un tiempo de duración de la

corrida de 100 minutos.

Se aplicó aproximadamente 100 ug de proteína de la muestra y del material de referencia. Para las

muestras y el material de referencia se hizo el reporte de los resultados, donde el perfil

cromatográfico de la muestra a analizar debe corresponderse con el perfil obtenido para el material

de referencia. La columna se conservó en una solución de Azida de sodio al 0.05 %.

f) Determinación de proteínas contaminantes por la técnica de Inmuno-dot.

Es un método de identificación y semicuantificación de proteínas. Las muestras se aplicaron en los

pocilios del equipo de Dot Blot (Biorad,USA) el cual se mantuvo conectado al vacío con el objetivo de

que las proteínas se quedaran retenidas en la membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se incubó

la membrana en leche al 5 % en PBS 1X/Tween 0.05 % a pH-7.3, durante 2 horas a 37 °C, al pasar

este tiempo se lavó la membrana 3 veces con PBS 1X, una vez con PBS Tween 0,05 % y

nuevamente 3 veces con PBS, luego se incubaron con el anticuerpo durante 1 hora y 30 minutos a 37

°C. Terminado este tiempo de incubación se repitieron los lavados descritos anteriormente,

seguidamente se le añadió el conjugado y se incubó a temperatura ambiente por 1 hora. Realizados

los pasos anteriores se procedió a revelar la reacción antígeno-anticuerpo con 3-3 Diaminobencidina

+ PBS + Peróxido de hidrógeno 0.015%.


35

g) Determinación de la actividad biológica in vivo.

El procedimiento empleado para obtener la actividad biológica de la Epohr esta basado en el método

reportado por Cotes y Bangham (Cotes y Bangham, 1961). Los ratones son sometidos a hipoxia 14 h

al día, durante 21 días a una presión de 0,5 atm. Tres días después de finalizada la hipoxia son

inoculados intraperitonealmente con diferentes dosis de Epohr de un patrón de trabajo (1 mg de

Epohr equivale a 100 000 Ul) y de la muestra a testar. Grupos de 5 ratones 48 h después se les

inocula Fe59 en solución salina por vía intravenosa, 24 h después se desangran los ratones y se

realiza el conteo de radioactividad presente en las muestras de sangre. Los resultados obtenidos se

linealizan mediante una transformación logarítmica. La potencia se estima según el método descrito

por Finney (Finney, 1964)

h) Determinación del peso molecular de la proteína

Proteínas de alto peso molecular

Se realizó una curva de calibración para la columna TSK 5000 PW, con un coeficiente de correlación

de 0.9967, utilizando las proteínas: Albúmina (69 000 Da), Aldolasa (158 000 Da), Catalasa (240 000

Da), Ferritina (450 000 Da), Tiroglobulina (669 000 Da). El flujo de trabajo usado fue de 0.5 mL / min.

ó 27.17 cm / h y utilizando el tampón PBS pH

7.

Proteínas de hasta 800 kDa.

Se calibró la columna TSK 3000 PW, a 0,4 mL/min. ó 54,35 cm / h, utilizando el tampón PBS pH 7 y

las proteínas: Citocromo C (12 500 Da), Quimotripsinógeno A (25 000 Da), Ovoalbúmina (45 000 Da),

Aldolasa (158 000 Da), Catalasa (240 000 Da), Ferritina (450 000 Da), Tiroglobulina (669 000 Da). La

curva de calibración dio un coeficiente de correlación de 0,949.

i) Focalización isoeléctrica (FIE)

A las muestras se les intercambió la solución tampón por agua destilada utilizando columnas PD10

Sephadex G25 (PHARMACIA, Suecia). Se les determinó la concentración de proteínas por análisis

espectrofotométrico o colorimétrico y se les eliminó el agua destilada utilizando el sistema de

evaporación por centrifugación al vacío Labconco CentriVap (Cole-Palmer). Luego se reconstituyeron

en agua destilada de forma tal que la concentración de proteína quedara a 1 mg/mL.

Las FIE se desarrollaron en dos sistemas acorde a las instrucciones descritas en el Manual del

Usuario del sistema electroforético Multiphor II (Multiphor II Electroforesis System, PHARMACIA,

1998).


36

j) Dicroismo circular.

Para obtener los espectros de dicroismo circular se empleó un espectropolarímetro Jasco J-T20. Las

condiciones de corridas fueron las siguientes:

Cubeta: 1 cm de paso de luz Ancho de banda: 1 nm Resolución: 0.5 nm Número de lecturas: 16

Sensibilidad: 5 mdseg Tiempo de respuesta: 1 seg Velocidad de lectura: 20 nm/min Rango de lectura:

250 nm a 320 nm

Se analizaron dos muestras de Epohr. Una se diluyó con etanol hasta que la concentración final del

solvente en la muestra fue del 50 % y a la otra se le añadió igual volumen de agua destilada. Ambas

muestras presentaron igual concentración final de proteína.

Para analizar si el efecto del etanol sobre la molécula de Epohr era reversible, se eliminó el etanol (a

los 120 min. de incubación con etanol), empleando una columna PD- 10 (PHARMACIA). La muestra

que no contenía etanol también se aplicó a esta columna para que presentara características

similares a la anterior, k). Análisis estadístico

Todos los resultados fueron analizados con el programa profesional soportado en Window

STATGRAPHICS Plus for Window 2,1.

2.6 Estudio de prefactibilidad de la producción de la Eritropoyetina humana recombinante.

Para realizar estos estudios, se empleó la metodología recomendada por UNESCO (UNESCO,

manual for Evaluation of Industrial Projects, 1986) y un programa de cálculo en Excel desarrollado al

efecto.

Los parámetros fundamentales que se calculan por esta metodología son:

VAN: Determina las ganancias esperadas del proyecto en un tiempo dado (horizonte del proyecto),

calculadas al valor actual del dinero. Dado que el VAN representa la verdadera contribución

económica del proyecto (en dinero de hoy) resulta válido como criterio de aceptación o rechazo de

proyectos.


37

TIR: Es una medida de evaluar el ritmo al cual el capital invertido es capaz de generar dividendos, por

lo cual es un indicador de la rentabilidad del proyecto. Nos dice cuál es la tasa de interés compuesta

que estarían rindiendo en promedio los fondos atados al proyecto. Es una tasa fácilmente comparable

con otras inversiones alternativas. También se puede interpretar la TIR desde otro enfoque: es la

máxima tasa de interés que toleraría el proyecto si este fuera financiado totalmente a partir de capital

prestado, siempre y cuando la duración sea la misma.

TRI: Esta medida indica la cantidad de años que transcurre hasta recuperar la inversión Inicial del

proyecto

Resultados v discusión

38

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para obtener el registro de un producto biofarmaceútico es necesario realizar una gran cantidad de

actividades o etapas sin las cuales nunca llegaría el nuevo producto al mercado. Es necesario

cumplir con todos los aspectos regulatoríos, económicos y técnicos que garanticen la seguridad y

éxito del producto. De forma general existen documentos regulatorios que pueden ser más

generales o específicos según el tipo de producto. El procedimiento de las compañías

farmacéuticas es privativo y específico para cada una, según las especificidades propias y nunca

es publicado, ya que se considera como parte de los valores intangibles que pertenecen a la

compañía.

La etapa del desarrollo del producto tiene una gran importancia debido fundamentalmente a:

1. En esta etapa se suministra la cantidad inicial del ingrediente farmacéutico activo para los

estudios toxicológicos y de formulación.

2. Se suministra el producto para los estudios clínicos de las diferentes fases hasta el

registro.

3. Se realiza la selección, el escalado y la validación de todos los procesos garantizando una

transferencia adecuada de la escala piloto hasta la productiva.

Después que el proceso ha sido aprobado por las agencias regulatorias, se hace extremadamente

costoso y requiere mucho tiempo la introducción de cambio al proceso ya establecido. Por lo

anterior se plantea que el proceso hace al producto (Petrides y colaboradores, 1996 y Petrides y


3.1. Diseño de la estrategia de desarrollo del ingrediente activo.

La Figura 3.1 muestra el esquema general que se propuso para el desarrollo del

proceso de obtención de la Epohr. Este esquema comprende todas las etapas del desarrollo de un

Ingrediente Biofarmacéutico Activo, que son necesarias para que pueda cumplir con las

especificaciones y regulaciones establecidas.

A continuación se presentan los resultados del desarrollo del proceso de obtención de la Epohr.


39

Fig 3.1. Diagrama de bloque de la estrategia de desarrollo de la Epohr desarrollada en el CIGB.


40

3.1.1 Preparación de la estrategia de purificación Para realizar el diseño del proceso de purificación se tuvieron las siguientes consideraciones:

1. El hospedero de expresión es CHO en cultivo: Dada la complejidad de los medios de cultivos de las

células de mamífero, es necesario identificar en primer lugar los posibles contaminantes principales que se

añaden al medio de cultivo (Por ejemplo rojo fenol, insulina, amino ácidos etc).

2. Teniendo en cuenta el hospedero de expresión, se hace necesario realizar un proceso de validación viral,

por lo cual se deben tener en cuenta pasos de eliminación e inactivación viral ( CPMPa, 1996; FDA, 1990;

ICH,1997)

3. La proteína de interés (Epohr), presenta isoformas activas e inactivas. Las activas se corresponden con la

ácidas, determinando el tiempo de vida media del producto en sangre y la actividad in vivo (Goldwasser y

colaboradores, 1974; Fukuda y colaboradores, 1989). Por lo anterior es necesario el establecimiento de un

paso cromatografico que permita eliminar las isoformas básicas.

4. Desde el punto de vista regulatorio sólo se pueden emplear las formas monoméricas de la proteína

(European Pharmacopeia, 2002). Por tanto se debe incluir, en el caso de existir otras formas de la

molécula, un paso de selección de estas formas.

5. El proceso a desarrollar debe tener aspectos novedosos, que lo diferencien de los que están actualmente

en el mercado.

6. El proceso a desarrollar debe ser capaz de eliminar todos los contaminantes que aporta el hospedero de

expresión como el ADN y proteínas del hospedero (European Pharmacopeia, 2002).

Teniendo en consideración los aspectos antes señalados fue necesario establecer un primer paso que

eliminara el rojo fenol del medio de cultivo y adecuara el pH de la preparación para los pasos siguientes.

De todos los posibles pasos se escogió la cromatografía de exclusión molecular, pues hasta el momento de

realización de este trabajo no se había reportado el empleo de este método como primer paso de purificación

de la Epohr (Miyake y colaboradores, 1977; Sieber y , colaboradores 1977; Yanagawa, y colaboradores , 1984;

Lee, 1980; Krystal, 1986; Fritsch, 1986; Hewick y colaboradores, 1987; Lai y colaboradores, 1987; Lin, 1990;

Merrifield, 1990; Ghanem y colaboradores; 1994; Zanette D, 1996; Se Pu, 1998). Esto facilitaría el

otorgamiento de la patente de proceso. Además los


41

recobrados reportados para este tipo de cromatografía son altos (Gel Filtration, Pharmacia Bíotech, 2001) y

también brinda la posibilidad de reducción de costos por equipamiento ya que con un mismo sistema

cromatográfico es posible realizar varios pasos de cromatografía del proceso productivo.

Como segundo paso de purificación se diseñó una Cromatografía de Intercambió Iónico, pues era necesario

seleccionar las isoformas más ácidas y a su vez aumentar la pureza de la preparación. También este tiene

ventajas desde el punto de vista de productividad, ya que la geometría de la columna no afecta el proceso, por

lo que se puede trabajar con columnas anchas y de poca altura, permitiendo altos flujos (Scopes, 1994;

Janson, 1998; Ion Exchange, Pharmacia Biotech, 2001). Esto es importante en los pasos de captura donde se

deben procesar grandes volúmenes de muestra.

Adicionalmente, este también puede funcionar como primer paso de eliminación viral. Como paso de pulido

final se planificó emplear la Cromatografía de Hidrofobicidad. Esta cromatografía puede emplearse como

segundo paso de eliminación viral y también como posible paso de inactivación viral. La inactivación se puede

lograr, realizando el diseño experimental de forma tal que la proteína de interés eluya en presencia de

solventes orgánicos (Scopes, 1994). Además, ninguno de los procesos de purificación reportados emplearon

esta cromatografía (Miyake y colaboradores, 1977; Sieber y colaboradores, 1977; Yanagawa, y colaboradores,

1984; Lee, 1980; Krystal G, 1986; Fritsch E, 1986; Hewick y colaboradores, 1987; Lai y colaboradores, 1987;

Lin, 1990; Merrifield, 1990; Ghanem y colaboradores; 1994; Zanette D, 1996; Se Pu, 1998). Por último está

cromatografía es la más adecuada como paso de eliminación de ADN (Hydrophobic Interaction, Pharmacia

Biotech, 2001).

Finalmente se consideró introducir un paso de Cromatografía de Exclusión Molecular para eliminar (en el caso

de existir) formas agregadas de la hormona.

3.1.1 Desarrollo del proceso de purificación a escala analítica a) Establecimiento de los parámetros de

operación de la Cromatografía de Exclusión Molecular.

Partiendo de lo expuesto en el epígrafe anterior se escogió como primer paso de purificación la cromatografía

de exclusión molecular, específicamente se seleccionó la matriz Sephadex G-25 (PHARMACIA,Suecia). Ésta

selección se realizó teniendo en cuenta las buenas propiedades físicas y químicas de la misma (Gel Filtration,

Pharmacia Biotech, 2001).


42

Los resultados del cromatograma mostraron varios picos en la elusión (Fig 3.2), el primero de los cuales

corresponde a las proteínas, seguidamente eluyen los aminoácidos que se encuentran presentes en el medio

de cultivo y por último los pigmentos del indicador empleado en los cultivos. De esta forma se pudo eliminar

tanto todos los pigmentos presentes en el medio de cultivo como la mayor parte de los aminoácidos presentes

que afectan la capacidad de adsorción de la Epohr en el intercambio iónico. Por último este paso posibilita el

acondicionamiento del material en cuanto a tampón y pH para pasar seguidamente a una Cromatografía de

Intercambio Iónico.

Para conocer las mejores condiciones de velocidad lineal (X1) y de carga (X2) y su influencia en el recobrado

del proceso (Y1, se realizó un diseño factorial 32. Se hicieron 9 corridas experimentales con dos réplicas cada

una (Tablas 3.1, 3.2, 3.3 y tabla 9.1 del Anexo 2).

Fig 3.2. Cromatograma tipo de la Cromatografía de Exclusión Molecular del proceso de purificación de la Epohr. El pico 1 representa la fracción correspondiente a la elusión de las proteínas, 2: Elusión de los componentes del medio de cultivo de bajo peso molecular (por ejemplo los Aminoácidos) y 3: Elusión de los pigmento del Rojo fenol.


43

Tabla 3.1. Estudio de los diferentes parámetros que influyen en la Cromatografía de Exclusión Molecular (Sephadex G-25). Velocidad lineal igual a 10cm/h.

Tabla 3.2. Estudio de los diferentes parámetros que influyen en la Cromatografía de Exclusión Molecular (Sephadex G-25). Velocidad lineal igual a 20 cm/h.

Tabla 3.3. Estudio de los diferentes parámetros que influyen en la Cromatografía de Exclusión Molecular (Sephadex G-25). La velocidad lineal igual a 30 cm/h.

Carga (%)

Voi.inicial (mL)

Conc.Prot (mg/mL)

Prot.Total (mg) Voi.

Elusión (mL)

Conc.Prot (mg/mL)

Prot.Total (mg)

Recobrados (%)

10 16,0 0,08 1,28 20,0 0,04 0,8 62,5 16,0 0,08 1,28 19,6 0,04 0,78 61,0

20 32,0 0,08 2,56 31,6 0,06 1,89 74,0 32,0 0,08 2,56 36,0 0,05 1,81 70,0

30 48,0 0,09 4,32 30,0 0,08 2,4 55,5 48,0 0,09 4,32 35,1 0,06 2,17 50,3 La concentración de la proteina fue determinada por el método de Bradford. La muestra se aplicó a una columna XK 26 empacada con 160 mL de la matriz y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5.

Carga (%)

Voi.inicial (mL)

Conc.Prot (mg/mL)


Elusión (mL)

Conc.Prot (mg/mL)

Prot.Total (mg)

Recobrados (%)

10 16,0 0,08 1,28 20,0 0,03 0,60 46,8 16,0 0,08 1,28 19,6 0,03 0,58 46,0

20 32,0 0,10 3,20 35,0 0,08 2,80 87,5 32,0 0,10 3,20 35,4 0,08 2,83 88,4

30 48,0 0,08 3,84 45,0 0,07 3,15 82,0 48,0 0,08 3.84 48,1 0,06 2,88 75,0 La concentración de la proteína fue determinada por el método de Bradford. La muestra se aplicó a una columna XK 26 empacada con 160 mL de la matriz y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5.

Carga (%)

Voi.inicial (mL)

Conc.Prot (mg/mL)


Elusión (mL)

Conc.Prot (mg/mL)

Prot.Total (mg)

Recobrados (%)

10 16,0 0,08 1,28 15,0 0,05 0,75 58,6 16,0 0,08 1,28 16,3 0,05 0,81 63,0

20 32,0 0,08 2,56 40,0 0,06 2,40 93,7 32,0 0,08 2,56 40.9 0,06 2,45 95,7

30 48,0 0,08 3,84 40,0 0,05 2,00 52,0 48,0 0,08 3,84 46,0 0,04 1,84 47,9 La concentración de la proteína fue determinada por el método de Bradford. La muestra se aplicó a una columna XK 26 empacada con 160 mL de la matriz y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5.


44

A partir de estos resultados fue posible ajustar la variable dependiente del modelo. En el Anexo 3 se

muestran los resultados del procesamiento estadístico para la variable Y1. En la Tabla 3.4 se resumen

estos resultados y en la Figura 3.3 aparece la superficie de respuesta que genera dicho modelo. El

diagrama de pareto que muestra la significación de los parámetros se muestra en la Figura 3.4.

La variable significativa (p<0,05), resultó ser sólo el terminó cuadrático de la carga (X2). La ecuación del

modelo ajustado:

Y,= 88,6167- 26,5 X22 (I)

Como se puede ver en el modelo, la carga resulta significativa, dicho resultado es lógico de acuerdo a lo

reportado para este tipo de cromatografía (Scopes, 1994, Gel Filtration, Pharmacia Biotech, 2001). El

signo negativo y la significación del término cuadrático indican que alrededor del punto central existe un

máximo de recobrado y que por tanto si variamos los porcientos de carga por debajo o por encima de

este punto central el recobrado del proceso disminuye.

Se puede plantear que el modelo ajusta, si se tiene en cuenta el valor de P (0,015) y que el coeficiente

Durbin Watson del modelo es mayor que 1,4. El valor de R2 obtenido no fue muy alto, pero teniendo en

cuenta que el objetivo del diseño experimental era conocer la influencia de la velocidad lineal y la carga

sobre el recobrado se puede considerar este aceptable, aun más para los procesos biológicos.

Tabla 3.4. Resultado del procesamiento estadístico de la variable Y-, (Recobrado), en el estudio de las mejores condiciones de operación de la Cromatografía de Exclusión Molecular en el proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinate.

Fuente Coeficiente F Probabilidad (p) b0 88,6167 14,3465 0,0000 X1 3,13333 0,926143 0,3726 x2 2,06667 0,61086 0,5527 X1

i2 -5,6 -0,95565 0,3581

-0,5 -0,120669 0,9060 X2

2 R2=65,32

-26,5 R2 (ajustado) =50,88

-4,52227 Coeficiente

0,0007

Durban-Watson : 1,477

Mercedes


X1X2

Mercedes


Resultados v discusión5

45

Fig 3.3. Superficie de respuesta que refleja la influencia de la velocidad lineal y la carga sobre el recobrado de la cromatografía de exclusión molecular, en el proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante.

Diagrama Pareto para el Recobrado

Efecto estandarizado

Fig 3.4. Diagrama de pareto de los resultados del estudio de la influencia de los parámetros de operación de la cromatografía de exclusión molecular del proceso de purificación de la Eritropoyetina humana recombinante. A: Velocidad lineal (cm/h), B: Carga (%).

Teniendo en cuenta que la velocidad lineal resultó estadísticamente no significativa y que desde el punto

de vista de productividad conviene trabajar a valores de carga mayores (aproximadamente 25 %), se

realizaron otras dos corridas experimentales con 25 % de carga y 30 cm/h de velocidad lineal. Los

resultados de recobrados obtenidos


46

fueron de 94,9 ± 2,85 (Tabla 3.5). Se consideró que este valor es muy bueno, por lo que

se empleó esta condición de trabajo en la escala analítica a establecer. Tabla 3.5. Estudio de los diferentes parámetros que influyen en la Cromatografía de Exclusión Molecular (Sephadex G-25). Los parámetros operacionales empleados fueron: Velocidad lineal igual 30 cm/h y un 25 % de carga

Para establecer el paso de la Cromatografía de Exclusión Molecular a la escala analítica final, se

tomó como consideración procesar el volumen de cosecha que se obtiene por cada frasco de

cultivo. Por cada frasco se producían aproximadamente 250 mL de cosecha, por lo que se decidió

trabajar con una columna empacada con 980 mL de matriz (aproximadamente 25 % de carga). En la

Figura 3.5 y en la Tabla 3.6 se muestran los resultados obtenidos para esta escala. Los recobrados

de la etapa son similares a los obtenidos en el experimento exploratorio.

Fig 3.5. Electroforesis SDS-PAGE de la muestra de Epohr del proceso de purificación analítico típico después de cada paso cromatogràfico. 1- Patrón de Pesos moleculares (PM), 2- extracto inicial, 3- G-25 elusión, 4- Lavado de la Cromatografía de Intercambio Iónico, 5- elusión de la Cromatografía de Intercambio Iónico, 6- Lavado de la Cromatografía de interacciones hidrofóbicas 7- Elusión de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbica , 8- Epohr control positivo. Se aplicó la misma cantidad de proteina para cada muestra (5,6,7,8).

Muestra Volumen (mL) Conc. Proteína Proteína Total Recobrado (mg/mL) (mg) (%>

Inicial 40 0.08 3.2 100 Elusión (R1) 52.2 0.06 3.13 97.8 Elusión (R2) 59.0 0.05 2.95 92.1

La concentración de la proteína fue determinada por el método de Bradford. La muestra se aplicó a una columna XK 26 empacada con 160 mL de la matriz y equilibrada con el tampón 50 mM NaAc, 0,01 % de Tween 20 a pH 5.

PM (KD) 1 2 3 4 5 6 7 8


47

Una vez establecida la escala analítica de la exclusión molecular se procedió a establecer la

Cromatografía de Intercambio Iónico,

b) Establecimiento de la Cromatografía de Intercambio Iónico Considerando los aspectos discutidos

en la etapa de diseño de la estrategia de purificación, se decidió emplear como segundo paso

cromatográfico un intercambiador iónico. La selección se realizó principalmente por la posibilidad que

brinda este para seleccionar las isoformas más activas de la molécula (pH 2-4) (Goldwassen y

colaboradores, 1974). Además, el intercambio iónico es una cromatografía que permite concentrar la

muestra, al mismo tiempo que se pueden lograr buenos factores de purificación (Janson y Ryden, 1998).

Estos dos aspectos son esenciales en los procesos de producción.

Como se plantea en el capítulo de Materiales y Métodos, la matriz seleccionada fue la "Q-Sefarosa FF".

La selección se realizó teniendo en cuenta que es un intercambiador aniónico fuerte, el cual permite

trabajar con velocidades lineales superiores a 100 cm/h y a valores de pH bajos, sin pérdidas de la

capacidad del gel (Ion Exchange, Amersham Pharmacia, 2001).

Como parte de la estrategia de purificación, se decidió introducir un paso de lavado con el mismo tampón

de equilibrio, pero a pH 4,0. Este permitió eliminar de la matriz todas las isoformas de la proteína cuyos

puntos isoeléctricos fueran mayores de pH 4,0. Además ese paso garantiza que el producto final pueda

ser homogéneo entre diferentes lotes, en cuanto a presencia y cantidad.

Tabla 3.6. Resultados de pureza y recobrado de los diferentes pasos cromatográficos del proceso de purificación analítico de la Eritropoyetina humana recombinante.

Etapa del proceso Pureza (%) Recobrado del

paso (%) Recobrado (%)

acumulado Muestra inicial 0,1 100,0 100,0 Exclusión molecular 0,1 96,6 ±0,88 96,6 ± 0,88 Intercambio Iónico 88,0± 0,015 60,2 ±2,35 57,6 ± 2,88 Hidrofobicidad 100,0 ±0,00 77,2 ± 3,64 43,9± 3,28 Precipitación etanólica 100,0 ±0,00 47,0 ± 5,33 20,7 ± 0,35

La pureza fue determinada mediante electroforesis en SDS-PAGE y los valores de recobrado corresponden al de la Epohr en cada paso del proceso (3 réplicas experimentales).


48

Para determinar la condición de elusión se trabajó inicialmente con 1 ml_ de matriz y se aplicó un

gradiente lineal de sales (ver Materiales y Métodos) (Fig 3.6). Posteriormente se determinó la

molaridad de NaCI a la que eluyó la Epohr (75 mM NaCI), la cual fue la empleada como condición

final de elusión.

Para establecer la escala analítica final de trabajo se empleó 5 mL de la matriz de intercambio

iónico para trabajar al 50 % de la carga teórica de este gel, ya que era necesario aplicar

aproximadamente 12 mg de proteínas totales procedentes de la cromatografía de exclusión

molecular.

El producto eluído del intercambiador iónico se obtuvo con una pureza superior al 87 % y con un

recobrado promedio de 58,5 % (Fig 3.5 ;Tabla 3.6 y Anexo 4 ).

En la Figura 3.7 se muestran los resultados del análisis de las fracciones de los diferentes pasos

cromatográficos mediante isoelectroenfoque-western-blot (ver descripción en Materiales y

Métodos). Se puede apreciar la gran importancia del lavado a pH 4,0 que se realiza en la matriz

de intercambio iónico, pues en este se eliminan la

Fig 3.6. Estudio de la condiciones de elusión de la Cromatografía de Intercambio Iónico en el proceso de purificación de la Epohr. Se empleó 1mL de matriz Q-Sefarosa FF. La velocidad lineal empleada fue de 100 cm/h y se empleó como condición de elusión un gradiente salino de 20 mL de tampón I (de O M de NaCI a 1 M de NaCI en el mismo tampón (50 mM NaCI).Pico 1: Fracción no absorbida, 2: Lavado a pH 4,0, 3: Elusión de la Epohr, 4: Elusión de las proteínas contaminantes.


49

mayoría de las isoformas cercanas a pH 5. Además, la población seleccionada (más ácidas) se

mantiene con el mismo perfil para los pasos siguientes.

De forma general es posible plantear que la selección del método cromatográfico y la matriz fue la adecuada

ya que empleando condiciones diferentes a las reportadas en la literatura se alcanzan buenos resultados en

cuanto a recobrado. (Miyake y colaboradores, 1977; Krystal G, 1986; Ghanem y colaboradores; 1994;

Fritsch E, 1986). Se debe destacar que el factor de purificación logrado con el intercambio fue muy alto (870

veces). Inclusive comparado con un paso de inmunoafinidad empleando anticuerpos monoclonales de Epohr

(410 veces) (Ghanem y colaboradores; 1994). La explicación a este resultado puede estar dada en la

selección que se hizo en las condiciones de aplicación, lavado y elusión. Aquí se tuvo en cuenta los puntos

isoeléctricos de las proteínas que forman parte del medio de cultivo (Insulina y albúmina), las cuales no se

debían absorber a la matriz y/o podían ser eliminadas en el paso de lavado. Además la baja fuerza iónica

con que se pudo eluir la Epohr posibilitó también el alto coeficiente de purificación del método establecido,

c) Establecimiento de la Cromatografía de Hidrofobicidad

Para el establecimiento de esta cromatografía se realizó un diseño que tuvo en cuenta todas las

consideraciones ya discutidas anteriormente. En particular se realizó un

Fig 3.7. Caracterización de las diferentes fracciones del proceso de purificación analítico de la Epohr mediante isoelectroenfoque-Western-.blot. Muestra 1: Cosecha del cultivo celular, 2: Lavado a pH 4 de la Cromatografía de Intercambio Iónico (Q-Sefarosa FF), 3: Elusión de la Cromatografía de Intercambio Iónico, 4: Elusión de la Cromatografía de Interacciones Hidrofóbicas, 5: Control positivo de Epohr.


50

diseño buscando cumplir con cada uno de los objetivos propuestos para esta cromatografía.

1. Debía permitir introducir un paso de eliminación y/o inactivación viral: Existen reportes en la

literatura que emplean la precipitación de la Eritropoyetina humana con etanol al 90%, sin afectar la

actividad biológica de la misma (Miyake y colaboradores, 1977). Esto permitió hacer el análisis de

tratar de realizar la elusión de la Epohr de la matriz hidrofóbica en presencia de este solvente y

someter posteriormente esta muestra a una incubación durante un tiempo determinado, como

posible paso de inactivación viral (WHO, 1992).

2. Debía funcionar como paso de pulido final: Teniendo en cuenta la hidrofobicidad de la molécula de

Epohr y la necesidad de realizar la elusión con etanol. Se propuso añadir un 20 % de sulfato de

amonio para fomentar suficientemente las interacciones hidrofóbicas. Esto permitiría que la

molécula de interés eluyera con etanol y los contaminantes se pudieran eliminar empleando el

tampón de equilibrio del intercambio iónico suplementado con 0.02 % de Tween 20.

Los resultados experimentales mostraron que los contaminantes que están presentes en la muestra eluída

del intercambio iónico son eliminados durante el lavado que se realiza en la columna hidrofóbica (Fig 3.5;

Tabla 3.6 y Anexo 4). Además existe una fracción de la Epohr que también es eliminada en este paso. Por

último se puede apreciar que la Epohr es eluída con etanol al 50 % con una pureza por SDS-PAGE cercana

al 100 % y con un recobrado del 77 %.

Existe un solo reporte en la literatura que emplea la Cromatografía de Hidrofobicidad (baja presión) como

método de purificación de Epohr (Lee y colaboradores, 1980). Este utiliza otra matriz (Fenil-Sefarosa), la

cual fomenta mucho más las interacciones hidrofóbicas (Manual de la cromatografía de Interacciones

hidrofóbicas, Amersham Pharmacia, 2001). Por tanto hace que las condiciones que tuvieron que emplear en

la elusión fueran muy severas (20 % etilenglicol en 10 mM NaOH y 4M de cloruro de guanidio), lo cual

puede inducir la desnaturalización irreversible de la proteína. En el proceso descrito en este trabajo se

emplean condiciones de elusión que no afectan la estructura de la proteína ni su actividad biología, pues

Miyake en 1977 (Miyake y colaboradores, 1977) reportó el uso de un paso de purificación de la

Eritropoyetina


51

humana empleando etanol al 90 %, sin encontrar pérdidas de la actividad biológica de la misma.

d) Proceso de inactivación viral y precipitación etanólica

Para establecer un posible paso de inactivación viral, la muestra eluída de la columna hidrofóbica se incubó

durante 2 h a -20°C. Los resultados del estudio de la cinética de inactivación viral demostraron la necesidad

de mantener este paso en el proceso establecido (Anexo 5).

Para poder eliminar el etanol de la muestra, se implemento una precipitación etanólica al 90 %. En la Tabla

3.6 se puede apreciar que este fue el paso donde se produjeron las mayores pérdidas de la proteína de

interés. Este fenómeno se puede explicar por la influencia de la concentración de la proteína en la muestra a

precipitar, sobre el recobrado de este proceso, o sea cuando disminuye la concentración de la proteína

disminuye también el recobrado de la precipitación con solventes orgánicos (Scopes, 1994, Murray, 1990.).

El precipitado final obtenido fue analizado usando la Cromatografía de Exclusión Molecular en HPLC. Los

resultados mostraron la existencia de formas agregadas de la molécula (Fig 3.8), por lo que se decidió

incluir un paso de exclusión molecular en HPLC en la escala piloto para poder eliminar dichos agregados.

Fig 3.8. Estudios en Cromatografía de Filtración en Gel-HPLC del producto de la precipitación etanólica. Se empleo una columna TSK 3000 PW, 7.5 x 600 mm. El cromatograma 1 representa el perfil correspondiente al Material de Referencia y el 2 la elusión de la columna de hidrofobicidad a los 120 min. de reposo. La flecha indica en A la fracción agregada y en M la fracción monomérica. EI tercer pico de la muestra 2 esta asociado al etanol


52

El proceso de purificación establecido alcanzó un recobrado total de un 20,7 % (Tabla 3.6) y en la Figura

3.5 se puede apreciar los contaminantes que son eliminados en cada paso cromatográfico.

e) Caracterización final del producto obtenido en la escala analítica.

Teniendo en cuenta que la Epohr purificada mediante los pasos descritos anteriormente tiene como

objetivo su aplicación en humanos, se realizó un proceso de caracterización del producto final, que incluyó

los criterios de calidad más importantes para esta proteína según la Farmacopea Europea (European

Pharmacopeian, 2002). Los resultados mostrados en la Tabla 3.7 demuestran que el producto obtenido

tiene una alta calidad, la cual se corresponde con los estándares internacionales para este tipo de

producto. Tabla 3.7. Resultados de las diferentes corridas de la escala analítica del proceso de purificación de Epohr

Se realizó una comparación entre la Epohr obtenida por esta tecnología con las eritropoyetinas que

dominan el mercado en cuanto a su patrón de isoformas mediante isoelectroenfoque (Fig 3.9). Existió una

correspondencia en cuanto a la movilidad electroforética de las bandas mayoritarias de todas las

eritropoyetinas estudiadas, aunque la de RECORMON y la desarrollada en este trabajo presentan una

banda más básica que la de EPREX (Tabla 3.8)

Análisis/corrida Réplica No.1 Réplica No.2 Especificaciones Pureza por SDS-PAGE 100 % 100 % > 95% Pureza por Filtración en 95 % 99% > 90% Gel-HPLC

Contenido de ácido 12,4 mol AS/mol 12,7 mol AS/mol 9 a 13 Siálico prot. prot moles/mol de

proteína Actividad específica 130 000 Ul/mg 150 000 Ul/mg. > 40 000 Ul/mg

Las especificaciones establecidas para cada control se muestran en el anexo 8.(2 réplicas experimentales)

Resultados y Discusión

53

3.1.3 Escalado del proceso de purificación Teniendo en cuenta los criterios de escalados discutidos en el capítulo de Revisión Bibliográfica (Sofer

y Nytron, 1991; Sofer, 1996; Sofer y Hagel, 1997), se procedió a realizar el escalado del proceso de

purificación analítico establecido. En este sólo se varió la altura de lecho empacado (en todos los pasos

cromatográficos) debido a la disponibilidad de columnas en el mercado con la adecuada geometría. En

todos los casos la variación de la altura del lecho empacado fue en aumento, para aumentar el

Fig 3.9. Comparación de la Epohr obtenida en el proceso desarrollado con otras que se encuentran en el mercado mediante la focalización Isoeléctrica donde se incluye: Línea 1- Epohr del proceso desarrollado: línea 2-Recormon (BOEHRINGER MANNHEIM), línea 3-EPREX (Amgen).

Tabla 3.8. Comparación de las bandas individuales respecto al área total, de la Epohr obtenida mediante el proceso desarrollado y las diferentes eritropoyetinas comerciales analizadas en la focalización isoeléctrica mostrada en la Figura 3.9.

Mov. Elect (cm) 23,76 26,25 28,32 30,38 32,14 33,14

EPOCIGB 2,4 12,2 23,4 33,7 20,7 7,6 RECORMON 2,5 5,9 21,1 38,6 29,9 2,0 EPREX - 8,4 27,5 35,6 27,1 8,5

EPOCIGB: Epohr producida con el proceso desarrollado; RECORMON: Epohr producida por BOEHRINGER MANNHEIM; EPREX: Epohr producida por Amgen.


54

número de platos teóricos y garantizar una mejor eficiencia de cada proceso cromatográfico. La

escala analítica se aumentó 56 veces para todos los pasos cromatográficos exceptuando la

cromatografía en Sephadex -G-25, que se escaló 25,5 veces.

Teniendo en cuenta los resultados de pureza (Fig 3.10) y recobrado de ambos procesos (Tabla 3.9

y Anexo 6) y los resultados más importantes de control de calidad obtenidos para ambas escalas,

se puede plantear que el escalado realizado fue adecuado. Solo se observó una disminución (no

significativa, p= 0.3314) del recobrado total en la escala piloto, lo que se puede explicar por las

características del material de cosecha. Este material está sujeto a variaciones en cuanto a

presencia de contaminantes y los niveles de expresión de la proteína de interés. Además las

características entre las diferentes cosechas no son iguales.

Se puede plantear que los valores de recobrado son buenos teniendo en cuenta que el hospedero

de expresión es CHO, lo cual implica el trabajo con medios complejos y procesar varias cosechas

que tienen diferencias en cuanto a presencia y cantidad de contaminantes. Además de todas las

proteínas existen en el mercado, la Epohr es la más compleja en cuanto a características físico-

químicas (ver Capitulo de Revisión Bibliográfica)


55

Como paso final se implemento la Cromatografía de Exclusión Molecular en HPLC, tal como se

describe en el capitulo de Materiales y Métodos. Los resultados mostraron (Tabla 3.10) una gran

variabilidad en los contenidos de los porcientos de agregados obtenidos en cada lote. Además, en

algunos lotes estos valores fueron superiores a la fracción monomérica. Las diferencias entre estos

valores para los diferentes lotes indujeron a pensar que existían varios factores que pudieran estar

afectando este proceso. Por todo lo anterior, se propuso realizar un estudio de este fenómeno de

agregación para finalmente implementar una solución tecnológica al mismo.

Tabla 3.9. Comparación de las características de control de calidad del IFA obtenido por la escala analítica y piloto.

Características del Valor obtenido Valor obtenido Especificación producto final escala analítica escala piloto

Pureza por electroforesis 100% ±0.0 100% ± 0.0 > 95% Pureza por Filtración en 97 % ± 2 % 96,9% ±1,32% > 90%

Gel-HPLC

Contenido de ácido siálico(AS) 12,5 ± 1,5 mol de

AS/mol 10 ± 0,5 mol de AS/mol 9 a 13 moles/mol de

proteína Actividad biológica in vivo

140 000 ± 10 000

Ul/mg 145 137± 40 428UI/ mg > 40 000 Ul/mg

Recobrado total 20,9 ±0.48 16,0 ±3,7

El recobrado total fue considerado hasta la etapa de precipitación con etanol. Se analizaron 4 lotes a escala piloto. Las especificaciones corresponden con las del anexo 8.

Tabla 3.10. Resultados de la Cromatografía de Exclusión Molecular (HPLC) de diferentes lotes pilotos del proceso de purificación de la Epohr. ________________________________________________

Lote Agregados % del total Monómeros % del total (mg totales) (mg totales)

1 2,5 14,8 14,4 85,2 2 13,7 55,0 11,2 45,0 3 7,0 38,8 11,0 61,1 4 1,8 10,2 15,75 89,7 5 5,0 22,0 17,67 78,0

Los porcientos de agregados fueron determinados realizando el balance de materiales del producto obtenido en la Cromatografía de Exclusión Molecular en HPLC a escala piloto.


56

3.1.4 Producción del Material de Referencia De forma general el Material de Referencia se puede obtener por cualquier proceso de purificación que

garantice la alta pureza del producto final. El criterio empleado fue producirlo durante el estudio de

escalado, ya que así se garantiza la homogeneidad del mismo y las cantidades requeridas.

La obtención de este material requiere de forma general 2 meses de trabajo, por lo tanto es necesario

que en cuanto se obtenga el primer producto con la calidad requerida se proceda a su confección del

mismo. La cantidad a producir depende de las técnicas analíticas y del tipo de producto. Se requiere que

este material sea probado en estudios clínicos (WHO, 1990).

Este material se somete a todos los controles de calidad propuestos y con sus resultados, unido a los de

los primeros lotes producidos, sirve para hacer la primera propuesta de las especificaciones de calidad.

En el Anexo 7 se exponen los resultados más importantes obtenidos con el Material de Referencia

producido.

3.1.5 Establecimiento de las Especificaciones de Calidad.

Esta es una de las etapas más importantes en el desarrollo de un producto, pues ella determina la calidad

final que se le va a exigir al nuevo ingrediente y por consecuente la seguridad del mismo. Es necesario

tener en cuenta los siguientes aspectos:

1. Se debe tener en cuenta desde el diseño del proceso de purificación las especificaciones

que deberá cumplir el producto, ya que esto garantiza que el producto obtenido,

mediante el proceso desarrollado, tenga la calidad necesaria.

2. Se deben fijar las especificaciones, teniendo en cuenta las existentes para productos

similares que aparecen en la USP o en la Farmacopea Europea.

3. Existen parámetros generales que deben cumplir y que son los mismos para cualquier

producto biológico inyectable.

4. Se recomienda fijar la especificación en el valor inferior permisible, de forma tal que a

medida que aumenta el número de procesos, esta se puede ir cambiando hacia el

extremo superior de la especificación.

Para este producto (Epohr), las especificaciones generales se pueden encontrar en la Farmacopea

Europea (European Pharmacopeia, 2002). En este caso se establecieron teniendo en cuenta que es un

producto que se está introduciendo en producción. Por


57

esto se debe dar un margen de seguridad en cada especificación hasta tanto no se tenga un mayor

número de lotes, para ver la tendencia de cada parámetro y realizar los ajustes necesarios.

En este caso se produjo el Material de Referencia con el producto de los estudios de escalado, lo cual

sirvió también para el establecimiento de las especificaciones de calidad.

En el Anexo 8 se muestran las especificaciones aprobadas para nuestro producto y los valores obtenidos

para varios lotes producidos a escala piloto.

Estos resultados demuestran que el proceso desarrollado cumple con todas las especificaciones

establecidas y por consiguiente brinda un producto final activo, con alta calidad y seguridad para el

paciente.

El estudio de estabilidad a tiempo real realizado para el ingrediente activo demostró que este producto

tiene como mínimo un año de estabilidad a -20 °C, evaluando los parámetros de calidad requeridos en los

estudios de estabilidad (Anexo 9).

3.1.6 Producción de los primeros lotes del Ingrediente Farmacéutico Activo

Antes de comenzar a producir los lotes del ingrediente farmacéutico activo para los estudios de

estabilidad y preclínicos se deben haber terminado todas las otras actividades del proyecto y se deben

producir como mínimo 3 lotes consecutivos liberados por Control de la Calidad del ingrediente activo y del

producto final de forma consecutiva. Además se debe tener en cuenta las siguientes consideraciones

prácticas:

1. Se debe planificar la realización de más de 6 lotes para garantizar la liberación de

tres consecutivos.

2. Teniendo en cuenta que es la primera vez que se realizan lotes del producto se

deben extremar las medidas sanitarias para evitar el rechazo de lotes por

problemas de esterilidad y pirógenos. Entre otras medidas se recomienda esterilizar

todas las soluciones de trabajo.

3. Se debe mantener el monitoreo de muestras realizado en la fase de desarrollo para

poder tener un poco más de datos del proceso y en el caso de surgir problemas

poder tomar las medidas adecuadas y en el tiempo mínimo.

4. Con el objetivo de ahorrar tiempo se recomienda formular los lotes finales a riesgo,

o sea sin esperar la liberación del IFA.


58

5. Hoy en día se exige que los lotes para estudios clínicos se produzcan en una

instalación que cumpla con las Buenas Prácticas de Producción. Puede que la

escala sea pequeña pero que cumpla con la BPP, pues este producto será usado

en humanos. Esto también es aplicable al proceso y al personal.

6. Se requiere confeccionar el registro de lotes y la producción debe ser ejecutada

empleando los procedimientos patrones de operación elaborados para este fin.

En este caso se realizó un gran número de lotes a escala piloto, que fueron liberados por Control de la

Calidad. Los resultados de los mismos son expuestos en el epígrafe correspondiente al escalado del

proceso (Tabla 3.9 y Anexo 6). Además en el Anexo 10 se muestran las planillas de liberación de 4 lotes

del ingrediente activo producido en esta escala piloto y liberados por el área de Control de la Calidad.

Por último, el estudio de estabilidad a tiempo real del ingrediente farmacéutico activo mostró un año de

estabilidad almacenado a -20 °C (Anexo 9).


59

3.2 Estudio de la agregación que se produce durante el proceso de purificación

Durante el establecimiento del proceso de producción se realizó un estudio de la agregación de la

Epohr. Se tuvo en cuenta que según las especificaciones de calidad de este producto se permiten

solamente conformaciones monoméricas de la misma, debido a una posible aparición de anticuerpos

como resultado de su uso (European Pharmacopeia, 2002). Para esto el trabajo se enfocó en primer

lugar, en determinar el paso del proceso de purificación donde se produce la agregación (Anexo 11).

Para esto se plantearon dos hipótesis:

A: La agregación se produce a la entrada de la columna de hidrofobicidad, provocada por la adición

de un 20 % de sulfato de amonio a la muestra.

B: La agregación se produce durante la elusión de la Epohr de la columna de hidrofobicidad,

provocada por la presencia del 50 % de Etanol y/o por el efecto de la columna de hidrofobicidad.

La hipótesis A está fundamentada por el efecto que se produce sobre la proteína al añadir el sulfato

de amonio, el cual aumenta la fuerza iónica resultando en un aumento de las interacciones

hidrofóbicas (Scopes, 1994). Esto hace disminuir la solubilidad de las proteínas globulares debido al

efecto de desalado (Scopes, 1994) que se produce por la interacción proteína-proteína por las zonas

hidrofóbicas, dando como resultado la posible formación de agregados solubles a valores de

concentración salina inferiores a los de precipitación.

La hipótesis B se fundamenta por el aumento de la interacción proteína-proteína provocado por la

reducción de la actividad del agua y la constante dieléctrica en presencia de solventes orgánicos. A

medida que aumenta el contenido del solvente en la solución disminuye la solubilidad de las

proteínas. Las causas fundamentales que pueden dar lugar a esta agregación son las fuerzas

electrostáticas y de Van Der Walls (Scopes, 1994).

Examen de la hipótesis A

Para estudiar la hipótesis A se realizó el estudio de agregación a diferentes valores de concentración

de sulfato de amonio, según se describe en el epígrafe en el capítulo de Materiales y Métodos.

Los resultados obtenidos (Fig 3.11) mostraron que no se producen agregados de la Epohr al

aumentar las concentraciones de sulfato de amonio en la muestra aplicada al gel de hidrofobicidad.

Se observa que no existen diferencias entre los tiempos de retención del material de referencia

(Epohr monomérica) y las distintas muestras ensayadas, con un


60

valor de 31,39 minutos. Los otros picos después del monómero corresponden a los elementos que

componen los tampones de las muestras. De esta forma se rechaza la hipótesis A, quedando

solamente por examinar la segunda hipótesis planteada.

Examen de la hipótesis B Para examinar esta segunda hipótesis se realizó una cromatografía de Exclusión molecular- HPLC al

producto eluído de la columna de hidrofobicidad. En la Figura 3.12 se puede observar la aparición de

un pico a un tiempo de retención inferior al obtenido con la muestra del Material de Referencia. Este

de acuerdo a la curva de calibración realizada con un coeficiente de correlación de 0,9478

corresponde a un valor aproximado de 2 000 kDa (59 unidades monoméricas) (Anexo 12). Por tanto,

este resultado demuestra la veracidad de la hipótesis B o sea, el agregado se forma a partir del eluato

de la cromatografía de Butilo.

Figura 3.11. Estudio de la influencia del sulfato de amonio sobre la agregación de la Epohr. El cromatograma muestra los resultados de la gel filtración-HPLC en la columna TSK 3000 PW, 7,5x 600 mm de los diferentes estudios realizados. Los cromatogramas corresponden a: 1- 30% SA; 2- 20% SA; 3-10% SA; 4- 5% SA; 5- 0% SA; 6- Material de referencia. SA: Sulfato de amonio. La flecha indica en M la fracción monomérica y enS los elementos de los tampones. Todos los cromatogramas no se pusieron sobre un mismo eje para facilitar la visualización de los resultados.


61

Según lo reportado en la literatura (Bosissel y colaboradores, 1993), la formación de homodímeros de

Epohr que se originan a partir de la ruptura del puente disulfuro formado entre la cisteína 7 y 161,

conlleva a una pérdida de la actividad biológica in vivo, mientras que Arthur en 1998 (Arthur y

colaboradores, 1998) reportó incrementos de actividad biológica in vivo cuando logró formar dímeros

y trímeros sin intervención de las cisternas propias de la molécula de Epohr

Con el objetivo de conocer si los agregados formado en este sistema eran producto de la interacción

entre los monómeros por puentes disulfuros (enlaces covalentes) u otro tipo de interacciones débiles,

se realizó una electroforesis en condiciones reducidas y no reducidas. Los resultados mostraron (Fig

3.13) que tanto la Epohr del Material de referencia, como la fracción de agregado tuvieron el mismo

perfil electroforético o sea, en la muestra correspondiente al agregado no se observaron bandas

superiores bajo las condiciones no reducidas. Esto evidencia que el tipo de interacciones que

persisten durante la agregación son de tipo no covalente.

Esto también se corrobora mediante el ensayo de actividad biológica que se le realizó a la muestra de

la proteína agregada y monomérica, cuyos valores fueron similares (140 000 Ul).

Figura 3.12. Estudios en fFiltración en Gel-HPLC del eluato de la columna de hidrofobicidad al cabo de los 120 minutos de reposo. Se empleo una columna TSK 3000 PW; 7,5 x 600 mm. El cromatograma 1 representa el perfil correspondiente al Material de referencia y el 2 la elusión de la columna de hidrofobicidad a los 120 min. de reposo. La flecha indica en A la fracción agregada y en M la fracción monomérica.EI tercer pico de la muestra 2 está asociado al etanol.


62

Teniendo en cuenta lo anterior, si los agregados formados fueran producto de interacciones

covalentes, se obtendría la banda de la fracción agregada a una talla molecular superior a la

monómerica, bajo las condiciones no reducidas, y además la actividad biológica fuera inferior o

nula con respecto a la fracción no agregada.

3.2.1 Parámetros que influyen en la agregación de la Epohr a) Estudio de la cinética de agregación

Teniendo en cuenta, que el proceso de purificación incluye la incubación durante dos horas de la

muestra eluída en etanol al 50 % como paso de inactivación viral, se realizó el estudio de la

influencia del tiempo de reposo sobre la agregación.

El análisis estadístico mostró que para la muestra eluída de la columna de hidrofobicidad (TSK-

Butilo), existían diferencias significativas entre el tiempo 0 min y los otros tiempos (p =

0, 0095). Mientras que no obtuvo diferencias significativas entre los tiempos 60 min, 90 min

y 120 (Fig 3.14)

También se analizó la influencia del paso de precipitación con 90 % de etanol que se realiza en el

proceso de purificación una vez terminado el tiempo de reposo (120 min.). Para esto se le realizó

la precipitación a cada variante estudiada en la cinética de agregación. No existieron diferencias

significativas entre las diferentes variantes antes y después de precipitar para un mismo tiempo de

estudio (P =0,0717), pero sí hubo diferencias entre el tiempo 0 min y los tiempos a partir de 60 min

(p= 0,0095) (Fig 3.14 y Anexo 13).

Del resultado anterior se puede concluir que la precipitación con etanol no aumenta la agregación

de la Epohr en el tiempo, para los parámetros de operación establecidos.

Figura 3.13. SDS-PAGE 15% en condiciones reductoras y no reductoras de la Epohr agregada y no agregada: 1- Patrones de peso molecular; 2 y 3 condiciones reductoras del Material de referencia y agregado respectivamente; 4 y 5 condiciones no reductoras del Material de Referencia y agregado respectivamente.


63

b) Influencia de la concentración de proteína sobre la agregación - Estudio de dilución del eluato de la Cromatografía Hidrofóbica con etanol al 50 %

Es conocido que con bajos valores de concentración de proteínas se logra disminuir los efectos de

agregación debido fundamentalmente a que existen menos posibilidades de interacción proteína-

proteína (Scopes, 1994). Esto se puede corroborar con los resultados obtenidos, pues en la Fig 3.15

(Anexo 14) se observa que a medida que disminuye la concentración de la proteína, sin variar la

concentración del etanol, disminuye en el mismo orden el proceso de agregación. Por tanto se puede

plantear que este proceso de agregación es reversible. Se requiere una dilución de 1/8 para obtener

el mismo porciento de agregación que la muestra de tiempo 0 min.

No hubo diferencias significativas entre todos los valores de porciento de agregados en el tiempo cero

minuto para las distintas diluciones (p= 0,9123), por lo que el efecto de disminución de los agregados

con las diluciones depende del tiempo de reposo.

Figura 3.14. influencia del tiempo de incubación sobre la agregación de la Epohr eluída de la columna de hidrofobicidad. En el gráfico se representan las curvas obtenidas a los distintos tiempos de la muestra sin precipitar (♦) y de la muestra resuspendida después de la precipitación (■) para cada tiempo estudiado. Se compararon los puntos experimentales utilizando el paquete estadístico Statgraphics. Plus. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas (p≥0,05)


64

Figura 3.15. Estudio de la influencia de la dilución con etanol al 50 % sobre la agregación de la Epohr. En el gráfico se representan las curvas obtenidas a tiempo O minutos O, 120 minutos O . Las diluciones estudiadas fueron 1/2; 1/4 y 1/8. También se representas los resultados del experimento control (dilución 1, muestras eluída de la cromatografía Hidrofóbica a O min y 120 min, o sea en etanol al 50 %). Se compararon los puntos experimentales utilizando el paquete estadístico Statgraphics.Plus. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas (p>0,05)

- Estudio de la influencia de la carga del gel de Hidrofobicidad en la agregación de la molécula

Para analizar el comportamiento a valores superiores de concentración de proteína, se realizó un

estudio de carga de forma tal que se estudiara este fenómeno en un rango que incluyera valores

similares a los estudiados en el experimento anterior, así como valores superiores a estos.

El análisis estadístico realizado dio como resultado que existen diferencias significativas para el

tiempo 0 min., a partir del valor de carga 1,6 mg/mL con respecto al valor final de carga estudiado

(3,2 mg/mL) (p= 0,004), Se observó un incremento de los agregados en un 35 % con respecto al

menor valor de carga estudiada (Fig 3.16 y Anexos 15 y 16). La carga de trabajo en el proceso de

producción es de 1 mg/mL.


65

El comportamiento obtenido para el tiempo 120 min fue diferente con respecto al cero minuto, en el

cual existieron diferencias significativas a partir 0,4 mg/mL comparado con los valores superiores

por lo que se incrementan los agregados cuando se aumenta la carga de la columna (p= 0,007). La

curva del precipitado etanólico siguió un comportamiento similar al de los 120 min (p= 0,001).

El análisis comparativo entre las diferentes curvas graficadas en cuanto a diferencias de

agregación, mostró que a partir de 1 mg/mL existen diferencias significativas para los porcientos de

agregación (p< 0,0001). Todos los valores de agregación obtenidos para los 120 min. son

superiores a los de 0 min., a partir de la carga mencionada anteriormente. Esto corrobora los

resultados discutidos con anterioridad.

Es interesante el comportamiento de la curva del precipitado etanólico, que mostró diferencias

significativas a partir de 1,6 mg/mL comparada con 120 min (P< 0,0001), mientras que el valor de

carga correspondiente a los experimentos controles (carga 1 mg/mL, que es la empleada en el

proceso de producción), se comportó de forma similar al obtenido en los estudios anteriores. De

este análisis anterior se puede interpretar que la

Figura 3.16. Influencia de la carga de la columna de hidrofobicidad sobre la formación de agregados. Se representa el porciento de agregado para los distintos valores de cargas (0,2; 0;4; 1;1,6 y 3,2 mg/mL de gel), al tiempo O minutos O, 120 minutos O y al producto precipitado con etanol A. Se compararon los puntos experimentales utilizando el paquete estadístico Statgraphics.Plus. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas (p≥0,05)

desarrollo de un proceso de purificación y obtención del...

Documents