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APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE FRUTA PARA PRODUCCIÓN DE

ENZIMAS Y BIOMASA FÚNGICA USANDO PLEUROTUS OSTREATUS

Proyecto de grado

Por

LAURA MILENA GONZALEZ VEGA

Presentado a la Facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO

Departamento de Ingeniería Química

Diciembre 2018

ii

Aprovechamiento de residuos de fruta para producción de enzimas y biomasa fúngica usando

Pleurotus ostreatus

Copyright 2018 Laura Milena Gonzalez Vega

iii

APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS DE FRUTA PARA PRODUCCIÓN DE

ENZIMAS Y BIOMASA FÚNGICA USANDO PLEUROTUS OSTREATUS

Proyecto de grado

Por

LAURA MILENA GONZALEZ VEGA

Presentado a la Facultad de Ingeniería de la

Universidad de los Andes

En cumplimiento parcial de los requisitos para el grado de

INGENIERO QUÍMICO

Aprobado por:

Asesora, Rocío Sierra Ramírez, Ph.D.

Co-Asesor, Daniel David Duran Aranguren

Jurado, Pablo Ortiz Herrera, Ph.D.

Director del Departamento, Andres Gonzalez Barrios, Ph.D.

Departamento de Ingeniería Química

Diciembre 2018

iv

ABSTRACT

Enzyme production and biomass plays an important role in the alternative energies

perspective, since it consists of the use of organic matter, microorganisms and waste for a

safe, efficient, low-cost energy production and with less environmental impact. In order to

use the carbohydrates that are present in the biomass it is necessary to fraction and degrade

the lignocellulosic structure through pretreatment. Lignicolous fungi such as Pleurotus

ostreatus produce a wide range of well-known enzymes that are useful in the pretreatment of

agro-industrial waste. Additionally, the fungal biomass obtained from this process serves as

a promising source of food that could help resolve food scarcity problems around the world.

In this work, the potential of enzymatic production and fungal biomass of Pleurotus ostreatus

is evaluated using peels of banana, dragon fruit (yellow), gulupa, mango, pineapple, and the

whole goldenberry fruit. First of all, a fruit-based agar was prepared using 1.7g of previously

dried fruit residues at 45°C and milled to a particle size of 1mm [1] mixed with 14g agar-

agar in 1L of deionized water. The autoclaved agar was served by triplicate per each selected

residue and incubated at 27°C. Then a mycelial growth rate (cm/day) was determined

according to the visible diameter of the mycelium. After that, biomass production, reducing

sugars and enzymatic production (cellulases, pectinases, and laccases) was registered for 25

days at 27°C and 150 rpm in submerged culture using 0.4L flasks, in which 1.7 g of fruit

residues were added plus 185 ml of citrate buffer pH 5. Fungal biomass in the form of pellets

was separated at the last day of culture and measured. On the other hand, reducing sugars and

pectinase activity was determined using the DNS method. It was found that the fruit- based

agars made of goldenberry, banana and dragon fruit were the ones that promoted better the

mycelial growth of PO having a maximum speed on day 7 of 0.993 cm/day and of 0.937

cm/day for the dragon fruit and the goldenberry fruit. Results for reducing sugars in

submerged culture indicate that pineapple has only a decreasing profile going from ~4g/L to

v

1g/L in the 25 days, this profile is similar to the one of goldenberry going from ~2.5g/L to

~0.5g/L. On the contrary, gulupa presented a sugar liberation profile that begins at ~3g/L of

reducing sugars and ending up in ~5g/L, presenting two peaks of sugar liberation at days 8

and 25. Banana and gulupa present similar behavior, that is, they begin both at ~2.5g/L, then

there is a consumption profile and when the fungi consume all the reducing sugars in the

media, enzyme production causes a new liberation of sugars. For all fruits, there is an

apparent hydrolysis of the fruit waste compounds (mainly cellulose and pectin) that causes

an increment in reducing sugars concentration from days 4 to 8. On the other hand, dragon

fruit never reaches a concentration higher than ~1g/L and it has a sugar liberation peak at day

16, being the residue with the lowest sugar concentration and a poor candidate for biomass

production. Meanwhile, results from the enzymatic production of laccase in submerged

culture indicate that both pineapple and goldenberry cultures present high laccase activity

and productivity, indicating that these two residues are candidates for enzyme production due

to its lower times of production (6 days) and high activity (>1200 U/L). Banana presents the

highest value of laccase activity (1697 ± 290) but it has an almost a half of the productivity

of pineapple, making it also quite adequate for laccase production. That is not the case for

dragon fruit, gulupa, and mango that present long times (16 days) to reach maximum laccase

activity.

On the other side, for the pectinases activity it was obtained a decreasing profile of

the enzymatic activity for the majority of fruit substrates showing that the highest production

is registered in the first days of the pretreatment, indicating a low productivity of the enzyme,

it should be noted that the pineapple is the one that reports the greatest activity on day 4

together with the pitahaya on day 12. Furthermore, for the cellulases activity the profile

obtained is similar to the pectinase activity in most fruits excluding the gulupa and the dragon

fruit whose day of maximum production is day 12. Finally, it is possible to conclude that the

relevant aspect for choosing a substrate depends on the objective wanted to achieve in terms

vi

of biomass and laccase production the substrate indicated is the pineapple but for cellulases

production the clear candidate is the gulupa and for pectinases production the dragon fruit.

Also, Pleurotus ostreatus is highly responsive to substrate composition due to the versatility

of behavior obtained

Keywords: biomass, bioproducts, enzymes, organic waste, pretreatment.

RESUMEN

La producción de enzimas y biomasa juega un rol importante en el campo de energías

alternativas, ya que consiste en el aprovechamiento de materia orgánica, microorganismos y

desechos para una producción de energía segura, eficiente, de bajo costo y con menos

impacto ambiental. Con el fin de usar los carbohidratos presentes en la biomasa, es necesario

un fraccionamiento y degradación adecuados de la estructura lignocelulósica a través de su

pretratamiento. Los hongos lignícolas como Pleurotus ostreatus tienen la capacidad de

producir una amplia gama de enzimas útiles en el pretratamiento de residuos agroindustriales.

Además, la biomasa fúngica resultante puede ser considerada como una fuente viable de

alimento, ayudando a la resolución de problemas de escasez de alimentos. En este trabajo, se

evalúa el potencial de producción de enzimas y biomasa fúngica de Pleurotus ostreatus

utilizando cáscaras de banano, gulupa, mango, piña, pitahaya y uchuva. En primer lugar, se

preparó un agar a base de frutas en donde se aisló el hongo y se incubó durante 25 días a 27

C. luego se determinó una velocidad de crecimiento micelial (cm/día) de acuerdo con el

diámetro visible del micelio. Después de eso, se registró la producción de biomasa, azúcares

reductores y producción enzimática (celulasas, pectinasas y lacasas) durante 25 días a 27 ° C

y 150 rpm en un cultivo sumergido utilizando biorreactores de 0,5 litros, en los que se manejó

1,7 g de sustrato (fruta) y 185 ml de buffer citrato pH 5. Durante los 27 días se hizo un

muestreo del medio para posteriormente cuantificar por espectrofotometría la actividad

enzimática de lacasas, pectinasas y celulasas; además de la determinación de azúcares

vii

reductores. A partir de los resultados obtenidos se afirma que, los agares con fruta que

promueven el crecimiento micelial en menor tiempo son los que contienen banano, pitahaya

y uchuva con una velocidad máxima en el día 7 de 0.993 cm/día y de 0.937 cm/día para la

pitahaya y la uchuva; se logra determinar perfiles de consumo de azúcares reductores en los

medios con piña, pitahaya, mango y uchuva mientras que en el banano y la gulupa se presenta

un perfil de liberación donde se aumenta la concentración de azúcares por acción metabólica;

en cuanto a la actividad enzimática lacasa los medios con piña y uchuva proporcionan una

mayor productividad enzimática, registrando actividades de 1430 U/L y 1238 U/L en el día

6; se obtuvo que un perfil decreciente de la actividad enzimática de pectinasas para la mayoría

de sustratos de frutas evidenciando que la mayor producción se registra en los primeros días

del montaje indicando una baja productividad de la enzima cabe destacar que la piña es la

que reporta mayor actividad en el día 4 junto con la pitahaya en el día 12; se evidencia que

la actividad enzimática de celulasas tiene un perfil similar a de la actividad pectinasa en la

mayoría de frutas excluyendo a la gulupa y la pitahaya cuyo día de máxima producción es el

día 12. Finalmente es posible concluir que en términos de máxima producción de biomasa

fúngica y producción enzimática de lacasas la fruta más indicada como sustrato es la piña,

mientras que en términos de producción enzimática de pectinasas y celulasas la producción

obtenida por los demás sustratos empleados no es prometedora.

viii

AGRADECIMIENTOS

La finalización de este proyecto es la culminación de mi pregrado, donde tuve la

oportunidad de conocer personas que me permitieron formarme como ingeniera química y como

una persona íntegra, a estas personas quiero presentarles mis sinceros agradecimientos.

En primer lugar, agradezco a mis padres y a mi abuela ya que sin su apoyo, enseñanzas y

amor no hubiera sido posible llegar a este punto, agradezco sus esfuerzos continuos por ayudarme

y guiarme en cada paso de mi vida y a lograr mis sueños y metas.

En segundo lugar, agradezco a mis amigos y a mi pareja, ya que su apoyo y paciencia

fueron pieza fundamental en aquellos momentos difíciles donde la meta se veía muy lejos y los

ánimos no eran los mejores.

Y finalmente, quiero agradecerle a la profesora Rocío Sierra Ramírez y mi co-asesor Daniel

Duran por su confianza en mí, su asesoría y dedicación en la realización de este proyecto. Han

sido un ejemplo a seguir y su apoyo fue importante para el cumplimiento exitoso de este importante

logro.

ix

TABLA DE CONTENIDO

ABSTRACT ........................................................................................................................ iv

RESUMEN .......................................................................................................................... vi

AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... viii

TABLA DE CONTENIDO ................................................................................................. ix

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... xi

1. Introducción ................................................................................................................ 1

1.1 Material para pretratamiento ....................................................................................... 3

1.1.1 Celulosa ................................................................................................................ 3

1.1.3 Lignina .................................................................................................................. 4

OBJETIVOS .......................................................................................................................... 6

2. METODOLOGIA ....................................................................................................... 7

2.1 Residuos de fruta ..................................................................................................... 7

2.1.1 Preparación de muestras ....................................................................................... 7

2.1.2 Sólidos totales ....................................................................................................... 7

2.1.3 Sólidos volátiles ................................................................................................... 7

2.2 Crecimiento de Pleurotus ostreatus en agares suplementados con fruta .................... 8

2.3 Medición actividad enzimática ................................................................................ 8

2.3.1 Montajes ............................................................................................................... 8

2.3.2 Medición azúcares reductores (Método de Miller o DNS) .................................. 9

2.3.3 Medición de actividad enzimática de lacasas ..................................................... 10

x

2.3.4 Actividad de la exoglucanasa ............................................................................. 11

2.3.5 Actividad de la Exopoligalacturonasa (pectinasa) ............................................. 11

2.3.6 Análisis estadístico ............................................................................................. 11

3. Resultados y discusión .............................................................................................. 12

3.1 Crecimiento de Pleurotus ostreatus en agares suplementados con fruta ............... 12

3.2 Biodegradación sustrato y producción de biomasa ............................................... 14

3.3 Determinación de azúcares reductores .................................................................. 18

3.4 Actividad enzimática de Lacasas ........................................................................... 20

3.5 Actividad de la exoglucanasa ................................................................................ 22

3.6 Actividad de la Exopoligalacturonasa ................................................................... 24

4. Conclusiones y trabajo futuro ................................................................................... 26

5. Referencias ...................................................................................................................... 28

ANEXOS ............................................................................................................................. 30

Anexo 1. Composición de los residuos de fruta estudiados (Durán et al.,2018). ............ 30

Anexo 2. Curva de calibración obtenida (DNS) .............................................................. 31

Anexo 3. Crecimiento del hongo en agares de fruta ........................................................ 32

Anexo 4. Evidencia fotográfica de cultivos sumergidos ................................................. 37

Anexo 5. Análisis estadístico ......................................................................................... 41

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Estructura pared celular (Knowledge Class, 2012) ............................................... 3

Figura 2- Estructura celulosa (Chen, 2014) ........................................................................... 4

Figura 3- Estructura lignina (Boerjan, Ralph, & Baucher, 2003).......................................... 5

Figura 4- Perfil de crecimiento micelial del hongo ............................................................. 12

Figura 5- Biomasa fúngica obtenida en cultivo sumergido ................................................. 15

Figura 6- Porcentaje de biodegradabilidad obtenida en cultivo sumergido ........................ 16

Figura 7- Perfil de azúcares reductores en cultivo sumergido para los residuos de fruta ... 18

Figura 8- Perfil de actividad de lacasas en los diferentes sustratos ..................................... 20

Figura 9- Productividad de lacasas en los diferentes sustratos ............................................ 21

Figura 10- Perfil de actividad de exoglucanasa en los diferentes sustratos......................... 22

Figura 11- Perfil de actividad de exopoligalacturonasas en los diferentes sustratos........... 24

Figura 12- Montajes en cultivo sumergido .......................................................................... 37

Figura 13- Preinóculo .......................................................................................................... 37

Figura 14- Crecimiento del hongo en forma de pellet en residuos de mango ..................... 38

Figura 15- Crecimiento del hongo en piña .......................................................................... 38

Figura 16- Recuperación del hongo: mango en agua destilada ........................................... 39

Figura 17- Recuperación del hongo: banano en agua destilada .......................................... 39

Figura 18- Recuperación del hongo: pitahaya en agua destilada ........................................ 40

xii

LISTA DE TABLAS

Tabla 1- Velocidades máximas............................................................................................ 13

Tabla 2- Comparación sólidos volátiles .............................................................................. 14

1. INTRODUCCIÓN

Con el objetivo de buscar fuentes de energía alternas a las provenientes de

combustibles fósiles y reducir el impacto y las consecuencias medio ambientales de su uso,

se han realizado diferentes estudios con respecto a la producción de biocombustibles como

bioetanol y biogás, a partir del aprovechamiento de desechos agrícolas; en la actualidad se

estima que en Colombia, el sector agroindustrial genera 71.943.813 t/año de desechos en el

procesamiento de productos agrícolas relacionados al café, palma de aceite, caña de azúcar,

maíz, arroz, banano y plátano. Además, el manejo de dichos residuos se basa en la

incineración o su disposición en rellenos sanitarios (Peñaranda, Montenegro, & Giraldo,

2017).

Adicionalmente, gran parte de esos desechos esta conformado por los residuos de

frutas, que en la actualidad son empleados para la producción de abono, la fabricación de

concentrados para animales, como materia prima para producción de biogás y como sustrato

para la producción de hongos comestibles; estas dos últimas alternativas no se emplean de

manera más amplia dejando como opción la acumulación de este material o su incineración

(Yepes, Lina, Naranjo, & Orozco Sánchez, 2008).

Debido a la alta generación de desechos agroindustriales y el incremento en el interés

por reducir el impacto ambiental, se desarrollan estrategias para el aprovechamiento de los

residuos, ya que por su alta disponibilidad y bajo costo son vistos como materia prima viable

para la producción de biocombustibles. Además, la mayoría de los desechos agroindustriales

se consideran materiales lignocelulósicos, de donde se busca obtener los azúcares

fermentables presentes en la estructura de este material (Montoya, 2012).

Para la obtención de los azúcares fermentables presentes en el material

lignocelulósico y facilitar el aprovechamiento de los residuos, se requiere de la realización

de un pretratamiento al material, este pretratamiento puede ser físico, químico, enzimático o

2

una combinación de los anteriores. El pretratamiento físico consiste en la reducción del

tamaño de las partículas por medio de molienda, el enzimático busca la degradación del

material por medio de cócteles enzimáticos compuestos por enzimas lignocelulolíticas y

celulolíticas que trabajan en conjunto para posteriormente reducir las estructuras del material

a azúcares más simples y el químico se basa en el uso de ácidos y álcalis (Pineda-Insuasti et

al., 2014).

El pretratamiento enzimático pretende el máximo aprovechamiento de la biomasa,

dando paso a la obtención de azúcares simples a partir de la degradación del complejo

lignocelulósico por medio de enzimas, estos pretratamientos están bajo estudio para

determinar condiciones que conlleven a una mayor producción enzimática y por consiguiente

al mejoramiento del proceso de degradación; para este proceso se destaca el uso de hongos

lignícolas como lo es Pleurotus ostreatus.

Pleurotus ostreatus hace parte de los hongos denominados de podredumbre blanca

(basidiomicetes ligninolíticos), estos hongos tienen la capacidad de producción de enzimas

ligninolíticas como lacasa, lignina peroxidasa (LiP) y manganeso peroxidasa (MnP); en el

proceso de pretratamiento de material lignocelulósico la producción de enzimas es

fundamental, ya que durante el proceso dan paso a una serie de reacciones que involucran la

acción de radicales libres que desestabilizan la estructura del material facilitando el acceso a

la hemicelulosa y la celulosa (Quintero & Lema, 2006)

Finalmente, teniendo en cuenta el panorama de desecho de fruta y sus oportunidades

para la generación de energía sostenible, se decide para este trabajo realizar un pretratamiento

de cáscaras de banano, gulupa, mango, piña, pitahaya y uchuva; utilizando el hongo

Pleurotus ostreatus.

3

1.1 Material para pretratamiento

El pretratamiento de material lignocelulósico está dirigido a la degradación o

separación de lignina presente en la estructura del material lignocelulósico, con el fin de

permitir el acceso directo a los azúcares fermentables o carbohidratos presentes, el material

a pretratar es de origen vegetal y está constituido principalmente por polisacáridos como

celulosa, hemicelulosa, pectina y lignina.

Figura 1- Estructura pared celular (Knowledge Class, 2012)

1.1.1 Celulosa

La celulosa es uno de los principales componentes estructurales de la pared celular,

es un biopolímero formado por unidades de glucosa unidas mediante enlaces β-1,4. Las

cadenas de glucosa tienden a formar estructuras cristalinas debido a los puentes de hidrógeno

formados hacia cadenas laterales, asimismo, la existencia de estos enlaces tiene relación a la

morfología, rigidez y reactividad de las cadenas celulósicas. Las cadenas están compuestas

por un extremo no reductor (unidad de D-glucosa y grupo C4-OH) y un extremo reductor

(C1-OH en equilibrio con la estructura aldehído; con respecto a su morfología las cadenas se

pueden clasificar en amorfas o cristalinas, donde las primeras son más susceptibles ante

reacciones. Al ser un polímero con alta versatilidad, la celulosa es empleada en varios

sectores de la industria como producción de papel, fibras, ropa, farmacéutica y cosmética

(Mejía, 2016).

4

Figura 2- Estructura celulosa (Chen, 2014)

1.1.2 Hemicelulosa

La hemicelulosa es un biopolímero constituido por polisacáridos que forman

estructuras poliméricas que sirven de soporte a las microfibrillas de celulosa, algunos de los

polisacáridos de los que se constituyen son xilano, manano, glucomanano y galactosa (Mejía,

2016).

1.1.3 Lignina

La lignina es un biopolímero aromático que se encuentra en la pared celular

secundaria y brinda rigidez y estabilidad a las fibras celulósicas, su presencia en la pared

celular brinda resistencia a ataques microbianos y a la biodegradación; al ser un polímero

polifenólico está constituido por tres monómeros los alcoholes p-cumarílico, coniferílico y

sinapílico, estos alcoholes se enlazan por polimerización oxidativa dando como resultado una

red tridimensional cuyos enlaces covalentes se ven afectados en el proceso de

deslignificación (Chen, 2014).

5

Figura 3- Estructura lignina (Boerjan, Ralph, & Baucher, 2003)

1.1.4 Pectina

La pectina es uno de los componentes principales de la pared celular ubicado entre

los filamentos de celulosa, se clasifica en ácido péctico, pectina y protopectina.

Adicionalmente, está estructurada en cadenas rectas de ácido galacturónico unidas mediante

enlaces α-1,4 glicosídicos (Chen, 2014). Teniendo en cuenta lo anterior, las propiedades

composicionales que están asociadas al pretratamiento de los residuos vegetales son el

porcentaje de lignina, de celulosa, de hemicelulosa y pectina presente, dicho porcentaje para

los residuos de fruta se encuentra reportado en literatura, oscilando entre 3,24% y 29,3% para

la lignina, 15,4% y 36,4% para la celulosa, 4,45% y 22,7% para hemicelulosa y entre 4,28%

y 18% de pectina. Es importante resaltar que dichos porcentajes varían según el sustrato

(Durán, Figueroa, Gualdrón, & Sierra, 2018). En anexo 1 se encuentra una tabla detallada

con este contenido.

6

OBJETIVOS

Objetivo general

Explorar en potencial de producción de biomasa fúngica y de enzimas con valor agregado a

partir de cultivos sumergidos y agitados de Pleurotus Ostreatus.

Objetivos específicos

• Determinar el potencial de producción de biomasa fúngica de Pleurotus ostreatus

usando como sustrato residuos de fruta

• Determinar el potencial de producción de enzimas de Pleurotus ostreatus usando como

sustrato residuos de fruta

7

2. Metodología 2.1 Residuos de fruta

2.1.1 Preparación de muestras

Se realizó la adecuación de los desechos de fruta recolectados siguiendo el protocolo

indicado por el NREL, donde se indica el proceso de secado y molienda (Hames et al.,

2008b). Inicialmente, se realiza el secado usando un horno de convección forzada a 45°C

durante 72 horas y luego se reduce el tamaño de la partícula a 1mm empleando un molino de

cuchillas.

2.1.2 Sólidos totales

En esta prueba se busca eliminar la humedad presente en la fruta. Primero se lleva un

crisol vacío a un horno a 105° C durante 4 horas, luego se lleva el crisol a un desecador por

30 minutos, se determina la masa del crisol y luego se le agregan 2,5 g de fruta,

posteriormente se coloca en el horno a 105 °C por un periodo de 26 horas; luego de este

tiempo se lleva la muestra al desecador por 30 minutos, acto seguido se determina la masa

final y se calcula la diferencia de masa con respecto a la del crisol y la muestra inicial (Sluiter

et al., 2008).

2.1.3 Sólidos volátiles

En esta prueba se busca determinar cuál es el porcentaje de cenizas en la fruta. En

primer lugar, se ubica un crisol en la mufla a 575 C durante 4 horas, luego se lleva dicho

crisol a un desecador por una hora y se determina la masa del crisol. Acto seguido, se le

agrega 2,5 g de muestra y se lleva de nuevo a la mufla, donde pasa por el proceso de rampa

de calentamiento y luego se retiran del equipo para ser llevadas al desecador y finalmente

pesadas. Para terminar, se determina la diferencia de masa entre la final y la del crisol y la

fruta (Hames et al., 2008).

8

2.2 Crecimiento de Pleurotus ostreatus en agares suplementados con fruta

Con el objetivo de determinar el potencial de producción de biomasa asociado a la

fruta como sustrato empleado, se realiza un registro fotográfico del crecimiento micelial de

Pleurotus ostreatus en una caja de Petri en agar suplementado con 1,7g de fruta a durante 25

días; posteriormente con ayuda del programa Adobe Photoshop CC se determina la diferencia

en el diámetro del micelio de forma diaria y así se establece una velocidad de crecimiento

micelial en cm/día.

2.3 Medición actividad enzimática

2.3.1 Montajes

2.3.1.1 Crecimiento de micelial de la cepa Pleurotus ostreatus en agar de malta

Se realizó el aislamiento de P. ostreatus en cajas de Petri empleando agar extracto de

malta para facilitar el crecimiento del hongo. La fase de incubación empieza recolectando un

plug por medio de técnica de punción, en la cual se extrae parte del micelio y permite su

ubicación en el agar. Las cajas inoculadas son llevadas a una incubadora a 25°C de 1 a 2

semanas, tiempo en el cual, el micelio del hongo cubrirá totalmente la superficie del agar

extracto de malta.

2.3.1.2 Preparación del pre-inóculo Pleurotus otreatus

Para la realización del pre-inóculo de Pleurotus ostreatus se emplearon 15 plugs

(Discos de agar del mismo tamaño) de 5mm de diámetro del micelio y se agregaron en 5 mL

de caldo SDY en tubo de ensayo de 10 mL, finalmente se llevan a la incubadora a 25°C por

1 semana.

9

2.3.1.3 Preparación material inóculo de Pleurotus ostreatus

Para el inóculo del hongo se requiere esterilizar durante dos ciclos el recipiente de 0,5

L donde se realizó el montaje junto con 1,7g del sustrato a emplear. Además de la preparación

de una solución buffer citrato con pH 6.

2.3.1.4 Inóculo de Pleurotus ostreatus y montaje

Teniendo el material de inóculo esterilizado, se agregó 170 ml de la solución buffer

citrato a cada recipiente con fruta, luego se agregó el contenido de los tubos de pre-inóculo .

El cultivo estuvo agitado a 150 rpm a una temperatura constante de 25° C y se estableció

realizar triplicado de cada montaje. Se realiza toma de muestra del medio líquido del montaje

cada 4 días para la realización de medición de actividad enzimática y azúcares reductores.

2.3.1.5 Recuperación de biomasa y cuantificación de biodegradabilidad

Al finalizar el ciclo de 25 días de cultivo, se procedió a la recuperación y medición de

la biomasa producto del pretratamiento, para esto se usó filtración al vacío para la separación

del medio restante y la biomasa y el sustrato, posteriormente manualmente con ayuda de una

espátula se separa la biomasa del sustrato, posteriormente, se realizó el protocolo de sólidos

totales a la biomasa y cenizas a el sustrato restante. Y finalmente se determinó un porcentaje

de biodegradabilidad para cada sustrato (Nielfa, Cano, & Fdz- Polanco, 2015).

%BD =SV0 − 𝑆𝑉𝐹

𝑆𝑉0∗ 100

BD = biodegradabilidad

SV0 = sólidos volatiles iniciales

SVF = sólidos volatiles finales

2.3.2 Medición azúcares reductores (Método de Miller o DNS)

Para realizar la medición de azúcares reductores en las muestras a través de

espectrofotometría, se usó DNS (ácido dinitrosalicílico), que al entrar en contacto con los

azúcares reductores se produce la oxidación del reactivo, cambiando la tonalidad de la mezcla

10

a un color naranja-marrón (Miller, 1959); se agrega el reactivo a la muestra y se sumerge en

agua caliente durante un periodo de 5 minutos. Posteriormente se realiza un baño de hielo

por 5 minutos, y finalmente se mide la absorbancia a una longitud de onda de 540nm. Para

su posterior cuantificación se debe realizar la curva de calibración correspondiente para así

determinar concentraciones de azúcares presentes. (Montoya, 2012).

2.3.3 Medición de actividad enzimática de lacasas

La determinación de actividad enzimática de lacasas se realizó por

espectrofotometría, usando una solución de 1mM de 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-

sulfónico) en una solución buffer acetato de pH 4,5; agregando 50 µL de muestra con 950

µL de solución ABTS en una celda y midiendo la absorbancia cada minuto durante un

periodo de 10 minutos (Montoya, 2012).

Finalmente se determinó el valor de la actividad enzimática en U/L de la muestra

usando la ecuación de Beer-Lambert (Montoya, 2012).

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 =

𝐴𝑡

(𝑉𝑡 ∗ 𝐹𝑑)

𝜀 ∗ 𝑉𝑚

𝐴

= Pendiente resultante de linealizar absorbancia en los 10 minutos de reacción 𝑡

Vt = Volumen de la celda (1 mL)

Fd = Factor de dilución

ε = Coeficiente de extinción molar a 436nm. 29.3

mM−1cm−1

Vm = Volumen de la muestra. 50 L l = longitud de la celda. 1 cm

11

2.3.4 Actividad de la exoglucanasa

Para realizar la medición de actividad de la enzima exo-1,4-β-D-glucanasa a través de

espectrofotometría se usa 500µL de celulosa cristalina al 1% en buffer citrato de sodio50 mM

con pH de 5.0. Esto es puesto a reaccionar con 500µL de muestra a 45ºC por 60 minutos,

luego se adiciona DNS para detener la reacción, se pasa la muestra por baño caliente en el

punto de ebullición del agua, luego se enfría en hielo para detener la reacción y finalmente

se procede a medir azúcares reductores por espectrofotometría (Montoya, 2012).

2.3.5 Actividad de la Exopoligalacturonasa (pectinasa)

Para realizar la medición de actividad de la enzima Exopoligalacturonasa a través de

espectrofotometría, se toma primero 250 L de la muestra con 250 L de una solución de

pectina al 1% en buffer acetato 0,1M y pH 4,5. Luego Las muestras son incorporadas en un

baño serológico durante 30 minutos donde la reacción conlleva a liberar más azúcares y se

procede a agregar DNS para medir la concentración de azúcares reductores por

espectrofotometría (Debing, Peijun, Stagnitti, Xianzhe, & Li, 2006).

2.3.6 Análisis estadístico

El diseño experimental usado será un Anova one-way donde le factor a analizar será

el tipo de sustrato o cáscara de fruta empleada para el crecimiento de los hongos en cultivo

sumergido. Se tendrá como variable de respuesta cada una de las actividades enzimáticas

mencionadas anteriormente y la concentración de azúcares reductores en el medio. Se

realizarán comparaciones pareadas de Tukey para identificar diferencias entre los niveles

evaluados.

12

3. Resultados y discusión 3.1 Crecimiento de Pleurotus ostreatus en agares suplementados con fruta

Se logró determinar perfiles y velocidades de crecimiento a partir de la diferencia de

diámetro hasta el día 25, pero por efectos de análisis se presentan gráficamente hasta el día

17, debido a que el hongo en ese día ya ha expandido su micelio por la totalidad de la

superficie de agar disponible. Es posible observar que a pesar de contar con diferentes

sustratos en el agar el hongo tiene un crecimiento acelerado del día 2 al 12.

Perfil de crecimiento

Figura 4- Perfil de crecimiento micelial del hongo

A partir de los perfiles de crecimiento obtenidos es posible afirmar que los agares

suplementados con uchuva y pitahaya favorecen al desarrollo micelial, mientras que el agar

suplementado con mango es el que menos lo favorece. Cabe resaltar que el crecimiento

durante la primera semana alcanza aproximadamente la mitad del diámetro alcanzado al día

17, indicando que la velocidad de crecimiento en esta primera semana es superior a la

obtenida a partir del día 8.

13

El perfil de crecimiento del hongo en agar suplementado con mango presenta

velocidades inferiores a las obtenidas con los demás sustratos, pero compensa su baja tasa de

crecimiento al hasta el día 14 donde alcanza a desarrollar un diámetro de micelio similar al

alcanzado por los demás sustratos. Estos resultados son similares a los reportados en literatura

donde se evalúa el crecimiento micelial de Pleurotus en diferentes sustratos lignocelulósicos

como salvado de trigo, hojas de palma y agar de dextrosa y papa, y se obtiene una cepa con

menor tasa de crecimiento que con el paso de dos semanas alcanza el crecimiento de las otras

cepas (Kabirifard, A., Fazaeli, H., Kafilzadeh, 2012).

Tabla 1- Velocidades máximas

Sustrato Máxima velocidad (cm/d) Día

Banano 0,993 7

Gulupa 0,867 7

Mango 0,682 9

Piña 0,741 7

Pitahaya 0,937 7

Uchuva 0,937 7

A partir de los datos de diferencias de diámetro se determina las velocidades de

crecimiento micelial en cm/día. De estas velocidades es importante resaltar que en el día 7 se

alcanza la velocidad máxima sin importar el sustrato empleado. Finalmente, de los resultados

obtenidos se determina que existe un potencial de producción de biomasa al usar residuos de

fruta como sustrato, es válido aclarar que esta información es nueva frente a los resultados

obtenidos previamente por la Universidad de los Andes.

14

3.2 Biodegradación sustrato y producción de biomasa

Con el objetivo de determinar la cantidad de material que fue aprovechado en el

pretratamiento, se evalúa la cantidad de sólidos totales y volátiles presentes en la fruta

previamente acondicionada siguiendo el protocolo NREL para preparación de muestras

(Hames et al., 2008), y la que fue recuperada después de los 25 días. Los resultados obtenidos

para cada sustrato se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2- Comparación sólidos volátiles

SÓLIDOS VOLÁTILES

SUBSTRATE

INITIAL

(g/kg)

FINAL

(g/kg)

Banano 708,904 84,395

Gulupa 870,310 203,019

Mango 894,695 220,948

Piña 711,058 205,896

Pitahaya 640,165 208,206

Uchuva 631,244 241,993

Se observa que la fruta con mayor cantidad de material disponible para el

aprovechamiento es el mango con 894,695 g/kg seguida de la gulupa con 870,310 g/kg y la

piña con 711,058 g/kg; esto implica que en los montajes donde se usen estas frutas como

sustrato se podría tener más proporción de compuestos orgánicos aprovechables por el hongo

para la producción de biomasa y enzimas producto del metabolismo del hongo.

15

Figura 5- Biomasa fúngica obtenida en cultivo sumergido

En cuanto a la producción de biomasa, se esperaba que las frutas con mayor

cantidad de sólidos disponibles fueran en las que se registrara una mayor producción de

biomasa por su cantidad de carbohidratos. Los resultados obtenidos reflejaron este

comportamiento para el caso de la piña y el mango, ya que la mayor cantidad de biomasa

promedio recuperada fue la proveniente de los montajes en los que se usaron estas frutas.

Por el contrario, en los montajes donde se utilizó gulupa, a pesar de tener uno de los más

altos contenidos de volátiles no produjo una alta cantidad de biomasa, lo que podría sugerir

que la gulupa no es un buen sustrato para la producción de biomasa bajo las condiciones

propuestas en los montajes. Estos resultados comprueban la conclusión de estudios

anteriores donde se afirma que la variación de crecimiento del hongo se puede relacionar

con la composición química y estructura física del sustrato implementado (Kabirifard, A.,

Fazaeli, H., Kafilzadeh, 2012).

16

Según (Ragunathan, Gurusamy, Palaniswamy, & Swaminathan, 1996) en su

estudio del crecimiento de Pleurotus en diferentes sustratos, afirma que la producción

enzimática puede tener un efecto negativo en la capacidad de crecimiento, esto podría ser

la causa de la poca obtención de biomasa de los medios que usaron como sustrato la

uchuva y la gulupa.

Figura 6- Porcentaje de biodegradabilidad obtenida en cultivo sumergido

En cuanto al porcentaje de biodegradabilidad se puede afirmar que el

pretratamiento realizado a estos residuos es efectivo, ya que los porcentajes oscilan entre

un 61% a un 88%, implicando que es una buena opción para la disposición de estos

desechos, siendo comparado con su actual disposición en rellenos sanitarios, esta opción

implica reducir las emisiones de metano hacia el medio ambiente.

Actualmente los rellenos sanitarios son considerados fuentes emisoras de

contaminantes atmosféricos producto de la degradación de material orgánico, además de

ser generadores de gases invernadero con alto contenido en metano y dióxido de carbono

afectando la calidad del aire y la salud. Entre los gases de invernadero el metano es el

segundo mayor contribuyente al calentamiento global, lo que hace necesaria la reducción

de emisiones de metano. (Camargo & Vélez, 2009).

17

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en conjunto, se evidencia que las

frutas que presentan una relación proporcional entre biodegradabilidad y biomasa

producida son el mango, la pitahaya y la piña. Esto se puede deberse a que el hongo está

aprovechando la mayoría de los carbohidratos presentes en el residuo para la formación

de biomasa, el comportamiento del banano podría indicar que tiene un potencial de

generación de biomasa mayor al de los otros sustratos, puesto que teniendo una misma

cantidad de residuo de fruta genero más gramos de biomasa.

Por otro lado, se evidencia que las frutas que presentan una relación inversamente

proporcional entre biodegradabilidad y biomasa producida son la gulupa y la uchuva. Esto

puede deberse a que el hongo este usando diferentes rutas metabólicas para el

procesamiento del residuo generando productos diferentes a la biomasa.

Al comparar los resultados obtenidos con los registrados en la literatura, se afirma

que son coherentes ya que fue obtiene una cantidad de biomasa a medida que el hongo se

encarga de la biodegradación del residuo (Morgan, A. Lee, T. Lewis, N. Sheppard, & J.

Watkin, 1993). Para el caso particular del banano al comparar el porcentaje de

biodegradabilidad obtenido con el reportado en literatura se puede afirmar que es superior,

ya que el que se reporta entra en un rango de 70% a 80% y el obtenido es de

88% (de Carvalho, de Aguiar, Sales-Campos, Minhoni, & de Andrade, 2012).

18

3.3 Determinación de azúcares reductores

Para determinar la concentración de azúcares reductores presentes en el medio fue

necesario realizar una curva de calibración con diferentes concentraciones de glucosa, la

curva de calibración permite relacionar la absorbancia obtenida usando las muestras con

una concentración establecida de glucosa. Dicha curva se puede encontrar en el anexo 2.

Banano Gulupa Mango Piña Pitahaya Uchuva

Figura 7- Perfil de azúcares reductores en cultivo sumergido para los residuos de fruta

A partir de los datos obtenidos se logró establecer los perfiles de concentración de azúcares

reductores a lo largo de los días del pretratamiento, para cada uno de los sustratos se

evidenciaron diferentes comportamientos, para los montajes que usaron banano y gulupa se

registró un perfil de liberación de azúcares en dos momentos durante los días 4 y 20 para la

gulupa y durante los días 12 y 20 para el banano, para las demás frutas se reconoce un perfil

de consumo partiendo de una liberación posterior en los primeros días o de solo consumo.

El perfil observado podría ser un indicador del comportamiento metabólico del hongo,

ya que se identifica claramente un consumo de azúcares por parte del hongo, y la liberación

19

de azúcares producto de la acción de las enzimas segregadas por el hongo sobre la estructura

del sustrato.

En los perfiles de consumo se registran puntos máximos de concentración en la

primera mitad de los días evaluados en el pretratamiento, esto se podría deber a la acción de

enzimas sobre la estructura de lignina causando la liberación de azúcares fermentables o un

efecto en la composición de sustrato.

En el caso de la uchuva este punto se registra en el día 4 y uno más adelante en el 12

de menor magnitud, en este sustrato se podría explicar la existencia del punto en los primeros

días por su composición, ya que es un sustrato rico en celulosa con bajo contenido de lignina

(3%). El diminuto aumento del día 12 sugiere ser una consecuencia de la acción de enzimas

sobre la estructura. Este comportamiento también se ve ilustrado en el caso de la piña.

En el caso del mango, solo se registra un punto máximo en el día 8, en este sustrato

se podría explicar la existencia de un solo punto por su composición, ya que es un sustrato

rico en celulosa y con un contenido de lignina del 11%, lo que sugiere que no hubo la

suficiente acción de enzimas para separar la estructura del sustrato.

En los perfiles de liberación se registran aumentos de concentración de azúcares

reductores en el medio a lo largo del tiempo del pretratamiento. Esto puede ser un indicador

de que el pretratamiento enzimático es una buena opción para la disposición de estos

desechos además de indicar un alto grado de biodegradabilidad, este tipo de comportamiento

se evidencia en el banano y la gulupa, y la diferencia de magnitud se explica por el mayor

contenido de celulosa y hemicelulosa de la gulupa y el alto contenido de lignina presente en

el banano.

A partir de los resultados obtenidos por (Cortes Ortiz, Ibla Gordillo, Calderón

Velásquez, & Herrera Bueno, 2015) en su trabajo de cuantificación de azúcares reductores

en cáscara de naranja y banano, se observa que los perfiles obtenidos reportados tienen un

comportamiento similar al registrado en los montajes de gulupa y banano, cabe resaltar que

20

en la investigación con la que se realiza la comparación se lleva a cabo un proceso de

hidrolisis ácida donde la degradación de las estructuras de los sustratos se realiza más

agresivamente.

3.4 Actividad enzimática de Lacasas

Tiempo (d)


Figura 8- Perfil de actividad de lacasas en los diferentes sustratos

A partir de la cuantificación de actividad de lacasas para cada uno de los sustratos, se puede

observar que el residuo de frutas permite una producción enzimática temprana al ser

comparada con la obtenida por otros sustratos como la cascarilla de arroz, esta información

también se ve evidenciada en estudios previos consignados en literatura, en estos estudios se

reportan actividades enzimáticas de lacasas durante los primeros 10 días de cultivo (Ire &

Ahuekwe, 2016).

Se evidencia que, al usar la piña y la uchuva como sustratos, se obtiene respuesta de

mayor actividad enzimática a pocos días de haber iniciado el pretratamiento, mientras que,

al emplear sustratos como mango, pitahaya gulupa la máxima producción varía entre los días

12 y 16. Este comportamiento podría relacionarse con la composición del sustrato, puesto

21

que la piña y la uchuva tienen un bajo contenido de lignina y un alto contenido de celulosa

facilitando el acceso a los azúcares fermentables, y con esto la presencia de un medio rico en

glucosa. Según el estudio de (Ire & Ahuekwe, 2016) los medios ricos en glucosa tienden a

favorecer la producción de biomasa y disminuir la producción de lacasas, el comportamiento

de la piña y la uchuva se podría explicar en un consumo de azúcares rápido que conlleva a

una reducción de su concentración en el medio y finalmente generando la producción

enzimática al percibir el cambio en la concentración de fuente de carbono.

Figura 9- Productividad de lacasas en los diferentes sustratos

A partir de los resultados de productividad de lacasas se recomienda el uso de uchuva

o piña como sustrato para el pretratamiento, a pesar de que el banano registra la mayor

cantidad de enzimas no se considera como primera opción para usar como sustrato ya que su

producción toma el doble de tiempo que la obtenida usando la piña, la pitahaya es el sustrato

que presenta la menor actividad enzimática y además le toma hasta el día 12 para tener su

mayor actividad, esto lo hace un pobre candidato para la producción de lacasas.

Para algunas de las frutas se puede establecer una relación entre el comportamiento

de azúcares reductores y actividad de lacasas, en el banano se percibe que en el día 12 donde

0

50

100

150

200

250

300

Pro

du

ctiv

idad

de

laca

sa (

U/L

d)


22

hay una disminución en la concentración disponible de azúcares en el medio (0,65 g/L) se

registra la mayor actividad enzimática (1697 U/L), provocando una liberación de azúcares

que se evidencia con un pico en el perfil de concentración de azúcares (3 g/L), esto podría

ser debido al mecanismo de acción de la enzima sobre el sustrato; caso similar se evidencia

en la piña donde hay un pico en el perfil de concentración de azúcares indicando una

liberación de las mismas posterior al día 4 donde presenta la mayor actividad enzimática.

3.5 Actividad de la exoglucanasa


Figura 10- Perfil de actividad de exoglucanasa en los diferentes sustratos

Se determinó con un 95% de confianza (p=0,000) que la actividad de la enzima exoglucanasa

se ve afectada por el tipo de sustrato empleado. En el anexo 5 se encuentra en detalle del

análisis estadístico. A partir de la cuantificación de la actividad exoglucanasa se puede afirmar

que esta enzima tiene un comportamiento de producción similar al registrado en actividad

lacasa ya que ambas se evidencia la mayor actividad el mismo día (12). Esta semejanza puede

0

100

200

300

400

500

600

0 4 8 12 16 20 25 Tiempo (d)

23

deberse a la composición de los sustratos empleados y una sinergia entre la producción

enzimática del hongo (Mejía, 2016).

Se evidencia que, al usar la uchuva, el mango y la gulupa como sustratos, se obtiene

una respuesta de mayor actividad enzimática a pocos días de haber iniciado el pretratamiento,

con valores de 228 U/L, 423 U/L y (489 U/L); mientras que al emplear sustratos como

pitahaya y banano la máxima actividad se presenta en el día 0 siendo consecuencia de

actividad previa relacionada a la descomposición de la fruta o actividad remanente.

La actividad de esta enzima en los diferentes sustratos se puede relacionar con

variaciones complejas entre los diferentes sustratos, es decir, existen casos como el mango

donde se obtiene una liberación rápida (día 4) posiblemente a consecuencia de un alto

contenido de celulosa beneficiado por la presencia de compuestos extraíbles con posible

contenido nutricional (Durán et al., 2018). En el caso de la gulupa y la pitahaya, posibles

diferencias estructurales pudieron ser la causa para que en el mismo día se diera el punto de

actividad máxima de lacasas y celulasas, mostrando que el hongo es muy sensible a la

composición del sustrato. En este caso, se tiene un considerable contenido de celulosa,

pectina y lignina que afecta la forma en la que se puede acceder a las fuentes de carbono. En

lo referente a la uchuva y piña la producción enzimática decrece a lo largo del experimento

y se mantiene en un valor no menor de 100 U/L al final del pretratamiento, esto implica que

la producción de la enzima, aunque disminuya en los primeros 16 días, se aumenta luego de

que el hongo detecte el agotamiento de azúcares y produzca nuevamente celulasas.

24

3.6 Actividad de la Exopoligalacturonasa

Tiempo (d)


Figura 11- Perfil de actividad de exopoligalacturonasas en los diferentes sustratos

A partir de los perfiles de actividad enzimática pectinasa se puede afirmar que la

productividad de esta enzima es muy baja para los montajes que usaron uchuva, banano y

gulupa, mientras que para los sustratos de piña, pitahaya y mango se evidencia una mayor

producción de esta enzima; con el objeto de producir pectinasa se recomienda el uso de

pitahaya como sustrato ya que es el único sustrato que muestra una producción relevante con

respecto a los estudiados y se diferencia por ser una fruta que además de presentar un

contenido de pectina alto puede tener pectina de mayor calidad es decir, de un alto grado de

metoxilación

El comportamiento obtenido es similar al reportado en literatura que se reporta en estudios

previos, con alta actividad de pectinasas (Rodriguez, 2006). Por esta razón el mango es el

segundo mejor candidato para la producción enzima con un perfil que oscila entre los 150 y

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 4 8 12 16 20 25

25

350 U/L. Es curioso que la gulupa aún teniendo un alto contenido de pectina no cause una

actividad alta de enzimas que modifican la pectina, esto podría deberse a que la gulupa posee

sustancias extraíbles asociadas a saponinas, antocianinas y otros compuestos (Peña, 2018) que

podrían generar interferencia en metabolismo del hongo y en el funcionamiento de las enzimas

exopoligalacturonasas ya que no se presentan en el sustrato natural del hongo (madera muerta).

Este tipo de compuestos se han reportado como mecanismo de defensa de otros hongos (Choi

et al., 2017).

26

4. Conclusiones y trabajo futuro

De acuerdo con lo obtenido en las velocidades de crecimiento del hongo en diferentes

sustratos en cajas de Petri con agar de fruta, este sustrato genera un ambiente propicio y

viable para el hongo Pleurotus ostreatus, aun este siendo un medio en el no crece

naturalmente. Esto implica que el hongo tiene una gran capacidad de adaptación y puede ser

posiblemente usado industrialmente ya que sus condiciones de crecimiento no son estrictas.

Se determinó que lo residuos de fruta con mayor producción de biomasa son la piña

y el mango, con porcentajes de biodegradabilidad similares alrededor del 70%. El

metabolismo del hongo estuvo dirigido al consumo de carbohidratos para la generación de

biomasa. Esto puede indicar que estos sustratos pueden ser usados para la producción de

alimentos en zonas de escasez donde estos residuos abunden y que normalmente se disponen

en rellenos sanitarios donde generan gases de efecto invernadero.

En cuanto al potencial para producción de enzimas, se observa que ciertos sustratos

favorecen un tipo específico de enzima. Para las lacasas, posibles sustratos favorables serían

la piña, la uchuva y el banano; estas enzimas podrían ser aplicadas para pretratamiento en la

producción de bioetanol y también como posibles conservantes de comidas debido a la

capacidad antibacterial de estas enzimas. En el caso de las exoglucanasas, el mango y la

gulupa resaltan como candidatas, con posibles aplicaciones en la industria papelera.

Adicionalmente, el mango y la pitahaya pueden producir pectinasas con alto valor agregado

para la industria cosmética (extracción de colorantes naturales), la industria de alimentos

(producción de bebidas frutales, aumentar la consistencia del vino).

En general, los residuos de piña y mango se presentan como dos posibles fuentes de

biomasa y enzimas, de forma simultánea. La cáscara de piña presentó la mayor cantidad de

biomasa y actividad de lacasas. Por otra parte, el mango presenta en simultáneo una

generación de biomasa alta junto con la generación de enzimas pectinasas y celulasas. Estas

dos alternativas pueden ser estudiadas a profundidad en trabajos futuros donde se puede

27

analizar la influencia de otros factores no tenidos en cuenta en estudio exploratorio.

Finalmente, puede ser interesante observar el funcionamiento del hongo creciendo en un

sustrato que contenga mezclas de mango y piña, y que posiblemente pueda generar sinergia

en la producción general de enzimas y biomasa fúngica.

28

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30

ANEXOS Anexo 1. Composición de los residuos de fruta estudiados (Durán et al.,2018).

Tabla 3-Composición de los residuos de fruta estudiados (Durán et al.,2018).

31

Anexo 2. Curva de calibración obtenida (DNS)

32

Anexo 3. Crecimiento del hongo en agares de fruta

Agar suplementado con uchuva, crecimiento

micelial al día 6

Agar suplementado con banano, crecimiento

micelial al día 6

Agar suplementado con gulupa, crecimiento

micelial al día 6

Agar suplementado con piña, crecimiento

micelial al día 6

33

Agar suplementado con pitahaya,

crecimiento micelial al día 6


micelial al día 6


micelial al día 4


micelial al día 4

34


micelial al día 4


micelial al día 4

Agar suplementado con pitahaya,

crecimiento micelial al día 4

Agar suplementado con mango, crecimiento

micelial al día 4

35


micelial al día 17


micelial al día 17


micelial al día 17


micelial al día 17

36

Agar suplementado con

pitahaya, crecimiento micelial al

día 17

Agar suplementado con mango, crecimiento

micelial al día 17, diámetro del halo 5,19 cm

37

Anexo 4. Evidencia fotográfica de cultivos sumergidos

Figura 12- Montajes en cultivo sumergido

Figura 13- Preinóculo

38

Figura 14- Crecimiento del hongo en forma de pellet en residuos de mango

Figura 15- Crecimiento del hongo en piña

39

Figura 16- Recuperación del hongo: mango en agua destilada

Figura 17- Recuperación del hongo: banano en agua destilada

40

Figura 18- Recuperación del hongo: pitahaya en agua destilada

41

Anexo 5. Análisis estadístico

CELULASAS

Analysis of Variance

Source DF Adj SS Adj MS F-Value P-Value

Sustrato 5 391141 78228,2 303,42 0,000

Error 12 3094 257,8 Total 17 394235

Model Summary

S R-sq R-sq(adj) R-sq(pred)

16,0568 99,22% 98,89% 98,23%

42

Tukey Pairwise Comparisons: Sustrato

Grouping Information Using the Tukey Method and 95% Confidence

Sustrato N Mean Grouping

Gulupa 3 489,340 A

Mango 3 444,497 B

Uchuva 3 229,612 C

Piña 3 183,048 D

Pitaya 3 134,125 E

Banano 3 114,202 E Means that do not share a letter are significantly different.

Tukey Simultaneous 95% CIs

LACASAS



Sustrato 5 2742697 548539 49,67 0,000

Error 10 110433 11043

Total 15 2853129

Model Summary


105,087 96,13% 94,19% 91,09%

43



Banano 2 2030,61 A

Piña 3 1429,82 B

Gulupa 2 1399,83 B

Mango 3 1337,45 B

Uchuva 3 1238,60 B

Pitaya 3 571,59 C Means that do not share a letter are significantly different.

44

PRODUCTIVIDAD DE LACASAS



Sustrato 5 79947 15989,5 119,27 0,000

Error 10 1341 134,1 Total 15 81288

Model Summary


11,5787 98,35% 97,53% 96,24%

45

Tukey Pairwise Comparisons: Sustrato



Piña 3 238,303 A

Uchuva 3 206,433 A

Banano 2 169,218 B

Gulupa 2 116,653 C

Mango 3 83,591 C

Pitaya 3 47,632 D Means that do not share a letter are significantly different.

Tukey Simultaneous 95% CIs

46

REDUCTORES



Sustrato 5 200,159 40,0319 131,28 0,000

Error 12 3,659 0,3049 Total 17 203,818

Model Summary


0,552201 98,20% 97,46% 95,96%

47



Mango 3 10,8740 A

Gulupa 3 10,7283 A

Piña 3 10,0072 A

Banano 3 6,1354 B

Uchuva 3 5,6285 B

Pitaya 3 1,7324 C

Means that do not share a letter are significantly different.

PECTINASAS

Method

Factor coding (-1. 0. +1)

Box-Cox transformation

Rounded λ -0,5

Estimated λ -0,390815

95% CI for λ (-0,843315. 0,00468530)

Analysis of Variance for Transformed Response


Sustrato 5 0,009754 0,001951 251,89 0,000

Error 12 0,000093 0,000008

Total 17 0,009847

Model Summary for Transformed Response


0,0027829 99,06% 98,66% 97,88%

48



Pitaya 3 928,546 A

Piña 3 926,833 A

Mango 3 320,487 B

Banano 3 183,335 C

Uchuva 3 145,864 D

Gulupa 3 116,508 E Means that do not share a letter are significantly different.

aprovechamiento de residuos de fruta para producciÓn de …

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