Aportaciones del laboratorio en el diagnóstico y el tratamiento del

paciente intoxicado.

Dra. Ana María López Parra

Dpto. Toxicología y Legislación Sanitaria, Fac. MedicinaUniversidad Complutense de Madrid

Esquema• Introducción.• Muestras.• Envasado, conservación y almacenamiento.• Análisis químico-toxicológico. • Métodos de extracción.• Detección e identificación del tóxico:

técnicas espectrofotométricastécnicas cromatográficastécnicas inmunoquímicas

IntroducciIntroduccióónn

La investigación toxicológica es el conjunto de procesos analíticos que tienen por objeto el aislamiento, identificación y determinación cuantitativa de los tóxicos, tanto en el vivo como en el cadáver, con el fin de permitir el diagnóstico de la intoxicación.

MuestrasMuestras• Contenido gástrico• Sangre• Orina• Pelo• Saliva• Meconio

MuestrasMuestras

Contenido gástrico-Vómito, aspirado gástrico y lavados estomacales.-En el caso de los lavados estomacales, primer

lavado.-Un volumen de aproximadamente 20 ml.-Puede ser necesario procedimientos de

homogenización, filtración y/o centrifugación.-No representa grado de intoxicación.

MuestrasMuestrasSangre-Es una de las muestras más útiles para la identificación y

especialmente para el análisis cuantitativo.-La sangre total y el plasma son las muestras más

representativas.-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como

anticoagulante. -Si se sospecha de intoxicación con etanol, utilizar fluoruro

sódico como conservante. Y la extracción deberáefectuarse desinfectando la zona con cloruro mercúrico.

MuestrasMuestras

Orina-Ensayos preliminares en el screening de tóxicos.-Para drogas de abuso.-La concentración de un tóxico puede llegar a ser 100 veces mayor que en la sangre. -Se debe de tomar antes del tratamiento.-Como mínimo 50 ml.

MuestrasMuestras

Pelo-Tóxicos minerales-Detección de drogas de abuso. -Refleja el estado promedio de los elementos minerales del organismo durante su crecimiento.

MuestrasMuestrasSaliva.-Correlación de los análisis séricos con drogas de abuso y psicofármacos.

Meconio. -Meconio: líquido amniótico, moco, lanugo, bilis y células que se han desprendido de la piel y del tracto intestinal. -Identificación de drogas durante la gestación.

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MuestrasMuestrasHígado

-Niveles de tóxicos superioresa los de la sangre.

-Especialmente útil cuando nose puede disponer de sangre.

-Evitar contaminación por bilis.-Evitar añadir conservantes.

Envasado y conservaciEnvasado y conservacióónn

• Tapones PTFE (polytetrafluoroethylene)

• Conservantes:– Azida sódica (0,1%, p/v)– Fluoruro sódico (1%, p/v)

• Anticoagulante:- Heparina- EDTA- Oxalato potásico (0,5%, p/v).

AlmacenamientoAlmacenamientoFactores que intervienen:

Temperatura

Descomposición biológica

Luz

Hidrólisis

Oxidación

AnAnáálisis lisis ququíímicomico--toxicoltoxicolóógicogico

• 1. Separación o extracción del tóxico de la muestra.

• 2. Detección e identificación del tóxico.

• 3. Cuantificación.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióónn

Desde el punto de vista analítico los tóxicos se dividen en:

– Tóxicos volátiles– Tóxicos gaseosos– Tóxicos orgánicos fijos o extraíbles– Tóxicos inorgánicos o minerales

Finalidad:

Aislamiento y purificación del tóxicoConcentración del tóxico en el extracto obtenido

Parte de la muestra se reserva íntegra

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos volxicos voláátilestiles

• Aquellos que se volatilizan por debajo de los 100ºC, por lo cual son arrastrados por el vapor de agua cuando ésta destila (alcohol etílico, alcohol metílico, benceno, fenoles, ...).

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos volxicos voláátilestiles

Las técnicas son:

-Destilación simple.-Destilación fraccionada.-Destilación directa al vacío.-Destilación por arrastre en corriente de vapor.-Microdifusión.-Técnica de “espacio de cabeza” ("head space" ).

DestilaciDestilacióón simplen simple

Muestraproblema

Tóxicovolátilextraído

DestilaciDestilacióón fraccionadan fraccionada

Separación según puntos de ebullición

MicrodifusiMicrodifusióónnAnálisis Muestra Agente

liberador Compartimento interior

Tiempo de difusión

Acetaldehído 3 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de SO3HNa 0,15M

3 horas

Acetona 3 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de SO3HNa 0,15M

3 horas

Monóxido de carbono

1 ml de sangre 1 ml de SO4H2 al 10%

2 ml de cloruro de paladio

1 hora

Cianuro 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de NaOH 0,1N

3 horas

Etanol 0,8 ml de sangre 4 ml de tejido

1 ml de CO3K2 al 10%

2 ml de dicromato potásico

3 horas

Formaldehído 3 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de SO3HNa 0,15M

3 horas

Hidrocarburos halogenados

1-4 ml de sangre 1-4 ml de tejido

- 1 ml de tolueno 3 horas

Isopropanol 2 ml de sangre 5 ml de tejido

1 ml de CO3K2 3,3 ml de SO4H2 al 10%

3 horas

Metanol 2 ml de sangre 5 ml de tejido

1 ml de CO3K2 3,3 ml de SO3HNa 0,15M

3 horas

Fenoles 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de NaOH 0,1N

3 horas

Sulfuro 2-4 ml de sangre 5 ml de tejido

3-4 gotas de SO4H2 al 10%

3,3 ml de NaOH 0,1N

3 horas

Camarade

Conway

TTéécnica de espacio de cabezacnica de espacio de cabeza1. La muestra se deposita en un vial

cerrado con tapón perforable, en el que se deja una cámara de aire.

2. Se calienta a 60ºC durante 30 min.3. Se extrae con una jeringa para

gases una muestra de la parte superior del frasco para inyectarla en un cromatógrafo de gases.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos gaseososxicos gaseosos

• Se denominan tóxicos gaseosos a todas aquellas sustancias que a temperatura ambiente se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo: CO, HCN, SH2, AsH3, SbH3 , NH3, Cl2, Br2.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos gaseososxicos gaseosos

• Las técnicas son: -La extracción de gases en sangre se basa en leyes físicas, según las cuales su solubilidad disminuye elevando la temperatura o disminuyendo la presión.-Mediante las mismas técnicas que para los tóxicos volátiles.

-Cromatografía de gases

Cromatografía de gases (GC)

Técnica de separación. Se basa en la diferente velocidad con que se mueven los solutos a través de un medio poroso arrastrados por un disolvente en movimiento.

TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficasVolatilización

CromatografCromatografíía de gasesa de gases

*Line Base *Altura del Pico*Pico Cromatográfico *Anchura del Pico*Base del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura*Área del Pico

Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• Técnica muy sensible, fiable y rentable para

determinaciones cualitativas (casi la totalidad de los tóxicos) y cuantitativas (límite de sensibilidad 1-5 µg/ml.) .

• Posibilidad de derivación (obtener un compuesto intermedio a partir de una sustancia no volátil) hace su aplicación prácticamente universal.

CromatografCromatografíía de gasesa de gases

MMéétodos detodos de microextraccimicroextraccióónnen fase sen fase sóólidalida

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos

Sustancias orgánicas y no volátiles. Se incluyen:

*Tóxicos de origen vegetal (glucósidos, aceites esenciales, alcaloides, etc)

*Productos de síntesis (medicamentos).

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos

Las técnicas son: -Con disolvente polar (etanol): técnica de Stas-Otto.- Con disolventes apolar: los más frecuentes son: éter etílico, cloroformo y diclorometano. Puede ser:

*Directa: sólo aplicable a muestras biológicas limpias como la orina *Previa purificación de la muestra (eliminación de proteínas).

Fraccionamiento del extracto antes de su análisis:Debido a la gran variedad de tóxicos orgánicos conocidos es

necesario un fraccionamiento del extracto.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos

Clasificación de tóxicos orgánicos en:

1. Ácidos: débiles (por ejemplo barbitúricos) o fuertes (por ejemplo salicilatos), unos y otros extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido.

2. Básicos: extraíbles con disolventes orgánicos en medio básico (alcaloides, antidepresivos tricíclicos, etc.)

3. Neutros: extraíbles con disolventes orgánicos en medio ácido o básico.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos

Las técnicas son: -Método de electrodiálisis: se basa en la propiedad que tiene la corriente eléctrica de descomponer las sales de los tóxicos orgánicos, yendo la base hacia el polo negativo y el resto al polo positivo.-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgánicas son absorbidas por la resina y luego son eluidos con solventes apropiados.

Extracción en fase sólida

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos orgxicos orgáánicos fijosnicos fijos

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de n de ttóóxicos minerales o xicos minerales o

inorginorgáánicosnicos

Estos tóxicos se encuentran en el organismo firmemente unidos a albúmina, lípidos o glúcidos, siendo requisito la destrucción de la materia orgánica para poder realizar su análisis.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de tn de tóóxicos xicos minerales o inorgminerales o inorgáánicosnicos

1. Mineralización: proceso por el cual se produce la destrucción de la materia orgánica y la consiguiente liberación del tóxico.

a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica empleando ácido nítrico o mezclas de ác. nítrico-agua oxigenada, etc.b) Destrucción de materia orgánica por vía seca (calcinación).c) Formación de complejos y posteriormente se separa con disolventes orgánicos.

Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, para obtener una muestra más apropiada.

MMéétodos de extraccitodos de extraccióón de tn de tóóxicos xicos minerales o inorgminerales o inorgáánicosnicos

Existen métodos que no precisan la destrucción de la materia orgánica como:

*Diálisis.*Ultrafiltración.*Electrodiálisis.*Desproteinización.

2. Marcha posterior de extracción

DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióónndel tdel tóóxicoxico

Dos etapas:

1. Rastreo o detección rápida: -Técnicas de inmunoensayo-Cromatografía en capa fina

2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas.-Técnicas cromatográficas.

TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo

Fundamento:

Reacciones antígeno-anticuerpo.

Se aplica especialmente para drogas de abuso y psicofármacos.

Tóxico libre

TTóóxico marcadoxico marcado

+ AC Tóxico libre-AC

TTóóxico marcadoxico marcado

TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo

1. Radioinmunoensayo (RIA): isótopo radioactivo.

2. Enzimoinmunoensayo: enzima.-ELISA: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas

3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluoróforo.

4. Inmunoanálisis por interacción cinética de partículas (KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar agregados de micropartículas.

TTéécnicascnicas inmunoensayo inmunoensayo

•Su aplicación es cualitativa y cuantitativa (con patrones de concentración).

•Técnicas rápidas, y sensibles.

•Posibilidad de reacciones cruzadas.

TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficasCromatografía en capa fina (CCF)

Fase movil Fase estacionaria Aplicaciones Cloroformo/acetona 80:20

Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm

Todos los tipos

Isopropanol/cloroformo Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30 min/10 cm

Barbitúricos

Cloroformo/acetona 90:10

Silica gel G activada a 120ºC/30 min Desarrollo: 30-45 min

Anticonvulsionantes Sedantes no babitúricos

DetecciDeteccióón e identificacin e identificacióónndel tdel tóóxicoxico

2. Técnicas de confirmación: -Técnicas espectrofotométricas.-Técnicas cromatográficas.

TTéécnicascnicas espectrofotomespectrofotoméétricastricas

Fundamento: capacidad que tienen las moléculas y los átomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda utilizando la energía de dichas radiaciones para producir cambios energéticos en su estructura (en los átomos transiciones electrónicas y en las moléculas movimientos electrónicos)

Aplicaciones Técnicas Compuestos Análisis

Espectrofotometría UV visible Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofluorimetría Orgánicos Cuali/cuantitativo Espectrofotometría infrarroja Orgánicos Cualitativo Espectrofotometría de absorción atómica Metales Cuali/cuantitativo Espectrometría de masas Orgánicos Cualitativo

EspectrofotometrEspectrofotometríía de absorcia de absorcióón n atatóómica (EAA)mica (EAA)

E*

E

Luzincidente Fluorescencia

emitida

EspectrofotometrEspectrofotometríía de a de absorciabsorcióón atn atóómicamica

EspectrofotometrEspectrofotometríía de a de absorciabsorcióón atn atóómicamica

Sistemadetector

Lámpara de cátodo hueco Sistema

atomizadorSistema

monocromadorSistemadetector

La emisión de una energía electromagnética de longitud de onda determinada, se hace incidir sobre un átomo libre en estado fundamental, este átomo absorbe la energía y con lo que pasa a un estado excitado.

Ventajas e inconvenientes• Costoso.• En la interpretación de resultados considerar:

contaminación en la toma y mantenimiento de las muestras, etc.

• Personal especializado.• Técnica muy sensible, fiable y rentable. Su

sensibilidad permite identificar y cuantificar metales en niveles de traza.

EspectrofotometrEspectrofotometríía de absorcia de absorcióón n atatóómicamica

EspectrofotometrEspectrofotometríía dea de emsiemsióónnatatóómica (EEA)mica (EEA)

E*

E

Luz emitida

EspectrofotometrEspectrofotometríía a de masas (EM)de masas (EM)

Técnica cualitativa y cuantitativa.Separa partículas moleculares o atómicas según su masa.

Volatilización

Ionización

2.Aceleracióniones

3. Separación

4. Detección

EspectrofotometrEspectrofotometríía de masasa de masas

Técnica cualitativa y cuantitativa.Análisis de fragmentos moleculares. Determinación de la estructura molecular.Su principal aplicación es la identificación de sustancias desconocidas

Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• Acoplamiento a GC (o HPLC): método

más efectivo para la identificación de tóxicos y sus metabolitos.

• ICP-MASAS

EspectrofotometrEspectrofotometríía de masasa de masas

ICPICP--MasasMasas

ICP: Plasma deacoplamiento inducido

TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficasficas

Cromatografía de líquidos

Cromatografía de gases

TTéécnicascnicas cromatogrcromatográáficas ficas Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Ventajas e inconvenientes• Costoso.• Personal especializado.• No destruye la muestra, lo que permite la detección por

distintos sistemas en serie.• Requiere mínima preparación y pequeñas cantidades. • Mayor precisión que GC. En general se aplica a

compuestos de alto peso molecular y polar mientras que GLC se aplica a gases permanentes y sustancias volátiles.

• Mejor resolución y menor tiempo de análisis.

CromatografCromatografíía la lííquida de alta quida de alta resoluciresolucióón (HPLC)n (HPLC)

Gracias por su atenciGracias por su atencióónn