ARTCULOS

ANTRACNOSIS EN ZBILA CAUSADA POR COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDESEN LA ZONA RIDA DEL ESTADO MRIDA, VENEZUELA

Luis Cedeo1, Armando Briceo R.2 y Gustavo Fermn2

Universidad de Los Andes, 1Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Facultad de Ciencias Forestales, Santa Rosa; 2CentroJardn Botnico, Facultad de Ciencias, Mrida 5101, Venezuela.Investigacin financiada por el Consejo de Desarrollo Cientfico, Humanstico y Tecnolgico de la Universidad de Los Andes(Proyecto FO-682-08-01-B), Mrida, Venezuela.

Recibido: 14 de junio de 2010. Aceptado: 22 de octubre de 2010.

30 Vol. 23, N 2, 2010

RESUMEN

Cedeo, L., Briceo R., A. y Fermn, G. 2010. Antracnosis en zbilacausada por Colletotrichum gloeosporioides en la zona rida del estadoMrida, Venezuela. Fitopatol. Venez. 23:30-34.

En abril de 2007, el hongo Colletotrichum gloeosporioides fueconsistentemente aislado de las pencas (hojas) de plantas de zbila(Aloe barbadensis Miller) cultivadas en la Estacin Experimental SanJuan de Lagunillas del Instituto de Investigaciones Agropecuarias dela Universidad de Los Andes, Mrida, Venezuela. Pruebas depatogenicidad realizadas en invernadero y subsecuentes re-aislamientos hechos a partir de las pencas inoculadas artificialmente,confirmaron que C. gloeosporioides caus la enfermedad investigada.La identidad de la especie se estableci sobre la base de anlisisfitopatolgicos tradicionales y confirmada mediante prueba molecularpor PCR. Este artculo constituye para Venezuela el primer reporteformal sobre una enfermedad de antracnosis causada porC. gloeosporioides en zbila.Palabras clave adicionales: Aloe barbadensis, biologa molecular,Glomerella cingulata, PCR.

ABSTRACT

Cedeo, L., Briceo R., A. and Fermin, G. 2010. Anthracnose on aloecaused by Colletotrichum gloeosporioides at the arid zone of MridaState, Venezuela. Fitopatol. Venez. 23:30-34.

In April 2007, the fungus Colletotrichum gloeosporioides wasconsistently isolated from leaves of aloe plants (Aloe barbadensisMiller) cultivated at the Experimental Station San Juan deLagunillas of Instituto de Investigaciones Agropecuarias,Universidad de Los Andes, Mrida, Venezuela. Pathogenicity testsperformed under greenhouse conditions and subsequent re-isolations from leaves artificially infected, confirmed that C.gloeosporioides caused the disease investigated. The identity ofthe fungus was determined based on traditional phytopathologicalanalysis and it was also confirmed by a PCR-based molecular test.This paper is the first formal report for Venezuela about ananthracnose disease caused by C. gloeosporioides on aloe.Additional key words: Aloe barbadensis, Glomerella cingulata,molecular biology, PCR.

INTRODUCCIN

La zbila (Aloe barbadensis Miller) [= Aloe vera (L.) P.Webb & Benth.], tambin llamada sbila y zabila, es unaherbcea de la familia Xanthorrhoeaceae originaria defrica, que se caracteriza por desarrollar una roseta basalde hojas suculentas. El trmino genrico Aloe deriva delrabe alloeh que, segn su sinnimo hebreo hallal, significasustancia brillante y amarga. A esta planta se le atribuyenpropiedades de utilidad alimentaria,cosmtica, farmacuticay mdica (16). Nacional e internacionalmente se comercializacomo hojas (pencas), jugo (acbar) y gel (cristales).

En Venezuela, las principales entidades productoras dezbila son: Falcn, Lara, Sucre y Anzotegui (15). La especiefue introducida a Falcn y algunos estados orientales desdelas islas del Caribe (Aruba, Curazao), mientras que a Laralleg desde Falcn. Recientemente, la alcalda del municipioSucre del estado Mrida inici la ejecucin del proyectoMucumb, cuyo propsito fundamental es producir,procesar y comercializar zbila y sus derivados, a los finesde garantizar empleo y mejorar la calidad de vida de losagricultores de la zona. Esta accin de apoyo a la agriculturafamiliar y a las comunidades campesinas en general, exigeiniciar estudios de diagnstico sobre insectos y enfermedades,que pudieran convertirse en potenciales amenazas para eldesarrollo exitoso del plan zabilero en referencia.

A pesar de poseer atributos medicinales de utilidadhumana, las plantas de zbila sufren enfermedades quealteran su capacidad productiva y, en casos excepcionales,le ocasionan la muerte. En abril de 2007, en una siembraexperimental de zbila situada en la Estacin ExperimentalSan Juan de Lagunillas del Instituto de InvestigacionesAgropecuarias de la Universidad de Los Andes (IIAP-ULA),sobrevino una enfermedad foliar que afect 80% de lapoblacin. Las hojas experimentaron necrosis localizadaprincipalmente en los bordes y la punta. Inicialmenteaparecieron lesiones de color marrn claro con margencastao oscuro que, posteriormente, se convirtieron enmanchas secas de color marrn oscuro a casi negras (Fig. 1).

El objetivo primordial del presente estudio fue identificary evaluar la patogenicidad del microorganismo causante delaenfermedad.

MATERIALES Y MTODOS

Aislamiento e identificacin del patgeno. Losaislamientos se realizaron a partir de plantas de zbilasintomticas provenientes de una plantacin experimentalexistente en la Estacin Experimental San Juan deLagunillas del IIAP-ULA, situada en San Juan de Lagunillas,municipio Sucre del estado Mrida. Despus de lavar las hojas

(pencas) enfermas por 1h con agua de chorro. Del margende las manchas se cortaron fragmentos de 2-3 mm delongitud que secuencialmente fueron sumergidos por 1 minen solucin 0,5 % de hipoclorito de sodio (NaClO), lavadosen tres cambios de agua destilada esterilizada (ADE),secados con papel absorbente esterilizado y sembradosaspticamente en placas de agua agar 2 % ms cido lctico(AAA, pH 4,5). Las placas se incubaron a temperaturaambiente (22 2 oC) y 12 h de fotoperiodo. Las coloniasemergentes se transfirieron a placas que contenan mediopreparado con papa dextrosa agar (PDA) ms antibitico(cloranfenicol, 150 g.mL-1), para posteriormente realizarcultivos monoconidiales y proceder a la identificacin delpatgeno sobre la base de la morfometra de las estructurasreproductivas y mediante anlisis molecular por PCR (2).Adicionalmente, se investig la sensibilidad a benomilo enmonoconidiales del hongo aislado (14). Para la obtencinde los cultivos monoconidiales se seleccion un cultivo masaldel cual se cosecharon conidias que inmediatamente fuerontransferidas a un tubo de microcentrfuga que contena1 mL de ADE. La suspensin se agit en Vrtex y con unhematocitmetro se procedi a determinar la concentracinconidial, para posteriormente ajustarla a 50 conidios/l. Enel centro de placas que contenan AAA PDA mscloranfenicol, se combinaron 0,3 mL de ADE y 1 l desuspensin conidial, procediendo luego a dispersar lapreparacin con una varilla de vidrio. Las placas seincubaron invertidas a temperatura ambiente (22 2 oC) y12 h de fotoperiodo. Los monocultivos fueron sub-cultivadosen tubos con PDA y conservados bajo refrigeracin.

Las caractersticas morfomtricas se registraron en10 cultivos monoconidiales y en cada uno de stos seexaminaron 50 conidias que fueron depositadas sobreportaobjetos, fijadas con formaldehido 4%, teidas conlactofucsina cida 0,025% y examinadas en microscopioZeiss, modelo Axioplan. Los apresorios se indujeroninoculando lateralmente piezas rectangulares de AAA,previamente depositadas sobre porta objetos incubados bajocondiciones de cmara hmeda preparada con cpsulas dePetri, papel filtro y ADE. La identificacin preliminar delmicroorganismo aislado se realiz sobre la base de lamorfologa y dimensiones de conidias y apresorios. Paraconfirmar la identidad del patgeno se hizo un anlisis

Fig. 1. A. Zbila con infeccin natural de antracnosis causada porColletotrichum gloeosporioides.

molecular por PCR utilizando cebadores dirigidos a lasecuencia transcrita interna de los ribosomas, ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTAGTATGC-3) y un cebador inversoespecfico para Colletotrichum acutatum (CaInt2: 5-GGGGAAGCCTCTCGCGG-3) o C. gloeosporioides (CgInt: 5-GGCCTCCCGCCTCCGGCCGG-3). Los cebadores fuerondiseados originalmente por Brown et al. (5,23). La extraccindel ADN, los anlisis de PCR y la identificacin de losproductos amplificados se realizaron como se reportarapreviamente (2).

Pruebas de patogenicidad. Se seleccionaron doceplantas sanas de zbila de seis meses de edad, de las cuales8 fueron inoculadas y 4 usadas como control. Previo a lainoculacin, todas las plantas fueron asperjadas con ADE ycolocadas por 24 h en cmara hmeda bajo condiciones deinvernadero. En cada planta seleccionada para la infeccinartificial se determin cantidad y longitud promedio de lashojas. El nmero de hojas/planta vari entre 5 y 11, con unpromedio aproximado de 7. La longitud oscil entre 15,2 y25,5 cm, siendo el promedio 19,7 cm. A cada hoja se le hizouna herida en la parte media del haz utilizando una agujade diseccin estril y sobre la puncin se deposit un disco(10 mm dim) de agar-micelio cortado de un cultivomonoconidial en PDA+ cloranfenicol incubado por 13 da temperatura ambiente (22 2 C). Sobre el disco inculose coloc algodn esterilizado y mojado con ADE,mantenindolo en el sitio con papel Parafilm. En lasplantas testigo slo se aplicaron discos de PDA +cloranfenicol sin el hongo. Seguidamente las plantasinoculadas y testigo fueron cubiertas con bolsas de plsticotransparente e inmediatamente incubadas por 5 d eninvernadero. Posteriormente, a partir de las plantasinfectadas experimentalmente, se hicieron re-aislamientosen AAA para confirmar el cumplimiento de los postuladosde Koch y, en consecuencia, la patogenicidad del organismo.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Aislamiento e identificacin del patgeno. A partirde los tejidos infectados naturalmente, siempre se aislun hongo perteneciente al gnero Colletotrichum que enplacas con PDA incubadas a temperatura ambiente y12 h de fotoperiodo, produjo colonias blanco-algodonosas queseguidamente se volvieron ligeramente rosadas y finalmentecomenzaron a tornarse grisceas desde la porcin central.El crecimiento ocurri en forma de bandas concntricas ylas conidias aparecieron en masas mucilaginosas de coloranaranjado prximas al borde de las placas. Por el reversose apreci un tinte ligeramente rosado. Se observaronconidias unicelulares, hialinas, oblongas, con ambos extremosobtusos y midieron 12,0-(13,8)-15,0 m de largo x 3,0-(3,2)-4,0 m de ancho. Los apresorios mostraron coloracin marrnsepia, forma clavada, ovada, ob-ovada o lobulada y midieron5,0-(7,5)-13,7 m de longitud x 2,5-(4,2)-6,2 m de ancho (Fig.2). Sobre la base de la morfologa y dimensiones de lasconidias y apresorios y las caractersticas del crecimientoin vitro, el organismo aislado se identific preliminarmentecomo C. gloeosporioides (21,22), anamorfo de Glomerellacingulata. En PDA el benomilo inhibi totalmente elcrecimiento micelial, condicin que es caracterstica en C.gloeosporioides (14).

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BA

B

A

Fig. 2. Colletotrichum gloeosporioides. A. Conidias producidas en PDA.B. Apresorios desarrollados en AAA.

Identificacin molecular del patgeno. Lapurificacin del ADN de C. gloeosporioides fue simple yproporcion fcilmente cantidades satisfactorias de producto.Medio gramo de micelio produjo suficiente ADN paracualquier estudio de biologa molecular. En las pruebasrealizadas para la identificacin molecular por PCR de laespecie, el ADN proveniente de cultivos monoconidiales nose degrad y fue confiable para la amplificacin de losproductos especficos. Los cebadores diseados para laidentificacin especfica de C. gloeosporioides permitieronla amplificacin de un producto muy prximo a las 500 pbreportada para la especie (23). No se observ ningn productocuando el mismo ADN se utiliz con los cebadores dirigidosa C. acutatum. En resumen, todas las pruebas de PCRconfirmaron que los cultivos monoconidiales examinadospertenecen a C. gloeosporioides y que las mismas sonconfiables para la discriminacin entre C. acutatum, C.coccodes y C. gloeosporioides (13) (Fig. 3).

La prueba de secuenciacin de los productos amplificadosy el alto nivel de similitud detectado al comparar losresultados obtenidos mediante BLAST en la base de datosGenBank, confirm la identidad del hongo investigado.

Pruebas de patogenicidad. Cinco das despus de lainoculacin (ddi), todas las pencas infectadas artificialmentepresentaban lesiones con centro marrn claro y margendefinido de color castao a marrn oscuro alrededor de laherida. Las pencas de las plantas testigo slo tenan necrosisen la herida hecha con la aguja de diseccin.

A los 13 ddi, se apreci que las lesiones haban avanzadoformando bandas ms o menos concntricas bien definidasy con tonalidades entre pardo-rojizo y marrn. En cada lesinse apreci una depresin que se extenda desde el haz hastael envs. Alrededor de las lesiones haba pecas de colorespardo y marrn. Para la fecha, las lesiones, incluyendolas reas deprimidas, midieron entre 2,5 y 3,5 cm de dim(Fig. 4).

A los 19 ddi, todas las plantas inoculadas presentabansntomas caractersticos de la enfermedad observada encampo. Las pencas inoculadas, en su mayora, mostrabancolor verde plido o ligeramente rosado y hasta ese momentono se observaron acrvulos. En promedio, las lesionescrecieron aproximadamente 1 cm por semana.

C. gloeosporioides fue aislado consistentemente de laslesiones reproducidas artificialmente en las hojas de zbila,confirmndose el cumplimiento de los postulados de Koch ydemostrndose, en consecuencia, que la especie de hongoinvestigada fue la causante de la enfermedad ocurrida en laEstacin Experimental San Juan de Lagunillas del IIAP-ULA. En la literatura disponible examinada, no apareceregistrado ningn reporte sobre antracnosis causada porC. gloeosporioides en zbila. En consecuencia, la presentepublicacin parece constituir el primer reporte sobre unaenfermedad de antracnosis causada por C. gloeosporioidesen zbila en Venezuela .

Las bondades que se le atribuyen a la zbila son diversase innumerables, lo que permite catalogar al cultivo comorubro con significativo potencial generador de ingresos.Sin embargo, es importante destacar que, con algunasexcepciones particulares, la produccin de zbila enVenezuela no ha recibido la atencin agronmica yfitopatolgica requerida para que su potencial productor seacomercialmente competitivo. A manera de ejemplo, en elestado Falcn, primer productor nacional y donde la tradicinzabilera ha transitado ms all de 500 aos, para el ao2005 la zbila todava conservaba la condicin de cultivomarginal o complementario (15). En este estado, el cultivose explota como una fuente adicional de ingresos (16), siendosta una de las razones por las cuales no se cumple con losestndares internacionales de calidad (15). Debido a esecarcter de cultivo secundario, hasta el inicio de la primeradcada del siglo 21, la informacin fitopatlogica fue escasae imprecisa. Tanto es as, que la zbila no aparece referida

Fig. 4. Antracnosis en zbila inoculada experimentalmente conColletotrichum gloeosporioides.

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Fig. 3. Identificacin por PCR de Colletotrichum gloeosporioides. Los productos de amplificacin fueron corridos por 1 hora en Gel de agarosaal 0,8%, utilizando buffer TAE 1X. Carriles 1 y 18: escalera de PM 1 Kb DNA leader. Carriles 2-9 amplificados con primer de identificacin paraC. acutatum: 2-6.- Aislados monoconidiales de lesiones en zbila, 7.- Aislado de C. acutatum (fresa), 8.- Aislado de C. gloeosporioides (mango),9.- control negativo sin ADN. Carriles 10-17 amplificados con primer de identificacin para C. gloeosporoides: 10-14.- Aislados monoconidialesde lesiones en zbila, 15.- Aislado de C. acutatum (fresa), 16.- Aislado de C. gloeosporioides (mango), 17.- control negativo sin ADN.

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en las publicaciones ndice de Enfermedades de las PlantasCultivadas en Venezuela de Daz Polanco y Salas de Daz(4) e ndice de Enfermedades en Plantas de Venezuela yCuba de Urtiaga (25). Para 1999, una publicacin dedifusin limitada refiere daos causados por especiesdesconocidas de hongos pertenecientes a los gnerosFusarium, Rhizoctonia y Pestalotia (1).

Fue a partir del ao 2001, durante la realizacin del XVIICongreso Venezolano de Fitopatologa, cuando se inici lapresentacin formal de informacin relativa a enfermedadesde la zbila provocadas por bacterias y hongos. Del estadoSucre se reportaron bacterias patgenas de los gnerosPectobacterium, Erwinia, Ralstonia y Pseudomonas (24),mientras que en Falcn se mencionaron daos inducidospor Pantoea aglomerans y Erwinia chrysanthemi (3,7,10). Encuanto a las enfermedades fngicas se sealaron problemascausados por Fusarium sp. (10), Fusarium solani (20), Rhizoctoniasp. (7,9,10), Sclerotium rolfsii (6,7,19,20) y Lasiodiplodiatheobromae (20). Posteriormente, en el ao 2003, fueronreportados desde Falcn E. chrysanthemi (12) y desde laPennsula de Araya, estado Sucre, Dreschlera hawaiiensiscomo causante de manchas foliares (17). En el 2004, Lugo et al.(11) sealaron que una especie desconocida de Rhizoctonia estabapudriendo el tallo y las races de la zbila cultivada en elestado Falcn.

C. gloeosporioides es un patgeno cosmopolita y ha sidoreconocido como agente causal de antracnosis enaproximadamente 250 especies botnicas distintas (18). Laenfermedad causada por este hongo pudiera convertirse enuna de las principales debilidades a corregir en el proyectode produccin industrial de zbila en el Municipio Sucre deMrida, cuya ejecucin ha sido motivada por el inters que

han manifestado empresas de Alemania y China, de recibirtodo el producto derivado de la zbila cultivada en esa zona,para ser usado como materia primera en la elaboracin decosmticos y medicamentos. La antracnosis ocasionaalteraciones estticas y estructurales en las hojas, quereducen su capacidad de almacenar gel. En etapa avanzadade enfermedad, las hojas se vuelven negras y retorcidas.

Finalmente, es importante sealar que desde el puntode vista econmico y ambiental, la prevencin destaca comola medida de control ms efectiva y menos costosa, ya quecuando se evita la aparicin de la enfermedad, no hay queaplicar pesticidas que pudieran limitar la utilidad de losderivados de la zbila, motivado a la presuncin sobreposibles efectos nocivos para la salud.

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