análisis de la respuesta celular cd8 específica contra ... · 11.2. interacción tcr 1 complejo...
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UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MÁDRID
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTODE MEDICINA
ej
UUNIVERSIDAD COMPLUTENSE
5314013694
Análisisde la respuestacelularCDS específicacontrael virus R,
en funcióndelcontrolviral y gradode inflamaciónhepática,
en la infecciónpersistenteporvirus B.
TesisDoctoral
JuanRamónLarrubia Marfil
Directores:
Prof.ManuelDiaz-RubioGarcía
Prof. JoséMaría LaderoQuesada
“ParaMaña,por supuesto”.
“Quién no sabelo quebusca,no ve lo queencuentra”.
ClaudeBernard.
II
AGRADECIMIENTOS
.
Me gustaríaexpresarmi agradecimientoatodasaquellaspersonase instituciones
quehanparticipadodeuno u otro modoen la realizaciónde estatesisdoctoral.
En primer lugar, quieromostrarmi reconocimientoa los directoresdeestatesis,
los ProfesoresManuel Díaz-Rubio y JoséMaría Ladero, por su acertadadirección.
Tambiénles agradezcosudecisivaparticipaciónenmi formaciónenGastroenterologia,
adquirida durante la residenciaen el hospital Clínico San Carlos, así como haber
despertadoenmi un especialinteréspor laHepatologíay la investigación,quehansido
las semillasparael desarrollode estatesisdoctoral.
Mi gratitud al Profesor Roger Williams por concedermeuna plaza de
InvestigadorClínico en el “Instituto de Hepatología”del “Royal Free and lJniversity
CollegeLondonMedical School”,donderealicée] trabajoexperimentaldeestatesis.
A mis tutoresenel “Instituto de Hepatología”,los doctoresAntonio Bertoletti y
Mala Maini, siempreles estaréespecialmenteagradecidopor habermeintroducido en
esteapasionantecampode la inmunopatogénesisdela hepatitisB.
Mi agradecimientoa los doctoresGrahamS. Ogg y Andrew J. McMichael del
institutode MedicinaMolecular,DepartamentoNuffxeid de Medicina,del HospitalJohn
RadcliffedeOxfordpor laelaboraciónde los complejostetraméricosULA-péptido.
A mis compañerosde laboratorioles agradezcosucontinuaayuday estimulantes
III
discusiones.C. K. Lee, 5. Reignat y J. Herberg colaboraronespecialmenteen los
experimentosde esteproyecto.
Mi recuerdoa todos los pacientesque de forma desinteresadaparticiparonen
este estudio. También mi gratitud a los profesionalesdel Departamento de
Enfermedadesde TransmisiónSexualdel Centro“Mortimer Market” (NUS) de Londres
por la recogidade muestrasy datosclínicos.
Mi agradecimientoalFondo de InvestigacionesSanitarias(FIS) del Instituto de
SaludCarlosIII del Ministerio de Sanidady Consumopor la financiacióneconómica
concedidaatravésde una becade Formaciónen Investigación(BEFI 98/9155),queme
hapermitidodedicarmecompletamentea estetrabajodurantedosaños.
A mis amigosles agradezcosucontinuo respaldoy aliento.JuanLuís, JavierU.,
JavierC., Femandoy Jesúsme enviaronsu apoyo y consejosdesdeEspaña.También
han compartido conmigo desde Londres los esfúerzosde esta tesis Ross, Ralph,
Stephaniey Fabio, quienesen todomomentosepreocuparonde replecionarmis niveles
de cafeínay cerveza.
Por supuestotengo que agradecera toda mi familia su inestimable ayuda,
especialmentea mis padresy hermana,quienescon su estimulo nuncadejaron lugar
parael decaimientoni la desilusion.
A María, a quien dedicoestetrabajo. Sin su apoyo estatesis no hubierasido
posible.
Iv
ÍNDICE
.
Página
1.RESUMEN 1
II. INTRODUCCION 3
11.1. Característicasgeneralesde la respuestainmuneanti-viral 4
11.1.1 Respuestainnata 4
11.1.2Respuestaadaptativa 5
11.1.3 Importanciade la respuestaCD8+ virus específica 8
11.1.4Mecanismosde persistenciaviral 10
11.2. InteracciónTCR 1 complejoliLA clase1-péptido 12
11.2.1 El receptorde la célulaT 12
11.2.2El complejoHLA clase1/péptido 14
11.3. Característicasantigénicasde la infecciónporVHB. 16
11.3.1 Estructuradelgenomadel VHB 16
11.3.2Replicaciónviral 18
11.3.3Transcripcióny transducciónviral. Antígenosdel VHB 19
11.4.Respuestainmuneespecíficaen la infecciónporVHB 23
11.4.1 Respuestainmunehumoral 23
11.4.2Respuestainmune HLA-II restringida 25
11.4.3RespuestainmuneHLA-I restringida 27
11.5. RespuestaCDS core IS-27específicaHLA-A2 restringida 35
11.6. Métodosdecuantificaciónde los linfocitos T citotóxicos 38
11.7 Justificacióndeesteestudio.Desarrolloinductivo 43
11.7.1 Cuadrosclínicosen la infecciónpersistenteporVHB 44
y
111.7.2Respuestacelularcitotóxicay dañohístico 47
111.7.3Respuestacelular citotóxicay controlviral 48
III. HIPÓTESISY OBJETIVOS 51
IV. DISEÑO,MATERIAL Y MÉTODOS 53
IV.1 Diseñodel estudio 53
IV.í.1 Tipo de diseño 53
IV.1.2 Ambito del estudio 53
IV.í.3 Selecciónde los sujetos 54
IV.1.4 Variablesdelestudio 59
IV.2 Pacientes,materialy métodosexperimentales 63
IV.2. 1 Sujetosseleccionados 63
IV.2.2 Recogidademuestrasy datosclínicos 63
IV.2.3 Estudiovirológico 65
IV.2.4 Tipalede I-{LA-A2 66
IV.2.5 SíntesisdecomplejostetraméricosHLA-A2/core 18-27 67
IV.2.6 Tinción de CMSP conanticuerposanti-CD8 y concomplejos
tetraméricosHLA-A2/core 18 27 68
IV.2.7 Producciónde líneascelulares 69
IV.2.8 Análisisde liberaciónde cromo y ensayode dilución límite ... 70
IV.2.9 Amplificacióndel gendelVHB core 1 8-27 71
IV.3 Diseñodel análisisestadístico 74
IV.3.1 Estadísticadescriptiva 74
IV.3.2 Estadísticainferencial 75
VI
V. RESULTADOS 80
V.1 Validaciónde la técnicade recuentode LTC core18-27 80
V.2 Descripciónde los datosy análisisunivariante 85
V.2. 1 Característicasdemográficasy clínicasde los sujetos 86
V.2.2 Frecuenciade linfocitos CD8+ITcl8-27+ensangreperiférica.88
V.2.3 Expansiónin-vitro de los linfocitos CD8+/Tcí8-27+ 96
V.2.4 Correlaciónde la frecuenciade célulasCDS+/Tcl8-27±con la
cargaviral y el dañohepático 101
V.3 Gráficosy tablasdescriptivas 103
V.4 Análisis multivariante.Controlde la confusióne interacción 110
V.4. 1 Análisis de la presenciade confusión e interacción en la
comparaciónde la frecuenciade célulasCD8+/TcI8-27+ en
los sujetoscon infecciónpersistente 110
V.4.2 Análisis de la capacidad de expansión de las células
CD8/Tc18-27±en los sujetosinfectadospor VHB ajustando
porla frecuenciainicial de célulasCD8¡TcI8-27+ 111
VI. DISCUSIÓN 113
VII. CONCLUSIONES 130
VIII. PUBLICACIONES GENERADAS 132
IX. APÉNDICES 133
IX.1 Abreviaturasutilizadas 133
VII
IX.2 Índicedegráficos 135
IX.3 Índicede tablas 137
IX.4 Financiacióndel proyecto 139
X. REFERENCIAS 140
vm
1. RESUMEN.
El virus de la hepatitisB (VHB) es un virus no citopático que permanecede
forma persistenteen el huésped,provocandodistintas situacionesclínicas. Múltiples
datos indican que los linfocitos T citotóxicosVHB específicosdesarrollanun papel
central en el controlde estainfeccion.
Análisismatemáticosquemodelanla interacciónentrevirus no citopáticosy la
respuesta celular citotóxica, sugieren que existe una disminución en la capacidad de
respuestade los linfocitos T citotóxicos virus especificosen aquellossujetos con
infección persistenteque no controlan la viremia. Por otro lado, se ha observadoen
modelosanimales y en ciertas infeccionesen humanosque el desarrollo de una
respuestacelularcitotóxicaadecuadaescapazdecontrolarla infecciónsin generardaño
tisular.
Hipótesis
.
Basándonosenestosantecedentes,seplanteósi aquellossujetoscon infección
persistentepor VHB sin datosde inflamación hepáticay con baja replicaciónviral
disponíandeunarespuestacelular1 CD8 VHB específicasuperiora la de los pacientes
conelevadacargaviral e inflamaciónhepática.
Métodos
.
La respuestacelular citotóxica desarrolladapor pacientesHLA-A2+ AgHBs+
contrael péptido 18-27del coredel VHB se utilizó comomodelo de respuestaCD8+
antígenoespecíficaen la infección persistentepor VHB. Paracontrastarla hipótesis
planteadasecuantificó,directamenteex-vivo, la frecuenciabasalde linfocitos CD8 core
18-27 específicosde sangreperiféricaen dosgruposde sujetoscon distinto gradode
control viral y daño hepático.Además,seevaluó la capacidadde expansiónde estas
células in-vitro, tras estimulacióncon el péptido core 18-27. En ambos análisis se
utilizaron complejostetraméricosHLA-I/p¿ptido parael recuentode las células CD8
antígenoespecíficasmediantecitometríade flujo.
Resultados
.
Seobservóqueel controlde la replicacióndel VHB seasociabaconla presencia
de un reservorio circulante de células CDS+ VHB especificasque eran capacesde
expandirsetrasel reconocimientoespecificodelvirus. Estasituaciónno se detectóen la
mayoríadesujetosconaltaviremiae inflamaciónhepática.
Conclusiones
.
La existenciade una capacidadde respuestacelular citotóxica VHB específica
disminuidaenla infecciónpersistenteporVHB podríainfluir enel controlde la viremia
y eneldesarrollode dañohepático.El controlde la replicacióndel VHB por las células
CD8+ VHB especificaspodríarealizarsede forma independientea la generacióndel
dañotisular.
2
II. INTRODUCCIÓN.
El virus de la hepatitisB (VHB) esun virus hepatotropoque infectaa másde
300 millones de personasen todo el mundo1 y es una de las principalescausasde
hepatitiscrónica,cirrosishepáticay hepatocarcinoma2’3’4.Unpequeñoporcentajede los
adultosque entranen contactocon el virus B no consiguecontrolar la infección. Sin
embargo,estasituaciónocurreen la mayoríade los casoscon infecciónadquiridaenel
periodoneonatal5,siendoestaruta la principalvía de contagioen el mundo.
El curso de la infección por VHB dependede la relaciónentre la respuesta
inmune del huéspedy la habilidaddel virus paraevadila.Aunquetodos los elementos
de la respuestaantiviral son importantesen el control de la infección, los linfocitos T
citotóxicos (LTC) antígeno específicos ejercen un papelprimordial en la erradicación
delVHB porsucapacidadde identificar las célulasinfectadas6y eliminarel virus7’8. Por
estasrazonesesespecialmenteinteresanteelestudiode estetipo de célulasen aquellas
situacionesen que el sistemainmune no es capaz de controlar completamentela
infección.
3
11.1 CARACTERÍSTICAS DE LA RESPUESTAINMUNE ANTI-VIRAL
.
Evolutivamentese ha alcanzadoun equilibrio entre el sistema inmune del
huéspedy el virus quegarantizala supervivenciade ambos.Esteequilibrio esdiferente
según se trate de un virus citopático o no citopático. Por esto, en ambostipos de
infección la respuestainmune presentacaracterísticaspeculiaresdebido al distinto
comportamientodelpatógenotA continuación,sedescribenlos mecanismosde defensa
antiviral del huésped,con especialdetenimientoen el papel de las células CD8 virus
específicasen infeccionesporvirus no citopáticos.
11.1.1Respuestainnata.
Entodarespuestainimunológicaanteun virus existeuna mmunídaddenominada
adaptativay otra innata.El sistemainmune innato9esun mecanismofilogeneticamente
muy antiguo no restringidosólo a los vertebrados.Sus componentesincluyen barreras
fisicas talescomo piel o mucosas,células fagocíticasy sustanciasquímicas como
lisozima, interferonesy complemento’0. Las células del sistema innato comparten
ciertaspropiedadesque las distinguende la respuestaadaptativa,comosonla rapidezde
respuesta,la ausenciademaduraciónen el tiempoy la capacidadde reconocermodelos
molecularesde patógenosatravésde receptorespoli-específ¡cos.Porejemplo,el RNA
de doble cadenapuedeactuar como una serial inmunomoduladorainductora de la
respuestainnata9. Estaes una moléculacompartidapor varios gruposde virus RNA
pero no por el huésped,lo que permitea estesistemareconocerlacomo extraña.Entre
las célulasdel sistemainnato destacanlas células fugocíticaspor sus propiedadesde
presentaciónde antígenosa las células del sistema adaptativo.Entre ellas, se debe
4
reseñara las células dendríticas que son células preferentementededicadasa la
presentación de antígenosque ademásde mostrar los epítopos virales a las células del
sistema adaptativo ~, puedenseleccionarlos apropiadosmecanismosefectores.Esto lo
realizan mediante la producción diferencial de citoquinas pro-inflamatorias como
interleuquina (IL)-12 o anti-inflamatorias como IL-4. Sin embargo, este sistema por sí
solo puede no ser suficiente para el control de la infección, siendo necesariala
participaciónde unarespuestamásespecíficaconstituidaporel sistemaadaptativo.
11.1.2Respuestaadaptativa.
La respuesta adaptativa constituye un mecanismo de defensa más avanzado, que
se caracteriza por su especificidad. Esta propiedad se debe a los receptores clonales de
la superficie celular que son generados por mecanismos somáticos durante la ontogenia.
Además, otra propiedad del sistema adaptativo es la memoria celular que constituye la
capacidad de responder con unaeficacia mejoradaanteun segundoencuentrocon el
patógeno.
La respuestaespecíficasedivide enhumoraly celular9.La inmunidadhumoral
esta mediadapor anticuerpos,que son producidosy liberados dentro del torrente
circulatorio por las célulasplasmáticasque derivana su vez de las células B. Estos
anticuerposreconocendeterminantesconfonnacionalesen proteínas,carbohidratosy
partículasantigénicasen membranasmucosasy en la sangre’2. Sin embargo,con
excepciónde las zonaslesionadas,no puedenentrarentejidos sólidos lo que impide su
actuaciónen órganosinfectados.De entre los distintos isotipos de inmunoglobulinas
producidaspor estascélulas, la IgO y la IgA son especialmenteimportantesen el
5
controlde la infección viral. Los anticuerposneutralizantesdel isotipo IgO desarrollan
un papel principal en la contención de la propagación de los virus citopáticos y también
en la prevención de la reinfección’3. Además, la inmunoglobulina secretora IgA bloquea
en las mucosas la unión de las partículas virales14, impidiendo así la entrada del virus.
Junto a estos mecanismos directos, los anticuerpos también pueden activar la lisis viral
mediadaporcomplementoy laposterioropsonizaciónparafuvorecerla fagocitosis.Los
anticuerposunidos a las células infectadaspor virus puedenactivar la citotoxicidad
celularmediadaporanticuerpos,atravésde la unión de las células“natural killer” a la
fracción Fc de la inmunoglobulina.Porotro lado, durantela reinfeccióncon el mismo
virus sedesarrollauna respuestahumoralsecundariamucho másrápida que es “timo
dependiente”,puestoquerequierelacolaboraciónde lascélulasT CD4+.
La inmunidad celular adaptativaesta mediadapor las células T, que se
diferencianen el timo y que secaracterizanporexpresarel receptorclonal de la célula
T, que les permitereconocerfragmentosantigénicospresentadosporel complejomayor
de histocompatibilidad(HLA). Las célulasT sedividen en dosgruposfimcionalmente
diferentes.Los linfocitos CD8 desarrollanuna actividad principalmentecitotóxica,
mientrasquelos linfocitos CD4realizanunafunciónreguladorade la respuestainmune.
Enla célula infectada,los péptidosendógenosderivadosde componentesvirales
son procesadosy presentadosa las célulasT CD8±a travésde la moléculaHLA de
clase1. Las vías de procesamientode estecomplejo incluyenla digestióncitosólicade
proteínas por proteosomasproteolíticos, la traslocaciónde los péptidos por el
transportadorasociado con el procesadodel antígeno (TAP) dentro del retkulo
endoplásmicodonde se asociacon la moléculaHLA de clase 1. Posteriormenteel
6
complejoHLA 1/péptidoestransportadoala membranaplasmática6”5”6(Figura.-11.2).
Por otro lado, las células presentadorasde antígenostalescomo macrófagos,
célulasB y célulasdendríticas,fagocitano endocitanproteínasque digiereny presentan
en la superficie mediantemoléculasde HLA de clase116 que son reconocidospor las
células T CD4+. Este mecanismode procesadoes similar pero algo distinto al que
ocurreen la presentaciónantigénicamediantemoléculasliLA de clase1. Unavez las
célulasT hanreconocidoel epítopoespecífico(en el contextode clase1 paralas CD8+
y de clase II para las CD4+) desarrollanuna expansiónclonal y muestranfunciones
efectoras.
Las célulasT CD4+ (linfocitos “helper”) jueganunpapelcentralen la respuesta
inmune adaptativa,a travésde la producciónde citoquinas que tienentanto efectos
protectorescomopromotoresde la funciónde las célulasB, T CDS±y macrófagos.Las
célulasT “helper” (Th) puedenser divididas en dos grupos; las células Th 1 se
caracterizanpor producir IL-2 e IFN-y y promuevenla activaciónde los LTC y el
desarrollo de reaccionesde hipersensibilidadde tipo retardado’7. Las células Th2
secretanIL-4, IL-5, e IL-lO que son importantesparala activacióny diferenciaciónde
las célulasB. Sehadefmidoun tercergrupo,formadopor las célulasThO que secretan
un perfil intermediode citoquinas.En resumen,las célulasT CD4+ generalmenteno
desarrollanunafuncióncitolítica pero sonmuy importantesen la regulacióndel sistema
inmune y puedenejercer un papel antiviral directo a travésde las citoquinasque
producen’8”9.
Los linfocitos T CDS±ejercensu función antiviral mediantela producciónde
7
citoquinasy a travésde mecanismoscitolíticos directossobrela célula infectadaporel
virus. Dos sonlos mecanismoscitotóxicosutilizadosporel LTC20. El primero consiste
en la liberaciónde gránulosque contienenla moléculaformadorade porosperforina y
la serinesterasagranzymaB. El otro métodoeslaexpresiónde la moléculaFasligando
(CD9SL) que interactuacon la moléculade Fas(CD95) que se expresaen la célula
diana.Estasvíasconvergenen la induccióndeapoptosisen lacéluladianaatravésde la
activaciónde los miembrosde la familia de las caspasas21.Además,los LTC generan
citoquinastipo 1 como interferóngammao factor de necrosistumoralbetaque pueden
controlarla viremiapormecanismosno citolíticos.
ILl.3 Importanciade la respuestaCD8+ virus específicaparaelcontrolviraL
Como sepuedededucirde las característicasde todos los elementosdel sistema
inmune comentadasanteriormente,las célulasT CD8+ son los agentesmásadecuados
parala vigilancia y controlde las infeccionesintracelulares.Sucapacidadde actuación
restringidapor la moléculade HLA-I, les permitereconocerla presenciade antígenos
viralesen las célulasinfectadasy destruirlas.Además,junto a estacaracterísticadestaca
la habilidadparamigrara los órganosperiféricos,alcanzandolos lugaresde infeccióna
los que no llegan los anticuerpos.Existen ejemplos en la literatura que apoyan
empiicamentela importanciade estetipo de células en el control viral. Así, se ha
observado como en sujetos inniunodeprñnidos con infección por VEB, que
desarrollabanun proceso linfoproliferativo, la infusión de linfocitos CD8 VEB
específicosconseguíacontrolarla enfermedad22.Tambiéntenemosdatosprocedentesde
modelosexperimentalesquedemuestranestaidea.Se hadescritocomo la transferencia
de LTCs influenza-específicoses capazde controlar la infección por influenza en
8
modelos murínos, sin capacidad de elaborar anticuerpos23.
Aunqueestascélulasson importantesen todaslas infeccionesvirales,su papel
es más relevanteen el caso de virus no citopáticos. En la infección por un virus
citopático lacapacidadde recuperaciónde laprimoinfecciónresideprincipalmenteen la
acción de citoquinas solubles anti-virales, que frenan la infección viral al hacer
resistentesa las célulasno infectadascontrala penetracióny replicaciónviral, y contra
el dañocausadopor el virus9. No obstante,en la infección porvirus no citopáticosla
mfecciónescontroladaprincipalmentepor las célulascitotóxicasCD8+ que destruyen
la célula infectadaantesde que descarguela nuevageneraciónde virus. Esto es así,
porque la ausenciade daño celular convierteal virus no citopático en un agentede
algunamaneramásoculto parael sistemainmune, haciendofundamentalla actuación
de los LTCs9 paracontrolarlo.Tanto es así que, en la infecciónmurina agudapor el
virus de la linfocoriomeningitismurina(LCMV) (virus no citopático)hastaun 50% de
los linfocitos CD8+ esplénicosson LCMV específicos24cuandoel huéspedescapazde
controlarel virus. Sin embargo,se ha observadocomo la respuestacelular citotóxica
estamuy disminuidaenaquelloscasosde infecciónpor virus no citopáticossin control
viral, comoocurreen la infeccióncrónicaporVHC o VHB25’26.
El desarrollode unarespuestaCD8±específicaanteunaprimoinfecciónviral es
un procesocomplejo. Inicialmente los linfocitos T CD8+ “naive” que expresanla
moléculaCD62L (receptorde atraccióna los ganglioslinfáticos) son reclutadosa los
ganglios linfáticos, dondelas célulaspresentadorasde antígenosactivana las células
CD8+ queexpresanel adecuadoTCR. La activaciónde estascélulas conlíevamuchos
cambioscelulares,como el incrementode la expresiónde receptoresde moléculas
9
co-estimuladorascomoLFA-1 o delmarcadordememoriaCD44, asícomo el descenso
de lamoléculaCD62L (L-selectina)27.Todosestoscambiossonesencialesparapermitir
al linfocito CD8+ migrar al lugar de la infección. Como resultadode estaactivación
ocurre una expansiónclonal, adquisición de característicasefectorasy migración al
órganoinfectado.En el tejido infectadotras ejercersu función citolítica estascélulas
sufrenapoptosisvía Fas28.Sin embargo,algunasde estascélulasadquierenun fenotipo
de memoriay persistendurantelargo tiempocomo mecanismode control. En la figura
11.1 se esquematizalos elementosque intervienenen la respuestainmune innata y
adaptativa.
11.1.4Mecanismosde persistenciaviraL
En el caso de la mayoríade las infeccionesque se cronifican, los virus usan
múltiplesestrategiaspara evadir o modificar la respuestainmunitaria del huéspede
impedir así suaclaramiento.Algunasde ellassecomentana continuaciónparailustrar
el dificil equilibrio entreel controly lapersistenciaviral29.
Los virus pueden escapar al reconocimiento inmunitario ocultándose en sitios
privilegiadosinaccesiblesal sistemainmune. Por ejemplo,hay virus que integran su
DNA dentrodel DNA del huéspedo colonizanórganosa dondeno puedenllegar los
LTCs29. Otra manerade evadir la respuestainmune esla pérdidade antigenicidad.De
estemodo determinadasmutacionesen el genomaviral seríanresponsablesde hacer
más invisible al virus. Así, sehadescritoquebajo el efectode la presiónininunológica
pueden seleccionarsemutaciones en aquellos epftopos virales importantes para
anticuerpos30’3’y LTCs32, denominadasmutacionesde escape.Además,algunosvirus
lo
han desarrollado mecanismos para interferir con el procesamiento y presentación de los
antígenos en las moléculas del HLA33, lo que les permite no ser vistos por los LTCs. En
otras infecciones, los antígenos virales pueden inducir inmunotolerancia al ser
reconocidos como propios durante el desarrollo fetal tras atravesar la placenta, como
ocurre en la transmisión vertical del VHBs5. En ciertas ocasiones, la ausencia de una
correcta estimulación de las células T durante el reconocimiento del péptido vira1 puede
llevar a la anergia celular y a la persistencia de la infección. Este fenómeno puede
ocurrir por déficit de moléculas co-estimuladoras en las CPAS~~ o por un inadecuado
ambiente de citoquinas o falta de ayuda por las células T CD435. También se ha descrito
como la máxima estimulación con un epítopo inmunodominante puede resultar en la
fatiga de la célula T que se vuelve anérgica o incluso es eliminada por apoptosis36,37.
Otros virus secretan moléculas con capacidades agonistas o antagonistas de citoquinas
humanas que favorecen la persistencia viral. Un ejemplo de este mecanismo es la
producción de un análogo de la IL-l 0 por el VEB que inhibe la síntesis de IFNy y
Hepatocitos infectados
*s* I Inmunidad innata
Neutrófilos Eosinófilos NK Interferones Complemento Macrófi
Inmunidad auaptativa CTL Células T helper CélulasB
Fig. 11.1. Esquema de la respuesta inmune innata y adaptativa ante una infección viral. NK: Natural Killer. CTL: linfocito T citotóxico. CPA: célula presentadora de antígenos. B: célula B. THl/TH2: celulas CD4 tipo 1 y 2.
11
disminuye laexpresiónde moléculasde HLA claseIi38. Algunosde estosmecanismos
han sido sugeridos en la infección persistente por VHB y serán comentados
posteriormente.
11.2. INTERACCIÓN TCR 1 COMPLEJO liLA CLASE 1-PÉPTIDO
.
11.2.1 El receptor de la célula T (TCR).
Como secomentópreviamente,el reconocimientodel antígeno por la célula T es
un punto central en la generacióny regulación de una respuesta inmune efectiva y se
realiza a través del TCR. La capacidadde los diferentesclones de linfocitos para
reconocerdistintosantígenosse debe a las propiedadesde esteelementocelular. El
TCR es un heterodímeroformado, en el 95% de las células T circulantes,por una
cadena a y otra ~339•En menos de un 5% de células se expresa el heterodímero
alternativo y6. Estascadenaspertenecena la superfamiliade las inmunoglobulinasy
tienen un dominio amino-terminal variable y otro dominio constante, cada uno de los
cuales tienen unionesdisulfiiro intracadena.Una cortasecuenciade conexióncon un
residuocisteinapermiteuna unióndisulfúro entrelas dos cadenas,además un dominio
transmembranaanda el receptor a la membranaplasmátical La secuenciade
variabilidaddel TCR resideen la regiónN-terminalde los dominiosa y fi, que son
homólogosa las regionesvariables de las inmunoglobulinas.Estos dominios están
generadospor la combinaciónde genesde los segmentosy, D y J parala cadena¡3, y V
y J paralacadenaa. Estazonade variabilidades laque permiteel reconocimientopor
el TCR del complejoHLA/péptido40.Análisis dediferentessecuenciasde los dominios
V del TCR han mostradoque hay cuatro regionesde secuenciade aminoácidos
12
hipervariablesen las cadenasa y ¡3, tres de las cuales son análogas a las regiones
determinantescomplementarias(CDRs) de los anticuerpos,involucradasen la unión a
antígenos. La región CDR3es la más variable dc todas ellas y de esta manera es la que
provoca más especificidad, permitiendo la diferenciación entre epítoposmuy similares.
El heterodímero afl ó y5 del TCRseasociacon la molécula CD3 en el complejo
TCR-CD3. El complejo CD3 esesencialpara laexpresiónen la membranadel TCR. La
molécula de CD3 es un complejo formado por dos heterodímeross8 y ty, y un
homodímero ~ cargados negativamente en la región transmembrana lo que permite la
unión al TCRque es de carga positiva39. Estas cadenas no presentan variabilidad de
aminoácidos entre diferentescélulas T y por tanto, no puedengenerardiversidad
asociada con el receptor de la célula T. La función de este complejo es la transducción
de la señala la célula tras la unión del ligando al TCR41. Los polipéptidos de la
molécula CD3 presentan en sus colas intracitoplasmáticas el llamado “motivo de
activación del inniunorreceptor basado en tirosina” (ITAM) que desarrolla un papel
esencialen la activacióndel linfocito T a travésde su interaccióncon tirosinquinasas42.
El complejoTCR-CD3 no tiene actividadintrínsecaprotein-tirosin-quinasa(PTK), sino
que la estimulacióndel receptorconducea la fosforilación de residuostirosina en las
ITAMs, a travésde las que seactiva la familia de las Src quinasas.Seguidamente,la
proteínaasociadaZ (ZAP) 70 se une con los ITAMs fosforilados.Todo esteproceso
conducea la activaciónde dos principales rutas, una involucrandoal diaclíglicerol
(DAG) y otra al inositol trifosfato (IP3) que provocan la elaboraciónde los factores
nucleares NF-AT y NF-icB que finalmente generan la activación celular4243’44. Otra vía
de activacióncelularesgeneradapor la adición de señalesco-estimuladorasa la unión
13
TCR-HLAlpéptido, promoviendo la síntesis de factores nucleares que activan el
“enhancer”del gende IL-2, estimulándosela producciónde estacitoquina44.
11.2.2 El complejoliLA clase1 1 péptido.Interaccióncon el TCR.
Anteriormentese explicó cómo el ligando del TCR es un péptido que es
procesado y presentado en la superficie celular por las glicoproteinas de
hístocompatíbilidad45.Aunquemiles de variantesalélicasde moléculasde ULA 1 han
sido identificadasen el serhumano,en un mismo individuo sólo sepuedenpresentar
hasta6 diferentesmoléculasdeclaseL Por esto,la uniónentreelpéptidoy la molécula
de HLA debeser“promiscua”,esdecir,unadeterminadamoléculade ULA puedeunir
unaenormevariedadde diferentespéptidosy algunospéptidospuedeninteractuarcon
varias moléculasde liLA. La estructuradel liLA de clase1 estáformadapor dos
dominios“rnniunoglobulina-like”en lazonaproximala la membranay otraregiónen la
zonadistal a esta,dondesesitúael lugar de unióndel péptido.Estesitio, denominado
brecha de unión, esta formado por un domino en lámina ¡3 plegada y dos regiones en a-
hélice.
La zona de unión del péptido en las moléculas de clase 1 esta bloqueada en los
extremos,lo que permiteel anclajede secuenciascon una longitud de entre 8 y 10
aminoácidos.Sin embargo,estabrechade uniónenlas moléculasdeclaseII esdistinta
y permitela unión de péptidosmayores,de hasta18 aminoácidos.Los péptidosque se
anclanen las moléculasde clase1 suelentenerunosresiduosde anclajecomunesentre
todosellosparaunamismamoléculade ULA. Estosresiduossuelenestarlocalizadosen
el aminoácido carboxi-terminal y en la segunda posición amino-terminal6.
14
La unión entre el péptido y la molécula de HLA es muy estable, pudiendo durar
horas. Además, el número de estas moléculas con el mismo péptido es muy bajo en la
superficie de la misma CPA. Por otro lado, la unión entre el complejo péptido-HLA y el
TCR es de muy baja afinidad, es decir, la unión permanece estable muy poco tiempo46.
Por tanto, como la célula CD8+ para activarse necesita la unión de varios TCR, obliga a
que un complejo péptido-HLA entre en contacto con múltiples TCR en la misma célula.
Se ha demostrado que un único complejo HLA-Upéptido puede interactuar y activar
hasta 200 TCRs. Para estabilizar esta interacción se establecen otras uniones entre
moléculas co-estimuladoras de la CPA y la célula T como son la unión entre CD28 y
B747. Cuando la interacción es óptima y dura lo suficiente se genera una señal que es
trasducida a la célula a través de la molécula de CD3, como se comentó previamente, y
se produce la activación del linfocito CD8. Sin embargo, no todos los ligandos con
.-
W Antígeno
Fas ligando
Fig.-11.2. Representación esquemática del procesado del antigeno vira1 en la célula infectada y su presentación en el complejo HLA-Vpéptido, que es reconocido por el linfocito CDS antígeno específico a través del TCR, activandose los mecanismos efectores citolítico y no citolítico.
capacidad de ser reconocidos por un TCRgeneran señales de activación. Algunos de
estos péptidospuedenactuar como verdaderosantagonistasy esta es una posible
estrategiade escapeviral48. En la figura 11.2 seesquematizalapresentacióndelantígeno
por lacéluladianay el reconocimientode la célulaT medianteel TCR.
11.3 CARACTERÍSTICAS ANTIGÉNICAS DE LA INFECCIÓN POR VHB
.
Una vez que se ha descrito de forma general la interacción entre la infección
viral y el sistema inmune, se presenta en las siguientes secciones de forma particular la
relaciónentreel VHB y la respuestainmunecontraestepatógeno.
El VHB esun virus hepatotropo,no citopático, DNA encapsuladode la Ñmilia
de los hepadnavirusque causauna enfermedadnecrointiamatoriahepáticade variable
mtensidady duración49.En la siguientesecciónserevisanlas característicasantigénicas
de estevirus a partir de las que seelaboranlos epftoposreconocidospor el sistema
inmune.
11.3.1 Estructura del genoniadel VHB ~.
El viión completoo partículaDaneesunaesferade42 ¡mx que contieneun core
o nucleocápsidequeencierrael DNA viral. El genoniadel VF{B esun DNA circular de
doble cadenaparcial con un tamaño aproximadode 3200 paresde bases, lo que le
convierteenel virus DNA conocidomáspequeño.La cadenanegativadel genomadel
VHB codifica cuatro genessuperpuestos:5 (superficie), C (core), X (proteína X) y P
(polimerasa) (figura.-1I.3). Los genes 5 y C presentandos regiones anteriores
16
denominadas pre-S y pre-C que codifican las proteínas preS1 y preS2, y pre-core
respectivamente. La cadena positiva es corta y de variable longitud.
Se han definido dos “enhancers” en el genoma del virus B. El “enhancer” ENH 1
es tejido específico y funciona sólo correctamente en el hígado. Une proteínas y factores
específicos del hígado así como ácido retinoico. El “enhancer” ENH II estimula la
actividad transcripcional de los genes promotores del gen S.
- DNAviral
\ At Oligorribonucleótido
1 Pmteinaunida covalentemente
Pre Sl (108a.a.)
PR core (29a.a.)
w core (183 a.a.)
Figura 11.3. Genoma del VHB que muestra las 7 proteínas codificadas por 4 genes superpuestos (superficie [SI, core [Cl, polimerasa [P] y proteína X [XI. El gen S contiene las regiones preS1 y preS2 y el gen C contiene la región pre C. El lugar de unión de la enzima de restricción EcoRI se muestra como punto de referencia.
11.3.2Replicación viral ~.
Parallevar a cabola replicaciónviral el VHB se une a la superficie celular y
penetra en ella. Se ha descrito que lamoléculaanexinaV de la membrana celular podría
ser e! principal receptor del VHB51. Una vez dentro de la célula, el core viral es
transportado hasta el núcleo celular, donde el DNA circular viral setransformaen el
DNA circular cerradocovalentemente (cccDNA) que funciona como matriz para la
síntesisde RNA viral. La transcripcióndel cccDNA da lugaratranscriptosde diferente
tamaño.Él de 3.5 kb esel RNA genómicoy sirve de matrizparala transcripcióninversa
de la polimerasa.La síntesisde la cadenanegativa de DNA a partir de este RNA
genómicoseinicia en la regiónfmal 3’ DRI, con la proteínaterminalde la polimerasa
como “prime?’. A medidaquela síntesisavanza,el RNA esdegradadopor la RiNAasaH
de la enzimaDNA polimerasa.La cadenapositiva seinicia en el extremo3’DR2 y la
síntesiscontinuahastaque se sobrepasala proteína en el extremo 5’ de la cadena
negativa.El “primer” de la cadenapositiva es un oligorribonucleátidoderivadodel
RNA genómico.
Todo esteprocesoproduceuna moléculadc DNA circular abiertasimilar al
VHB maduro. Posteriormente,las moléculas de DNA de nueva generaciónson
empaquetadas en el retículo plasmático rugoso(RER) con las partículasde la envoltura
y del core formando el virión completoque finalmente es de nuevo liberado para
infectar otras células. En la figura 11.4 se resume el ciclo replicativo del VHB.
18
11.3.3 Transcripción y transducción del VHB”. Antígenos del VHB.
Además del RNA genómico necesario para la replicación, el VHB elabora a
partir del cccDNA una serie de productos de transcripción que darán lugar a proteínas
que generan los antígenos del VHB. Se han identificado cuatro productos de
transcripción de mRNA a partir del cccDNA. El más largo de 3.5 kb es la matriz para la
replicación vira1 como se comento anteriormente, pero también sirve para la expresión
de las proteínas pre-core/core y polimerasa. Un transcripto de 2.4 kb codifica los
péptidos pre-Sl, preS2 y AgHBs, mientras que otro menor de 2.1 kb codifica los
péptidos pre-S2 y AgHBs. Finalmente, el más pequeño de los productos de
transcripción de 0.7 kb codifica la proteína X.
El gen de la nucleocápside contiene dos codones de comienzo en fase que
Iesenvoltura
ranscripción inversa y síntesis cadena +
Transducción 6 RNA vira1
K de DNA
Figura 11.4. Ciclo replicativo del VHB. La integración del vuus en el genoma del huesped no esta representada.
definen dos polipepéptidos superpuestos.El más corto de estos polipéptidos,
denominadoantígenodcl core del VHB (AgHBc), se ensamblaen el citoplasmadel
hepatocitoy despuésentraen el RE paraformar la nucleocápsideque,como se señaló
previamente, encierra la DNA polimerasa vital y el RNA
pre-genómicode 3.5 kb. El otro codón del gen C generaun polipéptido de mayor
tamaño,a partir del que se forma el antígeno e del VI-IB (AgilBe). Esta proteínaes
translocada,graciasa un péptido señalsituado en el extremoaminoterminal, dentrodel
RERdondesufre la perdidadeun residuocarboxí-terminaly esfinalmente secretadaa
la sangre.El AgHBe ensueroesun buenmarcadorde la replicaciónvital puestoque es
generadode la misma plantilla que usael virus para la replicación. Sin embargo,la
firnción de estepolipéptidoen el ciclo vital no estadefinida claramenteya que no es
necesarioparala replicacióndel VHB52. Datosc1ínicos~y experimentalesobtenidosa
partir de modelos transgénicossugieren que pudiera tener un papel inductor de
inrnunotoleranciaSS.Es decir, podríatratarsede una estrategiavital parafavorecerla
persistenciade la infección. La respuestainmune celular a los antígenosde la
nucleocápsideesun importantefactorenel aclaramientovital puestoqueprovocanuna
fuerterespuestade células1 HLA-I y liLA-II restringidasenpacientesinfectadosporel
VITIB comosedescribirámásadelante54.
El gen 5 contienetres codonesde inicio en fase que definen la regiónamino
terminal de tres polipéptidos superpuestos(principal, mayor y medio). Todos estos
polipéptidos contienen el Agl-lBs, mientras que extensiones amino-terminales
conteniendoel antígenopreS2o preS2 mas preSí forman los polipéptidos mayor y
medio, respectivamente.Los tres polipéptidos de la envoltura son componentes
esencialesdel virión infeccioso(partículaDane)queseformanmedianteensamblajeen
20
el interior del RER54. El virión es secretado tras glicoxilación de los residuos de la
envoltura en el aparato de 0o1g154. Los excedentes de los polipéptidos mayor y medio
de la envoltura se ensamblanen el interior del RER para formar partículas no
infecciosasesféricasde 22 tun, mientrasque el excesode polipéptido principal se
ensamblaenestructurasalargadasfilamentosasno secretablesque seacumulanen RER.
Esto conducea la formaciónde los característicoshepatocitosenvidrio esmeriladoque
son thncionalmente normales en condicionesbasalespero exquisitamente hipersensibles
a ladestrucciónbajoel efectocitopáticodel interferóngamma55.Cuandolos filamentos
de las partículasAgHBs seacumulanen gran cantidadcomprometenla fUnción del
RERy provocanla muertecelular54.Los polipéptidosgeneradosporlos genespre-Sson
importantesen la unión a la célulahuésped.Se conocen dos lugares in-vitro de unión
hepáticaespecíficaparael polipéptidopre-52y uno parapre-S156’57’51,ademásambos
puedenunirsea líneasde hepatoblastoma.El productodel genprc-S1 seune tambiéna
la membranaplasmática.Estaunión inespecíficapuedeser la utilizadaporel virus para
entrarencélulascomo los macrófagos.Además,el AgHBs seunea la moléculaanexina
y, quepuedeserel principal mecanismode entradadel virusenel hepatocitocomo ya
5’
sehacomentado
El gen X codificaunaproteínatransactivadqrade la transcripción(proteínaX)
que regula iii vitro positivamentela transcripcióndel VHB, de otros virus y de
promotorescelulares.La alteraciónde la regulaciónde la expresiónde la proteínaX
puedecontribuir a la hepatocarcinogénesisinducida por el VHB, puestoque se ha
observadoque lineasde célulasinmortalizadaspuedensertransformadas,cuandoson
establementetransfectadasconel gende la proteínaX58. Además,la expresióndeesta
proteína en cantidadeselevadasen ratón transgénicoincrementa la incidencia de
21
caremomahepatocelular59.A pesar de que la proteínaX estápresenteen minimas
cantidadesenel tejido infectado,probablementepor labajaconcentraciónde suRNA y
su corta vida media60, es inmunogénicapara las células B y t1, quizás porque
transactivegenes de importancia inmunológica como HLA-DR, HLA clase 1 e
62
ICAMí
El gen P codifica la polimerasaviral quecontienecuatrodominios: transcriptasa
inversa,DNA polimerasa,RNAasaH y unaproteínade unióna 5’DNA quesirve como
“primer” para la transcripción inversa del pregenomaviral como se ha indicado
previamente. El producto del gen de la polimerasatiene un papel esencial en la
encapsidacióny replicacióndel genomaviral, mediantela unión a una estructuraen
horquilla en el extremo 5’ del RNA pre-genómico,que sirve como señal de
empaquetadoy como matriz para la iniciación de la transcripcióninversadel pre-
genomaviral. El uso de una transcriptasainversapara la replicaciónprovocaun alto
gradode heterogeneidadgenéticaal carecerestaenzimade la fUnción decomprobación
(proof-reading).Este elevado número de mutacionesdel VHB puede favorecer su
persistenciaal generarmutacionesque puedandesactivarepítoposviralesy conducira
la selecciónde mutacionesde escape.Es interesanteresaltarque la proteínapolimerasa
esbastanteinmunogénicadurantela hepatitisaguday crónica26’63, a pesarde que esta
proteínainhibe la respuestacelulara interferónalfa y gamma”.
A partir del procesadode todos estos polipéptidos por las CPA surgenlos
epítoposque generanen el huéspedla respuestainmune específicaque a continuación
analizaremos.
22
11.4. RESPUESTAINMUNE ESPECÍFICAEN LA INFECCIÓNPORVHB
.
En estasecciónse revisa el papel que ejercenlos distintos componentesdel
sistemainmune adaptativoen la respuestacontrala infecciónpor VHB. Se analizacon
especialdetenimiento la labor de los linfocitos CD8 VHB específicosque son los
protagonistasdeltemade estudiode estatesis.
11.4.1 RespuestainmunehumoraL
En la primerafasede la infecciónporVHB el sistemainmune actúaa travésde
los mecanismosde respuestano específicostales como las células NK65, pero
simultáneamente,comienza la inducción del sistemaadaptativo por medio de la
presentaciónde los antígenosviralespor las CPA a las célulasB y T en los ganglios
linfático regionales.
Como se discutió previamente,la fUnción más importantede la respuesta
mmune humoral es el aclaramientode las partículas virales del compartimento
extracelulardel huésped.En la infecciónporVHB sedesarrollananticuerposcontralos
péptidosde la envoltura, la nucleocápsidey la polimerasa,así comocontrael genoma
vital. Sin embargo,sólo sonneutralizanteslos anticuerposcontra las glicoproteinasde
la envoltura.Estos anticuerposjueganun importantepapelen el aclaramientovital,
eliminandolas partículasviralesde la circulacióny evitandoqueseancaptadaspor las
células susceptibles66.No obstante, también pueden ser los responsablesde la
patogénesisde síndromes extracelularesasociados con la infección por VHB
(glomerulonefritis, poliarteritis nodosa, crioglobulinemia) y de los síndromes
23
prodrómicos caracterizadospor artralgia o urticaria, mediante la formación de
inmunocomplejos54. La aparición de los anticuerpos anti HBs se asocia con la
resoluciónde la infección. Están dirigidos contra dos dominios situadosentre los
aminoácidos124 y 147 que formanel determinante“a” comúna todos los subtiposde
VHB. Estosanticuerposofrecenproteccióncontrala reinfección,aunqueseha descrito
como mutacionespuntualescodificandouna arginina en lugar de una glicina en la
posición 145, debido a un cambio de O por A, provocanmutantesde escapecon
66elevadogradode replicaciónapesarde la presenciadeanticuerposantiHfls
El papel de la respuestahumoral contra los antígenosde la nucleocápside
(AgUBe,AgHBc) no estáclaro. Seaceptaque no tienenuna fUnciónneutralizantepues
seencuentranpresentesenelevadasconcentracionestanto en la infecciónagudacomo
en la infeccióncrónica.La apariciónde anticuerposcontrael AgUBeesun signo inicial
de recuperación,asociadocon la disminuciónde la replicaciónvital y desaparicióndel
AgHBe. Una excepcióna este patrón ocurre en los sujetosinfectadoscon un VHB
mutantecon un cambiopuntualG-A en el nucleótidoen la posición 1896 ó con una
mezclade virus “silvestre” y mutante.Estamutaciónprovocala apariciónde un codón
de paradaqueevita laexpresióndel AgHBe.
Es interesanteremarcarque la prevalenciaelevadadeanticuerposcontrael core
en la infeccióncrónicaporVHB sedebeprobablementea que estarespuestaestantoT
dependientecomo independiente,lo que permitela síntesisdeestosanticuerposa pesar
de queen la hepatitiscrónicala respuestaT “helper” estámuy disminuida67.
La respuestahumoralcontra el extremo carboxi-terminaly contrael dominio
24
RNAasa H de la polinierasaaparecencomo marcadoresiniciales de la infección y
representanla presenciaactiva de replicaciónvital68. Otro marcadortempranode la
infeccióny de posterioresreactivacionesesel isotipo IgM delanticuerpoHBc.
11.4.2 Respuestainmune ilLA-Il restringida.
En los pacientescon infección autolimitadapor VHB se detectaen sangre
periférica una respuestaCD4+ FILA-II restringida muy vigorosa y dirigida contra
múltiplesepítoposde los antígenosde la nucleocápside54.Sin embargo,la respuesta
claseII restringidacontraepítoposde la envolturaes mucho menosvigorosaen los
mismospacientes.La explicacióna estehechopuederadicar en que la respuestaCD4
contra los epitopos del AgHBs podría terminar exhaustacomo resultado de la
estimulación por altas concentracionesdel AgHBs en las fases iniciales de la
enfermedad.De cualquiermanera,estarespuestase ha podido detectaren el periodo
preclínicode incubación69.
Losepítoposlocalizadosentrelos residuos50-69delcoredel VHB son los más
comúnmentereconocidos,deentrelos diferenteepítoposdel polipéptido HBc/eAg,por
los pacientescon infecciónaguda,independientementede su FILA. Estarespuestase
asociacon el control de la infecciónen sujetoscon hepatitisaguday es muy débil en
pacientescon hepatitiscrónicaM. Estehallazgo permitepensarque la respuestaCD4
nucleocápsideespecíficadesarrollaun papel crítico en el control viral. Esto se podría
deberavariascircunstancias.La primerapodríaser la inducciónde unarespuestaCDS
VHB específica,asíseha observadoque el vigor de la respuestaT HLA-II restringida
específicacontraHBc/eAg en la infecciónagudava paraleloa la respuesta1 HLA-I
25
restringidaespecíficacontratodoslos antígenosvirales82.El otro mecanismopodríaser
la generaciónde ayudaa las célulasB VHB-envolturaespecíficas,parala producciónde
anticuerposneutralizantesmedianteun procesode ayuda “intermolecular”. En este
procesolas célulasB envolturaespecíficascaptanpartículasviralesmediantereceptores
para los determinantesHBs y preS. Posteriormenteprocesanestos viriones que
contienenel AgUBe y presentanlos epítoposderivadosdesudegradacióna las células
T CD4+ AgHBc especificas.A su vez, estascélulas T puedenayudara las célulasB
envolturaespecificasa producir anticuerposanti-envoltura70.Por tanto, la respuesta
CD4coreespecíficaejerceun importantepapelenel controlvital.
Durante la infección crónica por VHB la respuestaperiférica T FILA-II
restrmgidacontratodos los antígenosviralesesmucho menosvigorosaque en sujetos
conhepatitisaguda54.Aunqueestascélulassedetectanen el hígadode estospacientes,
pareceque estánpresentesenmuy bajafrecuencia.Se ha observadoquela respuestaT
CD4 nucleocápsideespecíficaaumentadurante las exacerbacionesde la hepatitis
crónicaB y va siempreprecedidade unaelevaciónenDNA VHB y del AgHBe71. Sin
embargo, durante estos episodios el AgHBs permaneceestable y la respuesta
proliferativa a antígenosde la envolturaesdébil o indetectable.Portanto, estosdatos
sugieren que la respuesta T HLA-II restringida puede ejercer un papel
mmunorreguladoren el control de la infección crónica y pareceque su intensidad
dependede laconcentracióndeantígenosde lanucleocápsidedelVHB.
26
11.4.3 RespuestainmuneHLA-I restringida.
Hastaahorahemoscomentadocómo la respuestacelular citotóxica juega un
papelesencialen el control de la infecciónvital no citopática,por su capacidadpara
identificar y eliminar las células infectadasa travésdel reconocimientode péptidos
viralespresentadosen las moléculasFILA de clase1. Tambiénhemosrevisadocómo se
produce la interacción entre el receptor de la célula T y el complejo
HLA clase 1/péptido de la célula infectada. A continuación,hemos analizado las
característicasantigénicasdel VHB, a partir de cuyospéptidoslas CPA y las células
infectadasgeneraranlos epítoposque presentaránen las moléculasde HLA-I a las
células CD8 VHB específicas.Además, hemos resumido como influyen otros
componentesdel sistemainmune adaptativoen el control del VHB. Por tanto, es el
momentode examinarel cometidoque desarrollanlas célulasprotagonistasde esta
tesis, es decir el papel que ejercen las célulascitotóxicas VHB específicasHLA-I
restrmgidastantoen la infecciónagudacomoen la infeccióncrónicaporVHB.
1. Hepatitisagudaautolintitada
La mayoríade los datosobtenidossobreel papelde los LTCs VHB específicos
en la hepatitisagudaprovienende la investigaciónen animal de experimentación.En
modelosexperimentalesmurinosseha observadocomo los LTCs FILA-I restringidos
VHB específicossoncapacesin-vivo de destruir la céluladianamedianteapoptosís72.
Curiosamente,las consecuenciaspatológicasdirectasde estadestrucciónson mucho
menosseverasquela producidapor la respuestaantiinflamotoriano antígenoespecífica
que inducenlos LTCs VHB específicoscuandoreconocenel antígeno.Tambiénseha
27
demostradoexperimentalmentequeesposibleel controlde la replicaciónvital mediante
mecanismosno citoliticos. Se ha observadocomo la producciónde citoquinastipo 1
(yIFN, TNF9) por los LTCs VFIB específicosescapazde inhibir la replicaciónvital sin
producir daño tisular”8. Estas citoquinas parecenactivar mecanismosde defensa
presentesen el hepatocito73.Datosde estudioscon chimpancésinfectadoscon VHB
sugierenque los mecanismosdedefensano citolíticospodríansermásimportantesque
la directaeliminaciónde los linfocitos infectados74.En esteestudiosehaobservadoque
la replicacióny expresióndel VHB puedesercompletamenteabolidabajo condiciones
en que menosdel 1% de los hepatocitosesdestruido,sugiriendoestedato un papel
primordiala los mecanismosno cítolíticos,al menosenestemodelo.
Medianteun modelo experimentalderatóntransgénicoque expresaelantígenos
de la hepatitisB (AgFIBs) seha observadoque la transferenciade LTCs específicos
contrael epítopo AgJ-IBs 25-39 desencadenaun proceso mmunológico que podría
explicar los fenómenos inmunopatológicosobservadosen la infección en el ser
humano75.En estemodelo enun estadioinicial se producela apoptosisde un número
reducidode hepatocitospor contactodirecto entreel LTC VHB específicoy la célula
infectada(cuerposde Councilman). Posteriormentelas citoquinas generadaspor los
LCTs VHB específicosproducenuna activaciónde LTCs no antígenoespecíficosy
neutrófilosque contribuyenal desarrollode un fenómenoinflamatorio. Finalmente,en
este modelo se describeun tercer paso mediado por IFNy, caracterizadopor el
desarrollode una respuestade hipersensibilidadretardadatipo IV por activación de
macrófagosy linfocitos que conducea un cuadro de hepatitis fUlminante. En este
modelo no se estudiael papelque ejercenmecanismosno citolíticos sobreel control
viral.
28
Junto a todos estosdatosexperimentalesexistenmuchosdatosprocedentesde
estudiostransversalesen sereshumanos.En estos trabajosse han descrito muchos
epítoposdel VHB que sonreconocidospor los linfocitos CD8 antígenoespecíficos.La
mayoríadeestosepítoposanalizadosson FILA-A2 restringidospor la mayor facilidad
de estudiode estospacientes,al ser esteHLA él más frecuenteen la razacaucásica.
Todos estos epítopospresentanlos residuospredichospara unirse a los puntos de
anclajede la moléculaHLA-A2, que sonun aminoácidoleucinaen laposición2 y una
vaInaen laposicióncarboxiterminal54.
Del estudio de la respuestacelular CD8±VHB específicaen pacientescon
infecciónagudaquecontrolanel virus, seha observadoque esunarespuestapoliclonal
y multiespecífica54.El hechode sermultiespecíficaimplica que sonreconocidosenun
mismoindividuo variosepítoposdel virus a la vez, lo quesuponeque seadificil parael
virus evadir la respuestainmune desarrollandomutacionesde escape.Además,al ser
una respuestapoliclonal ocasionaque distintos clonesde célulasT seancapacesde
reconocera la vezel mismo epítopo lo que amplifica la respuesta.Por otro lado, seha
observadoque muchosde estosepítoposvirales identificadossonesencialesparael
virus, lo queimpide quepuedanocurrir mutacionesde escapea estenivel. Por ejemplo,
las señalesde localizaciónnucleary encapsidacióndel genomadel VHB, debidaa los
residuosdel AgHBc 141-151,sonun importanteepítopoparalos LTCs de sujetoscon
ITILA-A3 1 y HLA-Aw6881. Otraimportanteconclusiónobtenidadeestostrabajosesque
variosde estosepítopos,especialmentecore 18-27,superficie250-258,superficie335-
343 y polimerasa455-463, son reconocidospor la mayoríade pacientesinfectados
HLA-A2±,mientrasque el resto de epítoposson“vistos” por una minoría de sujetos.
29
Estosdatossugierenqueexisteunajerarquíaen la respuestacelularcitotóxicacontrael
virus B, es decir existe cierto grado de inmunodominanciaentre determinados
epítopos49.Esta inmunodominanciaprobablementequededeterminadapor la afinidad
de unióndel epítopoa la moléculade FILA (enestoscasosdescritosA.2) y porel grado
de conservacióndel epítopoentrelas diferentescepasde VHB.
A pesar de estavigorosa respuestade linfocitos T VHB específicosen la
infección aguda,se ha descubiertoque concentracionesmuy bajas virales persisten
durantedécadasdespuésde la recuperaciónclínicay serológicacompleta,habiéndose
detectadohasta 20 años despuésde la infección76”7. El VI-IB es probablemente
transcripcionalmenteactivo, ya que coexiste en estos sujetos con una respuesta
citotóxicaespecíficaconmarcadoresde recienteactivación.Tambiénsehacomprobado
como esto tambiénescierto en la marmotamonosque desarrollauna infecciónaguda
porel hepadnavirusWHV. Esteanimal es capazde transmitir la infeccióna sus hijos
tiempo despuésde su completarecuperaciónde la hepatitisaguda78.Estoshallazgos
sugierenquepequeñascantidadesde VFIB persistenen reservoriosprivilegiadostras la
seroconversióny que la propagaciónde la infecciónescontroladapor los LTCs, puesto
quealgunosde estossujetoscarecende anticuerposcontraAgl{Bs. Portanto,esposible
que hígadoso sangrede sujetoscon una antigua infecciónagudapor VHB puedan
transmitirlaenfermedadal receptordeestostejidos’9.
De todos estosdatospodemosconcluir que la respuestacelular citotóxica es
capazde controlar la infecciónagudapor VHB por medioscitolíticos y no citolíticos,
siendoestaúltima fiteetaquizásla más importante.Además,los sujetoscon infección
agudaquecontrolanla infecciónmuestranunarespuestapoliclonal y multiespecíficade
30
gran intensidad,suficiente para ser detectadaen sangreperiférica. Sin embargo,el
adecuadocontrolviral no significadesaparicióncompletadelvirus en lamayoríade los
casos.
2. Infección crónica por virus 13.
Comoseha comentadoconanterioridaden un porcentajedecasosel huéspedno
escapazde controlar la infección.Paraun virus no cítopático,comoel VHB, la manera
de cronificarse es no induciendo una respuestainmune o bien desarrollando
mecanismosparaevadiría.Especialmenteimportanteparael VHB esconseguirescapar
al controlejercido por los LTCs VHB específicos.Varios son los mecanismosque se
especulapodríanpermitir estasituación.
En análisis transversales se ha observado que la respuesta celular citotóxica
VHB específica en pacientes con hepatitis crónica B es débil o prácticamente
indetectableen sangreperiférica24’80’81’82 excepto durante las exacerbaciones de la
hepatitiscrónica o tras la resoluciónespontáneao tras tratamientocon IFNaY3. Sin
embargo,estascélulas se han demostradoen el compartimentoperiféricode algunos
pacientesy tambiénse han aislado clonesde células T VHB específicasa partir de
84linfocitos intrahepáticosde sujetosconhepatitiscrónica . Portanto, podemosasegurar
que al menosen algunospacientescon hepatitiscrónica B se aíslanLTCs antígeno
específicos,pero éstasson incapacesde controlarcompletamentela infecciónaunque
podrían ser las responsablesdel dañohepático.
Sepuedeespecularque el VHB desarrollamecanismosparaalterarcualitativao
31
cuantitativamenteestascélulas. La tolerancianeonatales probablementeuna de estas
estrategias.Estemecanismoesresponsablede la ausenciade respuestainmune al VHB
y de la persistenciade la infección en los casosde transmisiónmaterno-fetal.En esta
situaciónel paso del AgHBe a través de la placentaprovocala eliminación de los
linfocitos AgUBe y AgFIBc específicoscentralmenteenel timo, al serconsideradoeste
antígenocomo propio85.Sin embargo,la persistenciade la infecciónenel adulto no es
bien comprendida.Quizás la explicaciónmás simple parala persistenciadel VHB es
cuantitativa, basadaen la cinética de la propagaciónvital y del desarrollo de la
respuestade los LTCs durantelos primerosmomentosde la infección. Por ejemplo, la
persistenciavital podríasurgirsí el tamañodel inoculo o la velocidadde replicacióndel
VHB excedieralavelocidadde la respuestacitotóxica.
Sin embargo,se han planteadootras posibilidadespara explicar porqué la
respuestacitotóxica es menos intensaen la infección crónica que en la aguda. Un
candidatorazonableseríala inducciónde toleranciaperiféricao fatiga en la respuesta
citotóxica por la elevadacargavital que caracterizaa la mayoríade pacientescon
infeccióncrónica. Así, enestudiosen modelosexperimentalesmurinos,seha sugerido
que el AgilBe en alta concentraciónpodría inducir inmunotoleranciaperiféricaen el
adulto, al deplecionar al animal experimental de células CD4 AgHBc/AgHBe
específicas.El déficit de estascélulasseríadecisivopara impedir la correctaactuación
de los LTCsVHB específicos86.De cualquiermaneraestono ha sido demostradoenel
serhumano.
Tambiénse ha sugerido que las células infectadasque expresanFas ligando
puedenprotegerseellasmismascontrael dañocitotóxico, medianteladestrucciónpor la
32
misma vía, Fasligando-Fasreceptor,queutiliza el LIC paraeliminar a sucéluladiana
pero al revés87.Puestoque los hepatocitospuedenser inducidosa expresarFasligando
durante la respuesta inflamatoria podría ocurrir que estas células eliminaran
selectivamentesusLTCs VHB específicosy asípermanecercronicamenteinfectadas.Si
bienestaposibilidadesmuyatrayenteparaexplicarla aparenteinnunodeficienciaVHB
específicaque caracterizaa los pacientescronicamenteinfectadoscon el VHB, en el
momentoactualesunaideameramenteespeculativa.
Otrosposiblesmecanismosde persistenciapodríanactuarsobrela capacidadde
los LTCs VHB específicosparareconocerla célula infectada.Así, un posiblecausante
de la persistenciapodría serel acantonamientodel virus en reservoriosprivilegiadosa
dondeno podríanllegar los LTCs antígenoespecíficos.Sehademostradoque los LTCs
VHB específicospuedenreconocerantígenosviralesen los hepatocitos,pero no en el
riñón o cerebrodel ratón transgénicoque expresalos péptidos virales72. En el ser
humanose han descrito formas replicativasdel virus en epitelio biliar, células del
músculoliso, páncreas,riñón, piel, cerebro,ganglioslinfáticosy tejido endocrino66,por
tanto las partículas virales acantonadasen algunos de estoslugares podrían escapar al
controlejercidopor las célulasCD8 VHB específicas.
El papelde las mutacionesde escapeen epítoposde LIC VHB específicosha
atraídorecientementeel interésde investigadorescomocausade la persistenciavital.
Pero teóricamente para que seprodujeran estasmutacionesdebería ocurrir una fUerte
respuestacelular citotóxica principalmentemonoclonal, centradaen un solo epítopo.
Esta situación fUvorecería el desarrollode variantesvitales que no expresaríanun
determinadoepítopopuestoquelas haríavirtualmenteinvisiblesal sistemainmune.Sin
33
embargo,estetipo de respuestaes extremadamenteinusual en la respuestacitotóxica
contrael VHB. Puescomo ya sehaseñalado,durantelahepatitisagudala respuestade
los LTCs es tipicamentevigorosa y multiespecifica,y débil o indetectabledurantela
hepatitiscrónica.Por tanto, sepuedeconcluir que estemecanismode persistenciaes
poco frecuente88;sin embargo,se han descritoalgunos casos89.No obstantesedebe
teneren cuentaqueestasvariantesaparecenen sujetoscon infecciónpersistente,por lo
queprobablemente,es la infeccióncrónica la quefavorecela apariciónde variantesde
escapey no al revés.Éstepuedeserel caso,comentadoanteriormente,de la común
mutaciónG-A en el nucícótido 1896 del genomadel VHB que generael codón de
paradatraslacionalque impide la generaciónde la síntesisde la proteínadel pre-core
provocandola seroconversióna AgUBe-. Seha sugeridoqueel virus conmutaciónpre-
coredisfrutaríadeventajasdecrecimientosobreel virus silvestrecualquieraque seala
respuestainmune, puesla ausenciadel AgHBe aumentala estabilidadconfonnacional
de la seflal de encapsidacióndel RNA vital, lo cual juegaun papelesencialen la
replicaciónvital90. Además,se ha demostradorecientementeque la expresiónde la
proteínadel pre-coreinduce una disminución de la eficacia de replicación iii vivo91.
Estasventajasdel VHB conmutaciónpre-coresobreel “silvestre” indicanque setrata
probablementede unaselecciónnaturalqueocurriríaensujetosinfectadoscrónicamente
y no esunamutacióndeescapeenel senode unarespuestainmune intensa,restringida
a un epítopodel AgilBe. Sobrelos restantesmecanismosposiblementeimplicadosen la
persistenciadeunainfecciónvital comentadosen la sección11.2 no existenevidencias
dequeocurranen la infecciónpor VIi-IB.
En resumen,enel momentoactualsabemosqueen los pacientesconpersistencia
del AgI-IBs existe una respuestacelular citotóxica inferior que en los sujetos que
34
seroconvierten a Ac antiHBs, aunque no están claramente definida las posibles causas
de esta diferencia. Tampoco se conoce si en todos los sujetos con persistencia del
AgHBs la respuesta celular citotóxica especifica es similar, independientemente de la
actividad de la enfermedad.
11.5. RESPUESTA CELULAR CDS CORE 18-27 ESPECÍFICA.
En esta sección se revisa el conocimiento acumulado sobre la respuesta celular
CDS core 18-27 específica en sujetos HLA-A2+ infectados por el VHB, por ser esta la
respuesta que usaremos como modelo de estudio de la respuesta celular citotóxica HBV
específica en esta tesis doctoral.
En 1991 el grupo del Dr. Carlo Ferrari demostró por primera vez en humanos la
F F
0 Residuos de anclaje
0 Zona de contacto con el TCR
Fig.- 11.5. Representación esquemática de una molécula de HLA-A*0201 presentando en la brecha el péptido del core 18-27 del VB. Se muestran los residuos de anclaje a la molécula de HLA y los aminácidos de contacto con el TCR.
35
existenciade una respuestacelular citotóxica específicacontrael VFIB FILA clase 1
restringida92’80 Setratabadel epítopoHLA-A2 restringidodelantígenodelcoresituado
en la secuencia11-27. Esta cadenade aminoácidosseencuentraconservadaentre la
mayoríade subtiposdel VHB. Posteriormente,con el avancesobreel conocimientode
la interacciónentreel complejo ULA clase1 y el péptido seobservóqueel verdadero
epítopoera la secuencia1 8-2t’~t La secuenciade aminoácidosde estepéptido es:
F L P 5 D F F P 5 V. Como se ve presentalos residuosadecuadospara poder ser
presentadopor una moléculade HLA-A2, esdecir un lisina en la posición 19 y una
valina en la posición ~ Por otra parte, el residuo 24 tambiénjuega un papel
secundarioen la unión a la molécula de histocompatibilidad.La parte central del
epítopoeslazonaexpuestay esportanto importanteen la interacciónentreel lCR y el
complejo HLA-A2/péptido core 18-27.La posición22 parececrucial parala activación
de los LTCs puesto que sustitucionesno conservativasen este lugar impiden la
actividadcitolítica deestascélulas,mientrasque las 21 y 23 son solo importantesen
algunos clones94.LTCs capacesde reconocerel complejo HLA*A0201/core 18-27
tambiénreconocenestepéptido si espresentadoporotros subtiposde FILA-A2 como
HLA-A0202, FILA-A0205, HLA-A0204 y FILA-A020694.
Las propiedadesbioquímicasy cristalográficasde la interacciónentreel péptido
18-27 y la molécula de HLA-A2 han sido extensamentecaracterizadas95’96’93.Este
hecho,junto al profundoconocimientoinmunológicosobrela respuestade LICs contra
esteepítopoensujetosHLA-A.2con infecciónpor VHB, conviertea estarespuestaen
un buenmodelo paraanalizarla respuestacelular citotóxica específicacontrael VHB
en el ser humano. En la figura 11.5 se esquematizauna moléculade HLA-A0201
presentandoel péptidocore 18-27.
36
La afinidad del péptido core 18-27 por el complejoHLA-A2 esmuy elevada,
concretamenteuna concentraciónde 3.3 nM es capaz de saturarel 50% de los
complejosl-JLA-A2. Se sabeque existe una relación entre la afmidad de unión a la
moléculadeclase1 y la inmunogenicidad.Se consideraque aquellospéptidosconuna
afmidad alta (<50 nM) tienen gran potencial inmunogénico.En un estudio de la
inmunogenicidadde este péptido, se evaluó la capacidadde los linfocitos CD8 de
pacientesHLA-A2 conhepatitisagudaparalisar célulasdianaHLA-A2+ pulsadascon
el péptido core 18-27. Se observóque un 65% de los pacientestenía una respuesta
citotóxica contraesteepftopo97.De entretodos los péptidosanalizadosfue una de las
másaltas,siendo solo igualadapor el péptido polimerasa575-583y polimerasa455-
463. Estos datos nos indican que el péptido core 18-27 presentacaracterísticasde
inmunodominanciaen la respuestacelularensujetosHLA-A2. Aunquetambiénhay que
tener en cuenta que en un 35% de estos individuos no fue posible detectaresta
respuesta,ya seaporestarpresenteenbajafrecuenciay no serdetectablecon la técnica
utilizada o porquesencillamenteestos individuos desarrollaronuna respuestacontra
otros epítoposdistintos. De cualquiermaneradebido a estaspotentescaracterísticas
inmunogénicaseste péptido ha sido elegido para la elaboraciónde una vacuna
terapéuticapara inducir una respuestacelular citotóxica en pacientescon infección
crónicapor VHB98’99.
Actualmentesabemosqueestarespuestaestápresenteen la sangreperiféricade
la mayoríade sujetosconhepatitisaguda.La frecuenciamásalta coincidecon la fase
clínica de la infección. Durante esta fase, estascélulas muestranun fenotipo de
activación(HLA-DR+, CD38+, CD62L-, CD45RA-) y ningunacapacidadde expansión
37
in vitro. Sin embargo,en la fase de recuperación,estos linfocitos disminuyen en
frecuencia,expresanun fenotipode célulasen reposoy vuelvena adquirir lacapacidad
de proliferar’00. Además,estascélulaserancapacesde producir IFNy in vitro y de lisar
célulasdianapulsadacon el péptido core 1 8-27’t Estosdatosdemuestranque en los
pacientesHLA-A2+ que controlan la infección tienen unas células CD8 core 18-27
específicasconcapacidadcitoUtica y de producircitoquinastipo 1. Es decir, muestran
lascaracterísticastípicasde unacélulaefectoraconcapacidadde controlvital. Además,
una vez han controlado la infección, las células de memoria CDB+ core 18-27
específicasvuelven a mostrar la capacidadde expansiónclonal ante el estímulo
antigénico.
La respuestaen la infección persistente está peor estudiada, pero se ha sugerido
que seríamuy débil o estaríaabolida92. Estasdiferenciasseñalan una vez más que la
actividadde estascélulasesimportanteenel controldel VHB.
11.6. MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE LOS LINFOCITOS T
CITOTÓXICOS
.
Anteriormente se ha justificado el interés del estudio de las células CD8+ VHB
específicas en la infección por este virus, pero la siguiente cuestión es como analizarías.
La cuantificaciónde los linfocitos 1 citotóxicoshadependidotradicionalmentedel uso
de análisis funcionales de la actividad citolítica de estas células. El problemade esta
estrategiaes la necesidadde teneruna poblaciónde célulasefectorassuficientemente
grande. Con el fin de mejorar la sensibilidad de estos análisis suele sernecesariala
expansiónde la poblaciónde interésin viiro, duranteal menosdossemanasantesde
38
analizar la función citolítica. Este proceso se realiza mediante el análisis de dilución
límite en el cual se estimulain viti-o unacélulapor pocillo para generar clones. Este tipo
de análisis requiere que las céjulas efectorasseancapacesde sobrevivir, dividirse y
mantenersu función in viti-o. Además, el método de estimulacióntiene que ser
reproducible y efectivo. Tales técnicas dependientes de una proliferación pueden
subestimarel númerode estascélulasal detectarsolamenteuna pequeñapoblaciónde
los linfocitos T citotóxicos. Datos provenientes de determinados pacientes con infección
porVIII sugierenqueesteproblemaexiste.Así, estosehaobservadoen sujetosen los
que ocasionalmentees posible detectaractividad citolítica directamenteex vivo, sin
necesidaddeun periodode proliferaciónin viti-o. Estos casosmuestranuna frecuencia
de linfocitos citotóxicos VIFI específicosen sangreperiférica de 1 en 100 células
lOt 102 acifra esmononuclearesdesangreperiférica(CMSP) ‘ . Est muy superiora la que se
conseguiríamedianteanálisis de dilución límite. Es decir, asumiendouna eficiente
estimulación,estadiferenciasedebeprobablementea que el análisisde dilución límite
cuantifica solo a aquellos linfocitos T citotóxicos capacesde proliferar en cultivo
durantedossemanas,lo cual subestima el númerodecélulascirculantes.
Recientementeotras técnicasbasadasen la producciónde citoquinas se han
utilizado para cuantificar células antígeno específicas’03’24”% Estos métodos
potencialmentepotentesno requieren una previa proliferación itt vitro, pero son
dependientesde la producciónde citoquinas como interferón-y, inducidas tras un
periodode estimulacióncon el péptido específico.La producciónde estascitoquinas
puede ser detectada mediante ELISPOT (ensayo de inniunomancha enziniático) o
mediantetinción intracelular de citoquinas y citometría de flujo. La existenciade
subtiposde linfocitos productoresde citoquinastipo 1 y tipo 2 (Tcl, Tc2) provocaque
39
tales técnicas subestimen la frecuencia de células citotóxicas antígeno específicas, al
contar solo las células capaces de producir la citoquina evaluada. A pesar de esta
potencial limitación, se ha demostrado que la frecuencia de linfocitos T específicos
contra el virus de la coreomeningitis murina capaces de producir interferón-y ex vivo es
unas 2 unidades logarítmicas superior a la frecuencia obtenida mediante análisis de
dilución límite. Estos datos confirman que la dilución limite solamente mide la
relativamente pequeña población de linfocitos T antígeno específicos que pueden
proliferar in vitro durante dos semanas.
Sin embargo, recientemente se ha desarrollado una nueva tecnología que permite
el recuento de los linfocitos CDS antígeno específicos directamente ex vivo sin
necesidad de ningún ensayo funcional. Desde que las células T fueron descubiertas, ha
habido intentos para identificarlas a través de su capacidad para reconocer al antígeno.
CDS
Células T virus específica
8
Figura 11.6.- Complejos tetraméricos HLA-Upéptido uniendose de forma específica al receptor de la célula T virus específica. CTL: linfocito T citotóxico.
40
z J CDS
;x 0
CP Complejos
tetraméricosHLA 1 / péptido
Primero se descubrió que estas células reconocíanel complejo formado por una
moléculade HLA másun péptido.Posteriormente,se identificó al receptorde la célula
T como la molécula que se unía al complejo HLA-péptido. No obstante,estudios
realizadoscon receptorespurificadosy complejosHLA-péptido mostraronqueaunque
la unióneraespecíficatambiénteníamuy bajaafinidad’05.Actualmenteseespeculaque
duranteel reconocimientode la célula infectadapor la célulaT, la bajaafinidad y el
rápidorecambiosonnecesariosparapermitir la interacciónde cadareceptorde la célula
T conmúltiplescomplejosHLA-péptido, cómo secomentóen lasección11.2.2106.Estas
característicasno son favorablesparala tinción directade estascélulascon complejos
HLA-péptido. Pararesolvereste problemaen 1996 Altman et al desarrollaronunas
moléculas formadaspor la unión de cuatro complejos HLA-péptido unidos a una
molécula fluorescenteque eran capacesde visualizar directamentelos linfocitos
citotóxicos antígeno específicos mediante citometría de flujo’07. Esta técnica no
dependede la habilidad de las células paraproliferar y así permitedirectamentela
cuantificaciónde las células citotóxicas antígenoespecíficassin una manipulación
previain viti-o.
Los complejos tetraméricosFILA péptido se unen específicamentea los
linfocitos T citotóxicosantígenoespecíficosqueexpresanel receptorde lacélulaT que
reconocen la combinación FILA-péptido utilizada (Figura.-fl.6). Esta técnica ha
mostradoser exquisitamenteantígeno-específicay altamentesensible’08.Así, se ha
descrito una sensibilidaddiagnósticainferior a una célula CDS+ antígenoespecifica
entre5000 linfocitos CDS’09. Por eso, estatécnicapermiteel análisisde respuestas
celularescitotóxicasde bajafrecuenciacomo por ejemplo aantígenostumorales”0”” u
112
otros autoantígenos y puedesermuy útil en infeccionesviralespersistentes,como la
41
infeccióncrónicaporVHB, en las que la frecuenciadeestascélulasesextremadamente
baja.
Existen evidenciasque demuestranque las células T CD8+ que unen los
complejostetraméricosformanunapoblacióncelular funcional. Se ha observadoquela
actividadcitolítica específicacontrael VJH estaasociadocon el porcentajede células
CD8+ que setiñen con el complejo tetraniéricoLILA péptido específico109• Se debe
destacarque porcentajesde lisis ex vivo inferiores al límite de detección(5-10%)
puedenenmascararfrecuenciaselevadasde linfocitos citotóxicos antígenoespecíficos.
De modo que cuandola lisis péptido específicaalcanzaex vivo entreel 5 y 10 % se
descubrenfrecuenciassuperioresaunacélulaCD8 antígenoespecíficaentre100 CMSP
mediante la tinción con complejos tetraméricos. Es decir, las técnicasutilizadas
previamentesubestimabanel númeroreal de estascélulas si las comparamoscon los
datosobtenidosconestanuevatecnología.
Experimentosque seleccionanmediantecitometria de flujo las células CD8
teñidas con los complejos tetraméricos, demuestranque estas células tras ser
estimuladasin vitro de formaespecífica,desarrollanuna expansiónque afectaa todas
ellas”2 lo quedemuestrala excelentesensibilidaddeestatécnica.
Portodasestascaracterísticaspositivashemoselegidoen estetrabajo la técnica
de tinción con complejostetraméricosHLA-I/péptido parael recuentode las células
citotóxicas VHB específicas, tanto directamenteex vivo como tras estimulación
antígenoespecíficain viti-o. En el capítulode materialy métodossedescribeel método
de síntesisde estasmoléculasdiagnósticas.
42
11.7 JUSTIFICACIÓN DE ESTE ESTUDIO. DESARROLLO INDUCTIVO
.
Como se ha descrito, existen claras evidenciasque demuestranque en la
infección por un virus no citopático los linfocitos 1 citotóxicos antígenoespecíficos
desarrollanun papelcentralen la defensaanti-viral9. Se ha sugeridoqúe sufrecuencia,
cinéticay capacidadde migración’’3 entreotras,soncaracterísticasde las que depende
el control vital. A estashabilidadesde las células T citotóxicas para eliminar la
infección se oponen factoresvirales para evitarlo. Algunos de ellos se comentaron
previamente29,como son la aparición de mutacionesen epitopos importantes, la
colonizaciónde lugaresininunológicamenteprivilegiadoso la producciónde factores
que puedaninducir inmunotolerancia.De la interacciónentrelos diferenteselementos
deestesistemamultifactorialsurgeun equilibrio capazo no de controlarla infección.
En la infecciónpor VHB el patógenoconsigueescaparal control del sistema
mmune en una moderada proporción de sujetos5. Sin embargo, aunque se ha
consideradoquela respuestacelularcitotóxica esmuy débil en todos estoscasos92’81’82
la situaciónclínica no es igual en todos ellos5. Estaobservaciónnos puedeinducir a
pensarque estasdiferenciassedebena un distinto comportamientode las célulasCD8+
Vii-IB específicasen estos individuos. A continuación,basándonosen esta idea, se
presentael procesoinductivo que nosha permitido plantearla hipótesisde estatesis
doctoral.
43
11.7.1 Cuadros clínicos en la infección persistentepor VLIB.
Entretodoslos sujetosinfectadospor VI-IB, alrededorde un 5 porciento de los
adultosy un 95 porciento de los neonatospresentacronicamenteel AgHBs+5. El curso
clínico de estospacientescon infecciónpersistentees muy variado,pudiendoen unos
casosprogresara unainflamacióncrónicaconposteriordesarrollode cirrosishepáticao
carcinomahepatocelular,mientrasque otros individuospermanecenen una situación
asintomática,sin desarrollarningún tipo de manifestaciónclínica2. Globalmente,los
casossin control vital completose puedenincluir mayoritariamenteen dos grupos
(Tabla.- 11.1):
a) Pacientescon inflamaciónhepáticacrónicay elevadareplicaciónviral, normalmente
defmidoscomohepatitiscrónica13 AgHBe±(I-ICBe+~.
b) Sujetos sin inflamación hepáticay baja carga vital, habitualmentedenominados
portadoressanos(PS)del antígenode superficiedelVHB5.
En la figura 11.7 se reproducela imagenhistológicade la infiltración hepática
por linfocitos CDS+ en un sujeto PS y un pacientecon HCBe+, en la que sepuede
observarel distinto grado de inflamaciónentre los dos casos.Una excepcióna estos
gruposes la infeccióncon VHB conmutaciónen la regiónpre-corequesuelenpresentar
un cursomásagresivoy son más frecuentesenel áreamediterránea114• Otra excepción
la forman aquellos pacientescon elevadacarga viral y sin signos de inflamación
hepáticaque se encuentranen la denominada“tbse de inmunotolerancia”.Esta fase
sueledurarsolamenteunassemanasen la mayoríade pacientes(periodode incubación).
44
Sin embargo,eshabitualque seperpetúeenpacientescon transmisiónvertical5.
Los individuoscon HCBe±secaracterizanpor elevaciónde la actividadsérica
de la enzimaalaninaaminotransferasa(ALT) y por la positividad de marcadoresde
replicaciónvital, como el antígenoe (AgUBe) y el DNA vital (DNA VHB). Por el
contrario, los PS tienen una concentraciónsérica de DNA VIi-LB prácticamente
indetectablemediantetécnicadehibridacióny el AgHBe séricoesnegativo.Además,la
actividad séricade ALT es normal y no muestrandatoshistológicosde inflamación
hepática”5.No obstante,enambosgrupospermanecepositivo el antígenodesuperficie
del VHB (AgHBs), indicandola persistenciade la infección. Enestatesisdoctoralnos
hemoscentradoen el estudiode estosdosgrupospor representarextremosopuestosen
el grado de control vital y daño hepático en sujetoscon persistenciadel AgHBs,
situación que consideramospuedenestar relacionadacon las característicasde la
inmunidadcelularcitotóxica.
Estudiossobrela historia naturalde la infeccióncrónicaporVHB indican que
estasdosformasdescritasrepresentandos diferentesestadiosevolutivos en la infección
crónica131 15 Sehaobservadoque,tanto de formaespontáneacomotrastratamiento,los
sujetos con HCBe+ puedenseroconvertirapareciendoanticuerposcontrael AgilBe
(AcHBe) y negativizándoseel DNA VHB medido con técnicas convencionales.
Podemosconsiderarque existendeterminadosfactoresen ambosgruposde pacientes
que determinanrespuestascitotóxicas diferentes que condicionanel estadio de la
enfermedad,y que cambiosen estarespuestapuedeninducir cambiosen la situación
clínica.En los siguientesdos puntosseanalizaporquéespeculamosconque existeuna
adecuadarespuestacelular citotóxica VHB específicacon control vital y sin daño
45
hepático en la infección persistente por VHB en sujetos PS y no en pacientes con
HCBe+, que es en definitiva la base de la hipótesis de esta tesis doctoral.
Ac antiHBs
DNA VHB
Ac antiHBe
Fase 1 Fase 2 Fase 3
Inmunotolerancia
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Normal
Hep. Crónica
Positivo
Negativo
Positivo
Positivo*
Negativo
Elevada
Portador sano
Positivo
Negativo
Negativo’
Negativo
Positivo
Normal
Fase 4
Inmune
Negativo
Positivo
Negativo
Negativo
Positivo
Normal ALT 1
Tabla 11.1: Distintas fases de la infección persistente por VHB. # Aunque el DNA vira1 es negativo mediante técnicas de hibridación, se puede demostrar en muchos pacientes mediante PCR. * El AgHBe es negativo en pacientes con hepatitis crónica infectados con VHB con mutaciones en la región pre-core.
Figura 11.7. Tinción inmunohistoquímica que muesra el infiltrado linfocitario ‘1‘ CL%+ en el hlgado de un sujeto portador sano (B) y un paciente con hepatitis crónica (A). Los linfocitos CDS+ se han teñido en negro mediante la técnica de inmunoperoxidasa y los hepatocitos en marrón con hematoxilina. Se puede observar un mayor infiltrado localizado en el espacio porta en el caso B, mientras que en A el infiltrado es menor y se distribuye por el parenquima.
11.7.2 Respuestacelular citotóxica y daño hístico.
Clásicamenteseha consideradoque el control de la replicacióndel virus 13 va
ligado a fenómenosimnunológicosque produceninflamación. Es decir, sesuponeque
de la interacciónde la célulacitotóxica VHB específicay la célulainfectadasurgeel
controlvital solamentemediantemecanismoscitopáticos.Así, seconsideraporalgunos
autoresque sujetoscon infecciónpersistentepero sin signosde dañohepáticocarecen
deunarespuestacelularactivacontrael VHB”5”’6. Sin embargo,actualmentesabemos
pormodelosexperimentalesque no serequiereuna destrucciónmasivade hepatocitos
infectadospara controlar esta infección7’~~. Tambiénhay datos que demuestranque
sujetos que han sufrido una hepatitis aguda y que se han recuperadototalmente,
mantienendurantedécadasun reservoriovital y de linfocitos CD8 VHB específicos
pero sin datosde daño hepático77.Además,seha observadoque en la infección por
VI-IC en chimpancés,las célulascitotóxicasantígenoespecíficascontrael virus de la
hepatitisC persistenen el hígadonormal tras un año de la resoluciónde la infección
aguda”7.Es decir, apesardeencontrarseel hígadoinfiltrado porcélulascitotóxicasque
controlan la infección no hay necrosisde hepatocitos.Además, existen modelos
experimentalescomo la infecciónmurina por el virus de la influenza, en las que el
estricto control vital dependede la cinéticay distribuciónde las células CDS virus
específicas”3.En estemodelo el control vital se lleva a cabopor la respuestainmune
antígenoespecíficasin daño tisular. Igualmente,en otras infeccioneshumanastales
como la infecciónpor HTLV-I seproduceel control de la infección tras una potente
respuestainmune antígeno específicasin daño hÉtico, mientras que una respuesta
insuficienteocasionaalteracionestisulares”8”’9
47
Estosdatosnos permitenpensarqueen la infecciónpersistentepor VHB podría
plantearsela misma situaciónque en los casospreviamentecomentados.Es decir, los
sujetos portadores sanos que se caracterizanpor la ausenciade lesión hística
desarrollaríanuna correcta respuestacelular citotóxica, mientras que ésta estaría
alteradaen los pacientescon dañohepático.
11.7.3Respuestacelular citotóxica y control viral.
Se han desarrolladomodelos matemáticospara analizar la relación entre la
respuestainmune celular y la cargavital. Estos modelos se basan, como ya hemos
comentado,en que existeunainteracciónentrela infecciónviral y el sistemainmunede
cuyo equilibrio dependeel controldela infección.
Antes de discutir la aportaciónde estosmodelosmatemáticosal desarrollode la
hipótesisde estatesisdoctoral,definiremosdosconceptosinmunológicosimportantes.
El primero es el concepto “respuestacelular citotóxica” que denotael número de
linfocitos T citotóxicosquetieneun determinadosujetoen un punto enel tiempo.Esta
respuestadependede la cantidadde estímuloaportadapor el virus, esdecirde la carga
viral. La respuestacelular y la cargavital estánrelacionadasde tal maneraque una
Iherterespuestacelularcitotóxicapuedereducir la cargavital, pero a suvez estacarga
vital disminuidaseráun débil estimuloque ocasionaráconel tiempo un descensoen la
respuestacelular. El segundoconceptoes la “capacidadde respuestacelularcitotóxica”
quesedefmecomo lahabilidaddeun sujetoparadesarrollarunarespuestacelulara un
determinadovirus. A escalacelular es la velocidada la que una determinadacélula
citotóxicaantígenoespecíficaescapazde proliferar trasencontrara la célulainfectada.
48
Estacapacidadde respuestapuedetenergran importanciaenel control de la infección,
puesencasodeno desarrollarsecorrectamentepermitiráque seestablezcaunasituación
deequilibrio entreel virus y lacélulacitotóxicavirus específicaafavor delpatógeno.
Enun análisisrealizadoporM. A. Nowaky C. R. M. Banghani’20seprediceque
en una infección vital persistentepor un virus no citopático existirán dos tipos de
sujetosdenominadosrespondedoresdébilesy respondedoresfuertes.Los respondedores
fuertestendránuna correctacapacidadde respuestatras encontraral virus con lo cual
reducirán rapidamente la carga vir al. Posteriormente, tras descender la carga vital se
alcanzará un estado de equilibrio en el que la frecuencia de células CDS antígeno
específicas también descenderá al disminuir el estímulo antigénico. En los
respondedores débiles la capacidad de respuesta esta muy reducida por lo que la carga
vital permanecerá en todo momento elevada y la frecuencia de linfocitos CD8 virus
específicos será siempre baja. Bajo este modelo si realizamos un estudio transversal
encontraremos en un punto en el tiempo una frecuencia similar de células citotóxicas
virus específicasen ambostipos de sujetos,sin embargola capacidadde respuestaserá
completamentediferenteentrelos individuosquecontrolanla viremiay los que no. En
la figura 11.8 serepresentalas cinéticasteóricasviralesy de los LTCsdeun respondedor
fuertey uno débil.
Estamismasituaciónpensamosquepodríaocurrir enla infecciónpersistentepor
Vi-iB, en la que los PS secomportaríancomo los respondedoresfuertesdel modelo
matemáticoy los pacientesconHCBe+comolos respondedoresdébiles.
En conclusión, los puntos en que nos hemos basadopara establecernuestra
49
hipótesis son:
1. En la infección persistente por VHB hay dos grandes grupos de sujetos
caracterizados por diferente control vira1 y daño hepático.
2. Existen criterios teóricos y experimentales para pensar que esta diferencia
puede estar relacionada con la respuesta celular CD8+ VHB específica.
Respondedor fuerte Respondedor fuerte
Buena capacidad de Buena capacidad de I I
respuesta respuesta I I
I I I I I I I I
Respondedor débil
I . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
/* l 0--
I
l * * 4’ I
Ausencia de capacidad de I
AY respuesta
I I 7
lnfeccion Tiempo
Carga viml
- LTC virus específicos
EMudio tmnsversal
Fig. 11.8 Representación de la teórica cinética vital y celular citotóxica en un modelo de respuesta inmune fuerte y débil.
50
III. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS.
Basándonosen el proceso inductivo comentado en el capítulo anterior,
planteamosla siguientehipótesis:
Hipótesis
.
Paracontrastarla validezde estashipótesistrazamoslos siguientesobjetivos de
estudio:
Objetivo «eneraL
1. La capacidadde respuestacelular citotóxica VHB específicaen la
infecciónpersistentepor ‘VHB seencuentradisminuida en los pacientescon hepatitis
crónicaAgHBe+ en comparaciónconlos portadoressanos.
1. Evaluaren individuos con infección persistentepor VHB la relación
entreel estadioclínico (PS frentea HCBe±)y la respuestainmune celularCDS VI-IB
específica.
51
Objetivos específicos
1. Compararla frecuenciade los linfocitos CD8+ core 18-27específicosde
sangreperiférica enindividuos1-ILA-A2+ con infecciónpersistenteporVHB en función
delestadioclínico (PS frenteaHCBe+).
2. Compararla capacidadde expansiónde los linfocitos CD8±core 18-27
específicosde sangreperiféricatras estimulaciónconel péptido del core 18-27delVIi-IB
entreportadoressanosHLA-A2±y sujetosconhepatitiscrónicaAgHBe+ HLA-A2+.
3. Relacionarel gradode daño hepático(transaminemia)y cargavital con
las característicasde la respuestacelular citotóxica contrael epítopo core 18-27 en
sujetosHLA-A2+ con infecciónpersistentepor VI-IB.
52
IV. DISEÑO, MATERIAL Y MÉTODOS.
IV.1 DISEÑO.
IV.t.1 Tipo deestudio.
Para contrastarla hipótesisplanteadase diseñó un estudiono experimental
transversalanalítico12’ enel que seinvestigó la frecuenciay capacidadde expansiónde
los linfocitos CD8 core18-27+específicosde sangreperiférica(variablesrespuesta),en
sujetoscon infecciónpersistenteporvirus B condistinto controlde la infeccióny grado
de inflamaciónhepática(variableexposición).
IV.1.2 Ámbito del estudio.
El estudioserealizóen el áreade saludde los distritoslondinensesde Islington
y Camden.Los casosserecogieronen las consultasexternasde atenciónespecializada
de enfermedadesinfecciosasdel Centro Mortiiner Market del Servicio Nacional de
Salud Británico (Londres,Reino Unido). El estudiose desarrollóentre los mesesde
septiembrede 1998y febrerode2000.
53
IV.1.3 Selección de los sujetos de estudio.
l.Criter¡os de admisión en cl estudio.
Duranteel periododel estudioseeligieronmediantemuestreoconsecutivolos
pacientesremitidoscon el diagnósticode infeccióncrónicapor el VHB que cumplían
con los siguientescriteriosdeinclusióny exclusión:
1.1 Criterios de inclusión:
grupode pacientes
los linfocitos CD8
- Edadentre16 y 65 años.
- Persistenciadel AgHBs durantemasde seismeses.Estecriterio seutilizó para
definir la presenciade infecciónpersistenteporVHB.
- Haplotipo HLA-A2 positivo. El estudioserestringióa este
porquedisponíamosexclusivamentede la tecnologíaparadetectar
core 18-27específicosHLA A2 restringidos.
- ALT elevada,AgHBe positivo y DNA VHB elevado.Este
formó el grupodepacientesconhepatitiscrónicaAgHBe+.
- ALT normal,AgilBe negativoy DNA VHB bajo. Estossujetoscumplíanlos
criteriosdeportadorsanodel AgHBs.
conjuntode sujetos
.54
1.2. Criterios de exclusión:
- ALT elevada,AgHBe negativoy DNA VIi-IB elevado.Estegrupode pacientes
presentabaprobablementeuna infección por VHB con mutaciónprecore.Se decidió
excluir a estossujetosporquepuedendesarrollarun cuadroclínico másagresivoqueel
122 123restode pacientesconhepatitiscrónica . Diversosestudiossugierenqueelantígeno
epuedeinducir la apariciónde inmunotoleranciaenel adulto86y durantela transmisión
vertical85. Por estarazónes posibleque estossujetospresentenuna respuestacelular
citotóxicadecaracterísticasdiferentes,al estarinfectadosporunavariantevital que no
expresael antígenoe.
- ALT normal, AgHBe positivo y DNA VHB elevado. Estos sujetos se
encuentranen la denominada“fase de imnunotolerancia”. En ciertas áreasdonde
predomina la transmisión vertical esta fuse puede mantenersedurante varias
décadas5’124.Se excluyóa estegrupo de sujetosporqueseguramentedesarrollanuna
respuestacelular citotóxica con característicasdiferenciales a la de los grupos
estudiadosenestetrabajo.
Tanto los pacientesen fasede inmunotoleranciacomo los sujetosconhepatitis
crónicaAgHBe- tendríanque habersido estudiadosen gruposindependientesde los
gruposque participaroneneste estudio.Dadala baja prevalenciade estascategorías
clínicas en el Reino Unido se decidió previamenteexcluirlos de este trabajo al
consideraseque no se alcanzaríaun número de casos suficientes para estudiar
correctamentela respuestacelularcitotóxicaVHB específicaenestossujetos.
55
- Tratamientoantiviral actualo en los seis mesespreviosa la entrevista.Estos
casosfueronexcluidosporel indudableefectoquepuedeejercerel tratamientosobreel
equilibrio entrela respuestacelularcitotóxicay la infecciónviral.
- Datosclínicosdedescompensaciónhepática,definidaporunaconcentraciónde
bilirrubina séricaelevada(2.5 vecessobre el límite de normalidad),un tiempo de
protrombinaalargadomasde tres segundosy una concentraciónde albumina sérica
inferiora 3 g/dL o historiaclínicade ascitis,variceso encefalopatía.
- Evidencia de hepatitisautoinmunedefinida como anticuerposantinucleares
superioresaun título de 1/160.
- Consumode masde80 g. deetanolal día.Los sujetosconconsumoelevadode
etanol se excluyeronporque el posible daño hepáticogeneradopor el etanol podría
confundirel gradode inflamaciónhepáticadebidoal VHB.
- Coinfecciónpor VHC o VHD. Fueronexcluidoslos pacientesco-infectados
con otrosvirus por desconocerseel efecto que puedenejercersobrela respuestaCD8
VHB específicay sobreel dañohepático.
- Inmunodepresiónprimaria o secundaria.Estos pacientesno entraronen el
estudio por las posibles consecuenciasde la inmunodepresiónsobre la respuesta
citotóxicacontrael VHB.
56
Además de los pacientesproblema del estudio se seleccionócomo control
internonegativoa un grupode sujetossanoscon AgHBs negativoy HLA-A2 positivo
de similarescaracterísticasdemográficasa los casos.Estos sujetosse escogieronentre
personasrelacionadascon miembrosdel Instituto de Hepatología(University College
London).Estegrupopermitió conocercuál erael ruido de la técnicautilizada parael
recuentolos linfocitos CDS core 18-27 específicos.Tambiénse eligió un grupo de
individuosHLA-A2 positivoscon inmunidadcontrala hepatitisB adquirida de forma
natural,esdecircon serologíapositivaparaanticuerposanti}{Bs y/o antiHiBc y conAg
HBs negativosin vacunaciónpreviacontrael VHB. Estegrupose utilizó como control
internopositivo,puestoquesabemosporestudiospreviosqueenun granporcentajede
sujetosinmunescontrael VIi-IB esposibledetectarcélulasCD8 VHB específicasmucho
tiempo despuésde controlar la infecciónaguda77.Además,estascélulassoncapacesde
expansiónin vifro tras estimulaciónantígenoespecífica’00.Es decir, este grupo nos
permitió conocercual era la respuestacelular CD8 VHB específicaen sujetos con
controlcompletode la infección. Estossujetosseeligieronde forma consecutivaentre
pacientesque acudierona las consultasde Enfermedadesde TransmisiónSexualdel
CentroMortimer Marketporcausasno relacionadascon la hepatitisB.
El número de sujetos en los grupos controlesno era representativode la
verdaderaprevalenciadeestoscolectivosen la poblaciónde referencia.Esta estrategia
seutilizó paraincrementarlaeficaciadel estudio.Por lo tanto,enestetrabajoel diseño
planeadosolo nos permitía estimar la probabilidad de la variable respuestaen los
diferentesgrupos,perono laprevaleciade laexposición.El estudiofue aprobadoporel
Comité Ético del Centro Mortimer Markety todos los pacientesdieronconsentimiento
informadoantesde participaren él.
57
2. Cálculodel tamaflo niuestral.
- Paradesarrollarel primerobjetivo (ver sección111.3) de esteestudioseestimó
el tamañomuestralnecesariomedianteuna pruebaZ bilateralparacomparaciónde dos
medias independientes’25.Estimamos la varianza de esta variable en sujetos con
infección persistente,basándonosen los datos publicados sobre la frecuenciade
linfocitos CD8/Tcl8-27 en pacientescon hepatitis agudaB1~. En este trabajo la
transformaciónlogarítmicade la variablefrecuenciade célulasCD8/Tc18-27seguíauna
distribuciónnormalcon unavarianzade 0.46.La mediade la frecuenciadeestascélulas
fue de 10 célulasCDS/Tcl8-27+sobre50.000célulasCD8 en el grupocontrolnegativo
enesteestudio.Suponiendoestemismo ruido y varianzaenelanálisisde sujetosHLA-
A2+ conhepatitiscrónica,consideramosque la mínimadiferenciaa detectarerade 10
linfocitos CD8/Tcl8-27sobre50.000célulasCD8.Aceptandoun erroralfadel 5% y un
errorbetadel 20% y suponiendounavarianzaen los dos gruposde 0.46 paradetectar
unadiferenciaigual al ln 10 necesitábamosal menos20 pacientesencadagrupo.
- Parael segundoobjetivo (ver sección111.3) se estimó el tamaño muestral
mediante una prueba Z bilateral para comparación de dos proporciones
independientes’26.Sabíamosque las células CD8¡Tcl8-27+ en la hepatitisagudano
expandenen la faseagudaprobablementedebido al alto grado de activación,mientras
queen la fasede recuperaciónsonfacilmenteexpandibles’00.Sí suponíamosque en los
pacientescon infecciónpersistenteocurría lo mismo, esdecir, sí esperábamosobtener
expansiónen los sujetosPS perono en los individuosconHCBe±,podíamosconsiderar
que la prevalenciade expansiónen HCBe+ seríainferior al 5% de los sujetos.Puesto
que esperábamosuna gran diferenciaentre la prevalenciade expansiónentrelos dos
58
grupos,podíamosdefinir la mínima diferenciaque pretendíamosdetectaren el 35%.
Con estassuposicionesy asumiendoun error alfa del 5% y un error betadel 20%
calculamosquenecesitábamosal menos19 pacientesporgrupo.
Puestoqueparael primerobjetivosenecesitaban20 pacientesporgrupoy para
el segundosólo 19 sedefinió el tamañomuestralmínimo del estudioen 20 casospor
grupo(40 sujetosen total). Parael desarrollodel tercerobjetivo (ver sección111.3) de
estetrabajoseconsideróapriori suficienteel tamañomuestralcalculadopreviamente.
IV.1.4 Variables del estudio.
1. Variable independiente.
El factorde riesgoanalizadoen esteestudiofue el estadioclínico de la infección
persistentepor VI-IB. Es decir, se suponiaque existíandeterminadosfáctoresen las
distintassituacionesclínicasqueinfluíanen la respuestacelularcitotóxica. Setratabade
unavariablecategóricacon las siguientescategorías:
- Hepatitiscrónica:AgHBs +1 DNA VHB alto 1 ALT elevado1 AgHBe+1 ULA A2 +
- Portadorsano:AgHBs ±1DNA VHB bajo 1 ALT normal¡ AgHBe - ¡ HLA-A2 +
- Controlnegativo:AgHBs-¡ AcHBs- / ALT normal/ HLA A2 +.
- Control positivo (Sujetos inmunes): AgHBs- IAcHBs+ y/o AcHBc IgG+/ ALT
normal.
59
2. Variables dependientes.
Paraanalizarla respuestainmunecon relacióna la exposiciónseregistraronlas
siguientesvariables:
- Frecuenciade células CD8/TclS-27 positivas sobre el total de célulasCD8+ de
sangreperiférica.Es unavariablecuantitativacontinuaconunrangoentreO y 1.
- Expansiónde las célulasCD8/TclS-27positivastras estimulacióncon el péptido
core 18-27. Es una variable categórica dicotómica que puede tomar los valores
expansiónpositivao negativa.
3. Covariables.
Comoposiblesvariablesconfundientesy/o modificadorasserecogieron:
- Edadenañoscumplidos.Variable cuantitativacontinuageneradaa partir de la
fechade estudiomenosla fechade nacimiento.La edadpuedeinfluir en la calidade
intensidadde la respuestaimnune. Se sabeque en las edadesextremasde la vida el
sistemainmune muestracierto gradode incompetencia.Además,la edadjunto a la ruta
de contagiopuedeindicar de formaaproximadael tiempode evoluciónde la infección.
Por estasrazonespensamosque era necesariocontrolarel efecto de la edaden este
estudio.
- Sexo.Variable categóricadicotómicacon las categoríasmasculinoy femenino.
60
En la infección persistentepor virus B existeuna mayor prevalenciade hombresde
causadesconocida’27.Esta diferenciamerecíaser controladapuestoque podría influir
en la respuestaantígenoespecíficacontrael VHB.
- Ruta de contagio.Variable categóricaordinal con las siguientescategorías:1.
Parenteralo sexual; 2. Desconocida;3. Vertical o infancia. Es conocido que los
individuoscon transmisiónvertkal o durantela infanciapresentanun mayor riesgode
cronicidadpor el posibledesarrollode inmunotolerancia85.Además,estaruta implica
normalmenteunaevoluciónmáslargade la infecciónqueen otrasvías de contagio.Por
tantoestavariablepodríacomportarsecomovariableconfundiente.
- Frecuenciade linfocitos CDS±en sangreperiférica. Variable continua con
rango entre O y 1. Puestoque la frecuenciade linfocitos CD8±/Tcl8-27+ seexpresó
sobreel número de linfocitos CD8+ de sangreperiférica, eranecesariocontrolar la
frecuenciade célulasCD8+ en el compartñnentoperiférico en los distintos gruposde
estudio.
4. Otras variables.
Paradefinir la categoríade la variable independientea la que pertenecíanlos
sujetosdelestudioserecogieronlas siguientesvariables:
- Concentraciónséricade la transaminasade alanina(ALT) en unidadespor
litro. Variable cuantitativacontinua. Esta variable tiúe elegidacomo indicadoradel
grado de inflamaciónhepáticapor ser de entretodos los testsenzimáticosde fácil
61
realizaciónél mas especificode inflamación hepática.También se recogieroncomo
variablesque valoraranel gradode inflamaciónhepática,la concentraciónséricade la
transaminasade aspartatoy labilirrubina total sérica.
- Variablesvirológicas:
1. Marcadoresserológicosde VHB: antígenode superficie(AgHBs), antígenoe
(AgilBe), anticuerpoanti core (AcHBc total), anticuerpoIgM anti core (HBcIgM),
anticuerpoanti e (Acli-{Be). Variablescategóricasdicotómicacon las categoríaspositivo
y negativo.
2. Concentraciónséricade DNA VHB en picogramospor mililitro (pg/mL).
Variablecategóricacon las categorías:1. Inferior a 2; 2. Entre2 y 100; 3. Entre100 y
1000;4.Entre1000 y 2000.5. Superiora 2000).
3. Reacciónen cadenade la polimerasa(PCR) para amplificar el gen del core
18-27. Variable categórica dicotómica con las categorías:ampliación positiva o
negativa.Esteanálisisnospermitirádemostrarla presenciadel VHB en los pacientes
del estudio.
Estas dos últimas variables se recogieronsolamenteen los sujetos AgHBs
positivo.
62
IV.2 PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
.
En estasecciónsedescribenlos pacientesadmitidosen el estudio,las técnicas
experimentalesy el protocolodesarrolladoen este proyectopara medir las distintas
variablesdel estudio.En la tablanúmeroIV.l seresumelacomposiciónde los distintos
mediosde cultivo y solucionesutilizadas.
IV.2.1 Sujetosseleccionadosparael estudio.
Entre septiembrede 1998 y febrero de 2000 acudierona las consultasexternas
de EnfermedadesInfecciosasdel Centro Mortimer Market de Londres (NHS) 40
pacientesIrILA-A2 positivoscon infeccióncrónicapor Vii-IB quecumplíanlos criterios
de admisiónenel estudio.Sin embargo,tresde estospacientesfueronexcluidos,dosde
ellos porcoinfeccióncon VHC y otro por infecciónporVIH. Por tanto, finalmente se
admitieronenel estudio37 pacientesconsecutivosHLA-A2 positivos,19 sujetosconel
diagnósticode podadorsanodel VHB y 18 con hepatitiscrónicacon AgHBe positivo.
Otros22 sujetosconformaronlos dosgruposcontroles(10 sujetosen el grupocontrol
negativoy 12 enelgrupocontrolpositivo). Las característicasclínicas, inmunológicasy
vitológicasde estoscuatrogrupossedescribenenel capítulode resultados.
IV.2.2 Recogidade muestrasy datos clínicos
A todos los sujetosadmitidos en el estudio se les recogierondurantela visita
clínica los datosde interéspor medio de un cuestionarionormalizado.Ademásse
extrajerontres tubos de sangre,uno de ellos heparinizadoy dos sin anticoagulante,
63
mediantetécnicade venopunciónestándar.
Procesamientode las muestrasde sangre
Los tubos con sangreno heparinizadaeran centrifugadosa 800 g durante5
minutosparaobtenerel suero.Partede estesuerosealicuotabaentubos de ependorfy
se congelaba inmediatamentea -8<YC para posterior amplificación del gen del
core 18-27 y cuantificacióndel DNA del VHB. El restodel suerose utilizabapara el
análisisde la bioquímicahepáticamedianteun analizadorautomáticoy parael análisis
de marcadoresserológicosde VHB, VHC, Vii-ID y VIH.
Del tuboconsangreheparmnizadaserecogíanlOOt.W. parael tipajedel 1i-JLA-A2.
El restode esta sangrese utilizabaparala obtenciónde CMSP mediantegradientede
ficol-hypaque.En un tubo de 15 mL. se poníaun tercio de ficol-hypaque y dos tercios
de sangreheparinizada.La sangrese dejabacaer con suavidadpara evitar que se
mezclaranambosfluidos. El tubo secentrifugabaa 1000 g durante20 minutossinfreno.
A continuaciónse extraja con una pipeta la capade CMSP situadaentre el ficol-
hypaquey el plasma.Las CMSP eranlavadasdos vecescon solución de lavado para
eliminar el ficol-hypaquequequedara.Finalmentelas célulaseran contadascon una
cámara de Neubauer en un microscopio óptico tras tUición con azul tripan.
Habitualmentese obtenianentre 10 y 15 x 106 de CMSPa partir de 10 mL. de sangre.
Lascélulasseresuspendíanen mediode cultivo paraserutilizadasacontinuaciónenel
recuentode la frecuenciade célulasCDS+/Tcl8-27+y para la producciónde lineas
celularesmedianteestimulaciónconel péptidodel core 18-27.
64
IV.2.3 Estudio virológico
El análisis serológico del AgHBs, Acli-IBc total e IgM, AgHBe, Acli-lBe,
anti-VHD, anti-VHC y anti-VIH-l se realizó con kits comercialesde inmunoensayo
enzímático(LaboratoriosAbbot, NorthChicago,IL; Ortho DiagnosticSystem,Raritan,
Ni!; SanofiDiagnosticPasteur,Mames—laCoquette,Francia).
La concentraciónsérica de DNA viral se cuantificó medianteuna técnica
estándarde hibridaciónmolecularsin amplificación,basadaen lacaptura“sándwich”de
híbridos de DNA, con el kit Digene Hybrid-Capture®(Digene, Beltsville, MD). El
ensayo se realizó siguiendo el protocolo previamente publicado’28. Primero se
preparaban50 j.iL. de la muestray de los controlesapropiadosen tubosde hibridación
diferentes,en los queseañadían25 uL. de solucióndisolventey251.iL. de reactivo.Los
tubosseincubabandurante20 minutosa 650C paraproducir la lisis y desnaturalización
de los ácidosnucleicos.Lahibridaciónsellevabaacaboen presenciade sondasde RNA
específicasparala cadenacompletadelDNA del VHB a 65 “C durante60 minutos.Los
híbridosDNA/RNA eranposteriormentetransferidosa tubosde capturacubiertoscon
anticuerposantí-híbridosDNA/RNA. La capturade los híbridos se realizabatras 60
minutosde agitaciónenun agitadorrotatorio. Despuéslos tubos erandecantadosy a
continuación,los híbridosinmovilizadosseincubabandurante30 minutosatemperatura
ambientecon anticuerposanti-híbridosmarcadoscon fosfatasaalcalina.Posterionnente
los tubos se decantabany lavaban varias veces.En el siguiente paso se añadíaun
substrato de la fosfatasaalcalina (LumiPhos®530) que era transformadoen un
compuestoluminiscentepor la enzimatras 30 minutos de incubacióna temperatura
ambiente.La emisiónde luz esproporcionala la cantidadde DNA VHB inicialmente
65
presente en la muestra. La luz de cada muestra se medía en un quimioluminómetro y el
resultado se obtenía como unidades relativas de luz. Una curva de calibración estándar
se utilizó para calcular la concentración de DNA VHB de cada muestra en pg/mL. El
nivel mínimo de detección de esta técnica se situaba en 2pg/mL.
IV.2.4 Tipaje de HLA-A2
Para determinar sí el paciente era HLA-A2 positivo se recogían 100 p.L. de
sangre periférica que se incubaban con anticuerpos de ratón anti HLA-A2 humano
Fig.IV.l. Histograma de un paciente HLA-A2 positivo que muestra una intensidad de fluorescencia para el anticuerpo ant HLA A2 superior a 10 unidades en las CMSP.
(Incstar, Stillwater, Mi) durante 20 minutos
en hielo. A continuación se teñía con un
anticuerpo IgG cabra anti ratón marcado
con fluoresceína (FITC) durante 20 minutos
en hielo. Posteriormente la muestra tenida
se trataba durante 15 minutos con la
solución lisante FACSB de Beckton
Dickinson para producir la lisis de los
glóbulos rojos en condiciones hipotónicas
suaves, al mismo tiempo que se
conservaban las CMSP. Tras ser lavadas las
células dos veces con solución de lavado pre-FACS se analizaban mediante el citómetro
de flujo FACScan de Beckton Dickinson@ con el programa informático CELLQuestB
(Becton Dickinson). En paralelo con la muestra problema se realizaba la tinción de un
control HLA-A2 negativo. Se considera que un paciente era HLA-A2 positivo cuando la
intensidad de fluorescencia era mayor que en el control negativo. En la figura IV.1 se
66
presenta el histograma de la distribución de la expresión de la molécula de HLA-A2 en
las CMSP de un paciente HLA-A2 positivo.
IV.2.5 Síntesis de complejos HLA-A2-core 18-27
Los complejos HLA-A2-core 18-27 (Tc18-27) (Figura IV.2) fueron sintetizados
por G.S. Ogg y A.J. McMichael en el Instituto de Medicina Molecular del
Departamento de Medicina Nuffteld del Hospital John Radcliffe, Oxford según la
metodología descrita previamenteio7. Las cadenas pesada de la molécula de HLA-A2 y
de la l32 microglobulina se produjeron en Escherichia coli trasformados con los vectores
apropiados. Solamente se expresaba el dominio extracelular de la cadena pesada de la
molécula de HLA-A2. El extremo carboxi-terminal fue modificado para añadirle una
0 Peptide core 18-27
0 82 microglobulina
+ Biotina
0 Cadena pesada de HLA-clase 1
Figura IV.2. Esquema del complejo tetramérico HLA-A2 peptido core 18-27.
Ficoeritrina
secuenciaque conteníaun lugar para biotinilización. Los complejos se formaban
in vUro mediantela unión de 30 mg. de la cadenapesadade HLA-A2, 25 mg. de ¡32
mícroglobulinay 10 mg. del péptidocore 18-27.Concretamentese utilizó comoepítopo
la secuenciadel core 18-27del VHB genotipo D: FLPSDFFPSV.El complejo HLA-
A2-péptido se biotiniló utilizando la enzimaBirA purificada a una concentraciónde
5~gmL más 0.5 mM de biotina y 5 mM de ATP. La reacciónse incubo durante16
horas a temperaturaambiente.Los complejos biotinilados se recuperaronmediante
purificación rápida de proteínas con cromatografia líquida usando una solución
tamponadaque contiene2OmM Tris (pH 8) y 50 mM deNaCí y concromatograflade
intercambioiónico mediantegradientede O a 0.5 M de NaCí. Finalmente,las moléculas
teraméricasse marcaroncon fluorescenciamediante la mezcla de los complejos
biotiniladosconestreptavidina-ficoeritrinaa unarazónmolarde 4:1.
IV.2.6 Tinción deCMSPcon anticuerposanti CDS humano y con el TelS-27
Una partede las CMSP obtenidasde sangreperiférica,tras separaciónmediante
gradiente de ficoll-hypaque, se utilizó para la cuantificaciónde la frecuencia de
linfocitos CD8/Tc18-27positivosen sangreperiférica.Estatécnicaha sido descritacon
anterioridadensujetosconhepatitisagudapor VHB1<~<>. Paracadapacienteseincubaron
medio millón deestascélulasdurante30 minutosa 370C con 1 J.tg del Tcl8-27en 100
j.tL. de RPMI más10% STF, en pocillos de fondo en U de 200 gL. Posteriormentelas
célulasselavabanconsoluciónde lavadopre-FACSy luego se incubabana40C durante
30 minutosconconcentracionessaturantesde anticuerpomonoclonalanti-CD8marcado
con PE-Cy5 (SigmaChemicalCo.,St. Louis, MO). Finalmente,las célulasselavabany
analizabaninmediatamenteenel citómetrode flujo FACS® de BectonDickinsoncon
68
el programainformático CELLQuest® (Becton Dickinson). Se analizaronal menos
200.000célulasmononuclearespor cadatinción, paraalcanzarun númeromínimo de
40.000linfocitos CD8±.
IV.2.7 Producciónde lineascelulares
Para evaluar la capacidadde expansiónde los linfocitos CD8 core 18-27
específicos,las CMSP se estimularonin viti-o con el péptido específicosiguiendoel
método descrito previamente92. En estos experimentos se utilizó el péptido
correspondienteala secuenciade la regióncore18-27del VIi-IB genotipo D adquiridoa
Chiron Mimotopes (Clayton, Victoria, Australia). Concretamente,las CMSP se
resuspendíana unaconcentraciónde 3 x 106de célulaspormL. enmediode cultivo y se
estimulaban con lgM del péptido del corel8-27 más toxoide tetánico a una
concentraciónde 0.5 gM enplatosde 96 pocillos de fondo en U. El toxoidetetánicose
utilizó como activador de los linfocitos T helper puesto que practicamentetoda la
poblaciónha sido vacunadapreviamentecon la vacunaanti-tetánica.La respuestaT
helpercontrael toxoide tetánicofavorecela creaciónde un ambientepropicio parala
expansiónde los linfocitos CD8 core 18-27específicos.En el cuartodía de cultivo se
añadióinterleuquina2 (IL-2) recombinante(30 UI/mL). Tras diez díasde cultivo las
célulaseran analizadasmediantecitometría de flujo de igual maneraa como se ha
descritoparael análisisen fresco.
69
IV.2.8 Análisis de liberación de cromo y análisis de dilución límite.
Estasdos técnicasse utilizaron en el procesode validación de la técnicade
tinción de LTC con los complejostetraméricosHLA-A2 / core 18-27.Como controles
positivos para realizar esta validación se produjeron, a partir de un pacientecon
hepatitisaguda,una línea celular y un clon específicoparael epítopocore 18-27 del
VHB. Como controlesnegativosse generóa partir de las CMSP del mismo sujetoun
clon específico para el epítopo 575-583 de la polimerasadel VHB y también se
estimularonestascélulasconel péptido77-85del gagdel VIH-1. Estosexperimentosse
comentandetalladamenteenla secciónV.I del capitulode resultados.Paracomprobarla
capacidadde reconocimientoespecíficoHLA-A2 restringidodel péptido core 18-27por
las líneas celularesy por los clonesutilizados como controles, se llevo a cabo un
análisisde liberacióndecromoque acontinuaciónsedescribe.
La actividadcitotóxica de las líneascelularesT y de los clonesfue analizada
usandocomo célulasdianaacélulas13 HLA-A2±inmortalizadasconel VEB, marcadas
con lOOgCi 51Cr (AmershamInternational, Buckinghamshire,UK) durante 1 hora a
370C. Tras lavar las células dianas fueron diluidas en RPMI más 10% de STF y
seguidamentefueron pulsadaso no durante una hora con lkunoVL del péptido
core 18-27, antesde añadirsea las líneas de célulasT o a los clones a una razón
efector:diana20/1.Las célulasfUeronincubadasenplatosde 96 pocillos de fondo enU.
La liberaciónde cromofue medidaenel sobrenadantedespuésde 5 horasde incubación
a 370C. El porcentajede citotoxicidad fue calculadousandola siguientefórmula: (E-
MID~M)*100, dondeE esla liberación de cromo en el experimento,M es el cromo
70
liberado en presenciasolamentede medio de cultivo y D es el cromo liberado en
presenciade Triton X al 10%~~.
Los clones de LTC corel8-27o polinuerasa575-583 específicosse crearon
mediantedilución límite. Diferentesnúmerosde CMSP (de entre 100 a 50.000> se
cultivaronenpocillosenU de unplato de 96 pocillos enpresenciade: CMSP autólogas
irradiadas(3.000 rads), 1 gmol/L del péptido core 18-27, y un ~xg/mLde AgHBc
recombinante.Los cultivos se suplementaroncon IL-2 a 20 U/mL cada3 días, y el
análisis de liberación de cromo se realizó despuésde 10 días. Los pocillos se
consideraronpositivossí la lisis específicaerasuperioral 10%.
IV.2.9 Amplificación del gen ‘viral del core 18-27.
Parademostrarlapresenciaviral se amplificó elgendel core 18-27del VIi-IB. A
partir de las muestrasde suerocongeladasdecadapacientese extrajo el DNA viral con
la columnade purificaciónde DNA viral QIAamp DNA Blood mini kit (QiagenLtd.,
U.K.). El gendel coredel VHB seamplificó mediantela reacciónencadenade la DNA
polimerasa(PCR) del Terniophilusaquaticus(Taq). En los pacientescon bajaviremia
serealizóunanuevaamplificaciónmediante“nestedPCR”. Se utilizaronlos “primers”
previamente 129 que sonderivadosde la regiónpre-coredel genomadel VHB
genotipoD. Concretamente,paralaprimeraPCRlos “primers” fUeron:
1.- “Primer” sentidoVHB3: 5’ ACGACCGACCTTGAGGCATACII1 3’
(Posiciónde nucleótidos:1688-1710).
2.- “Primer” antisentidoVHB578: 5’ CCCACCTTATGAGTCCAAGG3’
(Posiciónde nucleótidos:2478-2569).
71
El gen del core 18-27seencuentraa243 paresde basespordebajode VHB3. El
tamañodel productoobtenidoesde 791 paresde bases.
Parala “nestedPCR” los “primers” utilizadosfrieron:
1.- “Primer” sentidoWRI: 5’ GGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGC3’
(Posicióndenucleotidos:1778-1804).
2.- “Primer” antisentidoVHB2: 5’ CTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTT3’
(Posiciónde nuclcótidos:2396-2373).
El gendel core 18-27seencuentra150 paresde basespor debajode WR1. El
tamañodelproductoobtenidoconestaPCResde 619 paresde bases.
PararealizarlaPCRsepreparabaunasolucióncompuestapor 10 gL de solución
tamponadapara PCR, 200 1xM de cada uno de los cuatro deoxirribonucleótidos
trifosfato (Boebringer), “primers” a una concentraciónfinal de 20 pM, 6 gL de
magnesio25 mM, 2.5 U.I. de Taq DNA polimerasa(PharmaciaBiotech, Suecia),5
juL de DNA madrede la muestray aguadestiladahastaun volumenfinal de 100 pi.
La reacciónse desarrollabaen un cicladortérmico de DNA (PerkinElmer 9600). Los
programasutilizadosse describenen la figura 4. Paracomprobarel resultadode la PCR
se corría una alícuota del producto final, teñida con bromuro de etidio en una
electroforesisen gel de agarosa1% masTAL (Tris-acetato4OmM (pH 8), EDTA 1mM)
durante30 minutos a 100V. Posteriormentese visualizabanlos productoscon rayos
ultravioletasobservándoseunabandaen tomoa 700 paresde bases.
72
Fig. IV.3. Esquemadelosprogramasutilizadosparala amplificacióndel gen del péptidodel core 18-27.
73
SÚLÚCIONES
Solucióndelavadopre-FACS
Solución de lavado para separación
de CMSP
SolucióntamponadaparaPCR
Mediodecultivo celular
CONSTITUYENTES
• Soluciónfosfato tamponada:
(¡37 mM NaCL+ 1.7 mM NaH2PO4+5.3 mM KCI + 10
mM. N2HPO4(pR 7.4))
• 1%desuerodeternerafetal (STF).
• MedioRPMI 1640
• 10%STF.
• Tris HCI 20 mM + KCI 50 mM (pH 8.3)
• Medio RPMI 1640
• Hepes20 mM
• Piruvatosádico0.5 mM
• 100 Udcpenicilina
• ¡00 ¡.tg/mL deestreptomicina
• 2 Mercaptoetanol50 M
• AminoácidosesencialesXSO (1/50)
• Aminoácidosno esencialesXIOO (1/100)
• 10%STF
TablaIVA. Medios y tamponesutilizadosenlos experimentos.
IV.3 DISEÑO DEL ANÁLISIS ESTADÍSTICO
.
130
IV.3.1. Estadísticadescriptiva
Primero se describieronlas diferentesvariables del estudio en los distintos
grupos. Para describir las variables cuantitativas con los correctos índices de
centralizacióny dispersión,seevaluóen primer lugarsi las distribucionescondicionales
de estasvariables, segúnlos distintosgruposdefinidospor la variable independiente
(grupo clínico) seguíanuna distribución normal mediantela aplicacióndel test de
Kolgomorov Sminovcon la correcciónde Lillefors. La homogeneidadde varianzas
74
entregruposseanalizómedianteel testde Levene. Las variablescuantitativasnormales
fueron descritasmediantesumediay sudesviaciónestándar.Las que no siguieronuna
distribuciónnormalseresumieronmediantesumedianay amplitudintercuartil.
Las variablescategóricassedescribieronmediantesudistribuciónde frecuencias
en los distintosgruposdefinidospor lascategoríasde lavariableindependiente.
La representacióngráfica de las variables categóricasse realizó mediante
diagramasde barrasestratificadosporlos distintosgrupos.Las variablescuantitativasse
representaronmediantegráficosde cajasparacadagrupodelestudio,conexcepciónde
laedadqueserepresentómediantehistogramas.
IV.3.2. Estadística inferencial.
Como herramientametodológicase utilizó en todos los análisis la pruebade
significación de la hipótesisnula propuestapor Fisher. Todas las pruebasrealizadas
fueronbilateralesy a partir de un nivel de significaciónp<0.05 serechazóla hipótesis
nula.
Análisis un¡var¡antet31.
Se realizó un análisis univarianteparala comparaciónde las distintasvariables
del estudio en los diferentes grupos. En aquellas variables cuyas distribuciones
condicionalesseguíanuna distribución normal con homogeneidadde varuanzasse
realizó un análisis paramétrico.En aquellasvariables no normalesse intentaronlas
75
transformacionespertinentespara ajustarlasa la normalidad.En el caso de lograrseel
ajustedeseadosesiguió tambiénun análisisparamétrico.Parala comparaciónde los
cuatrogruposseutilizó el análisisde la varianzade una vía, seguidode un análisisde
contrastesparalas comparacionesentregruposen casode sersignificativo el análisisde
la varianza.En las variablesquedisponíamossolo de los datosde dosgruposseutilizó
la pruebat de Studentpara muestrasindependientes.En todos los casossecalculó el
intervalodeconfianzaal 95%de ladiferenciade las medias.
En aquellasvariablescuantitativasque no seguíanuna distribución normal a
pesarde las transformacionesrealizadasseutilizó un análisis no paramétrico.Parala
comparaciónentre los cuatrogruposseutilizó el test de Kruskal-Wallis mientrasque
paracomparacionesentredosgruposseutilizo el testU de Mann-Whitney.
La comparaciónde las variablescategóricasentrelos cuatro gruposse efectuó
medianteun test~2 deasociaciónlineal en aquellasvariablescategóricasordenadas.En
las variablescategóricasno ordenadasseutilizó el test ~2 de Pearson.En las variables
en que sólo sedisponíade los datos de los pacientesconAgHBs±se llevó a cabo una
pruebaexactade Fisher.
El análisis de la correlación de la transaminasemiay carga viral con la
frecuenciade célulasCD8/Tcl8-27+ en sangreperiférica se realizó medianteel índice
de correlaciónde Spearman.
76
Análisis multivariante’32.
El control de la confusióny de la interacciónentrevariablesserealizóen este
estudioa dos niveles. Primeramentese previno estesesgoen el diseño, al permitir
solamentela entradaal estudioa aquellossujetosnegativosparalas posiblesvariables
confundientes(criterios de exclusión). Posteriormentese controló este sesgo en el
análisis multivarianteajustandolos modelospor las posiblesvariablesconfrdienteso
modificadoras.
Paraanalizarla presenciadeconfusióno interacciónproducidapor las variables
sexo, edad,razay ruta de contagio sobrela frecuenciade células C8/Tcl8-27±en
sangreperiféricaen los distintos gruposse construyó un modelo de regresiónlineal
múltiple. Paraello primeroseconstruyóun modelo máximo contodos los términosde
interacción y modificación. Las decisionesde retener o eliminar del modelo los
términos de interacción se basó en una prueba de significación estadística.
Concretamentese realizó una pruebade significaciónglobal sobre el decremento
máximo de R2 producidoal estimarel modelo máximo sin los términosde interacción.
En esteanálisissi el resultadode la pruebade significaciónglobal no era significativo
se excluían las interacciones.Si era significativa la pruebaglobal se determinabael
gradodesignificacióndecadainteraccióny sereteníaenel modelo aquellasvariables
que eran significativas.A continuaciónse evaluabanlos términos de confusióndel
modelo. Para ello, el modelo sin las interaccionesno significativasy con todas las
posiblesvariablesconfúndientessecomparabaconmodelosmasreducidosenlos quese
excluíansistemáticamentelasvariablesconfundientesqueno eraobligadomantenerpor
la normajerárquica.Finalmente,se excluíandel modelo aquellosconflisoresque no
77
producíancambiosimportantesen el comportamientodelmodelo (sesgoy precisión).
A continuación, se evaluó el cumplimiento por el modelo creado de las
condicionesde un modelo deregresiónlineal: linealidad,homocedisticidad,ausenciade
autocorrelacióny normalidad.Paraello seevaluósilos residualesdecadadistribución
condicionaleranvariablesaleatoriasindependientesdistribuidassegúnleyesnormales
de media O y varianciacA El resultadode esteanálisisde regresiónlineal múltiple se
contrastócon los delanálisisunivarianteparavalorarla validezdeesteúltimo
Para estudiarel posible sesgo producido por la frecuenciabasal de células
CD8+/Tc18-27+ sobreel efectodel grupoclínico en la expansiónde estascélulastras
estimulaciónantígenoespecifica,serealizó un análisisde regresiónlogísticaajustando
por la variable “frecuencia de células CD8+/Tcl8-27+”. El modelo de regresión
logísticano necesitaasumirlas mismascondicionesdistribucionalesque el modelo de
regresiónlineal. Sin embargo,seevaluósi la variablecuantitativa“frecuenciade células
CDS±/Tcl8-27±”seguía una distribución normal multivariante, puesto que se
consiguensolucionesmásestables.Tambiénseevaluóla ausenciadecolinealidadentre
las covariablesya queestasituaciónpuedeaumentarel valor de los errorestípicos. Se
evaluóel “riesgo” de expansióndel grupoPSy del grupoHCBe+ sobreelgrupocontrol
positivomediantelas oddsratiosdel parámetrode lavariablepredictoraajustadopor la
posiblevariableconfrndiente.La decisiónde eliminar o retenerestavariablesetomó
sobrela basede si producíacambiosprácticamenteimportantesenel comportamiento
del modelo en cuanto a sesgo y exactitud.La significación del modelo se analizó
medianteel método de máxima verosimilitud. El resultadodel análisis de regresión
logísticasecomparócon el obtenido medianteel análisisunivariantepara conocerla
78
validezdeesteúltimo.
Los datosdel estudio fueron recogidosen una basede datosMicrosoft Access
97® y sedepurarony analizaronenelprogramaSPSS9.0 paraWindows® (SPSSInc.).
79
V. RESULTADOS.
V.1 VALIDACIÓN DE LA TÉCNICA DE RECUENTO DE LTC CORE 18-27
ESPECÍFICOS
.
Antes de comenzarel análisis de los pacientesdel estudio, se evaluó la
capacidadde los complejostetraméricosHLA-A2/core 18-27(Tcl8-27) paradetectar
las célulasCDS core 18-27específícasentre la poblacióngeneralde linfocitos CD8.
Paratal fin, se analizó la sensibilidady especificidadde la técnicapara diferenciar
clonesy lineascelularesque sabíamospreviamentesi erano no específicasparaeste
epitopo.
Comocontrolpositivo seutilizó unclonde célulasCD8 core 18-27específicasy
una línea celular citotóxica contrael epítopo core 18-27, generadasa partir de los
linfocitos CD8 de un pacienteli-ILA-A2 con hepatitis aguda. Estos linfocitos CDS
habíanmostradopreviamentein vifr~o actividadcitolítica contracélulasdianapulsadas
con el péptido core 18-27, evaluadamedianteel análisis estándarde liberaciónde
cromo. Como control negativo se utilizó un clon específicopara el epítopo de la
polimerasa(pol) 575-83 del VIi-lB y CMSP del mismo pacienteque seestimularoncon
el péptidogag75-85delVIH.
80
Los clonesse generaronsiguiendola metodologíacomentadaen el capítulo de
material y métodos. La tinción del clon core 18-27 específico con anticuerpos
monoclonalesanti CD8 y con tetrámerosHLA-A2/core 18-27mostróqueel 94% de las
célulaseran doble positivas. Es decir, la tinción con este tetrámeroera capazde
reconocerprácticamentela totalidad de las células del clon, lo que demostrabasu
elevadasensibilidad.Sin embargo,cuandoteñirnosel clon específicoparael epítopoPol
575-83del VHB con el tetrámeroHLA-A2/core 18-27másanticuerposmonoclonales
anti-CD8,solamenteunaminoría de célulasfue doble positiva. Esto demuestraque la
tinción con estamolécula es específicapara las células CDS que expresanel TCR
adecuado.Enla figuraV. 1 semuestranlos gráficosde puntosde estosdosanálisis.
Además,tambiénse comprobó la sensibilidady especificidadde estatécnica
mediantela tinción de las líneas celularesgeneradasa partir de este pacientecon
hepatitis aguda. Previamente analizarnos si estas líneas tenían capacidad de
reconocimientoespecífico del péptido core 18-27. Para ello se realizó el ensayo
estándarde liberaciónde cromo,usandocélulasdianaHLA-A2 pulsadaso no pulsadas
con el péptidocore 18-27,como secomentóenel apartadode materialy métodos.La
líneaestimuladaconel péptido del core 18-27mostróun índice de lisis específicade
célulaspulsadassobrelas no pulsadasde un 25%, esdecir, teníacapacidadcitolítica
HLA-A2 restringidade células que presentabanel epítopo core 18-27. Cuandoesta
línea celular fue teñida con tetrámeroscore 18-27 y anticuerpos monoclonales
anti-CD8, se observóque reconocíauna población de células doblepositiva, lo que
demuestrasusensibilidadparadetectarlas célulasCD8 VHB específicas.Porotro lado,
las CMSP de estemismo pacienteestimuladascon el péptido gag 77-85del VIII-> no
SI
mostraron ninguna actividad citolítica sobre las células pulsadascon el péptido
core18-27enel ensayode liberaciónde cromo.Logicamente,al estimularlas CMSP de
este paciente con un péptido distinto al core 18-27 no conseguimosexpandir la
población celular citotóxica específicapara el epítopo core 18-27 y por tanto era
imposible que existiera alguna actividad citolítica. Esta misma observaciónse
comprobó al teñir estas células con los complejos tetraméricos core 18-27. La
frecuenciade célulasdoblepositivatite inferior a 1 entre10.000células CD8+, lo que
demuestraunavezmás la granespecificidadde la técnica.En la figura V.2 semuestran
los gráficosde puntosde esteexperimento.
Obviamente,todos estos experimentosseñalanque la técnica utilizada para
reconocerlos linfocitos CD8 core 18-27 específicosmuestragran especificidad y
sensibilidad,pero no nos permite conocercual es la especificidady sensibilidaden el
análisisde los sujetosdelestudio.Estosparámetrosno sepuedencalcularal no disponer
de una técnica“patrónorn” de referenciacon la que compararla tinción con complejos
tetraméricos.Como se comentóen la introducción,actualmentese consideraque la
tinción con complejostetraméricoses la técnicaque sedebeconsiderarde referencia
parael recuentode las célulasT citotóxicas’08.Sin embargo,el análisisrealizadocon
estosclonesy líneascelularesnospermitesuponerel mismo comportamientode esta
técnicaen el estudio de las CMSP directamenteex-vivo en sujetos con infección
persistenteporVHB.
Finalmente,calculamosel ruido de la técnica,esdecirel punto de corteapartir
del cual consideramosque un sujeto presentabalinfocitos CD8+/TclS-27+en sangre
periférica. Para ello utilizamos el grupo control negativo del estudio. Es decir,
82
analizamosla frecuenciade célulasCD8+/Tcl8-27+en las CMSP de diezsujetossanos
HLA-A2 positivos.Las característicasde estossujetossedescribenenla tablaV.9.
Ladistribuciónde la frecuenciaen sangreperiféricade célulasCD8+ /Tcl8-27+
positivasno seguíauna distribución normal, pero si que lo hacíasu transformación
logarítmica (tabla V.l). Por tanto, se utilizó la variable transformada,“logaritmo
neperianode la frecuenciade célulasCD8+ITcl8-27+”, paradefinir el punto de corte.
Seconsideróqueun resultadoeranegativosi erainferior a la mediadeestavariableen
el grupo control negativomás dosvecesel error típico de la media. Estees el límite
superiordel intervalo que estimaal 95% del valor poblacionalde estavariable en el
grupocontrolnegativo.Estelímite sesituéenunafrecuenciade 7.2 célulasCD8/Tcl8-
27 positivasporcada50.000linfocitosCD8 de sangreperiférica.Portanto, seconsideró
que un sujeto del estudioteníaun resultadopositivo de nuestratécnicade recuentode
célulasCD8+/Tcl8-27±cuandopresentabaun valor superiora 8 célulaspositivaspor
cada50.000linfocitos CD8+.
83
Clon de células CDS+ core 18-27 específicas
Clon de células CDS+ ~01575443 específicas
Complejos tetraméricos HLA-A2kore 18-27
Figura V. 1. Gráfico de puntos de la tinción de los clones core 18-27 y pol 575-83 específicos con los complejos tetraméricos HLAKYcore 18-27 (Tc 18-27) más anticuerpos ami-CD& En el clon core 18-27 se observa una población doble positiva que no existe en el clon pol 575-583.
1
CD8
CMSP estimuladas con:
Péptido HBc 18-27 Péptido VIH-1 gag 75-85
Complejos tetraméricos HLA-AZ, core 18-27
Fig. V.2. Gráficos de puntos que muestra la especificidad de los complejos tetraméricos para detectar las celulas CD8+ core 18-27 específicas en dos líricas celulares de un mismo paciente en fase de recuperación de una hepatitis aguda B. En las CMSP estimuladas con el péptido core 18-27 se detecta un población de células doble positivas (CDS+/Tcl8-27) que no se detecta tras estimular estas células con el péptido gag 75-85 del VIH.
V.2 DESCRIPCIÓN DE LOS RESULTADOS.ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA Y
ANÁLISIS UNIVARIANTE
.
En estasecciónsedescribenlas distribucionesde las variablesdel estudioen los
cuatro gruposanalizados.En la tabla V.9 de la secciónde gráficos y tablas de este
capítulo,seenumerantodaslas variablesjunto a los índicesestadísticosquelas definen.
En estatablatambiénsemuestrasi las variablesseajustana unadistribuciónnormaly
presentanhomocedisticidad,lo quenospermitirávalorarque testestadísticoaplicaren
el análisisunivariante.En la misma tabla tambiénse enumeranlos valoresp de las
comparacionesde los índicesestadísticosde las variablesen los cuatrogrupos.En la
tabla y. lo se presentala estimaciónpoblacionalde las variablesmásimportantesdel
estudioen los dos gruposproblema(PS y HCBe+). La representacióngráfica de las
distribucionesde las variablesdel estudioseexponetambiénen la secciónde gráficosy
tablasdeestecapitulo(FigurasV. 10 aV. 18).
Las variables respuestadel estudio: “frecuencia de células CD8+/TclS-27” y
“expansiónde células CD8±/Tcl8-27”se describencon más detalle en apartados
individualesdeestasección.
Las variablescuantitativasedad, bilirrubina sérica,plaquetasy frecuenciade
linfocitos CD8 de sangreperiféricaseguíanuna distribuciónnormaly se han descrito
mediantesu mediay desviacióntípica. Las variablescuantitativasALT sérica,AST
séricay frecuenciade célulasCD8 core 18-27 específicasno seguíanuna distribución
normalpor lo quesedescribenmediantela medianay laamplitud intercuartil.
85
V.2.1 Característicasdemográficasy clínicasde los sujetosdel estudio.
En el estudio entraron49 sujetos con infección por VHB repartidosen tres
grupossegúnel gradode control viral e inflamaciónhepática.Además,otros 10 sujetos
formaron un grupo control negativo, definido así por tratarsede sujetosHLA-A2
positivossin contactoconel VHB. Deentrelos 49 sujetoscon infecciónpor VHB, 12
sujetosintegrabanel grupo control positivo, que eran aquellospacientesHLA-A2
positivos que tras previo contactocon el VHB habíancontrolado completamentela
infeccióneliminandoel AgHBs y desarrollandoAdHBs (sujetosinmunes).El 66% de
los integrantesde estegrupoteníaantecedentesde uncuadroclínico de hepatitisaguda.
La medianadesdeel primer diagnósticode la infecciónen los sujetosinmunesera de
3.5 añoscon una amplitudde variaciónde 16 años.Los 37 sujetosrestantesformaron
los dos grupos problema; el primero lo constituían 19 individuos HLA-A2+ con
caracteristicasc]ínicasdeportadoressanosy el segundolo formaron 18 pacientescon
hepatitiscrónicaAgHBe+.
Los cuatro grupos eran similares respectoa las principales características
demográficas.La edadmediade los sujetosde estudiose situabaal fmalde la tercera
décadaen los cuatro grupos,oscilandoentre los 40 añosdel grupoportadorsanoy los
36 del grupocontrolnegativo,con un recorridode la variableque iba de los 16 añosa
los 62. En los cuatrogruposexistíaunamayorproporciónde sujetosde razacaucásica
sobre la raza asiática y no había sujetos de otras razas en ningún grupo. La
representacióndel sexo masculinoerasuperioral sexofemeninoen todos los grupos,
conunavariaciónentreel52%del grupoportadorsanoy el 67%delgrupoHCJ3e+.
86
La posiblerutade contagioentre los gruposcon infecciónpersistentepor VHB
con AgHBs+ no fúe diferente(pO.2l4Qj.En ellos, la principal vía de contagioera la
sexualo parenteral,aunqueen un 42%de los PSy un 28%delos pacientesconHCBe±
no sospechabade ningunaposibleruta. Alrededordel 20% de los miembrosde ambos
gruposreferíanla transmisiónverticalo enla infanciacomocausade contagio.El grupo
controlpositivo,esdecir los sujetoscon inmunidadadquiridade formanaturalcontrael
VHB mostrabanuna mayor proporción de sujetos con contagio por vía sexual o
parenteralque los otros grupos, aunqueesta diferencia no llegó a ser significativa
(p=O.O64j. Esta tendenciapuededebersea que estossujetosfUeron recogidosen una
consultadeenfermedadesde transmisiónsexual,lo queles puedehacermásproclivesa
recordarestemecanismode contagio.De cualquiermanera,estatendenciase tuvo en
cuentaal realizarel análisismultivaríante.
Comoera de esperarlos valoresde transaminasemiaen los dosgruposcontroly
en el grupo“portadorsano”estabandentrode los limites de normalidad,mientrasquela
medianaenel grupo conHCBe+eradosvecesmaselevadoque el límite superiorde la
normalidad.Encambio,el valor medio de bilirrubina estuvodentro del intervalonormal
en los dos gruposde sujetoscon infecciónpersistenteAgHBs+. La bilirrubina no se
recogióen los sujetosde los gruposcontrol.
El resultadode la PCRparaamplificar el gendel core del VHB tite positivo en
el 100%de los sujetosdiagnosticadosconHCBe+y enel 68%de los portadoressanos.
Este análisis no se realizóen ninguno de los gruposcontroles.En la mayoría de los
portadoressanosfUe necesariarealizaruna “nestedPCR” tras la primeraPCR para
obtenerun resultadopositivo,debido a la menorconcentraciónséricade DNA viral en
87
estossujetos.La cuantificacióndel DNA viral ensueromediantetécnicade hibridación
fue siempreinferior a 2pgImL en los portadoressanos,mientrasque en los pacientes
conHCBe+fue siempresuperioraestevalor.
Por supuesto,todos los sujetoscon infección crónica por VHB tenían una
serologíapositivaparaAgHBs, y éstaeranegativaen todos los controles.Igualmente,
debido a los criterios diagnósticostodos los pacientescon HCBe+ tenían serología
positivaparael AgHBe y negativaparaanticuerposantiHBe,ocurriendolo contrarioen
los portadoressanos.Los anticuerposcontrael antígenodel core fueron positivosen
82% de los PS y en el 75% de los contmlespositivos. Entre los pacientescon l—lCBe±
solamenteel 35% tenían anticuerposantil-IBc. Esta diferencia en la frecuenciade
anticuerpos anti-HBc tite estadísticamentesignificativa y será comentadaen la
discusión.En el grupo controlpositivo todoslos sujetospresentabananticuerposcontra
el AgHBsmientrasque el restode los sujetosdel estudioteníanserologíanegativapara
esteanticuerpo.Finalmente,la frecuenciade linfocitos CD8+ en sangreperiféricalite
similar en los cuatrogrupos.Enresumen,esteanálisissugiereque existehomogeneidad
entrelos gruposen aquellasvariablesdistintas del factorde estudio (grupoclínico), lo
quepermitió lacomparaciónde los gruposy laextracciónde conclusiones.
V.2.2 Frecuenciade linfocitos CDS+ core 18-27+en sangreperiférica.
Las CMSP de los sujetos del estudio fueron teñidas con anticuerpos
monoclonalesanti-CD8 y complejostetraméricosHLA-A2/core 18-27 paravisualizar
mediantecitometríade flujo las célulasCD8+core 18-27específicas.
88
La distribuciónde la variable“frecuenciade célulasCD8+/Tcl8-27+” no seguía
unacurvanormalcomo se comentópreviamente(TablaV. 1). Concretamente,mostraba
una marcadaasimetríaizquierdacomosepuedever en el gráfico de puntos (Figura.
V.3). Probablemente,como sabemosporestudiosprevios,estaasimetríasedebea que
no todos los sujetos HLA-A2+ desarrollanuna respuestacontra este epitopo97. La
mediana de la distribución de esta variable en el grupo PS era 14 células
CD8+/Tcl8-27+ por cada 50.000 linfocitos CD8+ y en el grupo control positivo
(sujetosinmunes)era 18 células.En cambio, la medianade estavariableen los grupos
control negativo y HCBe+ era solamente 5 y 4 células CDS±/Tcl8-27R-
respectivamente,es decir por debajodel valor que consideramoscomo un resultado
positivo (Figura. V.4). La transformaciónlogarítmicadeestavariableademásde seguir
una distribución normal en todos los grupos (Tabla V.l) presentaba también
homogeneidadde varianzas(Test de Levene;p=O.498), lo que nospermitióun análisis
paramétricodelos datos.
Variable Grupos Testde Kolgomorov-
Sminov(p valor)
Controlnegativo >0.2
FrecuenciaCD8+/Tcl8-27 Hepatitiscrónica 0.19
Portadorsano <0.001
Controlpositivo 0.049
Controlnegativo >0.2
Ln (FrecuenciaCD8+ITcI8-27) Hepatitiscrónica 0.144
Portadorsano >0.2
Controlpositivo 0.173
TablaV. 1.- Análisisdenormalidadde la distribuciónde lasvariables“frecuenciade célulasCD8±/Tc18-
27+” y “Transfonnación logarítmica de la frecuenciade células CDS+/TclS-27+”. br logaritmonepenano
Por tanto, se realizó un análisis de la varianzade una vía para comparar las
89
mediasde la transformaciónlogarítmicade la frecuenciade célulasCD8+/Tc18-27+
entre los cuatro grupos. Este análisis tite extremadamentesignificativo (p’zO.001).
Posteriormente,serealizóun análisisde las diferenciasentrelos distintosgruposde las
medias de la transformación logarítmica de la variable frecuencia de células
CDS+/Tcl8-27+, medianteun análisis de contrastesdefmidosa priori. La posterior
transformaciónde estadiferenciaentrelogaritmosa unaescalanatural, nos aportóla
oddsratio de la frecuenciade1c18-27entrelos distintosgruposcomparados.Es decir,
nos indicó cuantasvecesson más frecuentesenun grupoque enotro estascélulas en
sangreperiférica.Los resultadosde esteanálisisse muestranen la tablaV.2. Además,
en la tabla V.3 sedescribenlos intervalosde confianzade la mediade frecuenciade
célulasCD8±/Tcl8-27±por 50.000 célulasCD8+ en sangreperiféricaen los distintos
grupos del estudio, obtenidasa partir de la transformacióna escalanatural de los
intervalosde confianzaal 95% de la mediade la variable“transformaciónlogarítmica
de la frecuenciadecélulasCD8±/TclS-27+”.
Grupos Valor p OR IC 95%de ORHepatitiscrónica!Controlneg.. 0.819 0.9 (0.43a2)
Portadorsano¡Controlneg. 0.006 2.9 (l.4a6.2)
Controlpos/Controlneg. 0.002 3.7 (1.6a 8.4)
Portadorsano!Hep.crónica. 0.001 3.3 (1.7a5.5)
Controlpos.¡ Hep.crónica. <0.001 4.1 (2 a 8.3)
Controlpos!Portadorsano. 0.504 1.27 (0.6 a2.5)
TablaV.2.- Odds ratio de las frecuenciasdecélulasCD8+/Tcl8-27+entre los distintos grupos que se
comparan.(Controlneg: grupocontrol negativo;Controlpos:grupocontrol positivo).
Grupos MediaFrec. Tcl8-27+/50000CD8+ I.C 95%de la media
Controlnegativo 4.12 (2.5 a7.2)
Hepatitis crónica 3.8 (2.4a 5.7)
Portadorsano 12.2 (7 a 22)
Controlpositivo 15.5 (8.75a27.4)
TablaV.3.- Media e intervalo de confianzade la media(1C95%)de la variable“frecuencia de célulasCD8+/Tcl8-27+por 50.000linfocitosCD8”.
90
Del anterior análisis se deduceque existe una frecuenciadiferente de células
CDS VHB específicasentrelos sujetosquecontrolan la viremia y los queno lo hacen.
Concretamente,el grupo “Portador sano” tiene 3.3 vecesmás célulasCD8±core 18-27
especificasque el grupo con “Hepatitis crónica”. También, sepuedeobservarque el
grupo “control negativo” y el grupo “hepatitis crónica” presentanla misma frecuencia
de células antígenoespecíficas,mientrasque el grupo “control positivo” y el grupo
“portadorsano” tienenunafrecuenciasimilar queademásessuperiora la de los grupos
controlnegativoy hepatitiscrónica.
Hg. V.3.- Gráfico de puntosrepresentandola frecuenciade célulasCD8+ core 18-27 especificaspor 50.000 linfocitosCD8+ de sangreperiféricaen los sujetosdel estudio.La líneahorizontal depuntosrepresentael puntode cortede la técnica(8 célulasC08±/1c18-27+por 50.000 linfocitosCD8+ de sangreperiférica.
10 18 19 12
~75-ocaoooo~60-+0ou+
o,ro1-
Di
Contiul negathvoHepatitis er¿nica Portador sano Contrtd positivo
Diagnóstco
o
I~ .1
o
o o
fl
•
IB
91
Escala logarítmica Escala natural
—tu
-6
w
Fig. V.4 Intervalosde confianzaal 95% dela mediade la variablefrecuenciade célulasC08±TcI8-27+por cada50.000linfocitosCDS+de sangreperiféricaen los cuatrogruposdel estudio.En el eje Yizquierdoserepresentael valor del loagaritmoneperianode la frecuenciade estascélulaspor 50.000linfocitosCDS+. En el eje Y derechoserepresentala transformacióna escalanaturaldeestevalor.
Sin embargo,aunqueladiferenciade frecuenciade célulasCD8±/Tcl8-27+ en
sangreperiférica entre los pacientescon “Hepatitis crónica” y los sujetos“Portadores
sanos” es estadísticamentemuy significativa, también es muy estrechaen valores
absolutos.Así, sí observamoslos intervalosde confianzade las mediasde la variable
“Frecuencia de células CD8+/Tcl8-27+” en ambos grupos, podemos ver que
practicamentese solapan(Tabla. V.3; Figura V.4.). Es decir, se puedesuponerque
desdeun punto de vistabiólogico ladiferenciaobservadano debeser importante.
¡ 1—c.d
e son—o
3—e
-oaoE
a~2.O0—oc•0oaEe
1.00—a
5—
Control negativo Hepatitis crónica Portador sano Control positivo
Diagnóstico
92
Tras el análisisde la frecuenciamedia de las células CDS+!Tc 18-27+en los
distintosgrupos,realizamosunanuevacomparacióndesdeotra perspectiva.Paraevitar
el posible sesgoprovocado sobredel valor medio de la frecuenciaTcl8-27+ por la
posibilidad de ausenciade respuestaa esteepítopo en algunossujetosdel estudio,se
realizó un análisis categorizandola variable. De estamaneraevaluamosqué grupos
presentabanunamayorproporciónde sujetoscon respuestacelular citotóxica contrael
epítopocore 18-27.
En el apartadoanteriordefinimos el límite de deteccióndenuestratécnicaen 8
células CD8+/Tcl8-27±por cada50.000 células CD8+, por tanto dividimos a los
sujetosdel estudioendos categorías:a) con másde 8/50.000célulasCD8+/Tcl8-27±;
b) conmenosde 8/50.000célulasCDS+/Tcl8-27+. Conestelímite observamosqueel
68% de los sujetosPS y un 75% de los sujetosdel grupo control positivo teníanuna
frecuenciasuperiora 8 célulasCD8iTcI8-27,mientrasqueestosólo ocurríaenun 10%
de los controlesnegativosy enel 22%de los pacientescon HCBe+(TablaV.4).
Frec.de células Control Hepatitis Portador ControlCDS+/Tcl8-27 negativo crónicae± sano positivo
0-8 N0decasos 9 14 6 3Porcentaje 90% 78% 32% 25%
Superiora8 N0decasos 1 4 13 9Porcentaje 10% 22% 68% 75%
Total N0decasos 10 18 19 12
Tabla V.4. Distribución de la proporcióndc sujetoscon una frecuenciade célulasCD8+frclS-27±en
sangreperiféricasuperiora 8.
Serealizó un análisisde la tablaV.4 medianteun testChi cuadradode tendencia
lineal que tite significativo con una p<O.OOI. Es decir, el porcentajede sujetos con
célulasCD8+ITcl8-27 se incrementade forma significativa desdeel grupo control
93
negativoal positivo. A continuaciónse realizó unacomparaciónde los gruposentresí,
corrigiendoel valor p mediantela técnicade Bonferroni.Seconsideróunacomparación
significativa cuandoel valor p era inferior a 0.0083, es decir 0.05 dividido por el
númerode comparacionesrealizadas.Esteanálisisseresumeen la tablaV.5.
Grupos Diferencia
proporción
IC 95%de la
diferencia.
p valor OR IC 95%dela
OddsRatio
p valor
1. Hepat crónica! 12% (-14%a38%) 0.410 2.5 (0.2a27) 0.430
Controlnegativo
2. Portadorsano¡ 58% (30% a86%) 0.003 19.5 (2 a 190) 0.011
Controlnegativo
3. Controlpositivo 65% (34%a 96%) 0.002 27 (2.3 a 311> 0.008
/ Controlnegativo
4. Podadorsano¡ 46% (17% a 74%> 0.005 7.6 (1.74a33> 0.007
Hepatitiscrónica
5. Control positivo 52% (21% a 83%) 0.004 10.5 (1.8a 58.3) 0.007
¡ Hepatitis crónica
6. Controlpositivo 16% (-25%a38%) 0.387 1.8 (0.3 a7.03) 0.694
1 Portador sano
Tabla VS.- Valoresp e XC. 95%de las diferenciasy razonesde Oddsínter-gruposde la frecuenciadesujetoscon másde 8 célulasCDS+/TclS-27+.Se considerasignificativa una p<O.OO83tras corregirelvalorp medianteBonferroni.
94
Mediante este análisis se observó de nuevo que no existía diferencia entre la
proporción de sujetos con más de 8 células CD8+/Tc18-27+ entre el grupo control
negativo y los pacientes con hepatitis crónica. Sin embargo, esta proporción fue un 46%
mayor en el grupo “portador sano” que en el grupo “hepatitis crónica” y se tradujo en un
riesgo 7.6 veces superior de encontrar más de 8 células VHB especificas por 50.000
células CD8+ en el grupo PS que en el HCBe+. Otra vez observamos que no existía
diferencia entre los grupos control positivo y “portador sano”. En el gráfico V.5 se
representa mediante barras estos datos.
En la figura V.6 se reproduce el diagrama de puntos del análisis mediante
citometría de flujo de un paciente típico de cada grupo del estudio. Se puede observar
No de casos
”
Control negativo Portador sano
Hepatitis crónica Control positivo
Grupos de estudio
Tc1 8-27+ CD8
>8 células
~8 células
Fig. V.5. Diagrama de barras que representa la proporción de sujetos con mas de 8 células CDS+/TclS- 27+ sobre 50.000 linfocitos CD8 en los distintos grupos.
95
como en el sujeto del grupo PS y en el sujeto inmune es posible diferenciar una
población de células doble positiva superior a 0.016% (límite de detección), mientras
que en el caso con HCBe+ la frecuencia de estas células se encuentra cerca del ruido de
la técnica y en el control negativo es muy inferior al valor mínimo de detección.
Tc1 8-27 Control negativo
I Portador sano
Hepatitis crónica
Control positivo
Fig. V.6. Diagramas de puntos del análisis citométrico de la tiecuencia basal de células CDW’l‘cl¿L27 en sangre periférica de cuatro pacientes del estudio.
V.2.3 Expansión in vi& de linfocitos TclS-27.
Se ha sugerido mediante modelos matemáticos’20 que una de las principales
variables que determina el control vira1 puede ser la capacidad de expansión clonal de
las células CDS+ virus-específicas tras encontrar el virus. Por esta razón analizamos en
nuestro estudio esta característica. Para ello planteamos el segundo objetivo de este
trabajo que consistía en el análisis de la capacidad de expansión in vitro de las células
CD8+ core 18-27 específicas tras estimulación antígeno específica.
En todos los sujetos del estudio se analizó la capacidadde expansiónde las
célulasCD8+ core 18-27específicastras estimulacióndurante10 díascon el péptido
core 18-27. Desgraciadamenteen tres sujetosPS y en otros trespacientescon HCBe+
no seobtuvieronresultadosporquelos cultivos secontaminaronconbacteriay portanto
excluimos estoscasosdel análisis. No obstante,el resto de sujetosdel estudio fue
suficienteparaobservarla grandiferenciaexistenteen la capacidadde expansiónentre
los distintos grupos.En el75%de los sujetosdelgrupoPSy enel 67%de los controles
positivos se obtuvo unaexpansiónde célulasCD8+ITcI8-27±trasla estimulacióncon
el péptido core 18-27,mientrasque esto solo ocurrió en el 13% de los pacientescon
HCBe±y en ninguno de los controles(Tabla V.6). Estadiferenciaentrelos distintos
grupos fue estadisticamentesignificativa (p<O.OOl, test Chi cuadradode tendencia
lineal). A continuación,estimamoslas diferenciasentrelas frecuenciasde sujetoscon
expansióny las oddsratio de expansiónentrelos distintosgrupos(TablaV.7). El valor
p consideradosignificativo se determinó mediante la corrección de Bonferroni
(p=O.0083).
Expansión Control Hepatitis Portador Control
negativo crónica sano positivo
Negativa N0 de casos 10 13 4 4
Porcentaje 100% 87% 25% 33%
Positiva N0 de casos 0 2 12 8
Porcentaje 0% 13% 75% 67%
Total N0 de casos 10 15 16 12
Tabla V,6.- Distribución de frecuenciasde la variable “Expansiónde los linfocitos COS core 18-27específicostras estimulaciónantígenoespecífica”enlos distintosgruposdelestudio.
97
Grupos Diferencia
proporción
IC 95%de la
diferencia.
p valor OR IC 95%de la
OddsRatio
p valor
1. Hepatcrónica! 15% (-4%a 35%) 0.194 2.1 (0.08a 57) 0.660
Controlnegativo
2. Portadorsano! 75% (54% a 96%) <0.001 48.5 <2.3 a 1014) <0.001
Controlnegativo
3. Controlpositivo 66% (40% a93%) 0.0012 32 (1.5 a 692) <0.001
¡ Controlnegativo
4. Portadorsano¡ 62% (34%a 89%) <0.001 19.5 (3 a 126) 0.0018
Hepatitiscrónica
5. Controlpositivo 53% (21% a95%) 0.004 13 (1.9 a88) 0.008
¡ Hepatitiscrónica
6. Controlpositivo 8% (-25%a42%) 0.630 1.5 (0.3 a 7.8) 0.630
¡ Portadorsano
tablaV.7.- Diferenciade proporcióny oddsratio inter-gruposde la frecuenciade sujetoscon expansiónde las células CD8+/Tcl8-27+ tras estimulaciónantígenoespecífica.Se considerasignificativo unap<O.0083trascorregirelvalor p medianteBonferroni.
En la figura V.7 semuestramediantediagramade barrasapiladasla proporción
de sujetosen cadagrupoconexpansiónde las célulasCD8+/Tcl8-27+trasestimulación
antígenoespecífica.En la figura V.8 serepresentalos diagramasde puntosobtenidos
mediante análisis por citometría de flujo de las CMSP teñidas con anticuerpos
monoclonalesanti-CD8 y con TclS-27. Se muestra la frecuenciade linfocitos
CD8+/core18-27antesy despuésde laestimulaciónen un pacientede cadagrupo.En
esteejemplo seobservacomo en el sujetoPS y en el control positivo seproduceun
incrementoen la frecuenciade célulasantígenoespecíficastras estimulaciónantígeno
específicain vitro. En cambio, en el pacientecon HCBe+ y en el control negativo no se
observaningunaexpansión.
Estos datos sugierenque, al menos ¡ti vitro, los linfocitos CD8+ VHB
98
específicos de sujetos capaces de controlar la infección vira1 muestran capacidad de
expansión clonal cuando encuentran el virus. Sin embargo, esta característica no existe
en aquellos pacientes con infección persistente y alto grado de replicación viral. No
obstante, este análisis univariante no aclara si esta diferencia se debe a la ausencia de
estas células en la sangre periférica de los pacientes con hepatitis crónica AgHBe+, o es
secundaria a diferencias cualitativas de estas células entre los sujetos que controlan y los
que no controlan la infección. Para evaluar este aspecto se realizó un análisis de
regresión logística con las covariables grupo diagnóstico y frecuencia basal de células
CD8+/Tc 18-27+. Este análisis se comenta en la sección de análisis multivariante.
No de casos
Control negativo Hepatitis
crónica
Portador sano Control
positivo
Grupos de estudio
Expansión
m Positiva
m Negativa
Fig. V.7- Diagrama de barras representando la proporción de sujetos de cada grupo con expansión de las células CDS+/Tcl S-27+ tras estimulación in vitro con el peptido core 1 S-27.
Pre estimulatión
Complejo tetramérico HLA-AL l core 18-27
Tras estimulatión
Control negativo
Hepatitis crónica
Portador sano
Control uositivo
Ac anti CD8
Figura V.8.- Gráfico de puntos que muestran los resultados de la estimulación con el péptido core 18-27 de las CMSP en un sujeto de cada grupo de estudio. Se puede observar como existe expansión de los linfocitos CD8+ VHF3 específicos del sujeto portador sano y en el control positivo, pero no en el paciente con hepatitis crónica ni en el control negativo.
V.2.4 Correlación de la frecuencia de células CDS+/TclS-27+ con los valores de
virenija y transantinasa sérica.
Los análisis previos indicabanque habíauna relacióndel grado de replicación
viral y dañohepáticocon la frecuenciade células CD8+¡Tcl8-27.Por ello decidimos
estudiarla correlaciónexistenteentreestasvariablesen los sujetoscon infecciónpor
VHB del estudio. Aunque en este trabajo no medimos la concentraciónde DNA VHB
en los sujetoscon imnunidad natural (grupo control positivo), se sabe que estaes
mínima y que sepuededetectarsolamenteenalgunoscasosensueromediantetécnicas
muy sensiblescomo la “nestedPCR”77. Por tanto, podemossuponercon todacerteza
que el valor de laconcentraciónséricade DNA VHB era inferior a 2 pg¡mL en todos
los sujetosde estegrupo. Haciendoestaconsideración,analizamosla correlaciónentre
la frecuenciade célulasCD8+/Tcl8-27+con la cargaviral y con la transaminemiaen
los sujetosdel estudio infectadoscon el VHB. Puestoque la variable “frecuenciade
célulasCDS±¡TclS-27+”no seguíauna distribución normal, se utilizó el indice de
correlacionno paramétricode Spearman.Los resultadosde estosanálisissemuestranen
la tabla“¿8 y en la figura V.9.
Correlaciónentrela frecuenciade Númerode Coeficientede p valor
célulasCD8+¡TclB-27+con: casos correlación
ALT (UI!L) 49 -0.521 =0.001
DNA VHB sérico(pg/mL) 49 -0.506 <0.001
TablaV.8.- Coeficientesde correlaciónde Speannande la frecuenciade célulasCD8+ftcl8-27+con lacargaviml y con el dañohepático
101
Fig. V.9. Diagramas de puntos que muestran la correlación de la frecuencia decélulas CD8+/Tcl8-27+ con la cargaviral y la transaminemia.La variable “frecuencia de célulasCD8-I-/Tcl 8-27±”se encuentrarepresentadaen esacalalogaritmicapara linealizarla.*EI coeficientede correlaciónutilizado en el análisis es el coeficienterho de Speannan.Las dos lineas rojasrepresentanlas redasderegresiónestimadascon la variable“frecuenciade célulasCD8+/Tcl8-27+”transformada.
En los diagramasde puntos se puedeobservarque existía una correlación
negativaentrela frecuenciade células CD8+¡Tcl8-27±y el daño hepáticoy también
conla cargaviral. Es decir, aquellossujetosqueteníanunamayorfrecuenciade células
VHB específicaspresentabanmenor viremia y menor daño hepático. Aunque los
coeficientesde correlaciónsonbastantealtos (-0.521 para ALT y —0.506 para DNA
VHB) no son excelentes.Sin embargocreemosque dada las característicasde la
variable “frecuencia de células CD8+¡Tcl8-27” son aceptables,pues no debemos
olvidarqueun grupodesujetosHLA-A2+ no desarrollaunarespuestacontrael epítopo
core 18-27, por lo que algunosde los valoresbajos de la variable en los portadores
sanossepuededebersencillamentea la ausenciade estarespuestacontraesteepitopo
en estossujetos, lo que no excluye que las células VHB especificascontra otros
epítoposmantenganla mismacorrelaciónconel controlviral y dañohepático.
• CélulasCDS+
- TclS-27+
ALT <tAJ DNA vii (pgIuS>
102
V.3 GRÁFICOS Y TABLAS DESCRIPTIVAS
.
103
Tabla descriptiva.
Tabla V.9. Descripciónpor gruposdelos indicesestadisticosde las variablesdel estudio.(Cuandose comparancuatrogruposse da la significacióndc la comparaciónglobal. En el texto secomentala comparaciónpor parejas).(Hep.crónica:hepatitiscrónica;Control Neg;controlnegativo;ControlPos:control positivo; Homocedist:homocedisticidad;Tend. lineal: tendencialineal; N.D.: no disponible).
Portadorsano 1-lep. crónica ControlNeg ControlPos valor p Normalidad! Testsn=19 n=l8 n~10 n12 I-Iomocedist.
0.684 51/51 ANOVAEdad:ahoscumplidosMedianaAmplitud
Raza:n (%)CaucásicaAsiélica
Seso:n (%)Masculino
Vía decontagio:n (%)Sexual¡ ParenteralDesconocidaVertical/Infancia
40(1742)
15(79)4 (21)
11(52)
8 (42)8 (42)3 (16)
37 36 40(29.52) (27-50) (30-52)
14 (78)4 (22)
12(67)
9(50)5 (28)4(22)
9 (90)1(10)
6 (60)
11(92)1 (8)
5(58)
11(92)0(0)1(8)
ALT sérica(UI/L)Mediana(IQR)
AST sérica(UI/L)Mediana(JQR)
Bilin’ubina sérica(mg/dL)Media(DE)
24.9(11) 101 (208.5) 23.5 (12) 18.5(6.25)
20(7) 90(139.5)
0.774(0.27) 0.83(0.6)
N.D.
N.D.
N.D.
•N.D.
<0.001 NO/NO KruskalWallis
<0.001 NO/NO
0.273 sl/sl
U MannWhitney
t-Síudent
PCRVI-IB: n (%)Positiva
0.020 TestexactodeFisher
DNA VI-IB sérico:n (%)<2 pg/mL
2-l00~og/mLl00-lOOOpgImL
1 000-2000p.g/mL>2000j.tg/mL
Ac anti ¡-lBs séricon(%)Positivo
AgliUs sérico:n (%)Positiva
AgUBe sérico:n (%)Positiva
19(100)
0(0)
19(100)
0 (0)
0 (0)2(11)1(6)
2(11)13 (72)
0(0)
18(100)
18(100)
N.D.
0(0)
0 (0)
N.D.
N.D. <0.001
¡2(100) <0.001
0<0)
N.D.
<0.001
<0.001
Ac antil-IBesérico:n (%)Positiva 19(100) 0<0) N.D.
Ac antil-lBc sérico:nPositiva
LinfocotosCD8 (%)Media(D
14(82) 6(35) N.D.
23(4.29) 26.7(7.18) 22(625) 21.3(5.3)
0.838
0.683
Test Chicuadrado.
Teod.lineal
TestChicuadrado.
Tend. lineal
TesÉChicuadrado,de
Pearson
0.064
13 (68) 18 (lOO). N.D. N.D.
TesoChicuadradode
Pearson
TestChicuadradode
PearsonTestChi
cuadradodePearson
TcstexactodeFisher
<0.001N.D.
0.0¡89(75)
TestexactodeFisher
0.16
TesÉChicuadrado.
Tend. linealANOVASI/sl
¡04
Tabla V. 10. Estimación poblacional de los parámetros de las variables más relevantes del estudio en los sujetos con infección persistente por VI-IB. I.C. 95%: Intervalo de confianza del 95%.
Portador sanos Hepatitis crónica IC 95% IC 95%
Edad: años cumplidos 34 a 42 años 34 a 40 años
Raza: (%) Caucásica 60 a97% 58a97%
Sexo: (%) Masculino 36 a 80 % 45 a 88 %
Vía de contagio: (%) Sexual / Parenteral Vertical / Infancia Desconocida
20a64% 20a64% 3 a 40%
27 a 73 YO
7a48% 3a41%
ALT sérica (WL) 21.1 a26.8 UI/L 95.8 a 176.5 WL
DNA VHB sérico (microg/mL): (%) >2 Oa17% 82alOO%
Gráficos resumen de las características de los grupos del estudio.
Distribución de la variable edad (años cumplidos).
’ Control negativo
‘j Portador sano Control positivo
Edad [años cumplidos)
Fig V. lo.- Histogramas de la variable edad en los distintos grupos estudiados.
105
I
Distribución de la variable sexo.
Control negativo
h’ig. V 1 I- Distribución de trecuenclas de la variable sexo en los dlstmtos grupos.
Distribución de la variable raza.
Control nefzativo
Portador sano
Hepatitis crónica
Control positivo
ig.V. 12 Distribución de frecuencias la variable raza en los distintos grupos.
Distribución de frecuencias de la variable ruta de contagio.
Control negativo Hepatitis crónica
Fig.V.13 Distribución de fkcuencias la variable ruta de contagio en los distintos grupos.
Distribución de la variable concentración sérica de ALT.
- --
m I I Comml negativo Hepatítis crónica Portador sano Comml positivo
Diagn6dcs
Fig.V.lC Diagramas de cajas de la variable concentración sérica de ALT.
I
Distribución de la variable concentración sérica de AST.
N. D = N.D
Di;rgnóstico
Fig. V. 15.- Diagramas de cajas de la variable concentración sérica de ALT. (N.D.: no disponible).
Distribución de la variable bilirrubina sérica.
2.0
= -E
,E 1.5
z
s n 1.0
z .t = m
0.5
Fig. V.16.- Diagramas de cajas de la variable concentración sérica de bilirrubina. MD.: no disoonible).
I N. D
Contml negatiro Hepatitis crónica Portador sano Contml positiuo
Diqnóslico
Distribución de la variable frecuencia de linfocitos CDS+ sobre el total de CMSP.
35
30
25
20
15
. I I
Ccmtrol negatiuo Hepatitis crónica Portador sano Control positivo
Diagnóstico
Fig. V. 17.- Diagramas de cajas de la variable porcentaje relativo de linfocitos CDS+ sobre el total de CMSP.
V.4 ANÁLISIS MULTIVARIANIE
.
V.4.1 Ansilisis de la presencia de confusión e interacción en la comparación de la
frecuencia de célulasCD8+ITcI8-27+ en los sujetoscon infección persistente.
Se analizó el posible efecto modificador y conflidiente de las variables sexo,
edad,raza y ruta de contagiosobrela frecuenciade células CD8+/Tcl8-27+en los
sujetoscon infección persistentepor VHB utilizando la estrategiacomentadaen la
seccíónde diseño estadístico.Como grupo de referenciase utilizó el grupo control
positivo (sujetos inmunes). Paracrear el modelo sólo se utilizaron los sujetos con
infecciónporVHB, esdecir se excluyóel grupocontrol negativo.Esteanálisisreveló
que ninguna de estas variables ejercía efecto modificador y solamente la edad
presentabaun mínimo efecto conflisor.No obstante,el modelo seconstruyóincluyendo
la variableedadporqueestimabade formamásprecisael intervalo deconfianzade la
odds ratio de la frecuenciade las célulasCD8+/Tcl8-27+entre los gruposque se
comparaban.El modelo eraestadísticamentesignificativo (p<O.0O1)y cl valor R2 erade
0.35, esdecirexplicabaun 35%de la frecuenciade estascélulasen los distintosgrupos.
El modelo de regresióncreadocumplíalos supuestosde linealidad, homocedisticidad,
independenciay normalidad.
Valorp Oddsratio IC 95%Oddsratio
Control positivo 1 0.001 4.5 (8.3a 1.9)
Hepatitis.crónica
Control positivo 1 0.598 1.36 (0.6a0.4)
Portadorsano
TablaV. 11. Oddsnitio dela frecuenciadecélulasCD8+/Tcl8-27+delgrupocontrolpositivosobreelgrupo“hepatitis crónica”y sobreel grupo“portadorsano”.
110
En la tablaV.1 1 sepresentanlos datosresumendeesteanálisisqueessimilaral
obtenido con el análisisunivarianteal no existir practicamentesesgode contUsión. Se
observó de nuevo cómo el grupo control positivo (sujetos inmunes) mostraba una
frecuencia de células CD8+ITcl8-27±4.5 veces superior al grupo de sujetos con
hepatitiscrónicaAgl-IBe+. Sin embargo,no seencontródiferenciaentrelos podadores
sanosy el grupo controlpositivo.
V.4.2 Análisis de la capacidadde expansiónde las células CDS/TelS.-27+en
los sujetos infectados por VHB ajustando por la frecuencia inicial de células
CD8/Tcl8-27+.
En el apartado de análisis univariante observamos cómo los linfocitos
CDS+ITcl8-27+ de sujetospodadoressanosy de los controlespositivos (inmunidad
natural) mostrabanmayorcapacidadde expansiónin-vitro tras estimulaciónantígeno
específica. Pem también hemos comprobado como estos grupos muestran una
frecuenciabasaldiferentede estascélulasen sangreperiférica,por lo queno sepuede
descartarque estadistintacapacidadde expansiónse debaal mayor número inicial de
célulasantígenoespecíficasen los podadoressanosy sujetosinmunes.Paracontrolar
este posible sesgo se realizó un análisis de regresión logística ajustandopor la
frecuenciabasal de células CD8±/TcIB-27±como se describió en el capítulo de
materialy métodos.
La prueba de razón de verosimilitud para estudiar la significación del modelo de
regresión logística fue estadisticamentesignificativa (p#t009). La prueba de
significaciónde los parámetrosdel modelo mostróque ambasvariablesinfluían en la
III
capacidad de expansión (grupo diagnóstico p~O.O2O9; frecuencia de células
CD8±/Tcl8-27±p=O.O327). La bondad de ajustedel modelo, evaluadamedianteel
índice Rs2 de Nagelkerke,fue del44%. En la tablaV. 12 sepresentanlas oddsratiosde la
capacidadde expansióndel grupoportadorsanoy hepatitiscrónicaAgHBe±respectoal
grupocontrolpositivo,ajustadaspor la frecuenciabasalde célulasCD8+/TcLS-27+.
Valor p Oddsratio 1C95%Oddsratio
0.012 6.6 (1.5329)
0.634 0.7 (0.14a3.3)
Controlpositivo¡
Hepatitiscrónica.
Control positivo¡
Podadorsano.
TablaV. 12. Oddsmijo de la capacidaddeexpansióndc las célulasC08+/Tcl8-27+ de los sujetosconhepatitiscrónicay portadoressanosrespectoal grupocontrolpositivo controladoporla frecuenciabasaldecélulasC08+/Tcl8-27±
Esteanálisisdemostróotravezque existíaunarelaciónentrela situaciónclínica
y la capacidadde expansiónde los linfocitos CD8 VHB específicos,aunquelos valores
de las odds ratio son inferiores a los obtenidoscon el análisis univariante.Esto es
debido al ajusteproducidopor la variable frecuenciade célulasCD8+/1c18-27+.Sin
embargo,tras esteajustepodemosobservarcomoenunasituaciónde igualdadbasalde
célulasCD8 VHB específicasunsujetodel grupocontrolpositivo presentaun riesgo de
expansión6.6 vecessuperiorqueun sujetocon hepatitiscrónicaAgHBe+, mientrasque
esteriesgoessimilarentreportadoressanosy el grupocontrol positivo. Por tanto, este
análisis sugiere que existendiferenciascualitativasentre las célulasCD8+/Tcl8-27±
entrelos sujetosportadoressanosy los pacientesconhepatitiscrónicaAgHBe+.
112
VI. DISCUSIÓN.
El control de la infección por VHB requiere la respuesta coordinada de los
sistemasinmunesinnato y adaptativotanto humoralcomo celular,pero probablemente
estevirus no citopáticonuncaseeliminacompletamentedel organismo.No obstante,en
la mayoríade los casosel sistema inmune del huéspedes capaz de controlar la
infección~’133’79’134’76”35 ocasionandoun cuadroagudo autolimitado con desanollode
una inmunidadcelular y humoralprotectorade largaduración.Esto mismo ocurreen
otras infeccionesvirales persistentes,como la infecciónpor VEB136 o en la infección
por HTLV-1137, en las que una respuestainmune eficaz controla la infección sin
repercusionesclínicas, aunqueno consigueel aclaramientocompletodel virus. Sin
embargo,en un porcentajede individuos con infecciónpor VHB el virus escapaal
control inmunitario induciendo la aparición de una enfermedad hepática
necroinflamatoriacrónica de variable intensidad. Estos son los casosdenominados
infeccióncrónicaporVHB en la prácticaclínica, caracterizadospor la persistenciadel
AgHBs ensuero.
Actualmentese consideraque la capacidadde montaruna eficiente respuesta
inmune celular contrael virus 13 esun factor crítico paracontrolar la infección54’138.
113
Concretamente,a la respuestacelular citotóxica VHB específicase le atribuye la
función efectoraesencialpara el control viral, tanto por su capacidadde destruir la
célula infectadacomoporsu facultad parainhibir la replicaciónviral por mecanismos
no citolíticos’39. Perotambiénse ha relacionadoa estascélulascon la producciónde
dañohepático.Estaafirmaciónsebasaenque el VHB esun virus no citopáticoy por
tanto incapazhabitualmentede destruirel hepatocito.Se haobservadoqueno hay una
relaciónentrela transaminasemiay lacargaviral, perosi existeuna correlaciónentreel
infiltrado linfocitario hepáticoy la severidadde la hepatitiscrónica.Además,durantela
seroconversióndel antígenoe seproduceun incrementoen la respuestainniune quese
acompañade la elevación de las cifras de transaminemia7~. Basándoseen estas
observacionesdiversosautoreshan postuladoque las células VHB específicascon
actividad citolítica pudieranser las causantesde este daño en la hepatitis crónica,
especulandoque su respuestaes débil para controlar el VHB pero suficiente para
generardañohepático~.
La respuestacelular citotóxica VHB específicaha sido ampliamenteestudiada
en la infecciónagudacon control viral, observándoseque se trata de una respuesta
intensa,policlonal y multiespecífica54que coincide con la elevaciónmáxima de las
cifras de ~ y precedeal aclaramientode los antígenosAgilile y AgHBs y al
desarrollode anticuerposneutralizantes’40.Sin embargo,en la infección crónicaseha
advenidoque estarespuestaesmás débil o indetectableensangreperiféricaTM, aunque
se han conseguidoaislar clonesde células T VHB específicasa partir de linfocitos
intrahepáticos84’141.
De cualquiermanera,es unarealidadque no todos los sujetosconpersistencia
¡14
del AgHBs presentanel mismo grado de daño hepáticoy de replicación viral’5. Este
rango de variaciónenestasdosvariablespuedeserdebidoa diferenciascuantitativasy
cualitativasen la respuestainmune y especialmenteen la respuestacitotóxica. Por esta
razón,enestetrabajoestudiamosla respuestacelularcitotóxicaVHB específicaendos
gruposde sujetosrepresentativosde dosdiferentessituacionesclínicasen la infección
crónica por VHB. Por un lado estudiamos los individuos “portadores sanos”,
caracterizadospor bajaviremia (“t2pglml en suero),ausenciade daño hepático(ALT
normal) y AgHBe negativo,y por otro, analizamoslos pacientescon hepatitiscrónica
AgHBe±,diferenciadospor la elevadatransaminemiay carga viral (>800pg/ml en
suero). Ambos grupos los comparamoscon un conjunto de sujetoscon inmunidad
contra el VHB adquirida de forma natural, es decir, con anticuerposanti HBs sin
antecedenteprevio de vacunación. Este grupo nos sirvió de control positivo de
referencia,puestoque sehademostradoquelos sujetosque controlancompletamentela
infección agudapor VHB desanollanuna respuestaCDS VHB especificaque sc
mantienedurantedécadasy que es capaz de controlar continuamentela replicación
viral77.
Estos tres grupos presentabansimilares característicasdemográficaslo que
permitía su comparabilidad. Obviamente eran diferentes en las características
serológicas y virológicas que definían las distintas categorías (carga viral,
transammnemía,AgHBs, AgHBe). Desdeun punto de vista imnunológico es interesante
resaltar que la frecuenciade sujetoscon Ac. anti Hllc era diferenteentreel grupo
“portador sano” y el grupo con hepatitiscrónicae+. Esta diferenciapuedereflejar la
existenciade una distintacapacidadderespuestacelularT entreestosdosgrupos.Se ha
115
demostradocon anterioridadque la producciónde anticuerposanti UBe estanto una
67
función independientede las célulasT comodependientede estarespuesta
Enestossujetoscondiferentecontrolde la infecciónporVHB nosplanteamosel
análisistantode la frecuenciade las célulasCD8 VHB específicascomo suhabilidadde
expansiónclonal. Es cadavez másclaro que la presenciade un reservoriode células
CD8 virus específicasconcapacidadde expansiónclonal, de migración al lugar de la
infeccióny de desarrollode lasadecuadasaccionesefectorasesnecesarioparamantener
al virus bajo control y responderrápidamentea las variacionesen la cinética de
replicación viral’20. Estos parámetrosdefmidos como eficiencia o capacidadde
respuestade los linfocitos T citotóxicossonmás importantesqueel númeroabsolutode
célulasqueposeeel sujetoinfectado.Tambiéninvestigamossi las característicasde esta
respuestaen los diferentesgruposseasociabacon distintosgradosde daño hepático,
paracomprobarsí secumplíala hipótesisampliamenteadmitidadeque son las células
citotóxicasantígenoespecificaslascausantesdeldañotisular84.
Parallevar a cabo nuestrosobjetivosutilizamos como modelo la infecciónpor
VHB en sujetosHLA-A2 positivos. En estossujetosseha descritocon anterioridad
múltiplesepítoposULA clase1 restringidos54.En nuestrotrabajo, elegimosanalizarla
respuestacontrael péptido del core 18-27 del VHB, porhabersedemostradoque está
presenteen la mayoríade casosagudosque controlanJainfección97”00,lo quenoshace
suponerque se trata de un epítopo inmunodorninante.Paravisualizar estascélulas
utilizamos los complejos tetraméricosHLA-A2/core 18-27. Esta tecnologíase ha
utilizado previamenteen el estudio de pacientescon infección aguda por VHB,
mostrandoserunatécnicamuy específica’0& Paradefinir el límite de deteccióndeesta
116
técnicaen nuestroestudio con sujetos con infeccióncrónica, se utilizó un grupo de
sujetossanosHLA-A2+, sin antecedentesclínicos o serológicosde contactocon el
VHI3, cuyasCMSP Iberonteñidasconcomplejostetraméricos.El punto de cortede la
técnicasesituéen un 0.016%de célulasCD8 VI-IB especificassobreel total decélulas
CD8 en sangreperiférica. Este valor mínimo de detecciónes similar al descrito por
otros autoresen el uso de complejostetraméricosparael estudiode otras infecciones
109
virales
Utilizando este modelo de estudio hemosdemostradoque en la mayoría de
sujetoscon infecciónpersistentequecontrolan la infecciónviral existeun reservoriode
célulasCD8±VHB específicas.Este reservorioestabapresentede forma semejante
tanto en los sujetosportadoressanoscomo inmunes.Concretamente,detectamosen
alrededordel 70%de los individuosdeambosgruposestascélulasensangreperiférica.
Es importanteresaltarque la ausenciadecélulasCDS core18-27específicasen un 30%
de estoscasosno debehacernospensarenqueno existeunarespuestacelularcitotóxica
antígeno específicaen estos individuos, sino que probablementeestossujetoshabrán
desarrolladouna respuestacontraotros epítoposvirales que no podemosdetectaral
utilizar complejostetraméricosdirigidossólo contraelpéptidocore 18-27.De cualquier
manera, tenemosque destacarque aunqueestascélulasse detectaronen la sangre
periféricade los pacientesquecontrolabanla replicaciónviral, sufrecuencia,al menos
para las célulasCD8 core 18-27 específicas,era muy baja y próxima al límite de
detecciónde la técnicautilizada.
Sinembargo,estascélulasno sedetectaronen la sangreperiféricade la mayoría
depacientesconhepatitiscrónicaAgHBei-. La interpretaciónde esteresultadonegativo
117
es compleja.La primera opciónes suponerque estascélulas estánpresentesen una
frecuenciamuy bajao estáncompletamenteausentes.Se ha demostradoen modelos
animalesque la repetidaestimulacióncon elevadasdosisde antígenopuedeinducir la
extenuación y la muerte celular36. Se sabe que las células T tienen una capacidad
limitada de división y puedenreplicar solamenteun número finito de generaciones
(limite Hayflick), por tanto la continua estimulaciónantigénicapodría ocasionarla
desapariciónde estas células”2. Un mecanismo homeostáticode control de la
proliferaciónde las célulasT esla muertecelularmediadaporFas’43(FiguraVI. 1). Esta
vía seactivaparaeliminar lascélulasqueencuentranrepetidamentea suantígeno,como
ocurrecon los linfocitos quereconocenautoantígenos.EstudiosrealizadosporUckeret
al. encélulasT murinasno transformadasdemostraronquediferenciascuantitativasen
la cantidadde antígenodeterminabanla respuestacelularen la direcciónde muerte o
proliferación celular’44. En este estudio la muerte celular era generadapor altas
concentracionesde antígeno.Tambiénse ha comprobadouna situaciónsimilar en un
modeloexperimentaldeencefalomielitisalérgica,unaenfermedadautoinmunemediada
por célulasCD4 especificascontra la proteínabásicade la mielina (PBM). En este
trabajosehaobservadoquealtasdosisde PBM soncapacesde eliminarcompletamente
fr-vivo las célulasT PBM específicas’45.Una situaciónsimilar puedeocurrir en la
infeccióncrónicapor VHB con elevadogradode replicaciónviral, dondeel continuo
estimulo antigénicopodríainducir la delecciónde estascélulas.Datosprocedentesde
un trabajo de Nakamuraet al. señalanque la frecuenciade linfocitos T de sangre
periféricaque muestransignosde apoptosises muy baja en pacientescon hepatitis
crónica cuando la concentraciónde ALT se incrementa y muy alta cuando la
transaminemia desciende.Estehallazgosugiereunacorrelaciónentreactivacióncelular
y muertecelular tras la activación¡~W. Además,estosmismos autoreshan demostrado
¡18
que la estimulaciónconAgHBc recombinantepodíainducir la apoptosisdeestascélulas
in vitro, lo que induce a pensar que la apoptosiscelularT inducidapor la activación
antigénicapodríaser una causade la deficienciade estascélulas.Sin embargo,en el
momentoactualestaatractivahipótesispermanecesin serconfirmada.No obstante,es
dificil pensarque existe una delecióncompletade la respuestacelular CD8+ VHB
específicaen los sujetoscon infeccióncrónicaAgHBe+,puestoqueestascélulas sehan
aisladoa partir de linfocitos intrahepáticosenotrosestudios84’141y sehaobservadoque
están presentesen sangre ~ y pueden ser expandidasen casos de
seroconversiónespontaneao inducidapor IFN alfa83. Sin embargo,enestostrabajosno
se ha analizado si las células encontradasrespondían a células con fenotipo
“memoria/efector”o setratabade célulasde nuevageneración.Decualquiermanera,no
sepuededescartarque en los pacientescon hepatitiscrónicaestascélulassevuelvan
anérgicas’43y no proliferenni sediferenciencorrectamentecomo sucedeen los sujetos
inmuneso portadoressanos(FiguraVI. 1>. Es muyprobablequeestosdos mecanismos
(inducción de anergia y muerte celular inducida tras activación) previamente
comentadosocurrana la vezenestospacientes.Así, (lallimore et al. hanobservadoen
un modelo murino de infecciónpor LCMV que altasdosisde cargaviral inducen la
desapariciónde las célulasantígenoespecificas,ya seapor ausenciadel apropiado
ambientede citoquinas para estascélulas productorasde perforina o por apoptosis
mediadapor activación.Sin embargo,es interesanteresaltarque enestemodelo existe
un periodode anergiaentre la inducciónde la activaciónde los LTC y la deleciónde
estascélulas36.
Otra posibilidad para explicar la baja frecuenciade estascélulasen sangre
periféricapodríaserla compartimentalizaciónenel lugarde la infección. El estudiodel
119
compartimentoperiféricopodríaenestecaso no serrepresentativode lo queocurreen
el hígado147.No obstante,debemostenerencuentaque el compartimentoperiféricoes
unarutaobligadaparalos linfocitos CD8 VHB específicosdesdelos ganglios linfáticos
al hígado, por lo que aun existiendo un secuestrohepático de estascélulas,el hecho de
no encontrarlas en sangre periférica induce a pensar que están presentesen una
frecuenciamuy baja. De cualquier manera, son necesariosnuevos estudiosde los
linfocitos CD8 VHB específicosintrahepáticosparaanalizarsi existeun alto gradode
compartimentalizaciónde estascélulas. Finalmente, otra razón para la ausenciade
detecciónde estascélulas en los sujetoscon hepatitiscrónicapodría serdebidaa la
regulacióna la bajadel TCR en los linfocitos citotóxicosVHB específicossometidosa
una elevadaantigenemia46.Estehechopodríaprovocarque el númerode TCR en la
superficiecelularfriera insuficienteparadar unaseñalpositivacon la técnicautilizada.
Sin embargo,estaposibilidad la creemospoco probable.Estudiosrealizadosin vitro en
nuestrolaboratorio estimulandoCMSP de sujetosinmunescontrael VHB con dosis
crecientedeantígeno,mostróun discretaregulacióna la bajadel TCR quenuncaevitó
el reconocimientode estascélulascon los complejostetraméricos(datosno publicados).
Nuestrosdatos sugierenque en los sujetoscon infecciónpersistentepor VHB,
cualquieraque seasu situaciónclínica,existeuna frecuenciade célulasCDS+ VHB
especificasmuy baja. Concretamente,parael epítopocore 18-27en sujetosHLA-A2+
que controlan la infección, esta frecuenciase encuentraalrededordel 0.02% de los
linfocitos CD8 y estevalor estapor debajodel 0.016%en los pacientescon hepatitis
crónica eAg+. Esta similitud en la frecuenciade LTC VHB específicosen sangre
periféricaen presenciadedistintosgradosde controlde la infecciónpareceextraña,sí
es cierto que estascélulas son importantesen el control viral. Sin embargo,este
120
fenómenose ajustaa las prediccionesde los modelosmatemáticosque describenla
interacciónentre las células T citotóxicas virus específicasy el virus. Este modelo
expresala clásicarelaciónecológicaentredepredadory presa’20.De tal maneraque,un
eficiente depredador(LTC) reducirá rapidamentela cantidad de presa (virus) a una
proporcióntan baja que la falta de estímulo provocarála posterior reducciónde la
frecuenciadel depredador.Sin embargo,en la situaciónopuestacon un depredador
ineficiente(LTC), la presa(virus) semantendrásiempreelevaday el depredadorenuna
frecuenciamínima. Esto es exactamentelo que hemos observadoen este estudio
transversal.En estecorteen el tiempoobservamoscomo sujetoscondistinto gradode
control del VHB (inmunes,portadoressanos,hepatitiscrónica eAg+) muestranuna
frecuenciade LTC VHB en sangreperiféricamuybajay próximaentodosellos.
En estemismo modelo matemáticose predice que la capacidadde respuesta
citotóxica, es decir la facultad de expansiónclonal tras encontraral virus, es un
elementomás importanteen el control de la infección que el número absolutode
LTd20. Los datos de nuestroestudio se ajustanperfectamentea esta idea. En este
trabajo sedemuestracomo tanto los sujetoscon inmunidadnaturalcomo los portadores
sanosdisponendeLTC VHB específicosconcapacidadde expansiónclonalqueno está
presenteen la mayoríade los pacientesconhepatitiscrónicaAgHBe+. La ausenciade
expansiónde los LTC VHB específicosencontradaen los pacientescon hepatitis
crónicatambiénha sido descritaparaestascélulasen la flise agudade la primoinfección
por VHB’00. En estafase las célulasestudiadasmostrabanun fenotipo de alto gradode
activación(HLA-DR+, CD3B±,CD45RA-, CD62L-) que probablementeindica que se
trata decélulasefectorasque sufrirán apoptosistras realizarsu función. Estasituación
puedeocurrir tambiénen lahepatitiscrónicaB y puedeserlacausade la incapacidadde
121
expansiónclonal de las célulasCD8+ VHB específicas.Sin embargo,sepodríaobjetar
que la ausenciade expansiónsedebea la t~ltadecélulasenel compartimentoperiférico
en los pacientescon hepatitis crónica, puesto que este trabajo sólo indica que su
frecuenciaes inferior al 0.016%de lascélulasCD8+. No obstante,cuandoserealizó el
análisis de la capacidadde expansiónen los distintos grupos controlando por la
frecuenciabasalde LIC VHB específicosestadiferenciasemantuvo.Por tanto, estos
datossugierenque existeunadesigualdadcualitativaen las poblacionesdecélulasCDS
VHB especificasentresujetoscony sin controlviral.
Ante estosresultadosestentadorespecularque dependiendode factoresvirales
(inóculo, ruta de contagio, velocidad de replicación viral, presenciade mutaciones
virales) y del huésped(tipo de respuesta1 “helper”, microambientede citoquinas,
eficaciade las CPA) se inducirá o no una respuestacitotóxica adecuadadurantela
primoinfección. En el casode desarrollarseunarespuestaidónea,sereducirála viremia
hastaun valor inferior al necesariopara inducir la activaciónmasivade los LIC. Sin
embargo,cantidadesvariables del VHII permaneceránen el organismo de fonna
persistente.Estastrazasvirales seráncontroladaspor el reservorioperiférico de LIC
VHB específicoscon capacidadde expansiónclonal ante el encuentrocon el virus.
Probablementeestascélulasabandonancontinuamenteel compartimentoperiféricopara
diigirse al hígadoy controlaraquelloshepatocitosinfectados.No debemosolvidar que
en los sujetos inmunes también participan en el control vial los anticuerpos
neutralizantes,pero no ocurre así en los “portadoressanos” que no presentan
anticuerpos contra el AgHBs. Enestoscasosesprobablequelos LIC VHB específicos
sean los únicos responsablesde dominar la infección. Las trazasvirales persistentes
puedenactuarcomo un estímulode baja intensidadque permiteque se mantengaun
¡22
reservoriode células de memoriaa partir de las que surgiráncélulasefectoraspara
mantenercontroladala infección’43.Esteesel escenarioqueposiblementeocurreen los
portadoressanos y sujetos inmunes. Sin embargo,si la respuestacelular citotóxica
especificaen la primoinfección no es adecuada,no serácapazde reducir rapidamentela
carga viral y se puede suponer que la estimulación continuadapor la elevada
antigenemiainducirála anergiayio muertecelularcomoocurre en la infecciónmurina
por LCMV35 o por CMV36 respectivamente.Estaes la situaciónque puedeocurrir en
los sujetos con infección crónica por VI-IB AgHBe+ quepresentanelevadareplicación
viral y elevadaantigenemia.
Es interesanteresaltarque los datosdeestatesissugierenqueel VHB persistede
forma indefinidaenel organismoa pesarde una correctarespuestainmune,como ha
sido señaladoporotrosautoresanteriormente77.En nuestroestudiosolo realizamosuna
búsquedadel VHB en suero mediante“nested PCR” en los sujetos con infección
crónica, sin embargoel hallazgo de LTC VHB en sujetos inmunes mucho tiempo
despuésde recuperarsede la infecciónagudamuestraqueel VHB no escompletamente
eliminado apesardel desarrollodeunarespuestainmuneeficiente.Es decir, puestoque
la respuestacitotóxicahalladaen estossujetosinmunesera específicacontraproteínas
del VHB querequierenla síntesisporlas célulasinfectadas,nuestrosdatosimplican que
existeun primadocontinuo de nuevosLIC por trazastranscripcionalmenteactivas del
virus 13. Porotro lado, en los sujetos“portadoressanos”observamosque a pesarde no
detectarmediante técnica de hibridación el DNA viral en suero, sí fue posible
descubrirloen la mayoríade individuosmediante“nestedPCR”. Portanto, enestecaso
podemos comprobar como a pesar del control ejercido por el sistema inmune
probablementemediantelos LIC VHB específicosel virus eraaundetectableensuero.
123
El siguienteobjetivo de nuestrotrabajoeraevaluarla relaciónqueexistía entre
el dañohepáticoy la respuestacelular citotóxica. Como seha comentadohastaahora,
los sujetos con control viral disponían de una respuestaCD8 VHB específica
cualitativamentesuperiora los pacientesconelevadaviremia. Sin embargo,tantoen los
sujetoscon inmunidadnaturalcomoen los portadoressanos,a pesarde la presenciade
estarespuestano existía daño hepático(transammasemíanormal), mientrasque los
pacientescon hepatitiscrónicaAgHBe+ con una respuestainferior presentabandaño
hepático.No obstante,se podría argumentarque esto no implica que los LTCs no
produzcan el dañoen la hepatitiscrónica,puestoque la bajafrecuenciade estascélulas
enel compartimentoperiféricopodríaindicarqueestánsecuestradasenel hígadodonde
produciríanel daño tisular. Sin embargo,creemosque los datos de estatesis son
compatiblescon observacionesobtenidas en investigación animal y humanaque
demuestranque puedeexistir un control viral por los LTCs virus específicossin
ocasionardaño hístico.
Cooperet al. handemostradoen chimpancésinfectadosconVHC queno existía
correlaciónentrelaactividadcitotóxicade los linfocitos CD8 VHC específicosaislados
del hígadoy el valor de transaminemia’17.En un modelomurino dehepatitisfulminante
por VHB se ha observado que el daño hepático es generado por las células
mononuclearesdel sistema innato que son reclutadasal lugar de la infección por
mecanismosdependientesde iFNy75. Estasituacióntambiénse produceen el modelo
animalde hepatitisinducidapor concavalinaA’48 y enun modelo murino de infección
por virus influenza23. En otro modelo de infecciónpulmonar murina por virus influenza
sehademostradocomolos linfocitos 1 citotóxicosvirus específicosquepresentabanlas
124
correctaspropiedadesefectorasy migratoriaserancapacesde controlarla infecciónsin
provocardaño hístico, mientrasque sí la respuestacitotóxica no era adecuadano se
controlabala infección y seproducíaun masivo infiltrado mononuclearpulmonar’13.
Estostrabajossugierenque el dailo provienede las célulasno antígenoespecificasque
infiltran el órgano infectado en ausenciade control del patógeno.En la infección
crónica por VHC en el hombrese ha observado,medianteel estudiocon complejos
tetraméricoscontravarios epítopos.quela mayoríade los linfocitos CD8 intrahepáticos
no son antígenoespecíficoscomo ocurríaen los modelosmurinos anteriores.Es por
tanto probableque lo mismo ocurraen la hepatitiscrónica13, esdecir, enausenciade
control viral por los LIC VHB específicosse generaráun infiltrado mononuclearpor
activacióninespecificaque ocasionaráel daño hepático,mientrasque los sujetoscon
una respuestaadecuadacitotóxica no desarrollarán estedaño.
CPA
Respuesta(17~~N-4normal
Proliferaciónydiferenciación
CTL
CTL Células
L activadas
eReconocimientoantigé»ict> sin
co-estimulación
Muerte celular(i?=%.4inducida por
activacion
FasFasL
Regulaciónmediada porcitoquinas
Interacción Fas-FasL
Supresiónmediadapor citoquinas
Célula ¡7 belper
Fig. VI.1 - Diferentesrespuestasde las célulasCD8“náive” trasreconocimientodel antígeno.
Anergia Ausenciaderespuesta
Apoptosis
Citoquinas
125
Además, recientesdescubrimientosdemuestranque las células CD8 VHB
específicas son capaces de controlar la replicación viral por mecanismos no
citolíticos’39. En los últimos añosvarios gruposhandemostradoque cuando los virus
infectan célulashepáticases más probableque el control viral se ejerza mediante
inactivación intracelular mediadapor citoquinas que a travésde la destrucciónde la
célula infectada.Guidotti et al. han estudiadoeste mecanismoprofUndamentey han
descritoque la replicaciónesabolidacompletamentemediantecitoquinastipo 1 en los
hepatocitosde ratonestransgénicosque expresanel VHB7’8. Estas citoquinas son
capacesde degradarcompletamenteel genomadel virus B y aclarar la infección sin
necesidadde destruir la célula infectada.Este método no citopático de aclaramiento
viral no esparticulardel VHB. El control de la infecciónhepáticapor CMV’49 o por
listeria monocitogenes pareceestarsobretodo mediadopor IFN>’ más que porvías
dependientesde perforina.Guidotti et al. han demostradoque el LCMV es aclarado
tambiénde los hepatocitospormecanismosno citolíticos queno sonoperativosen otras
células73.lodos estostrabajossugierenque el controlde los hepatocitosinfectadosno
requiereunalisis masivay quizásconstituyeunaestrategiaparapreservarla integridad
funcionalhepática.
Recientementeseha demostradoque durantela infección agudapor VHB en
chimpancés,el aclaramientodel virus ocurre antes de que aparezcael pico de
transaminemiae infiltración hepática. Este trabajo sugiere que la inactivación
intracelulardel VHB inducidaporlos LIC VHB específicospuedeserel mecanismode
control viral predominanteenestemodelorelacionadoconel hombre74.No obstante,se
debe recordar que la lisis de hepatocitos vía Fas o perforina está claramente
126
demostrada151.Por tanto, cierto grado de apoptosisy consecuenteregeneraciónde
hepatocitosdebeocurrir. Esto seha demostradoen la infecciónaguday crónicapor
VHW en la marmota,en la que seobservala presenciade lisis duranteel control de los
hepatocitosinfectados’52.
En resumen,los datosde estetrabajo muestranuna correlaciónnegativade la
frecuenciay capacidadde expansiónde los LIC core 18-27 específicosen sangre
periféricacon la cifra de transaminasemia,que junto a los recientesdescubrimientos
sobrelos mecanismosno citolíticos de controlviral sugierenque esposibleun control
de la infecciónpor lascélulasCD8 VHB específicassin producciónde dañohepático.
Desdeunpunto de vistapráctico,la informaciónobtenidacon esteestudionos
invita a pensarque la restauraciónde la respuestacelular citotóxicaVHB específicaen
los pacientesconhepatitiscrónicae+ a los mismosniveles que apareceen los sujetos
mmuneso portadoressanos,podríaayudaral control de la infecciónen estoscasos.Sí
suponemosque la elevadaantigenemialcargaviral puedeprovocar la anergia y/o
deleciónde los LIC VHB específicosen la hepatitiscrónica B, como ocurre en los
modelosmurinospreviamentecomentados36’35,unaposibleestrategiaparacontrolar la
infección podríaserel uso de fármacosanti-viralesque reduzcanla cargaviral para
permitir la recuperaciónde esta respuesta.En este sentido, el tratamiento con
lamivudina ha demostradoser capaz de disminuir la carga viral hasta valores
practicamenteindetectablescon técnicasdehibridación,aunqueno consigueeliminarel
cccDNA’53. El papelde estefármaco sobrela respuesta1 helper VI-IB específicaha
sido recientementeestudiado.Seha observadoquela lamivudinainduceun incremento
deestarespuesta,aunqueestasituaciónno favoreció laseroconversiónen la mayoríade
127
los casos154.Es importanteinvestigar en el futuro sí esteanálogode la deoxicitosina
ejerce el mismo efecto sobre la respuestacelular citotóxica antígenoespecífica.Es
posibleque la reducciónde la cargaviral permita la recuperaciónde las célulasCOS
VHB específicaso la aparición de nuevosprecursoresa partir del compartimento
tímico, como ocurre durante la terapia intensiva antiretroviral en la infección por
Otra interesanteestrategiapara restaurarla respuestaCD8 VHB especifica
puedeser la administraciónde vacunas,que induzcanuna vigorosa respuestacelular
citotóxica aprovechandoel descensode la viremia provocadopordrogasquereduzcan
la cargaviral. Recientementesehanpublicado los resultadosde un estudiopiloto con
una vacunabasadaenel epítopo core 18-27que escapazde incrementarla respuesta
CDB core18-27 ~ aunquesin un efectopositivo sobrela seroconversión.No
obstante,senecesitanmis estudiospara comprobarsí estosesperanzadoreshallazgos
puedenconvertir a estasestrategiasterapéuticasen alternativasal interferón alfa. Es
indudable que la utilización de los complejos tetrámericos HLA-I/péptido para
cuantificar las células CDS VHB especificaspermitirá de forma sencilla valorar el
efectode estostratamientossobrela respuestacelularcitotóxica.
En conclusión,la cuantificaciónde las célulasCD8 core 18-27específicasdel
compartimentoperiférico, en pacientescon infeccióncrónica por VHB con distinto
controlviral y diferentedañohepático,haaportadonuevasperspectivasal conocimiento
de la patogénesisde la infecciónpor VHB. Los datosde estetrabajo señalanque los
sujetosconcontroldel VHB muestranunaactivarespuestacitotóxicaespecíficaqueno
se observaen los pacientescon elevadacarga viral. Además, se sugiere que los
128
linfocitos CD8 VHB específicospueden controlar la infección sin generar lesión
hepática.Estos resultadosdebenalentamosa la búsquedade tácticasque permitan
restaurarestarespuestaenpacientessin controlde la infección.
129
VIL CONCLUSIONES.
1. La tinción de las células CD8±de sangre periférica con complejos tetraméricos
HLA-A2/core 18-27 en sujetosHLA-A2+ con infecciónpersistenteporVHB esuna
técnicaválidaparaestudiarlas célulasCD8±VHB específicas.
2. Utilizando estatécnicaes posible detectarun reservorio de linfocitos CD8 VHB
específicosen sangreperiféricade pacientesHLA-A2+ con infección persistente
porVHB.
3. Este reservoriose detectamás frecuentementeen sujetoscapacesde controlar la
infección queenpacientescon elevadaviremia y dañohepático.
4. No obstante,la frecuenciade células CD8+ core 18-27 específicasen sangre
periféricade sujetoscon infecciónpersistenteporVHB, independientementede su
situaciónclínica,esmuy baja(inferior al 0.05%de la poblaciónde linfocitos CD8).
5. La capacidaddeexpansiónclonal de las célulasCD8 VHB específicastrasentraren
contactoconlos epítoposviralesestápresenteensujetoscon infecciónpersistente
130
por VHB que controlan la viremia, mientrasque estahabilidad estáausenteen la
mayoríadepacientesconhepatitiscrónicapor VI-IB AgllBe+.
6. La distinta capacidadparaelaborarunarespuestacelularcitotóxica VHB especifica
entresujetosportadoressanosdel VHB y pacientescon hepatitiscrónica,puedeser
un factor determinanteen la diferentehabilidad para controlar la infección que
muestranambosgruposde pacientes.
7. El desarrollode unarespuestacitotóxicaVHB específicaadecuadapuedelograr el
controlviral sin producciónde dañohepático.
131
VIII. PUBLICACIONES GENERADAS.
Los datos de estatesis doctoralestánpublicadosparcialmenteen los artículos
referenciadosa continuación:
• M. Maini, C. Boni, U. Ogg, A. King, 5. Reignat,C. K. Lee, .1. R. Larrubia, U.
Webster,A. McMichael, C. Ferrari,R. Williams, D. Vergani,A. Bertoletti. Direct
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¡32
IX. APÉNDICES.
IX.1 Abreviaturas utilizadas.
Ac ant¡ Hile: anticuerpos contra el antígenoHBc.
Ae anti Hile: anticuerpos contra el antígenoHBe.
Ae ant¡ HBs: anticuerpos contra el antígenoHBs.
Ag ilBe: antígenoe del virus 13.
Ag HBs: antígenosdel virus B.
ALT: alaninaamino-transaminasa.
AST: aspartato amino-transaminasa.
cccDNA: DNA circular cenado covalentemente.
CDR: regióncomplementariadeterminante.
Core 18-27:epítopo core 18-27dcl VHB.
CMV: citomegalovirus.
CMSP: célulasmononuclearesde sangreperiférica.
DAG: diacil-glicerol.
DNA: ácido desoxirribonucleico.
DNA VHB: cargaviral del VHB.
VEB: virus de EpsteinBarr.
FasL: Fas-ligando.
133
Fc: fracción constantede la inmunoglobulina.
FLPSDFFPSV: fenilalanina-leucina-prolina-serína-aspartato-fenilalanina-fenilalinina-
prolina-serina-valina.
Gag 75-85:epítopo gag 75-85del VIH.
HCBe+: hepatitis crónica 13 AgHBe±.
VIII: virus de la inmunodeficienciahumana
IITLV-1: virus de la leucemiaT humana1.
HLA: complejo mayor de histocompatibilidad humana.
Ig: inmunoglobulina.
IL: interleuquina.
tEN: interferón.
IP3: inositol tri-fosfato.
ITAM: motivo de activaciónbasadoentirosina.
LTC: linfocitos T citotóxicos.
LCMV: virus de la linfocoriomeningitismurmna.
LDA: ensayode dilución límite.
PBM: proteínabásicade la mielina.
PCR: reacciónencadenade la polimerasa.
Fol 575-583:epítopo polimerasa575-583del VHB.
PTK: proteintirosinkinasa.
PS: portador sano.
RER: retículoendoplasmáticorugoso.
RNA: ácido ribonucleico.
STF: suerode ternerafetal.
TAP: transportador asociadocon el procesadodel antígeno.
134
Te 18-27:complejo tetraméricoHLA-A2/eore 18-27.
TCR: receptorde lacélulaT.
Th: linfocito T helper.
TNF: factor de necrosistumoral.
VHB: virus de la hepatitisB.
VHC: virus de lahepatitisC.
VHD: virus de lahepatitisD.
ZAP: proteínaasociadaZ.
WHV: virus de la hepatitisde la marmotamonta.
IX.2 Indice de gráficos.
1. Figura
2. Figura
3. Figura
4. Figura
5. Figura
6. Figura
11.1:
11.2:
11.3:
11.4:
11.5:
11.6:
7. Figura 11.7:
7. Figura 11.8:
8. Figura IV.1:
Página
Esquemade la respuestainmune 12
Esquemade la interacciónHLA-1 ¡ péptido-TCR 16
Genomadel virus B 18
Ciclo replicativodel virus 13 20
Esquemadel complejo HLA-A2 ¡core 18-27 36
Esquemade la tinción de celulas VHB especificascon
complejostetramericos 41
Tinción inmunohistoquimica de los linfocitos CD8+
intrahepáticosen un pacientecon hepatitiscrónica e+ y en
sujetoportadorsano 46
Cinética viral y celular citotóxica según un modelo
matemático 50
Histograma de la tinción para conocerel tipaje HLA-A2 66
¡35
9. Figura IV.2:
10. Figura IV.3:
11. Figura V.1:
12. Figura V.2:
13. Figura V.3:
14. Figura V.4:
15. Figura V.5:
16. Figura V.6:
17. Figura V.7:
18. Figura V.8:
Esquemadel complejotetraméricoHLA-A2 ¡ core 18-27 67
Esquemade los programasde las PCR utilizados para la
amplificacióndel gencore 18-27 73
Gráfico de puntosde la tinción con complejostetraméricos
HLA-A2/core 18-27 de un clon de célulasCD8 core 18-27
específicoy otro pol 575-583específico 83
Gráfico de puntosde la tinción con complejostetraméricos
HLA-A2/core 18-27 de líneascélularesestimuladascon el
péptidocore 18-27ó con gag 75-85 83
Frecuencia de las células CD8+/Tcl8-27±en sangre
periféricaen los distintosgrupos 90
Intervalo de confianzaal 95% dc la variable frecuenciade
célulasCD8+/Tcl8-27+ 91
Diagrama de barras de la proporción de sujetos con una
frecuenciade células CD8±/Tcl8-27superior al punto de
cortede latécnica 93
Gráfico de puntos del resultado del análisis mediante
citometría de flujo de la frecuencia de células
CD8+/Tc18-27+en un sujeto representativode cadagrupo.... 94
Diagrama de barras de la proporción de sujetos con
expansiónde una poblaciónde célulasCD8+/Tcl8-27±tras
estimulaciónin-vitro conelpéptidocore 18-27 97
Gráfico de puntos del resultado del análisis mediante
citometríade flujo de la estimulaciónin-vitro con el pitido
core 18-27de las CMSPde un sujetode cadagrupo 99
136
19. Figura V.9:
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
Figura
Figura
Figura
Figura
Figura
Figura
Figura
V. 10:
V.11:
V¿12:
V.13
V. 14:
V.15:
V.16:
27. Figura V.17:
28. Figura VI.1:
Diagramade puntos.Correlaciónde la frecuenciade células
CD8+/Tc18-27±en sangreperiféricacon la transaminemiay
con lacargaviral 101
Histogramade ladistribuciónde lavariableedad 104
Gráficode barrasde ladistribuciónde la variablesexo 105
Gráficodebarrasde ladistribucióndela variableraza 105
Gráfico de barrasde la distribución de la variableruta de
contagio 106
Gráficodecajasde ladistribuciónde la variableALT 106
Gráficodecajasde ladistribuciónde la variableAST 107
Gráfico de cajasde la distribuciónde la variable bilirrubina
sérica 107
Gráfico de cajasde la distribuciónde la variable frecuencia
de linfocitos CD8+ensangreperiférica 108
Esquemade diferentesposiblesefectosde la estimulación
antigénicade los linfocitos CD8+“naYve” 117
IX.3 Indice de tablas.
1. Tabla 11.1:
2. Tabla IV.1:
3. Tabla V.1:
4. Tabla V.2:
Página
Característicasde las distintasllisesde la infecciónporVHB 46
Mediosy solucionesutilizadasen los experimentos 74
Análisisde la normalidadde la variablefrecuenciadecélulas
CD8+/Tc18-27+y desutransformaciónlogarítmica 88
Razón de odds de la frecuencia de células CDS+/Tc18-27+
entrelos distintosgrupos 89
137
5. Tabla V.3:
6. Tabla V.4:
7. Tabla V.5:
8. Tabla V.6:
9. Tabla V.7:
10. Tabla V.8:
11. Tabla V.9:
12. Tabla V.10:
13. Tabla V.11:
Intervalo de confianzaal 95% de la media de la variable
frecuenciadecélulasCD8+/Tcl8-27+ 89
Distribución de la proporciónde sujetoscon una frecuencia
de células CD8±/Tcl8-27±en sangreperiféricasuperioral
puntode cortede la técnica 92
Intervalo de confianzaal 95% de la diferenciay de la razón
dc odds de la comparacióninter-gruposde la proporciónde
sujetos con una frecuencia de células CD8±/Tcl8-27±
superioral puntodecortede latécnica 93
Distribuciónde la frecuenciade la variableexpansiónde las
células CD8±/Tcl8-27+tras estimulación in-vitro con el
péptidocore 18-27 96
Comparacióninter-gruposde la frecuenciade sujetos con
expansiónde las célulasCD8+/Tcl8-27+tras estimulación
in-vitro con el péptido core 18-27 96
Coeficientesde correlaciónde Spearmande la frecuenciade
células CD8+/TclB-27+ en sangre périferica con la
transaminemiay lacargaviral 100
Tabladescriptivade las variablesdemográficasy clinicasdel
estudioenlos distintosgrupos 103
Estimación poblacionalde las variables demográficamás
importantesen los sujetosdelestudioantígenoHBs± 104
Análisis de regresiónlineal múltiple. Controlde la confrsión
e interacción. Razón de odds de la frecuenciade células
CD8+/Tcl8-27±de los grupos con AgHBs±respectoal
138
14. Tabla V.12:
grupocontrolde referncia(sujetosinmunes) 109
Análisis de regresiónlogística. Control de la confusión e
interacción.Razónde oddsde la capacidadde expansiónde
las células CD8±/Tcl8-27+de los grupos con AgHBs±
respectoal grupocontroldereferencia(sujetosinmunes) 111
IX.4 Financiación del proyecto.
El trabajo fue financiadoparcialmentemediante:
• Becadel Comitéde Desarrolloe InvestigaciónCIÁnica del
University College London. Investigador principal:
Dr. Antonio Bcrtolctti.
• Becade Proyectode Investigaciónde la WellcomeTrust.
Investigadorprincipal: Dr. Antonio Bertoletti.
El doctorandofue respaldadoporel Ministerio deSanidady Consumo:
• BecadeFormaciónen Investigación(BEFI 98/9155)del
Fondode InvestigacionesSanitariasdel Instituto de Salud
CarlosIII.
¡39
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