análisis toxicológico por lc/ms 65 compuestos ... · introducción – enfoque a un método...
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Análisis toxicológico por LC/MS
65 compuestos farmacéuticos y drogas
de abuso en orina en una sola
inyección
Jaume C. Morales
MS Product Specialist
Agilent Technologies Spain
Octubre 2011
MAD/BCN
Introducción – Enfoque a un método estándar para LC/MS :
Exhaustivo conjunto de compuestos farmacéuticos y
drogas de abuso
Agenda:
• Optima metodología del análisis utilizando un sistema Agilent LC/MS QQQ
• Herramientas de control y Software diseñadas para facilitar el desarrollo del
método
•Personalización de conjuntos de compuestos y metabolitos de diferentes
clases (opiáceos/ estimulantes/ sedantes/ otros de abuso).
• Enfoques en la preparación de la muestra – Dilución e inyección versus
técnicas de extracción SPE.
•Típicos resultados del rendimiento del método analítico
Listado de Compuestos Target y Metabolitos
estudiados (en orden de elución cromatográfica)
Opitates/Opiods ISTDs Stimulants ISTDsnor-Codeine d-Amphetamine
Morphine morphine-d6 MDA mda-d5
Oxymorphone methamphetamine
Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA mdma-d5
dihydrocodeine MDEA
naloxone phentermine phentermine-d5
Codeine codeine-d6 Benzoylecgonine benzoylecgonine-d8
Oxycodone ritalininc acid
naltrexone zopiclone zopiclone-d4
Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine cocaine-d3
6-monoacetyl morphine 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate methylphenidate-d9
m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene cocaethylene-d8
o-desmethyltramadol meprobamate
nor-Fentanyl norfentanyl-d5 fenfluramine fenfluramine-d10
tramadol tramadol-13c-d3
Heroin heroin-d9
tapentadol tapentadol-d3
N-desmethyltramadol
Meperidine meperidine-d4
Normeperidine
norbuprenorphine
Fentanyl fentanyl-d5
Trazodone
EDDP eddp-d3
Propoxyphene propoxyphene-d5
norpropoxyphene
Methadone methadone-d9
Buprenorphine buprenorphine-d4
Tie
mp
o d
e R
ete
nció
n
Opitates/Opiods ISTDs Stimulants ISTDsnor-Codeine d-Amphetamine
Morphine morphine-d6 MDA mda-d5
Oxymorphone methamphetamine
Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA mdma-d5
dihydrocodeine MDEA
naloxone phentermine phentermine-d5
Codeine codeine-d6 Benzoylecgonine benzoylecgonine-d8
Oxycodone ritalininc acid
naltrexone zopiclone zopiclone-d4
Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine cocaine-d3
6-monoacetyl morphine 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate methylphenidate-d9
m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene cocaethylene-d8
o-desmethyltramadol meprobamate
nor-Fentanyl norfentanyl-d5 fenfluramine fenfluramine-d10
tramadol tramadol-13c-d3
Heroin heroin-d9
tapentadol tapentadol-d3
N-desmethyltramadol
Meperidine meperidine-d4
Normeperidine
norbuprenorphine
Fentanyl fentanyl-d5
Trazodone
EDDP eddp-d3
Propoxyphene propoxyphene-d5
norpropoxyphene
Methadone methadone-d9
Buprenorphine buprenorphine-d4
Sedatives/Hypnotics ISTDs Abused/Other ISTDs7-aminoflunitrazepam PCP pcp-d5
zolpidem zolpidem-d6 Verapamil
Flurazepam carisoprodol carisoprodol-d7
Clonazepam clonazepam-d4 11-nor-9-carboxy-delta9-thc 11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9
Nitrazepam nitrazepam-d5
alpha-Hydroxytriazolam
Flunitrazepam
alpha-Hydroxyalprazolam
lorazepam
oxazepam
2-OH-ethylflurazepam
alpha-Hydroxyethylflurazepam
Triazolam
NorFludiazepam
desalkylflurazepam
alpha-hydroxymidazolam
Alprazolam alprazolam-d5
Temazepam
Chlordiazepoxide chlordiazepoxide-d5
Midazolam midazolam-d4
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
diazepam diazepam-d5
Sedatives/Hypnotics ISTDs Abused/Other ISTDs7-aminoflunitrazepam PCP pcp-d5
zolpidem zolpidem-d6 Verapamil
Flurazepam carisoprodol carisoprodol-d7
Clonazepam clonazepam-d4 11-nor-9-carboxy-delta9-thc 11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9
Nitrazepam nitrazepam-d5
alpha-Hydroxytriazolam
Flunitrazepam
alpha-Hydroxyalprazolam
lorazepam
oxazepam
2-OH-ethylflurazepam
alpha-Hydroxyethylflurazepam
Triazolam
NorFludiazepam
desalkylflurazepam
alpha-hydroxymidazolam
Alprazolam alprazolam-d5
Temazepam
Chlordiazepoxide chlordiazepoxide-d5
Midazolam midazolam-d4
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
diazepam diazepam-d5
>65x Iones
positivos
Isobáricos – La separación cromatográfica es de
gran ayuda. Iones de masa Isobárica – “Definidos como iones diferentes que tienen masa idéntica”
Morphine
(C17H20NO3)
[M+H]+ = 286 m/z
Hydromorphone
(C17H20NO3)
[M+H]+ = 286 m/z
Codeine
(C18H22NO3)
[M+H]+ = 300 m/z
Hydrocodone
(C18H22NO3)
[M+H]+ = 300 m/z
Methamhetamine
(C10H16N)
[M+H]+ = 150 m/z
Phentermine
(C10H16N)
[M+H]+ = 150 m/z
Cromatografía –
Es la Base del Método Analítico
mo
rph
ine
hyd
rom
orp
ho
ne
co
dein
e
hyd
roco
do
ne
methamphetamine
ph
en
term
ine
Column: Zorbax Poroshell 120 SB C18 (2.1 x 100 mm 2.7µm)
Injection volume: 5 µL
Column Temp: 55°C (Analytical column)
Needle Wash: MeOH (100%)
Mobile Phase: Pump A = H2O & 5mM NH4 Formate & 0.01% Formic acid
Pump B = Methanol & 0.01% Formic acid
Flow rate : 0.5 ml/min
Stop time: 6.0 min
Equilibration time: 1.5 min
Gradient:
Time (min) %B
0.0 10
0.5 15
3.0 50
4.0 95
6.0 95
Agilent 1260 HPLC series Binary Pump, Well Plate Sampler, Thermostatic Column Compartment
Método HPLC Toxicológico – Screen/Quant
Exhaustivo en 6 min.
Columnas Poroshell 120 para HPLC y UHPLC:
Características de las Poroshell 120 :
• 80-90% eficacia de las sub 2um
• A ~40-50% menor presión
• 2X eficacia de 3.5um (totalmente porosa)
Sin el doble de presión de las 3.5um
• Frita de 2um para reducir obturaciones
• Límite de presión de 600 bar para el uso
en HPLC o UHPLC.
• La partícula porosa está formada por un
núcleo sólido de 1.7um diam. y una capa
porosa exterior con un grosor de difusión
de 0.5um.
Poroshell 120 es una opción de columna de alta eficacia y resolución
para mejorar la productividad en LC y LC/MS
1.7um
0.5um
0.5um
Poroshell 120 Resiste Obturaciones. Frita de 2 um
Vália para Plasma o Matrices similares
Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um
LC: Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra: Plasma Precipitado
2 partes de Plasma
7 partes 20/80 Agua-ACN 0.1 % Ácido Fórmico
1 Parte Diflusinal 10 ug/ml en 50/50 Agua-ACN
Concentration final Diflusinal 1 ug/ml
Agitar y dejar reposar 10 minutos
SIN Centrifugado/ SIN Filtrado Volumen Inyección : 1ul
Canal A: Agua w/0.1 % TFA
Canal B: ACN 0.08 % TFA
Flujo 1 ml/min, Inyección1 ul
Tiempo % B
0 20
0.5 90
0.6 90
1.1 20
2.5 20
Test de ESFUERZO !!!
2500 Inyecciones consecutivas de Diflusinal en Plasma precipitado
¿Cómo evolucionan la PRESIÓN y la EFICACIA?
Poroshell 120 Resiste Obturaciones. Frita de 2 um
Vália para Plasma o Matrices similares
Diflusinal in Plasma
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
1 501 1001 1501 2001 2501
Injections
Pre
ssu
re
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Eff
icie
ncy (
N)
End Press
Plates
Columna: Poroshell 120 EC-C18, 3.0 x 50mm, 2.7um LC: Agilent 1200 RRLC (SL)
Muestra: Plasma Precipitado: 2 partes de Plasma: 7 partes 20/80 Agua-ACN 0.1 % Ácido Fórmico : 1 Parte Diflusinal
10 ug/ml en 50/50 Agua-ACN (Concentration final Diflusinal 1 ug/ml) Agitar y dejar reposar 10 minutos
SIN Centrifugado/ SIN Filtrado Volumen Inyección : 1ul
Canal A: Agua w/0.1 % TFA
Canal B: ACN 0.08 % TFA
Flujo 1 ml/min, Inyección1 ul
Tiempo % B
0 20
0.5 90
0.6 90
1.1 20
2.5 20
!Buena resistencia
con muestras de
Plasma!
Especificaciones de Fases Ligadas para Poroshell 120
Poroshell 120 EC-C18
Rango pH 2-9 Ideal para la
mayoría de fases móbiles LC/MS
Endcapped – mejor perfil de pico
Carga carbón – 8%
Superficie específica – 3.3 umol/m2
Poroshell 120 SB-C18
Rango pH 1-8 mayor resistencia a
muy bajo pH
Non-endcapped – para
selectividad mixta
Carga carbón – 7.5%
Superficie específica– 2.1 umol/m2
CHCH
CH
CH
CH
CH
O
SiO
O
O
O
Si
Si
Si
CHCH
CH
CHCH
CH
Si
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Material Base: Tamaño de poro :120Å; Tamaño Particula : 2.7um; Superfície: 130 m2/g
O
R
R
Si
OH
Si
O
Si
R
R
R
O
OH
R
Endcapped Grupos Voluminosos
para mejor resistencia a
pH 1-2
Análisis Toxicológico Dirigido (Target) por QQQ
Observaciones :
El potencial de un conjunto tan abundante de compuestos (>65) podría mermar
las posibilidades de un instrumento QQQ, con limitaciones de dwell-time :
•Exhaustivo Barrido y Cuantificación en 6 min.
•Con Patrones Internos ( 20 )
•Curvas de Calibrado con Patrón Externo ( 65 )
•Con éstas condiciones, un método „normal‟ Multi Reaction Monitoring (MRM) de
MS/MS resultaría muy comprometido debido a la cantidad de analitos (2
transiciones x cada uno) además de los respectivos Patrones Internos
isotópicos.
• El número de MRMs en éste exhaustivo método asciende a >170 en éstas
condiciones.
•Es necesario enfocarlo a un análisis por Dynamic MRM
Dwell-time : tiempo que el QQQ dedica a cada transición en cada ciclo
¿Qué es MRM? (Multiple Reaction Monitoring)
170 210 250 290
210
222
268 280 165
Espectro con
iones de matriz
(fuente ESI)
Q1 deja pasar
solamente el
ión m/z 210
190 210
210
La Celda de
Colisión rompe
el ion m/z 210
en fragmentos
150 170 190 210
210 158
191
Q3 sólo deja pasar
los fragmentos
característicos del
ion mz/ 210 :
158 y 191 para
cuant y cual.
160
158
190
191
no hay ruido químico
Ions
Máximo
Dwell Time
Tiempo por ciclo
Determinado por Anchura de pico (>12 puntos por pico)
Número de MRMs
Concurrentes
El conflicto para las
condiciones perfectas de
adquisición
(*) 15 puntos por pico
MassHunter “Dynamic MRM”
Muchas aplicaciones requieren el barrido de 100 – 1000 compuestos en un método MRM
• Forensic analysis, Food and Environmental
• Subsequent quantitation of positives in dedicated methods
SIN Dynamic MRM
• Necesidad de programar manualmente múltiples segmentos para maximizar el dwell time
• Tarea tediosa y frágil para cromatogramas con desvíos de tiempos
CON Dynamic MRM
• Programación Automática de segmetos solapados sin intervención del usuario
• Menor número de MRMs por tiempo permite mayores dwell time/sensibilidad
• Inmune a desviaciones de Rt
Time (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Compounds (10/block)
Cycle Time (sec)
Max Coincident
Cycle Time (sec)
MRM
50 80
0.4 0.4 0.4 0.4
20 40 40
Dynamic MRM
0.5 0.8 1
30
Time Segment 1 Time Segment 2 Time Segment 3 Time Segment 4
0.7
100 70
Ciclos 2 x menores permiten manejar picos cromatográficos más estrechos,
más analitos y dwell times mayores por compuesto
Principios de funcionamiento de Dynamic MRM
Counts vs. Acquisition Time (min)
x105
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Segmento 1 Segmento 2
Segmento 3
Segmento 4
Análisis por segmentos vs. MRM dinámico
MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo
La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés
Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1 Nº de Transiciones Concurrentes =
Rt
Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.
Tiempo de Ciclo
MRM dinámico
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1
Selección de 24 transiciones de analitos Para ilustrar la eficacia de los Tiempos de Ciclo usando dynamic MRMs.
Nº de Transiciones Concurrentes =
Tiempo de Ciclo
MRM dinámico
Time >>>
Abun
da
nce >
>>
Concurrent
Compounds
MRM dinámico - Simulación
Agilent 6420 QQQ MS
Fuente : Electrospray, ionización positiva
Condiciones de la fuente
Gas Temperature : 350°C
Gas Flow : 12 L/min
Nebulizer Pressure : 50 psi
Capillary : 2000 V
∆ EMV : 0 V
Dwell time : variable (en Dynamic MRM)
Condiciones del Método LC-MS/MS QQQ
Pain Management
Listado de algunas Drogas y Metabolitos y sus
condiciones de adquisición
(Dynamic MRM) Compound Name ISTD? Prec Ion MS1 Res Prod Ion MS2 Res Frag (V) CE (V) Ret Time
Ret Window Polarity
Oxymorphone 302.1 Unit 284 Unit 117 17 0.8 0.5 Positive Oxymorphone 302.1 Unit 227 Unit 117 29 0.8 0.5 Positive Morphine 286.2 Unit 165.1 Unit 158 41 0.85 0.7 Positive Morphine 286.2 Unit 152 Unit 158 60 0.85 0.7 Positive Hydromorphone 286.2 Unit 185 Unit 159 29 1.03505 0.7 Positive Hydromorphone 286.2 Unit 157 Unit 159 45 1.035667 0.7 Positive Codeine 300.2 Unit 165.1 Unit 158 45 1.76505 0.5 Positive Codeine 300.2 Unit 58.1 Unit 158 29 1.768633 0.5 Positive Naloxone 328.2 Unit 310 Unit 91 17 1.81 0.5 Positive Naloxone 328.2 Unit 211.9 Unit 91 41 1.81 0.5 Positive Oxycodone 316.2 Unit 298.1 Unit 143 17 1.911033 0.5 Positive Oxycodone 316.2 Unit 256.1 Unit 143 25 1.911033 0.5 Positive Naltrexone 342.2 Unit 324 Unit 117 21 1.99 0.5 Positive Naltrexone 342.2 Unit 55 Unit 117 41 1.99 0.5 Positive Hydrocodone 300.2 Unit 199 Unit 159 29 2.05 0.5 Positive Hydrocodone 300.2 Unit 128 Unit 159 65 2.05 0.5 Positive 6-monoacetyl morphine 328.2 Unit 165.1 Unit 158 41 2.072517 0.5 Positive 6-monoacetyl morphine 328.2 Unit 43.1 Unit 158 60 2.072517 0.5 Positive d-Amphetamine 136.1 Unit 119.1 Unit 66 5 2.177967 0.5 Positive d-Amphetamine 136.1 Unit 91 Unit 66 17 2.177967 0.5 Positive methamphetamine 150.1 Unit 119 Unit 92 5 2.2718 0.5 Positive methamphetamine 150.1 Unit 91 Unit 92 17 2.2718 0.5 Positive MDMA 194.1 Unit 163 Unit 97 9 2.284667 0.5 Positive MDMA 194.1 Unit 105 Unit 97 25 2.284667 0.5 Positive
Herramientas de control y Software diseñadas para
facilitar el desarrollo del método
MRM dinámico (DMRM)
Mejora de la sensibilidad basado en la
especificidad de la transición a su tiempo
tMRM Confirmación espectral de los target sin barrido
ni perdida de sensibilidad
Optimizer
Si no se dispone de Kits de Agilent permite
buscar los valores de adquisición óptimos
para la cuantificación
Fragmentor Voltage Collision Energy
QQQ Analyte Optimizer Máxima Sensibilidad
Optimización Automática de 2 Settings clave
Naloxone
220 V 200 V
180 V 160 V 100 V 80 V 60 V 40 V 140 V 120 V
Máximo a 130 V Optimización de Volatge de Fragmentor
25 eV
20 eV
35 eV
30 eV
40 eV
15 eV
10 eV
5 eV
Product Ion Spectra Overlaid;
(All Collision Energies)
Collision Energy = 20 eV
5 eV
15 eV
10 eV
25 eV
20 eV
FIA TIC – AFL B1
Optimización de la Energía de Colisión
Utilización del Optimizer
Resultado de la Optimización y Traslado al
Método
Fácil Desarrollo y Personalización del Método
Base de Datos que
contiene más de 200
compuestos.
Cada uno con
mútiples transiciones
MRM para asegurar
una rápida creación y
desarrollo del
método
Find By MRM (Cualitativo)
65 Analitos Toxicológicos /37 ISTDs (Ionización Positiva)
¿Que es Triggered MRM?
Threshold
Comp 3 supera el Umbral
Comp 3 dispara las Transiciones Adicionales
Ciclo Principal
Triggered cycle
Revisión de los espectros tMRM
Los espectros MRM pueden buscarse utilizando NIST LC/MS/MS o librerías própias
List of Analytes and ISTDs (a) (Listed in order of Elution)
Opitates/Opiods ISTDs Stimulants ISTDsnor-Codeine d-Amphetamine
Morphine morphine-d6 MDA mda-d5
Oxymorphone methamphetamine
Hydromorphone hydromorphone-d6 MDMA mdma-d5
dihydrocodeine MDEA
naloxone phentermine phentermine-d5
Codeine codeine-d6 Benzoylecgonine benzoylecgonine-d8
Oxycodone ritalininc acid
naltrexone zopiclone zopiclone-d4
Hydrocodone hydrocodone-d6 Cocaine cocaine-d3
6-monoacetyl morphine 6-acetylmorphine-d6 Methylphenidate methylphenidate-d9
m-hydroxybenzoylecgonine Cocaethylene cocaethylene-d8
o-desmethyltramadol meprobamate
nor-Fentanyl norfentanyl-d5 fenfluramine fenfluramine-d10
tramadol tramadol-13c-d3
Heroin heroin-d9
tapentadol tapentadol-d3
N-desmethyltramadol
Meperidine meperidine-d4
Normeperidine
norbuprenorphine
Fentanyl fentanyl-d5
Trazodone
EDDP eddp-d3
Propoxyphene propoxyphene-d5
norpropoxyphene
Methadone methadone-d9
Buprenorphine buprenorphine-d4
Incre
asin
g R
ete
nti
on
Tim
e
List of Analytes and ISTDs (b) (Listed in order of Elution)
Incre
asin
g R
ete
nti
on
Tim
e
Sedatives/Hypnotics ISTDs Abused/Other ISTDs7-aminoflunitrazepam PCP pcp-d5
zolpidem zolpidem-d6 Verapamil
Flurazepam carisoprodol carisoprodol-d7
Clonazepam clonazepam-d4 11-nor-9-carboxy-delta9-thc 11-nor-9-carboxy-delta9-thc-d9
Nitrazepam nitrazepam-d5
alpha-Hydroxytriazolam
Flunitrazepam
alpha-Hydroxyalprazolam
lorazepam
oxazepam
2-OH-ethylflurazepam
alpha-Hydroxyethylflurazepam
Triazolam
NorFludiazepam
desalkylflurazepam
alpha-hydroxymidazolam
Alprazolam alprazolam-d5
Temazepam
Chlordiazepoxide chlordiazepoxide-d5
Midazolam midazolam-d4
Desmethyl diazepam
Nordiazepam
diazepam diazepam-d5
*NB – Not all ISTDs are shown in these slides
Matrices Comunes
• Orine
• Sangre
• Sangre directa
• Plasma
• Suero
Matrices Alternativas
• Fluido Oral
• Sudor
• Pelo
• Meconio
Matrices Típicas en el Análisi Toxicológico
Enfoques en la preparación de muestra (Orine)
•Diluir e inyectar
– Otras opciones incorporando:
• Inorganic acid hydrolysis
• Glucuronidase hydrolysis
– La más rápida preparación
– Puede sufrir de efecto matriz (supresión iónica) en muestras de alta carga.
– Menor sensibilidad
– Posibilidad de un alto numero de Falsos Negativos
•Extracción en Fase Sólida (SPE)
– Diferentes técnicas y fases dependiendo de la naturaleza ácida/básica del analito
– Un solo protocolo no es necesariamente bueno para todos los analitos en conjunto.
– Típicamente mayor tiempo de preparación de muestra
– Más caro
– Muestras más Limpias
– Mayor Sensibilidad
Preparación de muestra. SPE (Compuestos Básicos)
Paso 2: Plexa DAU (30 mg)
Sample 0.2 mL urine
Sample Pre-treatment Dilute 0.6 mL 100 mM KH2PO4
SPE-Conditioning 1/ 0.5mL MeOH
2/ 0.5 mL H2O
SPE-Washes 1/ 0.5mL 50% MeOH in H2O
2/ Dry for 5 minutes
Elution 0.5 mL 50:50:5
(EtAc:MeOH:NH3OH)
Las muestras se evaporaron hasta los ~200 μL y se añadieron
100 μL de HCl 0.2% en MeOH. Luego se evaporaron a sequedad y
se reconstituyeron en 100 μL de Ácido Fórmico 0.01%
Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de orina;
utilizando al menos 10,000 units/ml) 60°C durante 2 horas [β-glucuronidase usada (≥100,000 units/ml)]
Estudio de recuperación. SPE de Sedantes en
Orina (n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-SPE urine 7-aminoclonazepam 3.532 102.6 101.2 2315.0 7.8 83 post-SPE urine 7-aminoclonazepam 3.532 94.8 94.9 1263.3 3.5 pre-SPE urine 7-aminoflunitrazepam 3.963 91.3 93.5 4966.6 4.4 85 post-SPE urine 7-aminoflunitrazepam 3.972 87.1 86.3 3151.3 2.4 pre-SPE urine zolpidem 4.316 100.6 99.8 11946.8 3.8 89 post-SPE urine zolpidem 4.316 93.4 93.9 7135.0 2.0 pre-SPE urine Flurazepam 4.675 92.6 91.1 4637.8 2.6 91 post-SPE urine Flurazepam 4.675 91.6 88.9 5538.6 2.8 pre-SPE urine Nitrazepam 4.814 99.5 91.0 334.3 7.3 86 post-SPE urine Nitrazepam 4.814 84.8 86.1 121.0 2.3 pre-SPE urine Clonazepam 4.819 109.0 101.8 220.3 6.8 89 post-SPE urine Clonazepam 4.819 103.1 95.6 174.5 4.8 pre-SPE urine Flunitrazepam 4.870 99.8 99.6 24.8 0.2 91 post-SPE urine Flunitrazepam 4.879 101.3 96.9 231.9 1.7 pre-SPE urine alpha-Hydroxytriazolam 4.883 99.7 92.0 91.5 8.9 99 post-SPE urine alpha-Hydroxytriazolam 4.891 87.3 82.6 71.4 6.9 pre-SPE urine alpha-Hydroxyalprazolam 4.927 95.3 95.9 16.9 0.6 93 post-SPE urine alpha-Hydroxyalprazolam 4.936 91.0 90.6 136.9 4.9 pre-SPE urine oxazepam 4.964 101.0 93.6 227.6 7.0 72 post-SPE urine oxazepam 4.972 120.0 115.5 132.1 2.9 pre-SPE urine lorazepam 4.961 96.2 94.7 55.5 2.0 79 post-SPE urine lorazepam 4.969 109.4 106.4 345.7 9.7 pre-SPE urine 2-OH-ethylflurazepam 4.976 102.0 96.9 171.1 3.3 91 post-SPE urine 2-OH-ethylflurazepam 4.985 83.1 86.1 212.1 3.8 pre-SPE urine Triazolam 5.017 96.9 93.6 326.7 2.1 91 post-SPE urine Triazolam 5.034 82.0 83.7 523.4 3.1 pre-SPE urine desalkylflurazepam 5.031 104.2 102.2 99.2 1.7 92 post-SPE urine desalkylflurazepam 5.039 101.5 97.8 110.0 1.7
Estudio de recuperación. SPE de Sedantes en
Orina (n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
(Continuación)
Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-SPE urine alpha-hydroxymidazolam 5.051 106.0 98.5 753.7 6.8 90 post-SPE urine alpha-hydroxymidazolam 5.051 89.3 88.8 56.2 0.5 pre-SPE urine Alprazolam 5.046 101.3 96.1 1628.1 5.2 92 post-SPE urine Alprazolam 5.046 98.6 92.9 274.5 0.8 pre-SPE urine Temazepam 5.055 111.6 105.8 1394.8 5.7 87 post-SPE urine Temazepam 5.055 110.4 107.9 841.6 3.0 pre-SPE urine Chlordiazepoxide 5.072 99.0 94.0 625.3 4.4 91 post-SPE urine Chlordiazepoxide 5.072 85.3 85.5 279.5 1.8 pre-SPE urine Midazolam 5.136 97.7 97.1 628.3 1.3 91 post-SPE urine Midazolam 5.144 90.1 89.6 313.2 0.6 pre-SPE urine Nordiazepam 5.115 101.4 98.7 475.9 5.6 79 post-SPE urine Nordiazepam 5.115 100.6 103.8 303.4 2.9 pre-SPE urine diazepam 5.190 96.2 96.6 1290.1 3.0 89 post-SPE urine diazepam 5.190 89.1 90.9 996.1 2.0
Sólo Oxazepam, Lorazepam y nordiazepam > 20% desviación respecto al 100%
Estudio de recuperación. SPE de Estimulantes en
Orina (n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-SPE urine d-Amphetamine 2.321 92.9 102.1 11315.7 18.0 119 post-SPE urine d-Amphetamine 2.321 96.4 96.4 26323.1 50.0 pre-SPE urine MDA 2.428 102.5 102.8 2568.7 4.0 79 post-SPE urine MDA 2.436 94.0 94.9 1458.5 1.8 pre-SPE urine methamphetamine 2.471 72.4 95.3 38330.9 29.0 187 post-SPE urine methamphetamine 2.471 81.1 37.3 73539.3 104.2 pre-SPE urine MDMA 2.526 97.7 97.6 13062.8 9.8 83 post-SPE urine MDMA 2.526 88.2 86.9 9206.6 5.8 pre-SPE urine m-hydroxybenzoylecgonine 2.522 113.0 102.7 4451.0 16.2 56 post-SPE urine m-hydroxybenzoylecgonine 2.522 123.0 127.8 3370.2 6.8 pre-SPE urine MDEA 2.869 93.7 98.6 26486.8 13.9 85 post-SPE urine MDEA 2.869 89.7 86.1 16577.3 7.4 pre-SPE urine phentermine 3.021 102.7 101.1 14665.2 21.2 145 post-SPE urine phentermine 3.021 93.4 93.9 28921.1 60.5 pre-SPE urine Benzoylecgonine 3.115 97.8 96.6 14245.2 8.9 74 post-SPE urine Benzoylecgonine 3.115 88.7 89.5 9569.7 4.4 pre-SPE urine zopiclone 3.504 99.8 98.0 5875.5 13.1 87 post-SPE urine zopiclone 3.496 88.4 90.5 1019.6 2.0 pre-SPE urine Cocaine 3.564 94.1 93.9 6839.4 2.3 89 post-SPE urine Cocaine 3.564 88.8 89.9 5901.3 1.8 pre-SPE urine Methylphenidate 3.618 95.1 94.3 43990.0 15.6 91 post-SPE urine Methylphenidate 3.626 90.0 89.9 32461.5 10.4 pre-SPE urine Cocaethylene 4.063 94.3 92.7 8144.6 2.6 90 post-SPE urine Cocaethylene 4.063 86.6 86.4 4341.2 1.3 pre-SPE urine meprobamate 4.111 96.4 106.9 198.5 10.4 12 post-SPE urine meprobamate 4.119 766.6 788.7 664.9 4.0 pre-SPE urine fenfluramine 4.169 103.5 112.6 107202.8 48.6 369 post-SPE urine fenfluramine 4.177 97.9 307.4 100109.1 167.5
MDA, m-hydroxyl y benzoylecgonine, fenfluramine & meprobamate > 20% desviación
respecto al 100%
Estudio de recuperación. SPE de Opiáceos en
Orina (n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-SPE urine Morphine 0.826 101.2 99.2 932.8 19.2 86 post-SPE urine Morphine 0.826 91.5 91.7 600.2 10.7 pre-SPE urine Oxymorphone 0.889 95.3 100.0 1062.3 13.0 84 post-SPE urine Oxymorphone 0.889 97.8 94.8 762.5 7.8 pre-SPE urine Hydromorphone 0.993 96.8 95.2 2125.1 12.0 88 post-SPE urine Hydromorphone 0.993 93.7 95.1 1662.7 8.2 pre-SPE urine dihydrocodeine 1.875 105.8 105.0 377.8 7.4 90 post-SPE urine dihydrocodeine 1.875 100.8 98.7 103.8 1.8 pre-SPE urine naloxone 1.904 108.0 105.7 3226.6 8.7 86 post-SPE urine naloxone 1.912 106.7 104.2 859.7 2.0 pre-SPE urine Oxycodone 2.090 100.8 103.2 2661.3 4.4 88 post-SPE urine Oxycodone 2.090 101.5 99.7 1378.7 2.0 pre-SPE urine naltrexone 2.221 108.9 106.5 4074.9 8.2 91 post-SPE urine naltrexone 2.221 102.5 98.9 1004.9 1.8 pre-SPE urine Codeine 1.885 106.3 108.1 432.3 5.3 91 post-SPE urine Codeine 1.885 100.5 100.3 312.1 3.5 pre-SPE urine Hydrocodone 2.275 96.8 95.7 2442.4 5.6 85 post-SPE urine Hydrocodone 2.275 91.3 92.0 1341.5 2.6 pre-SPE urine 6-monoacetyl morphine 2.331 93.8 93.4 5320.1 16.7 88 post-SPE urine 6-monoacetyl morphine 2.331 90.0 90.4 2244.3 6.2 pre-SPE urine o-desmethyltramadol 2.582 95.0 79.2 14312.1 6.2 90 post-SPE urine o-desmethyltramadol 2.582 67.4 71.5 4623.2 1.8 pre-SPE urine nor-Fentanyl 3.370 101.2 100.6 5409.1 6.0 90 post-SPE urine nor-Fentanyl 3.370 94.4 93.8 2520.9 2.5 pre-SPE urine Heroin 3.530 102.3 100.8 1092.6 6.4 86 post-SPE urine Heroin 3.530 96.4 95.0 171.0 0.9 pre-SPE urine tapentadol 3.653 95.3 94.9 8595.2 3.4 89 post-SPE urine tapentadol 3.661 88.0 87.9 3577.4 1.3 pre-SPE urine N-desmethyltramadol 3.733 105.1 92.0 107.5 3.1 88 post-SPE urine N-desmethyltramadol 3.739 82.1 84.5 244.8 6.2
Estudio de recuperación. SPE de Opiáceos en
Orina (n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
(Continuación)
Group Compound RT Conc (ng/ml) Ave Conc (ng/ml) SD CV SPE % Recovery pre-SPE urine Meperidine 3.806 95.8 95.0 16106.6 18.7 99
post-SPE urine Meperidine 3.814 90.8 89.5 16999.1 19.7
pre-SPE urine Normeperidine 3.908 106.6 95.6 4350.0 4.2 87
post-SPE urine Normeperidine 3.908 86.6 89.5 1640.2 1.4
pre-SPE urine norbuprenorphine 4.353 108.7 103.3 264.6 5.0 89
post-SPE urine norbuprenorphine 4.353 99.0 100.6 173.6 2.9
pre-SPE urine Trazodone 4.478 106.9 104.8 6078.9 3.0 93
post-SPE urine Trazodone 4.478 94.4 96.9 10059.6 4.7
pre-SPE urine Fentanyl 4.480 96.3 95.1 5871.6 2.3 92
post-SPE urine Fentanyl 4.489 89.0 88.9 7241.8 2.7
pre-SPE urine EDDP 4.624 97.3 96.0 56239.5 29.0 98
post-SPE urine EDDP 4.624 88.7 88.3 47811.5 24.1
pre-SPE urine Propoxyphene 4.926 95.9 95.6 7883.8 10.7 90
post-SPE urine Propoxyphene 4.934 91.8 90.5 3998.0 4.9
pre-SPE urine norpropoxyphene 4.943 100.7 91.9 27.7 9.9 46
post-SPE urine norpropoxyphene 4.960 156.4 165.8 76.0 12.5
pre-SPE urine Methadone 4.979 94.3 94.0 5256.2 9.8 85
post-SPE urine Methadone 4.987 88.5 88.4 4579.0 7.3
pre-SPE urine Buprenorphine 5.116 95.9 92.0 392.1 3.2 87
post-SPE urine Buprenorphine 5.116 85.5 91.0 351.6 2.5
Norpropoxyphene > 50% desviación respecto al 100%
Estudio de recuperación. SPE de Otros en Orina
(n=3) (Concentración – 100 ng/ml)
Group Compound RT Conc (ng/ml)
Ave Conc (ng/ml)
Analyte Area Average SD CV
SPE % Recovery
pre-SPE urine ritalininc acid 3.094 90.5 67.4 28871.0 25225.0 3299.1 13.1 62 post-SPE urine ritalininc acid 3.094 78.2 91.0 38710.0 40514.3 1835.2 4.5 pre-SPE urine PCP 4.327 98.9 99.1 88003.0 149632.7 53840.7 36.0 163 post-SPE urine PCP 4.327 90.4 91.0 163315.0 91753.3 63149.9 68.8 pre-SPE urine Verapamil 4.824 92.9 86.2 33622.0 35222.7 1605.5 4.6 87 post-SPE urine Verapamil 4.824 81.5 83.7 40318.0 40451.0 1732.3 4.3 pre-SPE urine carisoprodol 4.949 92.5 91.3 18942.0 17446.7 1394.8 8.0 78 post-SPE urine carisoprodol 4.949 82.6 84.6 22199.0 22476.3 498.7 2.2
Ritalinic acid, PCP & carisoprodol > 20% desviación respecto al 100%
Preparación de Muestra – Diluir e Inyectar
Paso 2:
Sample Dilution in Water 1/10
Sample Pre-treatment 3K filtration @ 12,000 RPM
Centrifuge spin filter
Conditioning Decant Supernatant into
sampling well or vial.
Paso 1: 1ml orina + 100ul de β-glucuronidasa (requiere 6,200 units/ml de
orina;
utilizando al menos 10,000 units/ml) 60°C durante 2 horas [β-glucuronidase usada (≥100,000 units/ml)]
ó
1ml orine + 100ul de HCl 5M, 60°C durante 1 hora
Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE
Compuesto
D/Shoot LLOQ
(ng/ml)
SPE LLOQ
(ng/ml) ULOQ
(ng/ml)
6-monoacetyl morphine 10 <1 1000
buprenorphine 10 1 1000
codeine 25 <1 1000
dihydrododeine 25 <1 1000
EDDP 10 <1 1000
fentanyl 1 <1 1000
heroin 10 <1 1000
hydrocodone 10 <1 1000
hydromorphone 5 <1 1000
meperidine 5 <1 1000
methadone 10 <1 1000
morphine 5 <1 1000
naloxone 5 <1 1000
naltrexone 10 <1 1000
N-desmethyltramadol 10 1 1000
norbuprenorphine 25 3 1000
norfentanyl 1 <1 1000
normeperidine 5 <1 1000
norpropoxyphene 5 <1 1000
o-desmethyltramadol 5 <1 1000
oxycodone 10 <1 1000
oxymorphone 5 <1 1000
propoxyphene 5 <1 1000
tapentadol 5 <1 1000
tramadol 1 <1 1000
trazodone 1 <1 1000
Compuesto
D/Shoot LLOQ
(ng/ml)
SPE LLOQ
(ng/ml) ULOQ
(ng/ml)
2-OH-ethylflurazepam 200 5 1000
7-aminoclonazepam 10 <1 1000
7-aminoflunitrazepam 5 <1 1000
alpha-OH-midazolam 10 <1 1000
alprazolam 10 <1 1000
a-OH-alprazolam 20 <1 1000
a-OH-triazolam 50 <1 1000
chlordiazepoxide 10 <1 1000
clonazepam 25 to 50 <1 1000
desalkylflurazepam 20 1 1000
diazepam 10 <1 1000
flunitrazepam 10 1 500
flurazepam 5 1 1000
lorazepam 50 20 1000
midazolam 10 <1 1000
nitrazepam 25 5 1000
nordiazepam 25 <1 1000
oxazepam 50 25 1000
temazepam 25 <1 1000
triazolam 5 <1 1000
zolpidem 5 <1 1000
Op
iác
eo
s
Sed
an
tes
Resultados de Sensibilidad 6420 QQQ
Diluir/Inyectar (dil. 1/10) versus SPE (continuación)
Estimulantes Otros
Compound
D/Shoot LLOQ
(ng/ml)
SPE LLOQ
(ng/ml) ULOQ
amphetamine 5 <1 1000
benzoylecgonine 5 <1 1000
cocaethylene 5 <1 1000
cocaine 5 <1 1000
fenfluramine 1 <1 1000
MDA 5 <1 1000
MDEA 1 <1 1000
MDMA 5 <1 1000
meprobamate 10 5 1000
methamphetamine 1 <1 1000
methylphenidate 5 <1 1000
m-hydroxybenzoylecgonine 10 <1 1000
phentermine 1 <1 1000
zopiclone 5 <1 1000
Compound
D/Shoot LLOQ
(ng/ml)
SPE LLOQ
(ng/ml) ULOQ
11-nor-9-carboxy-THC - 25 -
carisoprodol 5 1 1000
PCP 1 <1 1000
ritalinic acid 5 1 1000
verapamil 2 <1 1000
Rendimiento de la Poroshell 120
después de 3000 inyecciones (Dil e Iny)
Analito %RSD
(RT)
Analito
%RSD
(RT)
Analito %RSD
(RT)
Morphine 0.7 Meperidine 0.4 Triazolam 0
Codeine 0.4 zolpidem 0.3 Naltrexone 0.1
hydrocodone 0.4 Fentanyl 0.1 chlordiazepoxide 0.1
MDMA 0.3 EDDP 0.1 Desmethyl
diazepam
0.1
norFentanyl 0.2 Nitrazepam 0.1 Buprenorphine 0.3
Heroin 0.2 Propoxephine 0.1 Cocaethylene 0.2
Methyl
Phenidate
0.2 Buprenorphine 0.3 11-nor-9-carboxy-
delta9-thc
0
Muestra de algunos de los analitos en el análisis de 6 min.
Estado de la fuente Ortogonal ESI después de 3000
inyecciones (Dil e Iny) (3.5 semanas consecutivas)
Nebulizador
Spray Shield/Entrada MS/Capilar
Compounds at a Glance – Panel de revisión
mostrando 8ng/ml de cada analito en Orina.
Ejemplos de Calibración en Orina 0.5ng/ml1000ng/ml
Carisoprodol
Fenfluramine Propoxyphene
EDDP
R2=0.99602 R2=0.99934
R2=0.99852 R2=0.99651
Exhaustivo Estimulantes
Sedantes Otros
Opiáceos
Análisis ¿Exhaustivo o Personalizado?
Agilent ha desarrollado un
nuevo LC Triple Quad cada
año desde 2007
6460
Triple
Quad
6430
Triple
Quad
6420
Triple
Quad
6490
Triple
Quad
6460
Triple
Quad
Ren
dim
ien
to
La última tecnología en LC Triple Quads
6420
Easy Choice – Rango medio
Análisis de trazas en
rutina
6430
6460
Cuantificación Rutinaria
Tecnología
iFunnel
Análisis de Ultra-
trazas y alta
velocidad
6490
N U E V O 6 4 9 0 L C / M S T R I P L E C U A D R U P O L O
¡Sensibilidad a niveles de Zeptomol!
Prestaciones máximas en un tamaño más reducido
iFunnel Technology • Un nuevo paradigma en el muestreo de iones a presión atmosférica
• 10X sensitivity en ESI
• Mejora de la robustez de los ensayos y simplifica la
preparación de muestra
Celda de colisión curvada
• Transmisión muy eficiente; ruido minimizado
• Diseño compacto
Nuevas posibilidades en scan
• Aislamiento del ion precursor a 0.4 m/z precursor,
que reduce interferencias
• Dynamic MRM (DMRM)
• Triggered MRM (tMRM)
¿Qué es un Zeptomol?
Page
55
¿¿¿¿ Zepto ??? FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR
LA UNIDAD MULTIPLO PREFIJO
ABREVIATU
RA
0,1 mol 10-1 mol decimol dM
0,01 mol 10-2 mol centimol cM
0,0001 mol 10-3 mol milimol mM
0,0000001 mol 10-6 mol micromol μM
0,0000000001 mol 10-9 mol nanomol nM
0,0000000000001 mol 10-12 mol picomol pM
0,0000000000000001 mol 10-15 mol femtomol fM
0,0000000000000000001 mol 10-18 mol atomol aM
0,0000000000000000000001 mol 10-21 mol zeptomol zM
0,0000000000000000000000001 mol 10-24 mol yoctomol yM
602 moleculas
< 1molécula
C U A N T I F I C A C I Ó N - S E N S I B I L I D A D
“…sólamente somos capaces de detectar
1 de cada 103 a 105 iones
generados por electrospray (ESI) a presión
atmosférica con los diseños instrumentales
actuales.”
(Page, Smith, et al; JASMS, 2007, 18, 1582-1590)
iFunnel Technology Captura x10 veces más Iones
Página
57
Hexabore Capillary
• Capilar con 6 entradas.
• Muestrea x10 más gas
rico en iones de la fuente.
• Captura la mayor parte del
gas de la región de la
fuente.
Agilent Jet Stream
• Confinamiento térmico
de la pluma de ESI.
• Muy eficiente
desolvatación para crear
iones en fase gaseosa.
• Crea una zona rica en
iones.
Dual Ion Funnel
• Elimina el gas, pero
captura los iones
• Elimina el ruido de
neutros
• Prolonga la vida útil de
la bomba turbo
4-26m
Ion Funnel de 2 Etapas Desalineadas
1ª Etapa: 8-12 Torr 2ª Etapa: 1-3 Torr
• Elimina una elevada carga de gas
• Reduce neutros
• Mejora la robustez
• Transmite iones muy
eficientemente hacia óptica de Q1
2 etapas desalineadas -----: favorece la transmisión de sólo iones
Página
58
Innovaciones Instrumentales Triple Cuadrupolos
LC/MS: 6460 vs 6490
6460 LC/MS (Skimmer Configuration)
6490 LC/MS (iFunnel Configuration)
HB Cap Dual Ion Guía de Q1
Funnel Iones
por RF
Curved Collision cell
Q3
Ion Detector
Ion Detector
Cap Guía de Q1 Celda Q3
Iones Colisión
por RF
AJS
AJS
con
Aceleración
Lineal
Axial
con
Aceleración
Lineal
Axial
Skimmer
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6460 LC/MS (Skimmer Configuration)
6490 LC/MS (iFunnel Configuration)
HB Cap Dual Ion Guía de Q1
Funnel Iones
por RF
Curved Collision cell
Q3
Ion Detector
Ion Detector
Cap Guía de Q1 Celda Q3
Iones Colisión
por RF
AJS
AJS
con
Aceleración
Lineal
Axial
con
Aceleración
Lineal
Axial
Skimmer
Página 60
Innovaciones Instrumentales Triple Cuadrupolos
LC/MS: 6460 vs 6490
Nueva celda de colisión Curvada, Cerrada y
Convergente con Aceleración Lineal Axial Efficient Ion
Transmission over wide mass range. Reduces transmission of ionized generated noise
Mayor Apertura
(5 mm) de
Entrada Accepta más
Iones
Menor Apertura
(3.5mm) de
Salida Focaliza
mejor los Ionss dentro
de MS2
RF & DC
Voltages Set
Confinement and
Axial Acceleration:
SIN efecto “Cross Talk”
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Frecuencia Electrónica Cuadrupolo 6490: 1.4 MHz
• Una frecuencia más alta
produce más ciclos de
movimiento de iones en el
cuadrupolo
• Más ciclos de movimiento de
iones dan una mayor resolución
de masas – el 6490 se puede
sintonizar automáticamente
desde 0,4 m / z
• Una frecuencia más alta unidad
reduce rango de masas hasta
1400 m / z
Página 62
Análisis Cuantitativo de THC, 6-MAM, Morfina,
Fenobarbital, nor- y buprenorfina
Agilent 6490 QQQ LC/MS
acoplado a un 1290 Infinity
UHPLC
Objetivo
Demostrar el alto rendimiento del QQQ Agilent 6490 para el
análisis de varios compuestos de interesante desafío por su
baja respuesta.
(THC, 6-MAM, Morfina, Fenobarbital, Nor- y Buprenorfina)
Específicamente en lo referido a :
Sensibilidad MRM
Especificidad
Reproducibilidad
Analitos
buprenorfina
C29H41NO4
467.64
THC
C21H30O2
314.45
norbuprenorfina
C25H35NO4
413.55
6-acetyl morfina
C19H21NO4
327.374
morfina
C17H19NO3
285.34
Información y preparación de muestra
• Se dispone de patrones nuevos para cada uno de los siguientes analitos
así como de sus respectivos patrones internos de marcaje isotópico :
• delta-9-tetrahidrocanabinol
• morfina
• 6-acetilmorfina
• buprenorfina
• norbuprenorfina
• Reconstitución :
• ISTDs preparados a una concentración fija de 50ng/ml
• Todos los patrones se diluyeron en saliva sintética e inyectados
directamente en columna.
Método: 1290 Infinity UHPLC (THC, 6-MAM, Morfina, Fenobarbital, Nor- y Buprenorfina)
UHPLC Agilent 1290 Infinity
Bomba Binaria, Automuestreador de pocillos, compartimento de columna
termostatizado, 1200 binary pump
Columna: Zorbax poroshell SB C18, 2.1x100 mm, 2.7 um
Temp. Columna: 55 ºC
Volumen Inyección : 10 L
Temp. Automuestr. : 5 ºC
Limpieza de aguja : flushport (MeOH:H2O 75:25), 5 seconds
Fae Mobil: A = Formiato Amónico 5mM, 0.1% Ácido Fórmico en Agua
B = Metanol
Flujo: 0.5 mL/min
Gradiente: Tiempo (min) %B
0.0 10
0.5 15
3.0 50
4.0 95
Stop time: 6.0 min
Post time: 2.0 min
Métod0: 6490 MS MS: Agilent 6490 triple cuadrupolo LC/MS/MS
QQQ MS Conditions
Fuente Jet Stream, positive
Source conditions:
Gas temperature 250 ºC
Drying gas (nitrogen) 14 L/min
Nebulizer gas (nitrogen) 45 psi
Sheath gas temperature 380 ºC
Sheath gas flow (nitrogen) 11 L/min
Capillary voltage 3000 V
Nozzle voltage 0 V
Fragmentor 380 V
MRM acquisition:
Delta EMV 000V
Frag (V) CE (V) Cell Acc (V) Polarity
380 45 5 Positive
380 41 7 Positive
380 40 5 Positive
380 41 7 Positive
380 24 5 Positive
380 41 7 Positive
380 20 5 Positive
380 20 5 Positive
380 24 5 Positive
380 41 7 Positive25Morphine No 286.2 Widest / Wide
(6490)
165.1 Wide / Unit (6490)
25
morphine d3 No 289.17 Widest / Wide
(6490)
201 Wide / Unit (6490) 25
delta9-THC No 315.23 Widest / Wide
(6490)
193.1 Wide / Unit (6490)
25
delta9-THC d3 No 318.2 Widest / Wide
(6490)
196.1 Wide / Unit (6490) 25
6-monoacetyl
morphine
No 328.2 Widest / Wide
(6490)
165.1 Wide / Unit (6490)
25
6-acetyl morphine
d6
No 334.19 Widest / Wide
(6490)
211.1 Wide / Unit (6490) 25
norbuprenorphine No 414.3 Widest / Wide
(6490)
101.1 Wide / Unit (6490)
25
nor-buprenorphine
d3
No 417.29 Widest / Wide
(6490)
101.1 Wide / Unit (6490) 25
Buprenorphine No 468.3 Widest / Wide
(6490)
396.2 Wide / Unit (6490)
MS2 Res Dwell
buprenorphine d4 No 472.34 Widest / Wide
(6490)
88 Wide / Unit (6490) 25
Cpd Name ISTD? Prec Ion MS1 Res Prod Ion
Cromatografía (5ng/ml en saliva)
6-MAM
norbuprenorphine
morphine buprenorphine
THC
LOQ Morfina – 50pg/ml (50 ppt)
Morfina. Recta de calibrado : 0.01-1000 ng/mL
(n=3)
R2>0.996
LOQ 6-acetilmorfina – 50pg/ml (50ppt)
6-acetilmorfina. Recta de calibrado : 0.01-1000 ng/mL
(n=3)
R2>0.998
LOQ Norbuprenorfina – 500pg/ml (500ppt)
Norbuprenorfina. Recta de calibrado : 0.5-1000 ng/mL
(n=3)
75 For Research Use
Only.
R2>0.989
LOQ Buprenorfina – 500pg/ml (500ppt)
Buprenorfina. Recta de calibrado : 0.5-1000 ng/mL (n=3)
R2>0.992
LOQ Delta9-THC – 500pg/ml (500 ppt)
Resumen de los LOQ con 6490 QQQ (Inyección directa de saliva sintética)
Analito LOQ
(S/N>10)
Linearidad %RSD
Promedio
Morfina 50pg/ml R2>0.996 6
6-MAM 50pg/ml R2>0.998 5
norbuprenorfina 500pg/ml R2>0.989 7
buprenorfina 500pg/ml R2>0.992 5
Delta9-THC 500pg/ml R2>0.916 24
Resumen y conclusiones
•El poder del método exhaustivo está basado en una buena separación cromatográfica.
•El rango lineal típico de los analitos viene a ser de 1 a 1000 ng/ml (0.01 a 1000 para 6490)
•La funcionalidad Dynamic MRM, la Optimización Automática, y la base de datos de transiciones MRM ayudan a un desarrollo del método más directo y rápido.
•Se han comparado las técnicas de preparación de muestra SPE y “Diluir e inyectar”
•La sensibilidad del método por técnicas de SPE es claramente superior a técnicas de “Diluir e inyectar”, PERO son más caras y toman más tiempo.
Agradecimientos
Kevin McCann & Peter Stone
LC/MS Application Champions
Agilent Technologies Inc,
Santa Clara, California.
C L E A R LY B E T T E R M S S O L U T I O N S
Mass Spectrometry
Technology
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Jaume C. Morales
Especialista de Producto MS
Agilent Technologies Spain
901.11.68.90
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