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AFLATOXINA M1 en leches:Metodología innovadora por LC-MS/MSProblemática legal
Madrid 17 de Enero de 2014
D. Luis Mª Gallego Brogeras
Director General Grupo Analiza Calidad
Seminario Madrid Salud.
Laboratorio Municipal de Higiene
GRUPO ANALIZA CALIDAD
HIDROMANTE
calidad
Laboratorio Consultoría – Certificación -- Formación
MADRID
BARCELONA
VALLADOLID
6 laboratorios en los que forman parte más de 60 personas.
2 laboratorios, acreditados por ISO 17025 por ENAC:
- Analiza Burgos, certificado 552/LE1333 en alimentos, piensos,
materias primas y, certificado 552/LE1225 en aguas (potables,
residuales…)
- Analiza Madrid, certificado 1013/LE1770 en alimentos, piensos y
materias primas. Official Analyst to GAFTA.
www.analizacalidad.com
www.auditarcalidadconsultores.es
www.garantizasl.com
www.aklabs.es
www.sanilabcalidad.es
AKLABS
ANÁLISIS Y SERVICIOSLaboratorio
- Alimentos, Aguas potables y residuales, piensos y materias primas
• Microbiología Tradicional
PCR/ TR
• Físico-Químico: Nutricional, Instrumental, Aditivos alimentarios, Vitaminas….
• Sensorial: panales de cata, test de consumidores…
• Alérgenos: Gluten, Leche (b-Lactoglobulina), Leche (Caseína), Crustáceos,
Soja, Huevo (Lactoalbúmina), Mostaza, Apio, Trigo, Nuez, Cebada…
• Contaminantes: Micotoxinas, Metales pesados, Plaguicidas, Residuos
veterinarios, Hidrocarburos, PHA´S, VOC´S, BTEX´S…..
- Equipamiento
F-AAS, ET-AAS, HG-AAS, TOC, GC (FID), GC (ECD), GC (MS/MS), HPLC (IR),
HPLC (UV-DAD), HPLC (DAD), HPLC (FLD), LC (MS/MS), FTIR, PCR (T),
PCR(TR), ELISA, Alveógrafo de Chopin, Reofermentógrafo de Chopin…
Calidad y Seguridad Alimentaria
Productos Farmacéuticos
Medio Ambiente
Consultoría, Certificación y Formación
ANÁLISIS Y SERVICIOS
- Implantación de APPCC, Auditorías higiénico sanitarias de establecimientos
de alimentación.
- Normas de Calidad ISO 9001, ISO 14000, ISO 17025 e ISO 22000,
calibración de equipos.
- Normas de Seguridad Alimentaria IFS, BRC, Food defense.
- Cursos de Manipulación de Higiene (manipuladores de alimentos específicos
para cada industria), de Calidad…
- Plataforma de formación online: www.auditarcalidadconsultores.com
- Certificación de producto agroalimentario (Etiquetado Facultativo de Vacuno,
ETG Jamón Serrano, Certificación de Ibérico, Marcas de Garantía, ETG´s,
DOP´s, etc.)
- Máster en Análisis de alimentos, piensos, aguas, suelos, lodos y productos
farmacéuticos.
- Máster en Calidad y Seguridad Alimentaria.
- Cursos Homologados por la Junta de Castilla y León, para Biocidas,
Legionella, Fitosanitarios de uso agrícola.
PROGRAMA DE LA PONENCIA
1.1. DEFINICIÓN DE MICOTOXINAS
(Géneros , y ).
Afectan especialmente a los productos agrícolas:
Cereales (trigo, maíz, centeno, etc.)
Frutas (manzanas, uvas)
Frutos secos (cacahuetes, pistachos, etc.)
Los mamíferos productores de leche metabolizan las micotoxinas y una
parte de ellas se excretan junto con la leche, contaminándola.
1. 2. EFECTOS
Cambios en la del producto
Cambios
Cambios en las
Cambios en las
Presentan , tanto para animales como para humanos
Son considerados los .
1.3. AFLATOXINAS
Producidas por hongos del género
En solamente está legislada la
En
- (Carcinógeno más potente de origen natural que existe)
-
-
Carcinógenas
Hepatotóxicas
Nefrotóxicas
Mutagénicas (Sobre todo B1)
Pueden producir sobre todo en animales
Se descubre en los años 60: Turkey X Disease.
Clasificada en el (evidencias
probadas de que produce cáncer en humanos).
AFLATOXINA B1 M1
Hidroxilación
Aflatoxina B1 Aflatoxina M1
B1, B2, G1, G2, M1, M2
Aflatoxina B1, la más común, tóxica y cancerígena
(Deng et al., 2010)
Grupo 1 IARC
Aflatoxina M1: metabolito hidroxilado de aflatoxina B1, secretada por mamíferos que
consumen alimentos contaminados con aflatoxina B1
Grupo 2B IARC
2. LEGISLACIÓN
2.1. ALIMENTACIÓN ANIMAL
• Real Decreto nº 465/2003, sobre sustancias indeseables en la alimentación animal, regula las sustanciasindeseables en los productos destinados a la alimentación animal y los niveles máximos tolerados desustancias indeseables en aquéllos, a fin de proteger la salud humana, la sanidad animal y el medioambiente.Regula únicamente el contenido de Aflatoxina B1.
• Reglamento CE nº 691/2013, establece los métodos de muestreo y análisis para el control oficial depiensos.
Sustancias indeseables Productos para alimentación animal Contenido máx. en mg/kg(ppm) en piensos y humedad del 12%
Aflatoxina B1 Todas las materias primas para la alimentación animal 0.02
Aflatoxina B1 Piensos completos para bovinos, ovinos y caprinos, excepto: 0.02
Aflatoxina B1 Piensos completos para ganado lechero 0.005
Aflatoxina B1 Piensos completos para terneros y corderos 0.01
Aflatoxina B1 Piensos completos para cerdos y aves de corral (excepto animales jóvenes)
0.02
Aflatoxina B1 Otros piensos completos 0.01
• Reglamento 1881/2006 por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los
productos alimenticios.
Productos alimenticios Contenidos máximos (μg/kg)
Leche cruda, leche tratada térmicamente y lechepara la fabricación de productos lácteos
0,050
Preparados para lactantes y preparados decontinuación, incluidas la leche para lactantes y la
leche de continuación
0,025
Alimentos dietéticos destinados a usos médicosEspeciales dirigidos específicamente a los
lactantes
0,025
2.2. ALIMENTACIÓN HUMANA
Aflatoxina M1
2.3. VARIACIÓN DURANTE EL PROCESO PRODUCTIVO
MateriasPrimas
IndustriaTransformación
Producto final
Límite máximo Límite máximo Considerar:- Concentraciones- Diluciones- Mezclas- Proporciones- Etc.
Límite máximo
aflatoxina B1:
5 ppb
Límite máximo
aflatoxina M1:
0,05 ppb
Tasa de transferencia
AFB1 AFM1
1 – 6 %
Pienso contaminado con 5 ppbConsumo de 30 kg pienso diarios
Producción de 20 litros de leche/ díaLeche contaminada con 0,094 ppb AFM1
conversión
2,2%
2.3. TASA DE TRANSFERENCIA B1M1
2.4. LEGISLACIÓN USA Vs LEGISLACIÓN UE
USA: 0,5 PPB(USA, Australia y países de
MERCOSUR)
Basado en la TDI (ingesta máxima tolerable diaria)
AFLATOXINA M1 EN LECHE
UE: 0,05 PPB
Basado en el criterio ALARA (as low as reasonable achievable) y en los resultados analíticos obtenidos en 10778 muestras (valor medio de 0,023 ppb)
La Aflatoxina M1 es posiblemente carcinógena. Dado que no hay un nivel mínimo a partir del cual se garantice que un carcinógeno no produce tumores, la UE se mantiene firme en el criterio ALARA.
2.5. AFLATOXINA M1 EN PRODUCTOS LÁCTEOS
UE, USA: No hay legislación al respecto.
Queso (Holanda): 0,2 ppbQueso (Austria): 0,25 ppbMantequilla (Holanda y Austria): 0,2 ppb
La AFM1 se asocia muy bien con la caseína.Por eso, en la elaboración de productos lácteos, AFM1 se distribuye así:- 40% - 60% al queso- 10% a la nata- >2% a la mantequilla
5. TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL 5.1. Toma de muestras
El 88% de los errores en el análisis de micotoxinas tienen que ver con un inadecuado muestreo (muestra no representativa)
Legislación aplicable:
, establece los métodos de y
para el control oficial de piensos. (Actualización Reglamento CE nº 691/2013)
por el que se establecen los métodos de
y de para el control oficial del contenido de
micotoxinas en los productos alimenticios.
5.2. TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROLTÉCNICAS DE INMUNOENSAYO: MÉTODO ELISA
Sencillez en la preparación de muestrasEquipos de fácil manejoBajo coste y mantenimientoCaducidad kitsReacciones cruzadas
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL ENZIMOINMUNOENSAYOS - FLUJO LATERAL
Permite el flujo de la muestra por capilaridad a lo largo de una membrana de nitrocelulosaSe utiliza un anticuerpo marcado para producir la señal analítica
Cuando la muestra es introducida en la tira va migrando a la membrana de nitrocelulosa, que tiene una zona de ensayo y una zona control
Rápido: resultados en 15 minutos.Sencillo: ensayo cuantitativo empleando lector.Flexible: amplio rango de medida.Fiable: buena correlación con ELISA y HPLC.
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL ENZIMOINMUNOENSAYOS - FORMATO TARJETA
Rápido: resultados en 15 minutos.
Sencillo: prueba cualitativa de interpretación visual de resultados.
Flexible: diferentes límites en diversas matrices ( 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20 y 30 ppb)
Fiable: buena correlación de resultados con HPLC.
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL TÉCNICAS CROMATOGRÁFICASCROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)
Son económicas y rápidas, sobre todo cuando hay que analizar muchas muestras.
Se pueden analizar simultáneamente varias micotoxinas en más de una muestra.
El intentar aplicar la multidetección para una gran variedad de productos, también
conduce a problemas de purificación.
Todo esto se puede mejorar si aplicamos el estudio de la limpieza del extracto, a productos concretos y a micotoxinas concretas (análisis individual).
Técnica en la que se basan gran parte de los kits de detección rápida de micotoxinas
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL CROMATOGRAFÍA DE GASES
Adecuada para el análisis de tricotecenos (DON,Toxinas T2 y HT2….)
No son rápidas y son caras pero permiten la determinación simultánea de un buen grupo de
micotoxinas tricotecenos.
Técnica muy selectiva.
Necesita derivatización antes de la cromatografía de gases pero es bastante específica.
Las límites de cuantificación son bastante bajos.
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Una de las técnicas más utilizadas por los laboratorios analíticos por su elevada sensibilidad y especificidad.
Alcanza muy bajos límites de cuantificación.
Requiere una etapa previa de limpieza o clean-up.
En ocasiones requiere una derivatizaciónmuy específica
No permite análisis multitoxina
TÉCNICAS ANALÍTICAS DE CONTROL CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (LC-MS/MS)
Para medir un amplio número de analitos.
Permite el análisis multitoxina.
Confirmación inequívoca de la identidad del analito.
Preparación de la muestra de forma simple, sin necesidad
de una derivatización química.
Equipo de alto coste que requiere un adecuado
mantenimiento.
Requiere personal altamente cualificado para su manejo.
Efecto Matriz
Se ha descrito y validado un método de cromatografía
líquida/espectrometría de masas en tándem para 39 micotoxinas en
trigo y maíz: tricotecenos de grupo A y B y sus metabolitos,
zearalenona y sus derivados, fumonisinas, eniantinas, alcaloides del
ergot, ocratoxinas, aflatoxinas.
5.3. ¿CÓMO REDUCIR EL EFECTO MATRIZ?
Para reducir el efecto matriz se usan diferentes estrategias
Dilución de la muestra. Se diluye el efecto matriz, pero también el analito.
Calibración en matriz. Es tedioso y las diferencias con la matriz no se compensan del todo. Es difícil encontrar algunos blancos de matriz en el mercado.
Adición estándar a cada muestra. Se usa en métodos de rutina de multitud de laboratorios, pero encarece mucho el análisis.
Calibración interna. Se compensa el efecto matriz. el patrón interno debe ser lo más parecido estructuralmente al analito de interés
Lo ideal sería usar calibración interna con patrones marcados isotópicamente: Método SIDA (Stable Isotope Dilution Assay)
ENSAYO POR DILUCIÓN ISOTÓPICA (SIDA)
Adición de Patrón marcado a cada una de las muestras
Contempla todas las micotoxinas reguladas en alimentación sólida
Las pérdidas de analito en la extracción, quedan compensadas de forma reproducible
Sencilla y fácil de llevar acabo
No requiere limpieza de muestra
Representa mayores costes a corto plazo
Aplicable al análisis de Aflatoxina M1 [13C17]-Aflatoxina M1
APLICACIÓN DEL ENSAYO POR DILUCIÓN ISOTÓPICA A LA
DETERMINACIÓN DE AFLATOXINA M1 EN LECHE POR LCMS
Agilent 6460 Triple Quad LC/MS
Calentar la muestra y centrifugar (desgrasado)
Añadir extractante (Acetonitrilo/agua/ácido)Agitar en agitador orbital
Tomar una alícuota del sobrenadante y Microcentrifugar
a 15000 rpmAñadir patrón marcado
a las muestras patrones y QCs
Análisis LC-MS/MS
CONCLUSIONES
Los límites máximos permitidos de Aflatoxina M1 varían mucho entre un país y otro. El marcado por la Unión Europea es de los más estrictos.
La legislación en cuanto a contenido de Aflatoxina M1 en productos lácteos es prácticamente inexistente.
Las técnicas analíticas de inmunoensayo presentan reacciones cruzadas que pueden dar lugar a resultados erráticos.
Las técnicas cromatográficas pueden presentar efectos matriz.
El método SIDA elimina el efecto matriz y se puede aplicar con éxito a la determinación de Aflatoxina M1 en productos lácteos .
Es un método sencillo, rápido y robusto. Desarrollado y validado de acuerdo a la Decisión 2002/657/EC.
Su utilización previa al análisis por LC-MS/MS hace que se consigan límites de cuantificación incluso inferiores a los requisitos del reglamento 1881/2006/EC incluso para alimentación infantil, en previsión de límites más restrictivos en el futuro.
