8/16/2019 Análisis Molecular y Técnicas de Amplificación Molecular

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Análisis molecular y técnicas de amplificación molecular.

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa): La reacción en cadena de la polimerasa

es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia

específica de DNA durante varios ciclos repetidos. Para ello, la reacción aprovecha la

actividad de la enzima DNA-polimerasa que tiene la capacidad de sintetizar naturalmenteel DNA en las clulas. Los elementos importantes en la reacción son el templado o molde

!ADN o ADNc", la enzima, los oli#onucleótidos o primers, los deso$irri%onucleótidos

trifosfatados !dN&Ps' adenina, timina, citosina ( #uanina", el ión ma#nesio !)# *", una

solución amorti#uadora o %uffer ( a#ua. &odos estos elementos interact+an en tres etapas

principales de las que se compone la P' desnaturalización, hi%ridación ( e$tensión. Los

equipos en donde se realiza la reacción son llamados termocicladores, los cuales están

diseados para esta%lecer un sistema homo#neo en donde las condiciones de

temperatura ( tiempo necesarios no se modifiquen en cada uno de los ciclos.

Aplicaciones: se utiliza para para amplificar cantidades mu( pequeas de DNA, analizar

( amplificar DNA de mezclas celulares, para la identificación #entica como herramientaforense para la identificación de personas.

PCR Multiplex: requiere que los primers #uíen la amplificación de re#iones +nicas de

DNA en com%inación de muchos primers %a/o un simple set de condiciones de reacción.

Posteriormente de%e ha%er mtodos disponi%les para el análisis de cada producto de

amplificación de la mezcla de todos los productos.

Aplicaciones: se utiliza en micro%iolo#ía dia#nostica como prue%a simultanea para

diferentes a#entes en la misma reacción, por e/emplo para identificar el virus 0erpes

simple$ 1 ( 2 en un mismo ensa(o o el virus de la influenza tipo A ( 3.

PCR Asimétrico: #enera DNA de cadena sencilla de%ido a concentraciones desi#uales

de primers en la reacción. 4curren dos fases' producción de DNA de do%le cadena

se#uido por la producción de DNA de cadena sencilla.

Aplicaciones:

Nested PCR: se efect+a haciendo entre 15 ( 67 ciclos con un primer con/unto de primers

( despus otros 15 a 67 ciclos con un se#undo con/unto de primers respecto a una re#ión

interna del producto de ADN amplificado en primer lu#ar. Así pues, el fra#mento más lar#o

producido en la primera ronda de P se utiliza como ADN molde para la se#unda P.

Aplicaciones: se aplica en el dia#nóstico clínico de pató#enos que se encuentran enpequeas cantidades en san#re ( te/idos, principalmente virus.

PCR: es un tipo de P para medir la cantidad de secuencias específicas de DNA. 8e

utiliza un colorante que se une a la do%le cadena del DNA para cuantificar el pro#reso del

P en cada ciclo de síntesis.

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Aplicaciones: se utiliza en la detección de microor#anismos pató#enos en el dia#nóstico

clínico.

!ifferential !isplay PCR: se realiza una transcripción reversa de mNAs utilizando un

set de primers oli#o d& anclados9 despus se realiza la amplificación de las especies

cDNA de cada fracción de un set de primers ar%itrarios ( primers anclados9

posteriormente se realiza una separación por electroforesis de los fra#mentos resultantes9

entonces se reamplifican los diferentes fra#mentos que se están %uscando, clonándolos (

secuenciándolos9 por +ltimo se realiza una confirmación de e$presión diferencial

!Northern %lottin#".

Aplicaciones: e$tensivo análisis de e$presión de #enes entre #randes po%laciones de

clulas.

Amplified fra"ment len"t# polymorp#ism (A$%P PCR): pertenece a la cate#oría de

tcnicas de amplificación de fra#mentos de restricción selectivos el cual se %asa en la

li#ación de adaptadores a fra#mentos de restricción #enómica se#uido de una P

%asado en la amplificación con primers específicos a los adaptadores.

Aplicaciones: construcción de mapas de marcadores #enticos de mu( alta densidad

para su aplicación en la investi#ación del #enoma, análisis de la diversidad #entica en

distintas especies ve#etales, detección de al#unos polimorfismos.

Amplificación dependiente de #elicasa (&!A): se utiliza una DNA helicasa para

separar un DNA de do%le cadena !dsDNA" ( #enerar plantillas de cadena simple para la

hi%ridación del primer ( la su%secuente e$tensión. omo la DNA helicasa desenrolla

enzimáticamente dsDNA, el calor inicial de desnaturalización ( los su%secuentes pasos

del termociclador requeridos para el P pueden ser todos omitidos. 0DA proporciona un

simpe esquema de amplificación de DNA' una temperatura desde el inicio hasta el final dela reacción.

Aplicaciones: detección de la presencia de al#+n microor#anismo en una muestra.

&i'ridación in situ fluorescente ($&): se %asa en la hi%ridación de DNA nuclear con

una sonda de DNA marcada con un fluoróforo en la interfase celular o en la fi/ación de los

cromosomas en metafase en un portao%/etos.

Aplicaciones: aplicaciones dia#nosticas para la identificación de anomalías en los

cromosomas.

*lectroforesis en +el con +radiente de !esnaturali,ación-emperatura

(!++*-++*): D::; se %asa en la mi#ración de fra#mentos amplificados por P en

#eles de acrilamida. ;l am%iente desnaturalizante se crea por mantener una temperatura

uniforme entre 57 (

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parcialmente desnaturalizada, ( la mi#ración de la molcula prácticamente se detiene. Las

variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de

desnaturalización sean diferentes dentro del #radiente desnaturalizante, lo#rándose la

separación de los dominios de manera efectiva.

&::; e$plota los principios de D::;, sin utilizar los #eles de #radiente químico

desnaturalizante, hacindolo más simple ( rápido. ;l DNA amplificado se aplica a un #el

de poliacrilamida que contiene urea. Durante la electroforesis, la temperatura se

incrementa #radual ( uniformemente. ;l resultado es un #radiente de temperatura lineal

en el transcurso de la electroforesis. ;l am%iente desnaturalizante se forma por una

concentración constante de urea en el #el, com%inado con el #radiente de temperatura

temporal.

Aplicaciones: se pueden detectar mutaciones puntuales por la separación de los

fra#mentos de DNA que difieren en su secuencia de una %ase nitro#enada, análisis de la

estructura ( dinámica de comunidades micro%ianas comple/as.

mall su'unit ri'osomal RNA (/ rRNA): se utiliza la tcnica de P para amplificar

la pequea su%unidad ri%osomal del NA de los #enes de una %acteria. 8e utiliza un

primer del P marcado con un compuesto fluorescente para permitir la detección del

producto amplificado. ;l producto es diferido con enzimas de restricción ( se emplea un

una unidad de electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducido por laser

detectando +nicamente los fra#mentos con la marca fluorescente.

Aplicaciones:

Analisis de restricción de A!N ri'osomal amplificado (AR!RA): ;sta tcnica se %asa

en la di#estión del #en ri%osomal 1

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