análisis de estrategias metodologicas

INTRODUCCION

Las plantas o algunas partes de una planta pueden ser usadas por sus propiedades teraputicas, sabor o aroma, esto debido a sus aceites esenciales. Las plantas elaboran en sus metabolismos una serie de sustancias que van a tener diferente inters en funcin de sus utilidad. Los productos obtenidos directamente de la naturaleza, sus anlogos y derivados representan en la actualidad ms del 50% de todos los frmacos empleados en la teraputica.

Desde la Edad Media, los aceites esenciales se han utilizado ampliamente como bactericidas, fungicidas, antiparasitarios, insecticidas, medicamentos y aplicaciones cosmticas, especialmente hoy en da en productos farmacuticos, sanitarios, cosmticos, industrias agrcolas y alimentarias. Entre los productos farmacuticos se encuentran los suplementos alimenticios que pueden comercializarse en forma de t, jarabes, extractos, tabletas, cpsulas, plantas ya sea secas o frescas, etc.

A la mayora de los suplementos alimenticios no se les suele realizar pruebas de validacin del proceso con el que fueron fabricados y de la materia prima con que estn elaborados. Es importante validar los mtodos analticos de su fabricacin, as como la materia prima en este caso los extractos naturales, para cumplir con los controles de calidad y con las buenas prcticas de manufactura; que contribuyan a tener el mercado productos de buena calidad.

El empleo con fines teraputicos de las drogas vegetales, ya sea la planta directamente o bien como fuente de extraccin de principios activos debe estar sometido a unos rigurosos controles antes de que estas puedan ser empleadas como tal. Esta operacin comprende por una parte la identificacin del material vegetal, descartando posibles falsificaciones, u por otra la determinacin de su calidad y pureza es decir la verificacin del control de sus actividad biolgica as como de sus posibles adulteraciones. La identificacin puede ser realizada por reconocimiento botnico o por mtodos fisicoqumicos.

Las personas suelen consumir productos hechos a base de plantas para mejorar su salud, por ejemplo para aliviar los sntomas del resfriado comn que suele presentarse la mayora de veces en los meses ms fros del ao. Es la principal causa de consultas mdicas en Estados Unidos y representa la mayor causa de ausentismo laboral y escolar.

Las plantas son una fuente de innumerables recursos tiles para el desarrollo de la ciencia, entre los ms importantes estn los conocidos principios activos o metabolitos secundarios. Los compuestos fenlicos son un grupo muy comn de metabolitos secundarios presentes en las plantas, estos incluyen a los fenoles simples, polifenoles, flavonoides, taninos, entre otros (Albornoz Amrico, 1980).

Las propiedades ms representativas de estos compuestos son antioxidantes, antibacterianas, antivirales, antifngicas, anticarcinognicas, antitumorales, antimutagnicas, hepatoprotectoras, antiinflamatorias, antihipercolesterolmicas e inmunoestimulantes (Duke James A.).

ANTECEDENTES

Formulacin estandarizada para jarabeLa formulacin a analizar contiene los siguientes ingredientes: Eucalipto(Eucalyptus globulus) Gordolobo(Verbaascum thapsus) Tomillo(Thymus vulgaris) Sauco(Sambucus nigra) Propleo Equinacea purpurea(Echinacea purpurea) Blsamo de TolPreparaciones botnicas y extractos vegetales Preparaciones botnicas y herbales: son preparados medicinales que contienen una sola, dos o ms plantas medicinales. Y pueden ser analizarse los compuestos presentes por tcnicas cromatografcas comunes como HPLC. Extracto vegetal: La extraccin de las plantas permite disolver los principios activos de la materia vegetal, despus de la evaporacin (agua, alcohol o metanol) el extracto concentrado es estandarizado, es decir se controla el contenido de principios activos, ya que se eliminan las sustancias no activas. Los principales mtodos de extraccin son maceracin y extraccin continua de solvente en equipo Soxhlet.La identificacin de los compuestos activos en extractos de plantas se puede realizar mediante HPLC.

JUSTIFICACIN

Este trabajo tiene como objetivo validar los procesos de fabricacin de una formulacin estandarizada para jarabe, con un sustento cientfico realizado bajo condiciones estandarizadas, para que en un futuro si fuera posible pueda cubrir los requisitos necesarios para su acreditacin como un medicamento. Los aceites esenciales son las fracciones lquidas voltiles que contienen las sustancias responsables del aroma de las plantas y que son importantes en la industria.Para la utilizacin de los aceites esenciales es necesario conocer sus caractersticas fisicoqumicas como parmetros imprescindibles para establecer las normas que determinen sus requisitos mnimos de calidad. A estas determinaciones habr que agregarles los ensayos que aseguren su eficacia y la inocuidad de su uso. Se justifica este proyecto para evitar la utilizacin de productos con componentes qumicos lo cual trae consecuencias dainas para la salud, as como un costo de materias primas y produccin menor en contraste con la elaboracin de un jarabe a partir de un formulado con compuestos qumicos.

OBJETIVOSGeneral:Estandarizar y validar la formulacin de un jarabe a base de extractos naturales con actividad antitusiva, u otras afecciones respiratorias, para ofrecer las bases tcnicas para el desarrollo de la formulacin del jarabe antitusivo.Especficos: Identificacin del material vegetal con que est elaborado la formulacin estndar. Estandarizar la tcnica de extraccin como mtodo de separacin de sustancias integrantes de materia vegetal. Estandarizar el uso del mejor solvente para la obtencin de compuestos bioactivos. Obtener un balance de materia adecuado para la produccin de extractos bioactivos. Analizar la calidad y la pureza del extracto, sus criterios de seleccin con especial atencin en diferentes mtodos de anlisis cuantitativos y cualitativos.

METODOLOGA GENERAL

Para: Tomillo, Eucalipto, Saco, Equinacea, propleo y Gordolobo;De manera general:

1. Extraccin slido-lquido (mtodo de uso de solvente en equipo Soxhlet); extraccin por maceracin, extraccin por decoccin, todas las extracciones acuosas, alcohlicas o hidroalcohlicas. 2. Concentrado de la extraccin (separacin del solvente por medio de la evaporacin del mismo).3. Anlisis espectrofotomtrico de extractantes concentrado (mediante el uso del espectrofotmetro).4. Presencia de Fenoles (reaccin con Cloruro Frrico).5. Determinacin de Fenoles Totales (mtodo Folin-Ciocalteu).6. Actividad antioxidante (mtodo actividad inhibidora del radical libre 1,1-difenil-2-picrilhidracilo o DPPH).7. Anlisis antimicrobiano (anlisis en sensidiscos, se sugiere realizar exudados farngeos para estas pruebas).8. Identificacin de compuestos de extractos (uso del equipo de HPLC).

La extraccin por el mtodo Soxhlet Consiste en un mtodo de extraccin slido- lquido, que se utiliza generalmente para aislar los componentes lipdicos de una muestra por medio de un solvente (M. A. Salamanca y col., 2009). El uso de un aparato Soxhlet es una manera conveniente de preparar extractos crudos de plantas. Este proceso usa preferentemente solventes puros aunque algunos autores han utilizado mezclas binarias o Ternarias (L. A. Mrquez, 2003).La maceracin es un proceso de extraccin slido-lquido. El producto slido (materia prima) posee una serie de compuestos solubles en el lquido extractante que son las que se pretende extraer. Generalmente el agente extractante (fase lquida) es el agua, pero tambin se pueden emplear otros lquidos, como: vinagre, jugos, alcoholes, etc.La muestra se coloca en el recipiente de extraccin y se le mantiene en contacto con el disolvente extractante el tiempo necesario a una temperatura determinada. Es necesario hacer una filtracin de la muestra (G. Fernndez, 2007). Es conveniente una agitacin peridica, tratando de influenciar el gradiente de concentracin. Una vez elegido el disolvente que se vaya a emplear para la extraccin, las nicas variables que se pueden modificar para mejorar el rendimiento de extraccin son la temperatura, el tiempo de extraccin y la agitacin a la que se someta a la muestra.

Maceracin: Es una extraccin que se realiza a temperatura ambiente. Consiste en remojar el material vegetal, debidamente fragmentado en un solvente (agua o etanol, se prefiere el etanol puesto que a largos tiempos de extraccin el agua puede propiciar la fermentacin o la formacin de mohos) hasta que ste penetre y disuelva las porciones solubles. Se puede utilizar cualquier recipiente con tapa que no sea atacado con el disolvente; en ste se colocan el material vegetal con el disolvente y tapado se deja en reposo por un perodo de 2 a 14 das con agitacin espordica. Luego se filtra el lquido, se exprime el residuo, se recupera el solvente en un evaporador rotatorio y se obtiene el extracto.Para la obtencin de los extractos por ste mtodo se lleva a cabo el siguiente procedimiento: 1. Recoleccin de la muestra. 2. Pretratamiento: Limpieza y secado de la muestra 3. Reduccin de tamao: se toma la muestra seca y se moli. 4. Extraccin: se pesa en gramos una cantidad de material y se deposita en los recipientes dispuestos para tal fin, se adiciona el solvente hasta cubrir completamente el material vegetal, se agita y tapa. 5. Reposo: se deja reposar por un perodo de 10 das, agitando espordicamente el contenido. 6. Obtencin del extracto: se filtra el producto, se recupera el solvente con ayuda de un mini-destilador, se almacena el producto.

Nadja B. Cech y col., 2010. Echinacea and its alkylamides: Effects on the influenza A-induced secretion of cytokines, chemokines, and PGE2 from RAW 264.7 macrophage-like cells.

Colecta de Muestras:Las muestras de Tomillo (Thymus vulgaris), Eucalipto (Eucaliptus globulus), Saco (Sambucus nigra) y Gordolobo (Verbascum thapsus) fueron colectadas entre los meses de Enero y Febrero del 2015 en el mercado local de la ciudad de Huejotzingo, Puebla. Las plantas frescas y en buen estado fueron instantneamente almacenadas en bolsas de polietileno. Las muestras fueron transportadas inmediatamente al laboratorio (Laboratorios Farmacuticos LOREN S. A. DE C. V.) localizado en la misma ciudad y se resguardo en un cuarto a temperatura ambiente para su posterior tratamiento y anlisis.

Preparacin de las muestras (Desinfeccin):El conjunto de muestras se prepararon individualmente para su posterior anlisis, para ello, las muestras vegetales fueron enjuagadas con agua directamente del grifo de dos a tres veces cuidadosamente con la finalidad de remover polvo y restos de insectos principalmente, posteriormente se realiz un enjuague con agua destilada sumergiendo las muestras durante 15 minutos y se escurrieron en un cuarto a temperatura ambiente durante 3 horas. Una vez escurridos se colocaron en una estufa a 60C para su desecacin hasta alcanzar pesos constantes; para Tomillo se desinfectaron 100gr de muestra verde, una vez seco el material se obtuvo 20gr del mismo, para Eucalipto se desinfecto 1.034kg y se obtuvo 0.544gr en seco as mismo, se desinfecto 100gr y se obtuvo 0.056gr de muestra en seco, para Saco se desinfecto 20gr y se obtuvo 10gr de muestra en seco y para Gordolobo se desinfecto 10gr y se obtuvo 5gr de muestra en seco. Una vez seco el material vegetal de las muestras se convirtieron en semi polvo con ayuda de una licuadora durante un tiempo de trituracin de 3 minutos, para la muestra se saco se utiliz un mortero. Se obtuvieron para tomillo, eucalipto, saco y gordolobo 19.8gr, 0.548gr, 56.56gr, 10gr y 5gr respectivamente de muestra vegetal seco en semi polvo. Todas las muestras fueron guardadas en bolsas plsticas debidamente etiquetadas a temperatura ambiente libre de luz para su posterior extraccin, cada una contena por separado sobres de slice gel para absorcin de humedad.

Procedimiento de extraccin: Cada una por separado de las muestras de material vegetal en semi polvo (10gr para Tomillo y Eucalipto; 5gr para Saco y Gordolobo) fueron extrados con 3 diferentes solventes (Agua destilada grado farmacutico, Etanol 96 y mezcla de ambos Etanol/Agua 30:70), para Tomillo, Eucalipto y Gordolobo se utiliz 100ml de solvente y para Saco 50ml. Las muestras fueron extradas por el mtodo clsico de maceracin, cada muestra fue pesada y colocada dentro de un matraz Erlenmeyer y se adiciono el solvente correspondiente, la extraccin se realiz a temperatura ambiente por 72 horas. Despus se filtr con ayuda de un papel filtro y el filtrado se resguardo en un matraz Erlenmeyer cubierto para proteccin de la luz a temperatura de entre 4 y 8 grados para su uso posterior para anlisis espectrofotomtrico, fitoqumico, cuantificacin de fenoles totales, antioxidantes, etc.CONCENTRADO DE LA EXTRACCIN

El extracto obtenido se concentra hasta obtener un extracto espeso mediante evaporacin del solvente para ello se utiliza un equipo de mini-destilacin, se resguardan los concentrados para anlisis espectrofotomtrico mediante diluciones del mismo.

Pierre Morly y col., 1998: Polifenoles: rango de 260 350nmFenoles: rango, 257, 274, 285, 294, 288, 263nmFlavonoides: rango, 240-280, 267, 290 y 300-380nmDerivado de cido cinmico: 343nm

Urbano y col., 1999 y Villalobos y col., 2002:Pigmentos fotosintticos: 400-500 y 600-700nmClorofila: 620-700nm, 380-510nmPigmentos fotosintticos dbiles: 510-620nm

Screening fitoqumico:Los extractos de Agua destilada grado farmacutico, Etanol 96 y Etanol/Agua 30:70 se usaron como soluciones stock para poder realizar el screening fitoqumico. Se realiz un Screening para determinar la presencia de Fenoles, Flavonoides y Saponinas (Mohammad Amzad Hossain y col. Study of total phenl, flavonoids contents and phytochemical screening of various leaves crude extracts of locally grown Thymus vulgaris, 2013. Elsevier.

TOMILLOLa extraccin por el mtodo Soxhlet Consiste en un mtodo de extraccin slido- lquido, que se utiliza generalmente para aislar los componentes lipdicos de una muestra por medio de un solvente (M. A. Salamanca y col., 2009). El uso de un aparato Soxhlet es una manera conveniente de preparar extractos crudos de plantas. Este proceso usa preferentemente solventes puros aunque algunos autores han utilizado mezclas binarias o Ternarias (L. A. Mrquez, 2003).La maceracin es un proceso de extraccin slido-lquido. El producto slido (materia prima) posee una serie de compuestos solubles en el lquido extractante que son las que se pretende extraer. Generalmente el agente extractante (fase lquida) es el agua, pero tambin se pueden emplear otros lquidos, como: vinagre, jugos, alcoholes, etc.La muestra se coloca en el recipiente de extraccin y se le mantiene en contacto con el disolvente extractante el tiempo necesario a una temperatura determinada. Es necesario hacer una filtracin de la muestra (G. Fernndez, 2007). Es conveniente una agitacin peridica, tratando de influenciar el gradiente de concentracin. Una vez elegido el disolvente que se vaya a emplear para la extraccin, las nicas variables que se pueden modificar para mejorar el rendimiento de extraccin son la temperatura, el tiempo de extraccin y la agitacin a la que se someta a la muestra.

Una modificacin de la tcnica realizada por Andrzej L. Dawidowicz y col. Empleando agua destilada y etanol como solvente; muestra de 3 g de la hierba tomillo se extrajo con 70 ml de n-hexano (POCH SA, Gliwice, Polonia) durante 3 h en un aparato Soxhlet. Los extractos fueron almacenados a 8C hasta su anlisis. Extracciones Soxhlet se repitieron tres veces en porciones frescas del material (Andrzej L. Dawidowicz y col., 2008. Application of PLE for the determination of essential oil components from Thymus vulgaris L.).

Realizando hidrodestilacin: 100 gramos de material vegetal en polvo es sometido a hidrodestilacin (1000 ml de agua destilada) durante 3 h usando un aparato de tipo Clevenger como mtodo recomendado en la Farmacopea Britnica (British Pharmacopoeia, 1988). Las muestras se secaron con sulfato de sodio anhidro (Merck Co. Alemania) y despus se mantuvo en viales de color mbar a 4 1C antes de su uso (Abdollah Ghasemi Pirbalouti y col., 2013. Essential oil and chemical compositions of wild and cultivated Thymus daenensis Celak and Thymus vulgaris L.).

Maceracin: Es una extraccin que se realiza a temperatura ambiente. Consiste en remojar el material vegetal, debidamente fragmentado en un solvente (agua o etanol, se prefiere el etanol puesto que a largos tiempos de extraccin el agua puede propiciar la fermentacin o la formacin de mohos) hasta que ste penetre y disuelva las porciones solubles. Se puede utilizar cualquier recipiente con tapa que no sea atacado con el disolvente; en ste se colocan el material vegetal con el disolvente y tapado se deja en reposo por un perodo de 2 a 14 das con agitacin espordica. Luego se filtra el lquido, se exprime el residuo, se recupera el solvente en un evaporador rotatorio y se obtiene el extracto.El material vegetal se moli y se macero para la extraccin. Cincuenta gramos de muestra se pesaron en matraces Erlenmeyer de un litro y se aadieron luego 500 ml de disolventes con polaridades variables (metanol, etanol, ter dietlico y hexano) para las muestras de plantas. La extraccin se llev a cabo por agitacin a temperatura ambiente durante 72 h. Despus de la filtracin a travs de papel de filtro (Whatman No. 4), el residuo se volvi a extraer dos veces, y despus los extractos combinados de cada muestra se evaporaron a temperatura ambiente y se seca en desecadores bajo vaco hasta un peso constante. Los residuos finales se utilizaron para estudiar sus actividades antioxidantes (Mohamed Hussein Hamby Roby y col., 2013. Evaluation of antioxidant activity, total phenols and phenolic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia officinalis L.), and marjoram (Origanum majorana L.) extracts). Para la obtencin de los extractos etanlicos por ste mtodo se lleva a cabo el siguiente procedimiento: 1. Recoleccin de la muestra. 2. Pretratamiento: Limpieza y secado de la muestra 3. Reduccin de tamao: se toma la muestra seca y se moli. 4. Extraccin: se pesa en gramos una cantidad de material y se deposita en los recipientes dispuestos para tal fin, se adiciona el solvente etanol hasta cubrir completamente el material vegetal, se agita y tapa. 5. Reposo: se deja reposar por un perodo de 10 das, agitando espordicamente el contenido. 6. Obtencin del extracto: se filtra el producto, se recupera el solvente con ayuda de un mini-destilador, se almacena el producto.

Concentrado de las extracciones: El extracto obtenido se concentra hasta obtener un extracto espeso mediante evaporacin del solvente para ello se utiliza un equipo de mini-destilacin, se resguardan los concentrados para anlisis espectrofotomtrico mediante diluciones del mismo.

Todas las muestras se analizaran en el espectrofotmetro, se mostraran datos de tipo de Absorbancia con una visualizacin espectrofotomtrica entre un rango de 200nm a 500nm.

Presencia de Fenoles, Reaccin con Cloruro Frrico (FeCl3):La presencia de compuestos fenlicos en los extractos se determin con el reactivo de cloruro frrico (FeCl3), el cual indica que se debe aadir 0.5mL de solucin de cloruro frrico al 5% por cada mL de extracto diluido en etanol. El extracto alcohlico e hidroalcohlico sin calor reaccionaron con el cloruro frrico evidenciando la presencia de compuestos fenlicos en su composicin. Naranjo Blanca (n.f.), Prcticas de laboratorio de fitoqumica, Biblioteca del laboratorio de biotecnologa, Escuela Politcnica del Ejrcito, Ecuador.

El contenido de polifenoles totales (PT) se determinara empleando el mtodo colorimtrico de Singleton y Rossi de Folin-Ciocalteu siguiendo la metodologa propuesta por Piombo (2007). El contenido total de polifenoles se expresara en mg equivalentes de cido glico/g de muestra ya sea en seco o fresco (mgEAG/gMS o mgEAG/gMF). Los valores se presentaran como la media de los anlisis realizados por triplicado desviacin estndar (DE).

El contenido total de fenol se determin por el mtodo reactivo de Folin-Ciocalteu con modificaciones. De cada uno de los extractos crudos (1 mg) se disolvi en metanol (1 ml). Un total de 10% de reactivo de Folin-Ciocalteu se prepar mediante la adicin de Folin-Ciocalteu reactivo (10 ml) en agua (90 ml). A continuacin, 5% de Na2CO3 (3 g) se prepar mediante la disolucin de Na2CO3 (3 g) en agua (50 ml). Cada muestra de crudo (200 ul) fue tomada en un tubo de ensayo y se aade un 10% de Folin-Ciocalteu (1.5 ml). Entonces todo el tubo de ensayo se mantiene en un lugar oscuro durante 5 min. Finalmente, se aadi 5% de Na2CO3 (1.5 ml) a la solucin y se mezcl bien con la mano. Una vez ms todo el tubo de ensayo se mantuvo en la oscuridad durante 2 horas. La absorbancia se midi por toda la solucin mediante el uso de un espectrofotmetro UV a 750 nm de longitud de onda constante (Mohammad Amzad Hossain y col., 2013. Study of total phenol, flavonoids contents and phytochemical screening of various leaves crude extracts of locally grown Thymus vugaris).

El cido glico se prepar para el mtodo de Folin-Ciocalteu con modificaciones. El cido glico (3 mg) se disolvi en metanol (10 ml). Esto es a una concentracin de 300 mg/L. Se diluy mediante la adicin de metanol a la concentracin de preparado de serie 200, 100, 50 y 25 mg/L. El mismo procedimiento se sigui para el estndar de cido glico. La absorbancia se midi para todas las soluciones estndar mediante el uso del espectrofotmetro-UV a longitud de onda constante de 750 nm (Mohammad Amzad Hossain y col., 2013. Study of total phenol, flavonoids contents and phytochemical screening of various leaves crude extracts of locally grown Thymus vugaris).

La actividad antioxidante: DPPH Mtodo (captacin de radicales)La capacidad de los extractos de plantas para depurar DPPH radicales libres se determin segn el mtodo descrito por Brand-Williams et al. (1995). Una alcuota de 0.1 ml de la fraccin extrada se mezcl con 3.9 ml recin preparada DPPH solucin en una concentracin de 60 umol en metanol. Despus de 30 min de incubacin en la oscuridad a temperatura ambiente, la absorbancia resultante se midi a 515 nm. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Los porcentajes de inhibicin de la DPPH radical, como una funcin de las fracciones de efecto extrada, se calcularon utilizando la siguiente ecuacin (Kulisic et al., 2004).

Donde, ACO: la absorbancia del control en t = 0; AAt: la absorbancia de las muestras a t = 30 min. El porcentaje restante de DPPH en estado estacionario se represent frente umol de antioxidante dividido por umol de DPPH para determinar las cantidades de antioxidante necesario disminuir DPPH concentracin de radicales en un 50% (CE50). Los valores de CE50 tambin se estimaron por regresin no lineal. Estos valores fueron recalculados para el recproco de EC50 (1/EC50) que se define como el poder antirradical (ARP). Cuanto mayor sea el valor de la fuerza antirradical mayor ser la actividad antioxidante (Mohamed Hussein Hamby Roby y col., 2013. Evaluation of antioxidant activity, total phenols and phenolic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia officinalis L.), and marjoram (Origanum majorana L.) extracts).

La actividad antimicrobiana: Los aceites esenciales fueron probados individualmente contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Algunas cepas bacterianas utilizadas en este estudio se obtuvieron de la American type culture collection (ATCC), National Institute of Healthy(NIH), EE.UU. Todas las bacterias se almacenaron en caldo tripticasa de soja (Sanofi Diagnostic Pasteur, Francia) que contiene 25% (v/v) de glicerol (Sigma-Aldrich) a -20C. Antes de su uso, los cultivos fueron propagados dos veces en los medios adecuados como se mencion anteriormente para que sean fisiolgicamente activo. El bioensayo de microplacas (micro dilucin) se utiliz para la determinacin de la concentracin inhibitoria mnima (MIC) (NCCLS, 1999). La MIC se defini como la concentracin ms baja de aceite de tomillo que logra inhibir el crecimiento bacteriano visible despus de la incubacin durante 20 h a 37C (B. Imelouane y col., 2009. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil of thyme (Thymus vulgaris) from Eastern Morocco).

EUCALIPTOLa extraccin se llev a cabo mediante hidrodestilacin durante 4 h, usando un aparato estndar recomendado en la Farmacopea Europea. Se repiti esto 3 veces para cada muestra de 100 g de hojas secas trituradas. El aceite recogido de cada planta se deshidrat con Na2SO4 y se almacen a 4C, para su uso posterior en anlisis y pruebas de las actividades biolgicas (Ameur Elaissi y col., 2011. Antibacterial activity and chemical composition of 20 Eucalyptus species essential oils).

Hidrodestilacin por 4 h utilizando un aparato de tipo Clevenger para producir aceites esenciales de acuerdo con el mtodo de la Farmacopea Europea (4 ed., 2002). Los aceites se secaron sobre sulfato de sodio anhdrido y se almacenaron en viales sellados a baja temperatura (4C) (a. Tohidpour y col., 2009. Antibacterial effect of essential oils from two medical plants againts Methicillin-resistant Sthaphylococcus aureus (MRSA).

Las hojas frescas se sometieron a destilacin por vapor usando un aparato de tipo Clevenger. Brevemente, las hojas de las plantas se sumergieron completamente en agua y se calienta a ebullicin, despus de lo cual el aceite esencial se evapor junto con vapor de agua y finalmente se recogi despus de la decantacin. El destilado se aisl y se sec en un rota-vapor para obtener aceite de color amarillo verdoso. El aceite se almacen a 4C. El rendimiento de la extraccin de este aceite esencial fue 1.2% (w / w) (Bachir Raho G. y Benali M., 2012. Antibacterial activity of the essential oils from the leaves of Eucalyptus globulus against Escherichia coli and Sthapylococcus aureus).

Las hojas secas (1.0 kg) de E. globulus se extrajeron con agua caliente (3 l) a 90C durante 30 min. Despus de la filtracin y eliminacin del disolvente por liofilizacin, se obtuvo un polvo residual (135.8 g) (Tatsuya Hasegawa y col., 2007. Bioactive monoterpene glycosides conjugated with gallic acid from the leaves of Eucalyptus globulus).




El contenido fenlico total se determin con el reactivo de Folin-Ciocalteu segn el mtodo de Julkunen-Tiitto (1985), usando cido glico como un estndar. El resultado se expres como miligramos equivalentes de cido glico por gramo de producto de eucalipto (Yoshiaki Amakura y col., 2001. Constituents and their antioxidative effects in eucalyptus leaf extract used as a natural food additive).

El contenido total de fenoles se determin por el mtodo de Folin-Ciocalteu (Singleton y Rossi, 1965): a 0.5 ml de una solucin acuosa del extracto, 2.5 ml de Folin-Ciocalteu reactivo, previamente diluido con agua (1:10, v/v) y 2 ml de una solucin de 75 g/L de carbonato de sodio acuoso se aadi. La mezcla se mantuvo 5 min a 50C y, despus de enfriar, se midi la absorbancia a 760nm. El contenido de fenoles se calcul como un equivalente de cido glico (GAE) a partir de la curva de calibracin de las soluciones patrn de cido glico (2-40 ug/ml) y se expresa como g GAE/100 g de extracto (en base seca) (G. Vzquez y col., 2008. Evaluation of potential applications for chestnut (Castanea sativa) shell and eucalyptus (Eucalyptus globulus) bark extracts).

Las actividades antioxidantes se estimaron utilizando mtodos informados o modificados en parte, el mtodo (Hatano, Takagi, Ito, y Yoshida, 1997) ensayo de captacin de radicales libres [picrilhidrazil 1,1-difenil-2- (DPPH)]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces. El barrido de la capacidad de los radicales libres (mtodo DPPH) de las muestras se ensay como blanqueo de la DPPH estable. Una solucin (4 ml) de una muestra de prueba en MeOH se aadi a una solucin (1 ml) de DPPH en MeOH (concentracin final de DPPH: 0.2 mmol/l). Despus de mezclar durante 10 s, la solucin se dej reposar durante 30 min, y se midi la absorbancia de la solucin resultante a 520 nm. La actividad de barrido en el radical DPPH se expres como CE50, la concentracin de la muestra de ensayo requerida para dar una reduccin de 50% de la absorbancia de la de 0.2 mmol/l DPPH en MeOH (Yoshiaki Amakura y col., 2001. Constituents and their antioxidative effects in eucalyptus leaf extract used as a natural food additive).

1,1-Diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging assay con EtOH: El ensayo de DPPH fue realizada por un mtodo previamente informado (Marsden, 1958; Zhang et al., 2007). En resumen, 100 muestras de ensayo UL a diferentes concentraciones en EtOH y 100 ul DPPH (Sigma) en EtOH (200 ul) se aadieron a placas de microtitulacin de 96 pocillos. La placa se agit durante 1 min en un agitador de placas, y se incub durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Despus de la incubacin, la absorbancia se registr a 517 nm. Las muestras ensayadas a diferentes concentraciones sin solucin de DPPH se utilizaron como controles para eliminar la influencia de la muestra de color. El cido ascrbico se utiliz como control positivo, y la solucin de DPPH en EtOH sirvi como un control negativo. Todas las pruebas se realizaron de forma independiente por triplicado y la actividad de captacin de radicales libres de las muestras analizadas se compararon en trminos de valor de IC50 (Tatsuya Hasegawa y col., 2007. Bioactive monoterpene glycosides conjugated with gallic acid from the leaves of Eucalyptus globulus).

Con Metanol: La capacidad de los extractos para captar el ,-difenil--picrylhydrazyl (DPPH) radical se midi segn lo informado por von Gadow, Joubert, y Hansmann (1997). Dos mililitros de una solucin metanlica 6x10-5 M de DPPH se aadieron a 50 ul de una solucin metanlica de extractos, y la disminucin en la absorbancia a 515 nm se registr durante 16 min en un espectrofotmetro. El porcentaje de inhibicin (IP) del radical DPPH se calcul como:

La EC50 parmetro se calcula a partir de los datos IP como la cantidad de extractos solubles en acetato de etilo (volvi a disolver en metanol) causa una inhibicin del 50% del radical DPPH (J. Gonzlez y col., 2004. Production of antioxidants from Eucalyptus globulus Wood by solvent extraction of hemicellulose hydrolysates).

La actividad antibacteriana de los diferentes aceites esenciales se evalu por el mtodo de difusin en agar de papel de disco contra dos bacterias Gram-negativas modelo Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y las dos bacterias Gram-positivos Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Enterococcus faecalis (ATCC 29212). Los organismos se mantuvieron en Muller-Hinton agar (MH) (BioRad). Los inculos se prepararon diluyendo durante la noche (24 h a 37C) cultivos en medio liquido Muller Hinton a aproximadamente 106 CFU/ml. Discos absorbentes (disco Whatman No. 3, 6 mm de dimetro) se impregnaron con 10 ul de aceite y que se colocan sobre la superficie de placas de Petri inoculadas (90 mm). Discos de control positivo con gentamicina (10 ug/disco) se incluyeron en cada ensayo. Los dimetros de las zonas de inhibicin de crecimiento se midieron despus de la incubacin a 37C durante 24 h. El experimento se realiz por triplicado (Ameur Elaissi y col., 2011. Antibacterial activity and chemical composition of 20 Eucalyptus species essential oils).

GORDOLOBOLas hojas secas y pulverizadas (caulinares y basales, 750 g) fueron previamente desgrasados por extraccin con CH2Cl2 y posteriormente se extrajeron con MeOH (2.5 L x 3). Los extractos de MeOH combinados se evaporaron para producir un residuo (40 g) (Nektarios Aligiannis y col., 2003. Methanolic extract of Verbascum macrurum as a source of natural preservatives against oxidative randicity).

El material vegetal fue secado a la sombra y en polvo a un grado fino con un molino de escala de laboratorio. El material seco (10 g) se extrajo con metanol por maceracin dos veces (2 x 100 ml) a temperatura ambiente. Los extractos metanlicos combinados se evaporaron hasta sequedad a vaco para dar extractos metanlicos crudo (Esma Kozan y col., 2011. The in vivo anthelmintic efficacy of some Verbascum species growing in Turkey).

Extractos de polaridad alta (hexano, diclorometano, y extractos metanol): Las partes de las plantas se secaron al aire y el material a continuacin, en polvo seco (20 g) se extrajo con 150 ml de hexano, seguido por diclorometano (150 ml) y metanol (150 ml) en un aparato Soxhlet durante 6 horas para cada disolvente. Preparacin de Metanol extractos directos: Las partes de las plantas fueron secadas al aire y luego el material vegetal en polvo seco (20 g) se extrajo con 150 ml de metanol en un aparato Soxhlet durante 8 horas. Los extractos se filtraron, y los filtrados se evaporaron bajo presin reducida y se sec usando un evaporador rotatorio a 50C. El Extracto seco se almaceno en la oscuridad a 4C hasta su uso (B. Ozcan y col., 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of the various extracts of Verbascum pinetorum Boiss. O. Kuntze (Scrophulariaceae).

0,5 gramo de polvo a base de hierbas seca fue tomado y se disolvi en 10 ml de agua o etanol. La solucin se calent utilizando un bao de agua mantenido a 80 grados centgrados durante 15 minutos. La mezcla se enfri a temperatura ambiente y se centrifug a 6000 rpm durante 10 minutos. La solucin sobrenadante se filtr y el filtrado se recogi y se utiliz para el anlisis (Nithya Narayanaswamy and K. P. Balakrishnan, 2011. Evaluation of some medical plants for their antioxidant properties).

Verbascum extracto de etanol:200 g de material vegetal se maceraron con 2000 ml 50% de etanol (material vegetal/relacin de disolvente = 1/10, m/v) y 15 g de CaCO3 a temperatura ambiente, bajo agitacin de vez en cuando durante 3 h. Despus de la filtracin, se obtuvo un extracto marrn opalescente (1370 ml), que se concentra adicionalmente a 40C bajo presin baja (72-74 mmHg) para eliminar el disolvente, despus de que se almacenaron a 4C durante 24 horas el extracto se centrifug adicionalmente durante 45 min a 3000 rpm, dando como resultado los residuos 1 y 325 ml de extracto acuoso. Esta se concentr a 50C bajo presin baja (72-74 mmHg) hasta un volumen de 100 ml y se precipit con metanol (relacin extracto acuoso/disolvente = 1/4, v/v). El precipitado se sec adicionalmente en un horno a 40C. El filtrado se concentr a 40C bajo presin baja (72-74 mmHg) para obtener la fraccin L2 como un polvo marrn ligeramente higroscpico (A. Armatu y col., 2011. Characterization of biological active compounds from Verbascum phlomoides by chromatography techniques. I. Gas chromatografhy).




El contenido de fenoles totales se determin a travs de Folin-Ciocalteu y absorbancia cambios a 725 nm fueron registrados (Singleton y Rossi, 1965). La curva estndar de cido glico se utiliza para la determinacin del contenido de compuestos fenlicos en los extractos (Filis Morina y col., 2008. Peroxidase, phenolics, and antioxidative capacity of common mullen (Verbascum thapsus L.) grown in a zinc excess and B. Ozcan y col., 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of the various extracts of Verbascum pinetorum Boiss. O. Kuntze (Scrophulariaceae).

Actividad del radical DPPH: Las capacidades de barrido de radicales libres se determinaron de acuerdo con un procedimiento previamente usando el radical estable 2,2-difenil-1-picryhydrazyl (DPPH). En resumen, 100 ul de solucin de muestra, se diluye en DMSO, se aadi a 1.9 ml de una solucin de DPPH 315 uM (en etanol) y se dej reaccionar durante 30 min a 37C. Entonces, la densidad ptica se midi a 515 nm, y se calcul la disminucin real de la inducida por el compuesto de prueba de absorcin. Los valores de IC50 se corresponden con la cantidad requerida de cada muestra para secuestrar 50% de los radicales libres DPPH. Se calculan a partir de lneas de regresin, donde la abscisa representa la concentracin de la muestra, y la ordenada es la reduccin media por ciento de radical DPPH. Cada valor de IC50 corresponde a un promedio de tres pruebas separadas (Nektarios Aligiannis y col., 2003. Methanolic extract of Verbascum macrurum as a source of natural preservatives against oxidative randicity).

1,1-difenil-2picrylhydrazyl (DPPH) Ensayo.50 ul de diferentes diluciones del extracto se mezclaron con 5 ml de una solucin de metanol 0.004% de DPPH. Despus de un perodo de incubacin de 30 min, la absorbancia de las muestras se ley a 517 nm en espectrofotmetro Shimadzu (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japn). Butilhidroxitolueno (BHT) y cido ascrbico se utilizaron como controles positivos. La inhibicin de DPPH de radicales libres en tanto por ciento (I%) se calcul en forma siguiente:

Ablank es la absorbancia de la reaccin de control (sin compuesto de ensayo), y Asample es la absorbancia del compuesto de ensayo. La concentracin de extracto que proporciona el 50% de inhibicin se calcul a partir de la elaboracin de una grfica (B. Ozcan y col., 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of the various extracts of Verbascum pinetorum Boiss. O. Kuntze (Scrophulariaceae).

Mtodo de difusin en pocillos de Agar para Actividad antimicrobial: Los extractos de plantas secas se disolvieron en dimetilsulfxido (DMSO) a una concentracin final de 200 mg/ml. Cada pocillo inocularon con 50 ul de extracto (10 mg/pocillo) a una concentracin de 200 mg/ml. Los inculos se suspendieron en solucin salina estril y se diluyeron de acuerdo con las normas de 0.5 Mc Farland. Eran "los pocillos inoculados" en la superficie de agar Mueller Hinton (MHA). Los pozos (6 mm) se cortaron de la superficie de agar y 50 ul de diversos extractos se inocularon en ellos. Despus del perodo de incubacin, 24 horas, a 37C, se midieron los dimetros de las zonas de inhibicin en milmetros. Todas las pruebas en este estudio se realizaron por triplicado (B. Ozcan y col., 2011. Antimicrobial and antioxidant activities of the various extracts of Verbascum pinetorum Boiss. O. Kuntze (Scrophulariaceae).

EQUINACEALas muestras de races secas E. purpurea se extrajeron un plazo de tres semanas de secado. Las races enteras secas fueron cortadas, y se pulverizan en un polvo fino usando un mezclador. El polvo se macer durante siete das en 75% de etanol (Frmaco-AAPER, Shelbyville, KY, EE.UU.) en una proporcin de 1: 5 (g material vegetal:mL de disolvente). Todos los extractos se almacenaron en botellas de polipropileno estriles a 2-8C hasta el momento de posteriores anlisis (Nadja B. Cech y col., 2010. Echinacea and its alkylamides: effects on the influenza A-induced secretion of cytokines, chemokines, and PGE2 from RAW 264.7 macrophage-like cells).

El material seco de Echinacea purpurea se moli a un polvo. Echinacea purpurea se extrajo (1: 100 w/v en etanol al 96%) a temperatura ambiente durante 24 h (Silviya S. Georgieva y col., 2013. Comparative evaluation of the polyphenol composition and antioxidant capacity of propolis and Echinacea purpurea).




El contenido de fenoles totales de extractos de etanol de E.purpurea se determin mediante el uso de la modificacin de Folin-Ciocalteu. Una alcuota (1 ml) de extractos o una solucin patrn de cido glico (10, 20, 40, 60, 80, 100 y 120 mg/l) se aadi a un matraz aforado de 25 ml, que contiene 9 ml de agua desionizada destilada (dd H2O ). Se prepar un blanco de reactivo usando dd H2O. Un mililitro de reactivo de fenol de Folin-Ciocalteu se aadi a la mezcla y se agita. Despus de 5 min, se aadieron 10 ml de solucin de Na2CO3 7% a la mezcla. A la solucin del H2O dd se aadi hasta el volumen de 25 ml y se mezcl. Despus de la incubacin durante 90 min a temperatura ambiente, la absorbancia contra blanco de reactivos preparados se determin a 750 nm con un espectrofotmetro UV-VIS (Cary;. Varian australiano Pry Ltd., Mulgrave, VIC, Australia). Contenido de fenoles totales de extractos se expresa como equivalentes de cido glico mg por 100 ml (GAE/100 ml) (Silviya S. Georgieva y col., 2013. Comparative evaluation of the polyphenol composition and antioxidant capacity of propolis and Echinacea purpurea).

Determinacin de la actividad de eliminacin de radicales libres: El DPPH proporciona informacin sobre la reactividad de los compuestos de ensayo con un radical libre estable. Debido a su electrn impar, DPPH da una fuerte banda de absorcin a 517 nm en la espectroscopia visible (color violeta profundo). Como este electrn queda emparejado en presencia de un eliminador de radicales libres, la absorcin desaparece, y la decoloracin resultante es estequiomtrico con respecto al nmero de electrones emprenderse. El radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) ha sido ampliamente utilizado para evaluar la capacidad antioxidante (AOC) de antioxidantes naturales. DPPH es un radical libre estable y acepta un electrn o radical hidrgeno para convertirse en una molcula diamagntica estable. El AOC de las muestras analizadas se determin por fotometra utilizando el mtodo DPPH. Brevemente, se aadi 1 ml de muestra de extracto diluido a 4 ml 0.004% de solucin de DPPH en metanol (0.004 mg/100 ml). Despus de 60 min la retencin de solucin en la oscuridad, la absorcin de luz se mide en cubeta de 1 cm estndar a 517 nm con un espectrofotmetro-VIS-UV. El lquido de referencia fue metanol. La inhibicin de radicales libres (barrido) se calcul mediante la frmula siguiente:

-Ao; absorcin del lquido de referencia no contiene extractos (que es la solucin de 0.004% de DPPH en metanol)-As; la absorcin del extracto que contiene la muestra.

La solucin de DPPH se preparar diariamente, almacenada en un frasco cubierto con papel de aluminio, y se mantiene en la oscuridad a 4C antes de las mediciones. El IC50 es un parmetro que representa la concentracin del extracto, capaz de inhibir el 50% de la cantidad DPPH utilizado. Se determin dibujando un grfico con la concentracin de la muestra Cw (ml Exract/l de disolvente) en la abscisa y la capacidad de inhibicin de radicales libres I [%] como ordenada. (Silviya S. Georgieva y col., 2013. Comparative evaluation of the polyphenol composition and antioxidant capacity of propolis and Echinacea purpurea).

El mtodo de difusin en agar se utiliz para la determinacin de las actividades antimicrobianas de extractos, para la levadura y el moho, se utiliz agar de dextrosa Sabouraud (SDA) (Merck); para cultivos de bacterias, se utiliz agar triptona soja (TSA) (Merck), y agar de recuento en placa (Merck) se us para la determinacin del nmero total de microorganismos (CFU ml-1). 0.1 ml de suspensin de microorganismos, formado por 24 h de cultivo en agar oblicuamente con 10 ml estril al 0.9% de NaCl, se suspendi en 10 ml del medio nutritivo (aproximadamente 106 CFU ml-1). Placa de Petri (86 mm de dimetro interno) se llen con este sistema. Los pocillos (10 mm de dimetro) se cortaron del agar y 30 ul de solucin de extracto (concentracin 20 mgml-1 en metanol) fue liberado en ellos. Como control, metanol (30 ul) fue liberado en un pozo para cada placa de Petri. La eritromicina (997 mgmg-1; [114-07-8]; Aprox. 98%; contenido de H2O 4%; Sigma) y tilosina Tartarat (950 ugmg-1; [74610-55-2]; Sigma) se utilizaron como un control positivo (concentracin en solucin de metanol, 0.05 mgml-1). Todas las diluciones se filtraron usando un filtro de membrana de 0.45 micras (Sartorius, Alemania). Despus de incubacin a 37C durante 24 h placas de agar se examinaron para zonas de inhibicin. Los dimetros de las zonas de inhibicin (mm) se midieron por Fisher Lilly Antibitico Zona Reader (Fisher Scientific Co., EE.UU.) y cada prueba se realiz por triplicado (Ivana Stanisavijevic y col., 2009. Antioxidant and antimicrobial activities of Echinacea (Echinacea purpurea L.) extracts obtained by classical and ultrasound extraction).

SAUCOLa harina de semilla seca (10 g) se extrajo con ter de petrleo (150 ml, con punto de ebullicin 30-60C) utilizando un aparato Soxhlet a 80C durante 24 h. La extraccin del residuo de semillas se repiti dos veces usando hexano como disolvente (150 ml, punto de ebullicin = 69C) a 90C durante 2 h. Se recogieron los extractos, se evapor el disolvente en un evaporador rotatorio a 35C a sequedad, y el residuo se sec bajo vaco (Alessia Fazio y col., 2012. Comparative analyses of seeds of wild fruits of Rubus and Sambucus species from Southern Italy: Fatty acid composition of the oil, total phenolic content, antioxidant and anti-inflammatory properties of the methanolic extracts).

La extraccin de los polifenoles a partir de residuos de harina de semilla desgrasada (3 g) se extrajo tres veces durante 16 horas a temperatura ambiente mediante agitacin con metanol (10 ml de disolvente/g de harina). Entre las extracciones, las muestras se centrifugaron durante 10 min con una velocidad de 2000 rpm. Se recogieron los sobrenadantes combinados, se filtr a travs de papel de filtro y se evaporaron a sequedad. El extracto de semilla metanlico crudo residual se pes y se almacena en recipientes hermticos marrones en 20C bajo una corriente de gas nitrgeno. Las extracciones se realizaron por triplicado (Alessia Fazio y col., 2012. Comparative analyses of seeds of wild fruits of Rubus and Sambucus species from Southern Italy: Fatty acid composition of the oil, total phenolic content, antioxidant and anti-inflammatory properties of the methanolic extracts).




El contenido fenlico total en el extracto se determin por el mtodo de Singleton y Rossi y la cantidad de contenido fenlico total se expres como equivalentes g de cido glico (GAE) / 100 g de extracto (M. Ciocoiu y col., 2009. The effects of Sambucus nigra polyphenols on oxidative stress and metabolic disorders in experimental diabetes mellitus).

El mtodo ligeramente modificada de Brand-Williams (Brand-Williams, Cuvelier, y Berset, 1995), lo que permite estimar la capacidad de captacin de radicales libres de antioxidantes, se adopt para la evaluacin de la actividad antioxidante de los extractos examinados. Para este propsito, 0.04 ml del extracto se aadi a 1.96 ml de 6x10-5 mol/l solucin DPPHd metanol para alcanzar el volumen final de 2 ml. La disminucin en la absorbancia se determin mediante un espectrofotmetro a 515nm en el rango de tiempo de 0-120 minutos con intervalos de tiempo 15 min (este procedimiento se repiti tres veces para cada extracto). La concentracin de la DPPHd restante se lee de la curva de calibracin y se expres como un porcentaje de la DPPHd residual. El porcentaje de inhibicin (IP) del radical DPPHd se calcul a partir de la siguiente ecuacin:

Donde Cc(0) es el valor de la concentracin de DPPHd a 0 min y Ce(t) es el valor de la concentracin de DPPHd en presencia de extracto en el tiempo igual a (t) min (Andrzej L. Dawidowcz y col., The antioxidant properties of alcoholic extracts from Sambucus nigra L. (antioxidant properties of extracts)).

Se realiz prueba de la actividad antimicrobiana de extracto lquido de saco en cultivos lquidos (Christian Krawitz y col., 2011. Inhibitory activity of a standardized elderberry liquid extract against clinically-relevant human respiratory bacterial pathogens and influenza A and B viruses).

PROPOLEOPara preparar EEP, muestras de propleos se cortaron primero en trozos pequeos. Veinticinco gramos de propleos, entonces se extrajo con 250 ml de 80% (etanol) por agitacin (150 rpm) a 25C durante 48 h. A continuacin, la solucin de extracto etanlico se filtr a travs de un Whatman no. 1 papel de filtro y restaurado a su volumen original (250 ml) con etanol al 80%. Basado en el peso seco individual determinada en la solucin, la solucin de EEP se ajust adicionalmente con una cantidad apropiada de etanol al 80% para obtener soluciones que contienen diversas cantidades de EEP (Shigenori Kumazawa y col., 2004. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins).




Total de polifenoles contenidos en EEP se determinaron por el mtodo de Folin-Ciocalteu (Kumazawa, Taniguchi et al., 2002; Singleton, Orthofer, y Lamuela-Raventos, 1999). Solucin de EEP (0.5 ml) se mezcl con 0.5 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu (Kanto Chemicals, Tokio, Japn) y 0.5 ml de 10% Na2CO3, y la absorbancia se midi a 760 nm despus de 1 h de incubacin a temperatura ambiente. Las muestras de EEP se evaluaron a la concentracin final de 20 mg/ml. Total de polifenoles contenidos se expresaron como mg/g (equivalentes de cido glico) (Shigenori Kumazawa y col., 2004. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins).

Libre actividad de captacin de radicales de DPPH:La mezcla de reaccin contena 2 ml de etanol, 125 uM DPPH, y muestras de ensayo. Despus de 1 h de incubacin a temperatura ambiente, la absorbancia se registr a 517 nm. Los resultados se expresaron como porcentaje de disminucin con respecto a los valores de control (Chen y Ho, 1995; Kikuzaki, Hisamoto, Hirose, Akiyama, y Taniguchi, 2002) (Shigenori Kumazawa y col., 2004. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins).

El mtodo de difusin en agar se utiliz para la determinacin de las actividades antimicrobianas de extractos, para la levadura y el moho, se utiliz agar de dextrosa Sabouraud (SDA) (Merck); para cultivos de bacterias, se utiliz agar triptona soja (TSA) (Merck), y agar de recuento en placa (Merck) se us para la determinacin del nmero total de microorganismos (CFU ml-1). 0.1 ml de suspensin de microorganismos, formado por 24 h de cultivo en agar oblicuamente con 10 ml estril al 0.9% de NaCl, se suspendi en 10 ml del medio nutritivo (aproximadamente 106 CFU ml-1). Placa de Petri (86 mm de dimetro interno) se llen con este sistema. Los pocillos (10 mm de dimetro) se cortaron del agar y 30 ul de solucin de extracto (concentracin 20 mgml-1 en metanol) fue liberado en ellos. Como control, metanol (30 ul) fue liberado en un pozo para cada placa de Petri. La eritromicina (997 mgmg-1; [114-07-8]; Aprox. 98%; contenido de H2O 4%; Sigma) y tilosina Tartarat (950 ugmg-1; [74610-55-2]; Sigma) se utilizaron como un control positivo (concentracin en solucin de metanol, 0.05 mgml-1). Todas las diluciones se filtraron usando un filtro de membrana de 0.45 micras (Sartorius, Alemania). Despus de incubacin a 37C durante 24 h placas de agar se examinaron para zonas de inhibicin. Los dimetros de las zonas de inhibicin (mm) se midieron por Fisher Lilly Antibitico Zona Reader (Fisher Scientific Co., EE.UU.) y cada prueba se realiz por triplicado (Ivana Stanisavijevic y col., 2009. Antioxidant and antimicrobial activities of Echinacea (Echinacea purpurea L.) extracts obtained by classical and ultrasound extraction).

análisis de estrategias metodologicas

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