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Universidad de Colima
FACULTAD DE MEDICINA CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
"DETERMINACIÓN DE FRECUENCIAS DE ALELOS HLA REGIÓN DQ Y DR EN PACIENTES CON LEPRA LEPROMATOSA, EN EL
ESTADO DE COLIMA."
TESIS
Que para obtener el grado de:
Doctor en Ciencias Médicas
Presenta
El M. en C. Francisco Vargas Salas
Asesores
DR. C. J. RAFAEL COLL CÁRDENAS C.U.I.B., U. DE C. DR. C. MOISÉS HERNÁNDEZ SUÁREZ, FACULTAD DE CIENCIAS, U. DE C.
Colima, Col. Marzo del 2006
AGRADECIMIENTOS
A Dios, por haberme permitido concluir un ciclo más de vida, en compañía de mis
seres queridos y en especial, mis padres.
A mis padres, Francisco y Margarita, que con gran esfuerzo y dedicación, me
impulsaron a concluír éste trabajo con su valiosos apoyo y dedicación, siempre los mantendré
en mente con un gran cariño.
A los doctores J. Rafael Coll y Carlos Moisés Hernández por su gran gestoría, tiempo,
asesoría, dedicación y apoyo para la culminación de esta tesis .
A mi esposa, Gabriela A., con la que he contado con su cariño y sobre todo paciencia,
y le agradezco lo que he compartido con ella: bellas experiencias y responsabilidades.
A mis hijos Gabriela Margarita y Francisco, por su gran cariño, impulso y alegría, que
me han motivado en la vida.
A la doctora Silvia Ensch, a los biólogos Jorge A. Mayorga R. y Carlos A. Díaz G.
por transmitirme sus conocimientos, experiencias y su valioso tiempo para el desarrollo y
culminación del presente trabajo.
A todos aquellas personas que de alguna manera intervinieron en la realización de
este trabajo.
INDICE
RESÚMEN .............................................................................................................................. 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... 5
DEFINICIÓN ........................................................................................................................................... 5 SINONIMIA ............................................................................................................................................. 5 MARCO TEORICO ................................................................................................................................. 5 EPIDEMIOLOGÍA .................................................................................................................................. 7 DATOS EPIDEMIOLOGICOS ............................................................................................................... 7 DATOS EPIDEMIOLOGICOS ESTATALES ........................................................................................ 8 ETIOPATOGENIA .................................................................................................................................. 9 COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD ........................................................................ 15 GENES DE LA REGIÓN DEL CMH ...................................................................................................... 15 ESTRUCTURA BASICA DEL COMPLEJO GENÉTICO CMH EN LOS SERES HUMANOS .......... 15 RECEPTORES DE CELULAS T ........................................................................................................... 15 FUNCIÓN DE LAS MOLÉCULAS CMH .............................................................................................. 16 INMUNOGENETICA DEL CMH ........................................................................................................... 16 EXPRESIÓN Y REGULACIÓN DE LOS GENES CMH ....................................................................... 17 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................ 22 MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................................................... 22
HIPÓTESIS .............................................................................................................................. 23
OBJETIVOS ............................................................................................................................. 24
DESCRIPCIÓN DE TÉCNICAS DE LABORATORIO ......................................................... 25
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ..................................................................................................... 26
RESULTADOS ........................................................................................................................ 28
DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 47
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................................... 52
ANEXOS .................................................................................................................................. 56
1
RESUMEN
La Lepra se caracteriza por un espectro de manifestaciones clínicas, resultado de las
interacciones entre la respuesta inmunológica del anfitrión y la invasiva Mycobacterium
leprae. A pesar de que la inmunobiología de la lepra ha recibido mucha atención a través de
los años, aún se desconocen a ciencia cierta, las diferencias individuales en la resistencia y la
respuesta a los bacilos. Más aún, la lepra no ocurre en todos los pacientes infectados con M.
leprae y el contacto con casos infecciosos no siempre resulta en la transmisión de la
enfermedad. Estudios de gemelos, de familias y de población han indicado que en los
humanos, los factores genéticos del anfitrión son los principales determinantes de la
susceptibilidad a la lepra.
El descubrimiento de genes de respuesta inmunológica ligados al complejo principal de
histocompatibilidad (CMH), combinado con el discernimiento de que el resultado de una
infección con Mycobacterium leprae igualaba la reactividad inmunológica celular del
anfitrión al bacilo, condujo a un considerable número de estudios que investigaron la relación
entre la lepra o tipos de lepra y el CMH, el CMH del hombre. Los estudios en familias
ofrecieron evidencia de que un gen recesivo ligado a CMH predisponía a la lepra. Otros
estudios han mostrado claramente que estos genes ligados a CMH no confieren
susceptibilidad a la lepra por sí misma, sino que determinan el tipo de enfermedad a
desarrollar.
El Estado de Colima, ha sido por muchos años el primer lugar a nivel nacional en los
casos de prevalencia. A pesar de los esfuerzos realizados por la Secretaría de Salud, en el año
2005 reporta 2 municipios con una tasa de prevalencia mayor de 1.0 por 10,000 habitantes.
Reportando un total de 638 enfermos registrados, predominando la Lepra lepromatosa con un
número de casos de 492 pacientes.
2
El presente estudio ha sido retomado para investigar los alelos de CMH Clase II en la
región DQB1* y DRB1* en 31 pacientes con lepra lepromatosa originarios del Estado de
Colima.
Estudios previos, han demostrado que la Lepra Lepromatosa se encuentra fuertemente
asociada a los antigenos de leucocitos humanos ( CMH ). En nuestro estudio encontramos
que el locus DRB1*15 ( 2 de cada 10 pacientes lo presentaron ) al igual que el alelo
DRB1*04, lo que puede tener un papel importante en la patogénesis de la lepra; encontrando
que el alelo DRB1*12 se encontró con el menor número de frecuencias( 1.79% ). Con
respecto al locus DQB1*, encontramos diferencia significativa entre los alelos DQB1*03,
DQB1*06, DQB1*02, DQB1*05 y DQB1*11.
3
ABSTRACT
Leprosy is characterized by a spectrum of clinical manifestations which is the result of
the interaction between the immune response of the host and the invasive Mycobacterium
leprae. Despite the fact that leprosy immunobiology has received much attention over the
years, individual differences in resistance and response to the bacilli remain unknown. What is
more, leprosy does not occur in all patients infected with M. leprae and contact with infectious
cases does not always result in disease transmission. Twin, family and population studies have
indicated that host genetic factors are the principal determinants of leprosy susceptibility in
humans.
The discovery of immune response genes linked to the major histocompatibility
complex (MHC), together with the discernment that the result of an infection with
Mycobacterium leprae equalized cellular immunological reactivity of the host to the bacillus,
led to a considerable number of studies on the relation between leprosy, or types of leprosy ,
and the human leukocyte antigen (HLA)– the MHC in man. Family studies provided evidence
that a recessive gene linked to HLA predisposed leprosy. Other studies have clearly shown
that these genes linked to HLA do not necessarily confer susceptibility to leprosy itself, but
rather determine the type of leprosy that will develop.
For many years, the State of Colima has held the number one position nationally for
leprosy prevalence. Despite Health Department efforts, two municipalities having a prevalence
rate above 1.0 per 10,000 inhabitants were reported in the year 2005. Out of a total of 638
registered patients, 492 of them were cases of Lepramatose leprosy.
The present study has been taken up again to research the relation between the DQB1∗
and DRB1∗ region of the MHC and the susceptibility to Lepramatose leprosy in 31 patients
presenting with the disease.
4
Previous studies, including our own, have demonstrated that Lepramatose leprosy is
found to be strongly associated with human leukocyte antigens (HLA). In our study, we found
that the DRB1∗15 locus (in 2 out of every 10 patients) as well as the DRB1∗04 locus can play
an important role in leprosy pathogenesis. The DRB1∗12 allele was the least frequently found
(1.79%), suggesting it as a protecting factor. With regard to the DQB1∗ locus, no relation was
found between the DQB1∗03, DQB1∗06, DQB1∗02, DQB1∗05 and DQB1∗11 alleles.
5
INTRODUCCIÓN
1.1.- DEFINICIÓN: Enfermedad infecto-contagiosa, poco transmisible, con
manifestaciones esencialmente en piel y nervios periféricos, aunque puede ser sistémica; hay
pérdida de la sensibilidad, y puede acompañarse por fenómenos agudos; causada por el
bacilo de Hansen ó Mycobacterium Leprae (Hansen, 1872).
1.2.- SINONIMIA : Lepra, hanseniasis, también se le conoce como “Mal de sangre”,
“Enfermedad de Hansen”; “Mal encerrado de san Antonio” ó de “San Lázaro”. (20)
2.- MARCO TEÓRICO: La lepra afecta a 700,000 personas cada año y representa
uno de los mayores problemas de salud en países subdesarrollados. En un reporte de la
Organización Mundial de la Salud emitido en el año 2004, se menciona que la lepra está
reportada en 110 países a nivel mundial con un total de casos registrados en el año 2002 de
524,311. El Continente Americano presenta un número de casos registrados de 75,686 y una
tasa de prevalencia de 14.43 por 10,000 habitantes en el año 2002(26), por lo que se considera
un problema de salud grave. El Continente Africano con un número de casos reportados de
53,888 y, una tasa de prevalencia del 10.27 por 10,000 habitantes. Cabe mencionar que el
Continente Europeo es el único que aparece con una tasa de prevalencia de 0.008; es la que
considera la O.M.S. de menor que 1 por cada 10,000 habitantes. Donde podemos observar la
situación de la lepra en el año 2002 en un reporte emitido por la Organización Mundial de la
Salud, en el anexo B ).
Unas 800 mil personas enferman de lepra al año en el mundo, según la Asociación
alemana de Ayuda contra la Lepra y la Tuberculosis ( DAHW ) (37), la cual asegura que la
cifra supera los 500 mil casos anuales reconocidos de manera oficial. Es muy importante el
diagnosticar al enfermo en época temprana, ya que muchos de los afectados no saben que
6
tienen lepra, debido al largo período de incubación del padecimiento, que puede ser incluso
de varias décadas. Añadiendo que el enfermo no visita las organizaciones de salud porque no
quiere ser considerado leproso, enfermedad que tiene una gran estigma social aún en nuestros
días. Es importante recalcar que la lepra es un problema de salud en colima, e insistir a
nuestras autoridades en la búsqueda de casos nuevos.
Millones de personas sufren las consecuencias de la lepra en los países en vías de
desarrollo, convirtiéndose en disminuidos físicos, individuos desfigurados y discriminados
socialmente. El padecimiento es curable, ya que las bacterias que la causan pueden
eliminarse con antibióticos, lo que no ocurre con las mutilaciones y desfiguraciones
provocadas, que permanecen como secuela de la enfermedad. La cifra de personas
disminuidas físicas como consecuencia de la lepra se sitúa entre dos y cuatro millones, según
datos de la DAHW. La lepra no afecta sólo a los enfermos, sino también a sus familias, niños
o incluso nietos, que son excluidos socialmente y se convierten en víctimas de la pobreza.
La OMS estima que más de dos millones de pacientes deben ser todavía descubiertos
en los próximos tres años y el 90% de ellos viven en 13 países donde la prevalencia de la
lepra en este momento del 4.4% por cada 10,000 habitantes (21). Afecta cualquier raza.
Predomina en varones, casi siempre se inicia durante la niñez y la adolescencia, pero suele
diagnosticarse hasta la adultez, donde el rango en años de convivencia de los antecedentes
previos de lepra en la República Mexicana es de 22 años, se pueden observar en el anexo G ),
los años en medias y rangos de tiempo y, convivencia de los antecedentes previos de lepra
según parentesco con el caso nuevo de lepra, del año 1998 al 2002. Constituye un problema
de salud pública prioritario; es la principal causa de neuropatía. Se ha observado una mayor
frecuencia relacionada con pobreza, promiscuidad, falta de servicios sanitarios y
desnutrición.(1)
7
La enfermedad predomina en estratos socioeconómicos y educativos bajos, en 75%
son débiles sociales. A esto se agrega el desconocimiento y apatía no sólo del enfermo y su
familia respecto a la enfermedad, sino del personal médico, paramédico y el público en
general. La única manera de luchar contra el desconocimiento es la educación acerca de la
lepra en todos los niveles
A pesar de ser tan antigua como la humanidad, pues se ignora a ciencia cierta donde y
cuando apareció, sigue cargando el más injusto prejuicio que alguna enfermedad pueda tener
pues inclusive médicos, enfermeras y personas de alto nivel cultural la siguen considerando
como el símbolo de todo sufrimiento, de todo castigo, la más terrible, la más contagiosa, el
ejemplo de incurabilidad, ideas que prevalecieron en la edad media y que aún perdura en
nuestra época, iniciado el siglo XXI. (3, 15)
La lepra es considerada un padecimiento de salud pública, debido a la discapacidad
que produce en los pacientes, (21) el daño tanto físico como psicológico ocasionado por la
deformidad de sus extremidades y lesiones en su cara; así como el rechazo social que sufre al
verse afectada su imagen física.
3.- EPIDEMIOLOGIA.
3.1.- DATOS EPIDEMIOLOGICOS : La lepra es un padecimiento que existe en
México desde el siglo XVI, (25) fue traída por los españoles afectando la cuenca del atlántico y
posteriormente la introducción de los asiáticos portadores en la cuenca del pacífico,
extendiéndose en el país para formar focos delimitados y aumentando gradualmente el número
de casos. Debido a la cronicidad del padecimiento, a su largo periodo de incubación y la
aparición de medicamentos adecuados para su tratamiento.
8
En México la endemia es de tipo medio, con prevalencia menor de 0.5 por 10,000
habitantes; se han informado 32,000 enfermos, pero se calcula de 50,000 a 100,000. Es
endémica en toda la República; predomina en tres focos: el principal es el centro occidental,
que abarca Sinaloa, Nayarit, Jalisco, Colima, Guerrero, Michoacán. (1), Donde podemos ver
gráficamente la tendencia de la Lepra en el periodo 1990 – 1999 en el anexo C ) e I. ). Cabe
mencionar que la tendencia que generó ésta enfermedad del año 1990 al 1999 en dicha
región, de haber 18 entidades federativas, en que la lepra no estaba eliminada; en el año de
1999 solamente los estados de Colima y Sinaloa eran las entidades que no habían podido
eliminar la Lepra. Actualmente los casos de lepra se localizan fundamentalmente en regiones
limitadas o determinadas de los países endémicos por razones geográficas o de otra índole,
que hacen difícil la llegada de los medicamentos a los enfermos. También influyen los
tramites burocráticos que todavía se exigen en determinadas regiones y la falta de recursos
humanos para el diagnóstico y tratamiento en las citadas zonas.(26).
3.2.- DATOS EPIDEMIOLOGICOS ESTATALES : En el estado de Colima se
iniciaron las actividades de reconocimiento y manejo de enfermos de lepra en 1938 con la
fundación del dispensario Dr. Ricardo Cicero; que atendía a los pacientes de lepra utilizándose
en aquella época el aceite de chamugra, que era la única terapia conocida en aquella época,
posteriormente se introdujo el tratamiento de por vida con sulfona. (21) La introducción de la
poli quimioterapia en el país en 1989 representó una etapa importante a nivel mundial,
nacional y en los estados prioritarios, como en el estado de Colima en la lucha y control del
tratamiento para lograr la eliminación de la lepra.
Por décadas el estado de Colima a ocupado el primer lugar nacional, en tasa de
prevalencia por 10,000 habitantes, de lepra. (21) A partir de la introducción de la poli
quimioterapia la situación epidemiológica ha cambiado gracias a los diversos apoyos
obtenidos y a los medicamentos actualmente utilizados; en donde en los anexos J ) y K ), se
reportan el histórico de la incidencia de lepra de 1990 al año 2005 y, la prevalencia
respectivamente. Cabe mencionar que aunque el estado de Colima ya no se encuentra en el
primer lugar Nacional de casos de Lepra, es importante enunciar que por los reportes
9
emitidos por la Secretaria de Salud del Estado de Colima; se considera a la Lepra como un
serio problema de Salud Pública ya que en el análisis del programa de prevención, control y
eliminación de la lepra del periodo enero a septiembre del 2005 hay registrados un total de
casos en los 10 municipios del Estado de 638(25). En donde la tasa de prevalencia del
municipio de Ármeria reporta de 1.60 y, el municipio de Minatitlán de 1.090, no lejos de
ellos se encuentran los municipios de Coquimatlán y Tecomán con una tasa de prevalencia de
0.980 y 0.740 respectivamente. Donde podemos observar gráficamente de enero a septiembre
del 2005 el número de casos registrados por municipios y la suma a nivel estatal, ver anexo N
). Así como la situación estatal en el año 2004, ver anexo M ). Sin embargo, siempre se
recomienda multiplicar por 2 el registro obtenido, para tener un dato más cercano a la
realidad. (29)
Actualmente se observa una tendencia descendente de la incidencia y distribución del
padecimiento. Las acciones tienden a controlar este problema de salud pública y se orientan a
la utilización de esquemas de tratamiento por tiempo limitado de acuerdo con las
recomendaciones de la OMS. Este tratamiento de poli quimioterapia garantiza la curación
clínica y bacteriológica de los pacientes.
Las ideas anacrónicas y equivocadas respecto a la transmisibilidad de la enfermedad y
su no-curación, provocó la persistencia de perjuicios y dificultad para el desempeño de las
actividades que el personal de salud realiza en su lucha para el control y el tratamiento de la
enfermedad.
4.- ETIOPATOGENIA : Se origina por el bacilo de Hansen ó M. leprae, mico
bacteria intracelular no cultivable; pertenece a la clase Actinomicetales; es un bacilo
acidorresistente de 1 a 8 micras de largo por 0.3 a 0.5 micras de ancho, rectilíneo o curvado;
se presenta en agrupamientos unidos por una sustancia llamada glea, que miden de 100 a 200
micras y se denominan globias. (1).
10
Las principales vías de entrada son la piel y mucosa nasal. La mico bacteria entra por
la piel o la nariz y se contagia a través de estornudos, moco y saliva ó de las ulceraciones de
la piel de un enfermo sin tratamiento. La mico bacteria afecta primero la parte interna de la
piel, donde destruye las fibras nerviosas que transmiten las sensaciones de frío, calor ó
dolor.Es un bacilo de muy baja virulencia y mínima patogenicidad, no existe otra enfermedad
en el que el paciente muestra tal cantidad de gérmenes en los tejidos afectados como en la
lepra y pierde rápidamente esa patogenicidad, cuando sale al exterior de las células en las
que vive. (15)
La entrada del Mycobacterium leprae al organismo en el 90% de las personas lleva a
una infección subclínica y a la cura sin tratamiento. Esta resistencia natural proviene de la
respuesta inmune, de la magnitud y de la frecuencia de la exposición al bacilo. La
susceptibilidad inmunológica del huésped, la magnitud del inóculo y las necesidades básicas
insatisfechas, desnutrición, hacinamiento, mala higiene personal y de la vivienda, constituyen
los factores de riesgo asociados con la presencia de un caso nuevo de lepra.(28)
En la lepra lepromatosa hay una dicotomía inmunitaria, por el deterioro de la
inmunidad celular específica ante M. Leprae, e inmunidad humoral normal. En la mayoría de
las personas con inmunidad celular normal y que reciben los bacilos de Hansen en cantidad y
por tiempo suficientes, éste es objeto de fagocitosis inmediata y se produce la lepra infección
( no la enfermedad ). En la lepra lepromatosa, los macrófagos fagocitan a los bacilos, que se
reproducen en abundancia y transforman a los macrófagos en células vacuoladas llenas de
bacilos ( células de Virchow ).
En un 10% de la población se desarrolla una lepra indeterminada que si se diagnostica
a tiempo y se trata, cura sin dejar secuela. Cuando no hay un diagnóstico precoz se
desarrollan formas clínicas estables o inestables de acuerdo a la respuesta inmune: Lepra
Tuberculoide, Lepra Lepromatosa o Lepra dimorfa.
11
Rotberg, leprólogo brasileño, habló de la existencia de un factor natural de resistencia,
factor N que tendríamos el 95% de los seres humanos y sólo un 5% carecería de él. (15) Estas
personas, la margen anérgica, al tener la posibilidad de recibir bacilos, serían las que podrían
tener la lepra enfermedad. Actualmente este factor N puede materializarse en la competencia
inmunológica del paciente que le permite la destrucción de los bacilos.
Actualmente conocemos que la lepra es familiar debido a que es por afectación
genética-inmunológica, donde está afectada la inmunidad celular y es transmitido a los
familiares, de ahí la importancia de revisión de contactos.
Estos diferentes tipo de lepra, que pueden desarrollar los individuos están
relacionados con los genes ligados al sistema CMH. Se sabe que los armadillos de nueve
bandas padecen la infección, posiblemente contraída originalmente de pacientes
multibacilares antes de la época de las sulfonas y que puede haber infección entre ellos. (28)
Se considera que la lepra es una enfermedad multifactorial que depende del estado
inmunitario del paciente, la dosis infectante y la virulencia del microorganismo, así como de
la frecuencia de la exposición y la duración de la misma. (1) La incubación no está bien
precisada; puede variar de seis meses a cinco años, aunque se han observado lactantes
afectados, y hay controversias en cuanto a la existencia de lepra neonatal. Dentro de la
familia la transmisión se produce de cinco a ocho veces más a menudo que afuera; 29% de
quienes comparten el mismo lecho adquiere la enfermedad dentro del hogar, pero sólo se
observa lepra conyugal en 6 por ciento.
En 1990 la Asamblea Mundial de la Salud aprobó la propuesta de eliminar la Lepra
como problema de salud pública para el año 2000. (10) Lo que se definió como la reducción de
la tasa de prevalencia a cifras inferiores a 1 por 10,000 habitantes, por lo que esta meta no
significa la erradicación de la enfermedad sino la reducción de la prevalencia a niveles muy
bajos, en los que se considera que el potencial de transmisión es muy limitado.
12
Por mucho tiempo, se ha debatido sobre el rol de los factores genéticos y ambientales
en la determinación de la ocurrencia y el tipo de lepra. (22) Una voluminosa literatura
documenta la agregación de la lepra en familias y discute la relativa importancia de la
herencia ( los determinantes genéticos de la susceptibilidad a la infección por Mycobacterium
leprae ) y el contagio ( contacto cercano entre miembros de la familia ), ver anexo F ) y H ),
en su aparición; donde se reporta en primer lugar el hermano, seguido del padre, y en último
lugar el amigo. Estudios de diferencias raciales, patrones genealógicos y marcadores
genéticos han sugerido el posible papel de los factores genéticos en el control de las
respuestas del anfitrión a la lepra, y estudios gemelos, han proporcionado fuerte evidencia a
favor de una hipótesis que apoya la determinación genética.
Se puede suponer que las diferencias entre hospederos en respuesta a la infección con
el bacilo de la lepra, reflejan diferencias en la competencia inmunológica específica entre
individuos. Tal suposición es consistente con la variación en tipos patológicos que se
manifiesta en pacientes con lepra, cuyo espectro de enfermedad va del lepromatoso ( conteo
alto de bacteria en la piel y poca o ninguna respuesta celular ) al tuberculoide ( poca o
ninguna bacteria en la piel y fuerte respuesta celular ).
Debido a la asociación funcional entre los genes de CMH y una variedad de
desórdenes inmunopatológicos, varios investigadores han indagado sobre la hipótesis de que
alelos específicos de CMH podrían ser responsables de los diferentes mecanismos
inmunopatológicos de la lepra. Varios de estos estudios revelaron que los pacientes con lepra
poseían un ligero exceso de ciertos alelos, en comparación con los controles sanos. (22) Sin
embargo, el alelo putativo era diferente en cada estudio y los niveles de significatividad
estadística de los resultados podían cuestionarse, debido al gran número de alelos que se
investigaron. Sin embargo, como lo hicieron notar McDevitt y Bodmer (30), tal variación entre
asociaciones de alelos CMH específicos en diferentes poblaciones podría esperarse si el
factor que controla la enfermedad no fuera el mismo alelo CMH, sino que estuviera ligado a
la región CMH, encontrándose las dos regiones en “desequilibrio de enlace” dentro de la
población ( es decir, la asociación entre alelos específicos enlaza en la población no se
13
completó, pero fue mayor de lo que se podía esperar de una variedad aleatoria ). La hipótesis
de un enlace entre los genes que controlan la enfermedad y los genes CMH es consistente
con otra evidencia que indica que un complejo de genes de respuesta inmunológica podría
estar estrechamente ligado a la región de CMH más importante en el cromosoma 6 en
humanos. Los autores trazaron un mapa de la susceptibilidad a la lepra en una región de 6.4
Mb en el brazo corto del cromosoma 6. Utilizaron secuenciación comparativa y búsquedas en
bases de datos para identificar 64 SNPs en la región, de tal forma que por lo menos uno de
ellos estaba asociado con cada uno de los 31 genes que residen en esta región. (16) Las
variantes que controlan la susceptibilidad a la lepra se sitúan en un bloque de 80 Kb.
La hipótesis de un factor ligado a CMH que controla la respuesta del anfitrión a la
lepra condujo a de Vries et al. a investigar la asociación entre tipos específicos de CMH
(haplotipos) y la lepra dentro de familias que presentaban casos múltiples, asumiendo que
cualquier enlace estaría presente entre individuos estrechamente emparentados. Encontraron
fuerte evidencia para una asociación entre la distribución de haplotipos paternales y la
distribución de lepra tuberculoide o subpolar dentro de 16 familias en Surinam.
Estos estudios no sólo representaron un avance considerable en la metodología de los
estudios de familias sobre enfermedades infecciosas, sino que también sugirieron una visión
importante hacia el mecanismo de respuesta a la infección por M. leprae. Es claro que se
necesita corroborar con muestras de estudio más grandes, con diferentes poblaciones y con la
inclusión de miembros de la familia sanos para asegurar que cualquier distribución sesgada
de haplotipos esté asociada con la lepra y no sea un reflejo de un sesgo en el comportamiento
de segregación de esos haplotipos en particular.
La confirmación y elucidación de un mecanismo genético que sustenta la respuesta
del anfitrión a la lepra tiene importantes implicaciones tanto prácticas como teóricas. (22) La
habilidad de identificar portadores de genotipos de susceptibilidad permitiría un rápido
reconocimiento de individuos en alto riesgo de desarrollar la enfermedad. En segundo lugar,
podría proporcionar una pista hacia el mecanismo bioquímico que sustenta las diversas
14
respuestas del anfitrión a la infección por M. leprae. Finalmente, podría tener implicaciones
sobre la estrategia y efectividad de los intentos por crear una vacuna contra la lepra.
Se ha encontrado relación del HLA-DR2 y HLA-DR3 con lepra tuberculoide, y
aumento del haplotipo DR-2 y DQw1 entre lepra lepromatosa. (1) La lepra está asociada a
factores genéticos del ser humano. Los genes se localizan en los cromosomas. Éstos son
cuerpos individuales apareados, constituidos por DNA y proteínas especiales que se
encuentran en el núcleo celular. (11) Un cromosoma de cada par homólogo es derivado de la
madre y el otro del padre. El hombre tiene 23 pares. Los genes se ordenan en forma lineal a
lo largo de cada cromosoma. Cada gen tiene una posición definida ( locus génico ) y una
estructura y función individuales.
Las diferencias genéticas individuales en la eficiencia de las vías metabólicas se cree
que predisponen a enfermedades que son el resultado de la interacción de varios genes, por lo
general en combinación con influencias ambientales particulares. Ellas podrían incluso
proteger a un individuo de una enfermedad a la cual otro individuo esté propenso. El análisis
genético convencional, examina la relación genética de individuos basada en su parentesco.
(11) Estas relaciones de herencia están presentes en una familia. Un rasgo observado se
denomina fenotipo. Éste puede ser una enfermedad, un grupo sanguíneo, una variante
proteica o cualquier atributo determinado por observación.
El fenotipo depende en gran medida del método y la precisión de las observaciones.
El término genotipo se refiere a la información genética en la que se basa el fenotipo.
Las definiciones de genotipo y fenotipo se refieren a la información genética
contenida en un determinado locus genético. El locus génico es el sitio dentro del cromosoma
donde reside la información para un rasgo determinado. Las diferentes formas posibles de la
información genética en los locus se llaman alelos. En los organismos diploides ( todos los
animales y la mayoría de las plantas ) hay tres posibles genotipos con respecto a dos alelos en
15
cualquier locus: 1 ) homocigota para un alelo, 2 ) heterocigota para dos alelos diferentes y 3 )
homocigota para el otro alelo
5.- COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD
5.1.- GENES DE LA REGIÓN DEL CMH : La región del CMH ( complejo mayor de
histocompatibilidad ) es una región de genes altamente polimorfos ( alrededor de 10 a 50
álelos por locus ). (11) Abarca cerca de 3,500 Kb, en el brazo corto del cromosoma 6 en seres
humanos: En conjunto se los denomina genes de la respuesta inmune ( Ri ). Se expresan
sobre la superficie de varias células. Sus productos pueden demostrarse serológicamente o
por reacciones celulares en un ensayo de linfocitos mezclados. Los genes del CMH controlan
la respuesta inmune para proteínas antigénicas por la unión específica a células T. Es
necesario aclarar, que nuestro estudio nombraremos al sistema CMH, como complejo
principal de histocompatibilidad ( CMH, del inglés major histocompatibility complex ) ya
que es un estudio realizado en humanos.
5.2.- ESTRUCTURA BÁSICA DEL COMPLEJO GÉNICO CMH EN LOS SERES
HUMANOS : Los loci del gen de la región del CMH se agrupan en tres clases ( I-III ): La
clase I en seres humanos comprende los HLA-A; HLA-B y HLA-C. La clase II comprende
HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR en seres humanos. Estrictamente hablando, los genes de la
clase III no pertenecen a los loci del CMH: éstos contienen genes para diferentes proteínas
del complemento y otros pocos genes. (2)
5.3.- RECEPTORES DE CÉLULAS T : La superficie celular de un linfocito T
contiene moléculas receptoras que, con alta especificidad, reconocen antígenos extraños y
moléculas de la superficie celular del CMH. El receptor antigénico de la célula T es un
complejo de varias proteínas integrales de la membrana plasmática. A diferencia de las
células B, las células T sólo reconocen fragmentos de proteínas antigénicas extrañas. Además
se unen físicamente al CMH de una célula presentadora de antígeno: Durante la maduración
16
de las células T en el timo, segmentos del gen de la célula T son reestructurados en un orden
definido por recombinación somática, semejante a la formación de inmunoglobulinas. (11)
5.4.- FUNCIÓN DE LAS MOLÉCULAS CMH: Las moléculas CMH tienen la
función de unir péptidos que podrían ser potencialmente reconocidos por un receptor
específico en los linfocitos T, a causa de la función de unión a péptidos; puede hablarse de
las moléculas CMH como receptores, pero son un tipo especial de receptores, ya que al
menos hay tres características que las distinguen de otros receptores : dependencia de
expresión de las moléculas CMH de acuerdo con la presencia de péptidos; estabilidad de las
uniones péptido-molécula CMH y la relativa promiscuidad en la unión de péptidos. Mientras
que otros receptores no se unen con sus ligandos durante una buena parte de su vida media,
las moléculas CMH se asocian con péptidos desde su muy temprana formación . (5). La
generación de péptidos antigénicos y su asociación con moléculas del complejo mayor de
histocompatibilidad (CMH) requiere la acción concertada de un conjunto de moléculas
accesorias que incluye chaperonas, transportadores de péptidos y proteasas encargadas de
degradar los antígenos. (12)
5.5.- INMUNOGENÉTICA DEL CMH: El complejo principal de histocompatibilidad
(CMH, del inglés major histocompatibility complex) está conformado por un grupo de genes
que, entre otras características, son extraordinariamente polimórficos. (5) Los productos de
estos genes se expresan en la superficie de las células. Los genes de CMH desempeñan una
función importante en la respuesta inmunológica; algunos de ellos, como es el caso de los
genes CMH, son imprescindibles para el desarrollo de una respuesta inmunológica en contra
de antígenos proteicos. Por otro lado, los genes del complemento también localizados dentro
del CMH, son importantes en la respuesta inmunológica innata. En otras palabras, las
moléculas de CMH de clase I y clase II son el mecanismo por medio del cual el organismo
reconoce las estructuras propias y logra diferenciarlas de las estructuras extrañas; de lo
anterior, la célula responsable es el linfocito T, que sólo reconoce los antígenos cuando éstos
están acoplados a una molécula CMH.
17
5.6.- EXPRESIÓN Y REGULACIÓN DE LOS GENES CMH.- La expresión de
genes MHC de clase II es más restringida en relación con los genes de clase I. La expresión
de las moléculas CMH de clase II se limita a las células inmuno-competentes, como los
linfocitos B, células T activadas, macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans y
epitelio tímico. Los elementos reguladores que controlan la expresión de genes MHC de
clase II están bien caracterizados; éstos han mapeado en el segmento corriente arriba del
sitio de inicio de transcripción y el primer intrón del gen DRA.(5)
En la nomenclatura para los genes CMH de clase II, la primera letra ( D ) identifica el
gen ( locus ), la segunda especifica a la familia de donde proviene ( P, Q y R ) y la tercera
indica el tipo de gen ( A para la cadena α y B para la cadena β ). El primer número que sigue
de esas tres letras especifica el locus, y el resto denota el alelo. La designación del locus
(letras ) y el alelo ( números ) está separado por un asterisco (*). Por ejemplo: DQB1*0402 y
DRB1*0807.
FUENTE: http://aulabio22.us.es/Departamentos/INMUNOLOGIA/Nueva%20carpeta/Mapamhc.htm
18
La expresión de genes CMH de clase II es más restringida en relación con los genes
de clase I. La expresión de las moléculas CMH de clase II se limita a las células inmuno-
competentes, como los linfocitos B, células T activadas, macrófagos, células dendríticas,
células de Langerhans y epitelio tímico. Participa en la regulación del sistema inmune, se ha
propuesto que estos genes podrían ser importantes en la patogenia de enfermedades, en
particular aquéllas donde se observan fenómenos como la inmunorregulación.
Las correlaciones con una enfermedad pueden ser positivas o negativas: las primeras
implican que un alelo predispone a una enfermedad, mientras que una negativa sugiere que el
alelo CMH pueda tener un efecto protector.
La lepra lepromatosa, que es una forma grave de la infección por Mycobacterium
leprae incontrolable por el sistema inmune que se relaciona con la especificidad serológica
HLA-DR2 ( codificada por el locus DRB1 ). (5)
La resistencia del huésped humano a la infección. por M. Leprae está influida por
factores genéticos, lo cual explica el espectro clínico y patológico tan variado de la
enfermedad. La capacidad de los macrófagos para detener la multiplicación de las mico
bacterias varía mucho, pero no se conoce con precisión la función del gen que expresa y
determina la capacidad bacteriostática en los macrófagos. (8) Las moléculas de clase CMH II
intervienen en la respuesta específica a la infección y en la evolución de la respuesta inmune
secundaria a los antígenos de M. leprae. Los sistemas CMH que controlan la inmunidad
mediada por células hacen probable que las diferencias en los haplotipos CMH contribuyan
al amplio espectro de respuesta inmune observada en la lepra. Debido a la complejidad de los
factores de riesgo intrínsecos de la susceptibilidad o resistencia a la lepra, no se han descrito
los determinantes genéticos con precisión, pero se asume que por lo menos dos loci pueden
contribuir a la transmisión del M. leprae, junto con los eventos ambientales ligados a la
duración y a la intensidad de factores de riesgo extrínsecos, variando en función del tiempo.
En general, los isotipos HLA-DR están asociados con respuesta protectora, mientras que los
isotipos HLA-DQ están asociados con las formas multibacilares de la lepra lepromatosa. (8)
19
El papel de la genética aunque discutido no puede negarse, se dice que la resistencia
se hereda en forma dominante y la predisposición en forma recesiva, y ello explica
precisamente lo raro de la lepra conyugal, la falta de contagio de la enfermedad al personal
que trabaja con pacientes y el hecho de que cuando son los dos padres los enfermos, el
número de hijos que puede enfermarse aumenta de manera importante. También hay estudios
con gemelos.
Estudios previos, han demostrado que la lepra se encuentra fuertemente asociada a los
antígenos de leucocito humano ( HLA )-DR2, especialmente los hálelos DRB1*1501 y
DRB5*0101 del grupo DR2. (14)
Mientras que en un estudio realizado por Satoru, J. los alelos predominantes en sus
estudios fueron los alelos: HLA-DRB1*1501, DRB1*0405, DQB1*0602, DQB1*0401 los
cuales estuvieron asociados positivamente con los pacientes leprosos. (14)
En estudios mundiales, mencionan que el alelo HLA-DRB1*1501 podría tener un
papel importante en la patogénesis de la lepra en algunas poblaciones. (14) Mientras que en un
estudio realizado en Yogyakarta, Indonesia, (6) el antígeno DRB*02 estuvo asociado con la
lepra LL/BL. También han correlacionado que los hijos afectados con lepra lepromatosa ( LL
ó BL ) compartieron los haplotipos de los padres con mayor frecuencia de lo esperado
(P<0.05 ). Estos datos confirman que el control del tipo de lepra y la predisposición al estado
lepromatoso están ligados al HLA. (18)
El antígeno HLA-DRB1*12 se encontró negativamente asociado con la lepra en
cualquiera de sus tipos. (6) Esto quiere decir que la resistencia a la enfermedad está asociada a
HLA-DRB1*12. Mientras que en un estudio realizado en el norte de la India, los no
relacionados a la enfermedad fueron : DRB1*0701, DQB1*0201, que estuvieron disminuidos
en pacientes con lepra multibacilar.
20
Los hallazgos de asociación entre HLA-DR y HLA-DQ con lepra han sido también
resueltos por tipificación de HLA. (9) DRB1*1501, DRB1*1502 y DQB1*0601 ocurre más
frecuente en todas las formas de lepra que en controles, pero la asociación es más fuerte con
LL que TT. Los alelos DRB1*1501, DRB1*1502, DQB1*0601 (7)están asociados con lepra
lepromatosa, en Hindúes. Mientras que en pacientes Japoneses, los asociados a LL son:
DQB1*0602. (9)
Para adquirir la lepra infección, se requiere solamente recibir por un tiempo variable,
tal vez meses ó la media nacional que son 22 años, (26) una gran cantidad de bacilos lo cual se
logra en el medio intra domiciliario mediante convivencia íntima y prolongada con un
paciente infectante. Para adquirir la lepra enfermedad, se necesita además de recibir los
bacilos, tener esa predisposición probablemente heredada, que permita al bacilo reproducirse
y producir la enfermedad.
La información proveniente de la secuencia del genoma humano modificará favorable
o desfavorablemente muchos aspectos de la práctica clínica. (4) Y, a través de nuestra
comprensión de los mecanismos de las enfermedades, incrementará y guiará el desarrollo de
nuevas drogas y procedimientos terapéuticos. A corto plazo, sin embargo, el conocimiento
del genoma tendrá un profundo impacto clínico en la capacidad de diagnóstico de los
laboratorios de genética clínica. La fenotipificación molecular, utilizando información
genética y genómica, permitirá una más temprana y exacta predicción y diagnóstico de las
enfermedades y de su progresión. La medicina estará orientada hacia la prevención de las
enfermedades, y no hacia los esfuerzos por curar personas en estado avanzado de
enfermedad.
La investigación genética reportada recientemente ha proporcionado un poderoso
discernimiento hacia la causa de esta enfermedad y los factores genéticos de riesgo comunes
han sido identificados. Esta información guiará futuras investigaciones orientadas a controlar
la lepra. En la mayoría de las enfermedades, la atención médica no comienza hasta que el
paciente ha visitado a su doctor presentando varios síntomas. En ése momento, puede ya ser
21
tarde en la evolución natural de la enfermedad y la intervención terapéutica puede limitarse a
aliviar los síntomas y retrasar el progreso de la enfermedad. Pero en algunas áreas de la
medicina, este acercamiento estandarizado ha avanzado al incorporar múltiples pruebas de
diagnóstico que identifican con precisión los mecanismos de la enfermedad, indican el tipo
más apropiado de intervención terapéutica y evalúan la respuesta terapéutica y las
consecuencias de la enfermedad.
Nuevas herramientas genómicas provenientes del Proyecto Genoma Humano
mejorarán nuestra habilidad para identificar individuos en riesgo o en fase pre-sintomática de
enfermedad y definir con mayor precisión los subtipos de dicha enfermedad en base a sus
pato- fisiologías individuales y sus reacciones a la terapia. (4)
22
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Cuál es la similitud o diferencias en los enfermos con lepra lepromatosa nacidos en el
estado de Colima, respecto a los alelos reportados mundialmente?
MATERIAL Y MÉTODOS
UNIVERSO DE TRABAJO: Población del estado de Colima.
UNIVERSO DE ESTUDIO: Enfermos de lepra lepromatosa que sean la segunda
generación de personas nacidas en el estado de Colima, atendidos por las instituciones de
salud.
UNIDAD DE ESTUDIO: Pacientes diagnosticados de lepra lepromatosa,
provenientes de instituciones de Salud y práctica privada, que cumplieron con los criterios de
inclusión y exclusión, en el periodo enero del 2003 a Agosto del 2005, siendo en total 31
muestras de pacientes.
TAMAÑO DE MUESTRA: Pacientes remitidos para nuestro estudio por distintas
instituciones de salud y área privada, comprendido de enero del 2003 a agosto del 2005 hasta
completar la cantidad de 31 muestras de pacientes que cumplieron con los requisitos de los
criterios de inclusión y exclusión.
23
CRITERIOS DE INCLUSIÓN: Pacientes diagnosticados como lepra lepromatosa
(multibacilar ) según la norma oficial mexicana de la S.S.A. NOM-027-SSA2-1999, que
hayan nacido y vivido en el estado de Colima. Ya sean recién diagnosticados, en tratamiento
o post tratamiento.
CRITERIOS DE EXCLUSIÓN: Todos aquellos pacientes cuyas muestras se haya
hemolizado, que la concentración de DNA para el alelo DRB1* extraído debe tener una
concentración superior a 0.01 µg/µl. La pureza ( A260mm/A280mm ) deberá ser mayor de 1.5 y el
DNA del alelo DQB1* extraído debe tener una concentración superior entre 0.02 µg/µl y 1.5
µg/µl . La pureza ( A260mm/A280mm ) deberá de ser ≥ 1.5.
HIPÓTESIS
HIPÓTESIS NULA: Ho= Los alelos de las regiones DQB1* y DRB1* , en la
población con lepra lepromatosa en el Estado de Colima, son similares por sexo, tipo
sanguíneo y frecuencia alélica.
HIPÓTESIS ALTERNA: Ha= Los alelos de las regiones DQB1* y DRB1* , en la
población con lepra lepromatosa en el Estado de Colima, son diferentes por sexo, tipo
sanguíneo y frecuencia alélica
24
OBJETIVO GENERAL
Determinar la frecuencia de los alelos de CMH Clase II, de las regiones DQ y DR, en
pacientes con lepra lepromatosa en el Estado de Colima.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar los alelos de HLA Clase II, regiones DQ y DR en pacientes con lepra
lepromatosa en el Estado de Colima.
Describir los alelos de HLA Clase II, regiones DQ y DR en pacientes con lepra
lepromatosa en el Estado de Colima.
Analizar los alelos de HLA Clase II, regiones DQ y DR en pacientes con lepra
lepromatosa en el Estado de Colima.
Comparar los alelos obtenidos en nuestro estudio y comparar con los reportados
Mundialmente.
Discutir los alelos de HLA Clase II, regiones DQ y DR en pacientes con lepra
lepromatosa en el Estado de Colima, con los reportados a nivel mundial.
25
DESCRIPCIÓN DE TÉCNICAS DE LABORATORIO
Se extrajo sangre total a los pacientes que cumplían con los criterios de inclusión una
cantidad de aproximadamente 6 a 10 ml de sangre total periférica en tubos con EDTA.
Existen diferentes protocolos para la extracción de los ácidos nucleicos. La mayoría se
caracterizan por el empleo de detergentes y solventes orgánicos que rompen los núcleos de
las células y remueven las proteínas adheridas al ADN, seguidos por la precipitación de éste
con sales y alcoholes. De esta manera son utilizados en la amplificación in vitro po medio de
la PCR. Se utilizó el micrométodo de extracción de ADN por CTAB/DTAB: Método rápido
de extracción de ADN partiendo de poco material biológico: Descrito por Gustincinch en
1991, se basa en el empleo de dos detergentes, bromuro de dodecil trimetil amonio ( DTAB )
y bromuro de hexadecil trimetil amonio ( CTAB ). El DTAB lisa las células blanco y el
CTAB, detergente catiónico, se une al ADN para precipitarlo. El procedimiento de la
presente técnica se describe en el anexo “O”. Así como la técnica de PCR para los alelos
DRB1* y DQB1*. También se agrega en dicho anexo la técnica de tipaje INNO-LiPA HLA
que se basan en los principios de hibridación reversa. El material de ADN biotinilado
amplificado se desnaturaliza químicamente para los alelos respectivos.
26
ANÁLISIS ESTADÍSTICO .
Para cumplir con los objetivos propuestos se aplico la prueba Binomial ( Conover,
1980; Infante et al., 1984 ) y la prueba de Chi-Cuadrada Conover, 1980; Infante et al., 1984 ).
La prueba Chi-Cuadrada se eligió porque permite comparar frecuencias observadas (
frecuencias obtenidas en un experimento o muestreo ) con frecuencias esperadas según un
modelo supuesto ( hipótesis nula ). En este caso la prueba de Chi-Cuadrada se utilizó para: a)
Probar bondad de ajuste una distribución de frecuencias y b) para probar independencia. La
metodología en cada uno de los dos casos es muy similar. La diferencia principal está en la
forma en que se calculan las frecuencias esperadas ya que estas dependerán de la hipótesis
nula en cuestión. (23, 24)
a) Bondad de ajuste una distribución de frecuencias. Aquí el juego de hipótesis a
probar es: el estadístico de prueba tiene una distribución Chi-Cuadrado con k-1 grados de
libertad y se define de la siguiente manera:
( )∑
−
−=k
i i
ii
c ee
X1
22 0
.
Donde iO son las frecuencias observadas y ie las frecuencias esperadas. Las
frecuencias esperadas se calculan multiplicando el tamaño de muestra n por cada una de las
proporciones supuestas en 0H . ii ne π= . La Regla de la decisión: es la hipótesis nula se
rechaza con un nivel de significación α si el 2cX resulta mayor que el valor de tabla
[ ]2
1,1 −− kX α o si el valor de probabilidad es menor que α .
27
Donde las variables para el presente estudio fueron: a) los enfermos con lepra
lepromatosa, el alelo DQB1*, el alelo DRB1* y el grupo sanguíneo. Donde a continuación se
describen en una tabla la variables analizadas. Los resultados obtenidos de los 31 pacientes,
se reportan en el anexo A), donde se reportan el código del paciente, el sexo, la edad, el
grupo sanguíneo así como el haplotipos de HLA Clase II, tanto de la región DQB1* y
DRB1*; respectivamente para su análisis.
VARIABLES
VARIABLE NATURALEZA NIVEL DE MEDICIÓN UNIDAD DE MEDICIÓN TÉCNICA DE ESTUDIO ENFERMOS CON LEPRA LEPROMATOSA CUALITATIVA NOMINAL DICOTOMICO
ENFERMOS MULTIBACILARES
ALELO DRB1* CUANTITATIVA DE INTERVALO ALELOS
ALELO DQB1* CUANTITATIVA DE INTERVALO ALELOS
GRUPO SANGUÍNEO CUALITATIVA ORDINAL POLITOMICA ANTÍGENOS
28
RESULTADOS
Prevalencia por sexo
En la Figura 1 se observa que la frecuencia es mayor en los hombres en la muestra
estudiada ( n = 31 individuos ), siendo el resultado de 54.84% hombres y, 45.16% mujeres.
Mujer Hombre
Sexo
0
20
40
60
80
100
Per
cent
aje
45,16
54,84
Figura 1. Prevalencia de la enfermedad de Hansen en la muestra de 31 individuos colimenses.
Para corroborar que en efecto la prevalencia es diferente en los sexos, se aplicó la
prueba de proporciones para una muestra, con la proposición de hipótesis 5.0:0 =HpH vs
5.0: ≠Ha pH . Se encontró que no se rechaza la hipótesis nula, con un nivel de significancia
29
del 5% )05.0( >P , esto, significa que no hay diferencia estadística entre la porción de
hombres y mujeres con la enfermedad.
Prevalencia por tipo sanguíneo
En la Figura 2 se examina la prevalencia de la enfermedad por tipo sanguíneo. Se
evalúa que de los 31 individuos que componen la muestra el tipo de sangre prevaleciente en
los enfermos es el tipo sanguíneo “0”, seguido por el A1. Mientras que del tipo sanguíneo
“B” solamente se encontró a un individuo ( 3.2% ), lo cual es congruente debido a que este es
el tipo sanguíneo dominante en nuestra población es el “0”. (17)
A1 A2 B O
Tsangre
0
10
20
30
40
50
60
Per
cent
aje
25,8
12,9
3,2
58,1
Grupo Sanguíneo
30
Para corroborar si éstas diferencias son estadísticamente significativas se aplicó la
prueba estadística Chi-Cuadrada, comparando los tipos sanguíneos. El juego de hipótesis
que se probó es siguiente: ):( 21 oBAA ppppHo === , donde 1Ap es la probabilidad del
grupo sanguíneo “A1”, el 2Ap es la probabilidad del grupo sanguíneo “A2”, el op es la
probabilidad que el grupo sanguíneo “O” y el Bp es la probabilidad que el grupo sanguíneo
“B”, tengan significancia estadísticas.Se encontró que se rechaza la hipótesis nula( Cuadro
1: 22tablascal χχ > y 05.0<P ), es decir que en efecto existe diferencia significativa entre las
proporciones, por lo que en efecto existe diferencia significativa y el tipo sanguíneo
prevaleciente es el “O”, seguido del “A1”.
Cuadro 1. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias por tipo sanguíneo.
Tipo Sanguíneo observados Esperados iii EEO /)( 2−
A1 8 10.333 0.527 A2 4 10.333 3.882 O 18 10.333 5.688 B 1 10.333 8.430
Total 31 2calcχ 10.097
2
)3,05.0(tablasχ 7.810
31
Locus DQB1*
Frecuencias de los alelos
2 3 4 5 6 11
Alelos
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
Por
cent
aje
16,13
33,87
12,90
16,13
19,35
1,61
Figura 3. Frecuencias relativas de los alelos del locus DQB1*.
Para analizar si las diferencias observadas en las frecuencias son reales se probó la
siguiente hipótesis: 11654320 : ppppppH ===== vs. :aH Al menos una proporción es
diferente. Se rechazó la hipótesis nula (Cuadro 2) con un nivel de significancia del 5%
(Cuadro 2: 22tablascal χχ > y 05.0<P ). Sin embargo, dado que deseamos saber cual es el alelo
asociado con la enfermedad, se procedió a probar el siguiente juego de hipótesis:
32
654320 : pppppH ==== vs :aH al menos una proporción es diferente, es decir se quito
del análisis el alelo 11 el cual es el que menor frecuencias presentó. Bajo esta modificación
no se rechazo la hipótesis nula Cuadro 3: 22tablascal χχ > y 05.0<P ), por lo tanto con una
confiabilidad del 95% se concluye que ninguno de los alelos ( 2, 3, 4, 5 y 6 ) tengan
significancia estadísticas.
Cuadro 2. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos en locus DQB1*
Alelo Frecuencias Porcentaje Observados Esperados
2 10 16.13 10 10.33 0.01 3 21 33.87 21 10.33 11.01 4 8 12.9 8 10.33 0.53 5 10 16.13 10 10.33 0.01 6 12 19.35 12 10.33 0.27
11 1 1.61 1 10.33
8.43
Total 62 100 20.258
11.07
Cuadro 3. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos
eliminando del análisis las frecuencias del alelo 11.
Allelo Frecuencias Observados Esperados iii EEO /)( 2−
2 10 10 12.20 0.40 3 21 21 12.20 6.35 4 8 8 12.20 1.45 5 10 10 12.20 0.40 6 12 12 12.20 0.00
Total 61 2calcχ 8.59
2
)5,05.0(tablasχ 9.49
iii EEO /)( 2−
2calcχ
2)5,05.0(tablasχ
33
Efecto del sexo sobre las frecuencias de los alelos
En la Figura 4 y Cuadro 4 se aprecia que en los alelos 2, 3 y 11 predominan las
frecuencias del sexo femenino, mientras que en los alelos 4, 5 y 6 predominan los del sexo
masculino.
2 3 4 5 6 11
Alelos
0
10
20
30
40
50
Per
cent
aje
10,7
25
17,9 17,9
28,6
20,6
41,2
8,811,8
2,9
Sexo
Femenino
Masculino
Figura 4. Distribución de las frecuencias por sexo para el loci DQB1.
Cuadro 4. Distribución de frecuencias por sexo Allelo Femenino Masculino Total 2 3 (10.7%) 7 10 3 7 (25 %) 14 21 4 5 (17.8%) 3 8 5 5 (17.8%) 5 10 6 8 (28.57%) 4 12 11 0 (0%) 1 1 Total 28 (45.16%) 34 (54.83%) 62
34
Para probar si existe dependencia entre los alelos y el sexo se planteó la
hipótesis: :0H existe independencia entre alelos y el sexo :aH no existe independencia entre
los alelos y el sexo. La hipótesis planteada no contempla al alelo 11, el cual se eliminó del
análisis debido a que presenta frecuencias de cero en el sexo femenino. En este caso no se
rechazó la hipótesis nula (Cuadro 5) con un nivel de significancia del 5% : ( 22tablascal χχ < y
05.0>P ). Esto significa que existe independencia entre alelos y sexo.
Cuadro 5. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos eliminando del análisis las frecuencias del alelo 11.
Allelo Femenino Masculino Total 2 3 7 10 (-4.59) (-5.41) 3 7 14 21 (-9.64) (-11.36) 4 5 3 8 (-3.67) (-4.33) 5 5 5 10 (-4.59) (-5.41) 6 8 4 12 (-5.51) (-6.49) Total 28 33 61
.249.0;49.9;393.5 2
)4,05.0(2 === Ptabascal χχ
Nota: valores observados sin paréntesis y los esperados están dentro de paréntesis.
35
Efecto del tipo sanguíneo sobre las frecuencias de los alelos
En la Figura 5 se advierte que el tipo sanguíneo “A1” y el “A2”son muy semejantes
en los alelos 2, 3, 4, 5 y 6. Mientras que el tipo sanguíneo “0” prevalece en el alelo 3 y el tipo
sanguíneo “B” solamente se encontró en el alelo 5.
2 3 4 5 6 11
Alelo
0
5
10
15
20
Fre
cuen
cias
34
34
21 1
4
2
5
16
56
1
TSanguineo
A1
A2
B
O
Figura 5. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo para el locus DQB1*
36
Cuadro 6. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo Allelo A1 A2 B O Total 2 3 2 0 5 10 3 4 1 0 16 21 4 3 0 0 5 8 5 4 1 2 3 10 6 2 4 0 6 12 11 0 0 0 1 1 Total 16 8 2 36 62
Para analizar si existe dependencia entre los alelos y el grupo sanguíneo se aplicó el
siguiente juego de hipótesis: :0H los alelos y el grupo sanguíneo son independientes vs :aH
los alelos y el grupo sanguíneo no son independientes. Dado que se tienen frecuencias
observadas muy bajas y en muchos casos iguales a cero para los tipos sanguíneos A1, A2 y
B, no fue posible realizar el análisis correspondiente. Utilizando únicamente las frecuencias
del tipo sanguíneo “O” se aplicó la siguiente hipótesis 654320 : pppppH ==== vs
:aH al menos una proporción es diferente para el grupo sanguíneo “O”. En este caso se
rechaza la hipótesis nula ( Cuadro 7: 22tablascal χχ > y 05.0<P ), por lo que se concluye que
existe diferencia significativa entre las frecuencias de los alelos, y el que mayor frecuencias
presenta es el alelo 3 y el que menos presenta es el alelo 11.
Cuadro 7. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias para el tipo
sanguíneo “O”.
Allelo O Observados Esperados
2 5 5 6 0.167 3 16 16 6 16.667 4 5 5 6 0.167 5 3 3 6 1.5 6 6 6 6 0 11 1 1 6 4.167
Total 36 36
22.667
11.07
iii EEO /)( 2−
2calcχ
2)5,05.0(tablasχ
37
Locus DRB1*
Frecuencias de los alelos
En la Figura 6 se aprecia que los alelos 4 y 15 son los que presentan las frecuencias más altas, mientras que los alelos 7, 9, 10 y 12 las más bajas.
1 3 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Alelos
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
Por
cent
aje
12,50
5,36
17,86
1,79
10,71
1,79 1,79
7,14
1,79
7,14
12,50
19,64
Figura 6. Porcentajes de individuos con cada uno de los alelos encontrados en el locus DRB1*.
38
Para nombrar si las diferencias observadas, Figura 6, en las frecuencias son reales se
probó la siguiente hipótesis
1514131211109874310 : ppppppppppppH =========== vs :aH al menos una
proporción es diferente. Se rechazó la hipótesis nula (Cuadro 8) con un nivel de significancia
del 5% ( Cuadro 8: 22tablascal χχ > y 05.0<P ). Así los alelos que mayores frecuencias
presentan son el 4 y el 15.
Cuadro 8. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos del locus DRB1*.
Alelo Frecuencias Porcentaje observados Esperados iii EEO /)( 2−
1 7 12.50 7 4.667 1.167 3 3 5.36 3 4.667 0.595 4 10 17.86 10 4.667 6.095 7 1 1.79 1 4.667 2.881 8 6 10.71 6 4.667 0.381 9 1 1.79 1 4.667 2.881 10 1 1.79 1 4.667 2.881 11 4 7.14 4 4.667 0.095 12 1 1.79 1 4.667 2.881 13 4 7.14 4 4.667 0.095 14 7 12.50 7 4.667 1.167 15 11 19.64 11 4.667 8.595
Total 56 100 2calχ 29.714
2
)11,05.0(tablasχ 19.68
39
Efecto del sexo sobre las frecuencias de los alelos
En la Figura 7 también se analiza que los alelos 4 y 15 son los que más altas
frecuencias presentan, sin embargo en el alelo 4 predominan los del sexo masculino, mientras
que el alelo 15 predominan los femeninos.
1 3 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Alelo
0
5
10
15
20
25
30
Per
cent
aje
14,3 14,3
17,9
3,6 3,6
14,3
3,6
28,6
10,7 10,7
21,4
3,6 3,6
14,3
21,4
10,7
Sexo
Femenino
Masculino
Figura 7. Porcentajes de individuos por sexo encontrados en cada uno de los
alelos del locus DRB1*.
40
Cuadro 9 . Distribución de frecuencias por sexo para el locus DRB1* Alelo Femenino Masculino Total 1 4 3 7 3 0 3 3 4 4 6 10 7 0 1 1 8 5 1 6 9 1 0 1 10 0 1 1 11 0 4 4 12 1 0 1 13 4 0 4 14 1 6 7 15 8 3 11 Total 28 28 56
Para nombrar si existe dependencia entre los alelos y el sexo se probó el siguiente
juego de hipótesis: :0H existe independencia entre alelos y el sexo :aH no existe
independencia entre los alelos y el sexo. El juego de hipótesis planteado contempla
únicamente a los alelos 1,4, 8 14 y 15, los restantes se eliminaron del análisis debido a que
presenta frecuencias de cero. En este caso no se rechazo la hipótesis nula (Cuadro 10) con un
nivel de significancia del 5% ( Cuadro 10: 22tablascal χχ < y 05.0>P ). Esto significa que
existe independencia entre alelos y sexo.
Cuadro 10. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos por sexo eliminando los alelos con frecuencias de cero, para el loci DRB1*.
Alelo Femenino Masculino Total 1 4 3 7 3,76 3,24 4 4 6 10 5,37 4,63 8 5 1 6 3,22 2,78 14 1 6 7 3,76 3,24 15 8 3 11 5,90 5,10 Total 22 19 41
064.0;49.9;862,8 2)4,05.0(
2 === Ptabascal χχ
41
Efecto del tipo sanguíneo sobre las frecuencias de los alelos
En la Figura 8, se puede apreciar que el tipo sanguíneo “O” es el que predomina en
todos los alelos; sin embargo, éste resalta aún más en el alelo 4. El tipo sanguíneo con
presencia un poco menor es el “A1” quien también es más alto en el alelo cuatro. Sin
embargo el tipo sanguíneo “B” está únicamente en los alelos 1 y 14.
1 3 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Alelo
0
1
2
3
4
5
6
Fre
cuen
cias
3
4
3
1
2
3
1 1
2
3
6
1
3
1
4
1
4 4
TSanguíneo
A1
B
A2
O
Figura 8. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo para el locus DRB1*
42
Cuadro 11. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo para el locus DRB1* Allelo A1 A2 B 0 Total 1 3 0 1 3 7 3 0 2 0 1 3 4 4 0 0 6 10 7 0 0 0 1 1 8 3 0 0 3 6 9 0 0 0 1 1 10 1 0 0 0 1 11 0 0 0 4 4 12 0 0 0 1 1 13 0 0 0 4 4 14 2 0 1 4 7 15 3 4 0 4 11 Total 16 6 2 32 56
Como se tienen frecuencias observadas muy bajas en varios alelos y en algunos casos
iguales a cero para los tipos sanguíneos A1, A2 y B, no fue posible realizar el análisis
correspondiente a la dependencia entre alelos y tipo sanguíneo. Por lo que se evaluaron
únicamente las frecuencias del tipo sanguíneo “O” Se probó la siguiente hipótesis
1514131211109874310 : ppppppppppppH =========== vs :aH al menos una
proporción es diferente para el grupo sanguíneo “O”. En este caso no se rechaza la hipótesis
nula ( Cuadro 12: 22tablascal χχ < y 05.0>P ), por lo que se concluye que no existe diferencia
significativa entre las frecuencias de los alelos en el grupo sanguíneo “O”.
43
Cuadro 12. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos en tipo sanguíneo “O” en el locus DRB1*.
Allelo 0 Observados Esperados iii EEO /)( 2−
1 3 3 2.667 0.042 3 1 1 2.667 1.042 4 6 6 2.667 4.167 7 1 1 2.667 1.042 8 3 3 2.667 0.042 9 1 1 2.667 1.042 10 0 0 2.667 2.667 11 4 4 2.667 0.667 12 1 1 2.667 1.042 13 4 4 2.667 0.667 14 4 4 2.667 0.667 15 4 4 2.667 0.667
Total 32 2calχ 13.75
2
)11,05.0(tablasχ 19.68
44
En la tabla No. 1, contiene los datos que se obtuvieron de los pacientes para su análisis.
Tabla No. 1
PACIENTE SEXO EDAD GRUPO SANGUINEO
DQB1* DRB1*
ALELO PAT ALELO MAT ALELO PAT ALELO MAT
1 F 31 "A1" 0402 0602
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
1507/1511
2 F 39 "A1" 0201/0202 05011 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111 1402/1406/1447
3 F 54 "A1" 03011/03012/0309/0310/0313 05011 040302/0446 040302/0446
4 F 57 "A1" 0402 0602 0807/0811
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
5 F 67 "A1" 0201/0202 0302/0307 0402/0414 0428
6 F 68 "A1" 03011/03012/0309/0310/0313 05011 010201/010202 080302/0810/0823
7 F 76 "A1" 0402 050101 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111
080201/080202/080203/080401/080402/080403/080404
8 M 55 "A1" 0201/0202 03011/03012/0309/0310/0313
100101/100102 1402/1406/1447
9 F 5 "A2" 0304 0602
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
1507/1511
10 M 44 "A2" 05011 06011/06013
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
1507/1511
11 M 60 "A2" 0202 0602 030101/030501/030502
0304
12 M 60 "A2" 0202 0602
13 M 74 "B" 050101 050301 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111
140101/140701/140702/1426/1439
14 F 24 "O" 0310 0402 0807/0811
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
15 F 29 "O" 050101 0602 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
16 F 39 "O" 0602 0603 1334/1352 1510
17 F 43 "O" 0602/06111 0603/0614 1317 1317
18 F 71 "O" 03011/03012/0309/0310/031
0402 080101/080102/0806/0816
1338/1348
45
PACIENTE SEXO EDAD GRUPO SANGUINEO DQB1* DRB1*
19
F 74 "O" 0201/0202 0302/0307 090102/0902 120201
20 M 35 "O" 03011/03012/0309/0310/0313
0302/0307 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111 1402/1406/1447
21 M 37 "O" 0201/0202 03011/03012/0309/0310/0313
070101/070102/0703/0704/0705/0706 1424
22 M 49 "O" 0402 0502 0807/0811
150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513
23 M 51 "O" 0302/0307 0302/0307 0404/0408/0419/0423/0431/0444 1402/1406/1447
24 M 53 "O" 030101/0313 0603
25 M 55 "O" 0203 030101/0313 0424/0448
110101/110102/110104/110401/110402/111201/1115/1124/112701/112702/1129/1139/1143/1144
26 M 55 "O" 0402/0414 1105 0404/0408/0419/0423/0431/0444
110101/110102/110104/110401/110402/111201/1115/1124/112701/112702/1129/1139/1143/1144
27 M 62 "O" 0310 030201 0424/0448
110101/110102/110104/110401/110402/111201/1115/1124/112701/112702/1129/1139/1143/1144
28 M 63 "O" 0201/0202 0302/0307 0306/0316/0318 040301/0406/040701/040703/0420/0439
29 M 70 "O" 0202 030201
30 M 76 "O" 0402 050101 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111
140101/140701/140702/1426/1439
31 M 85 "O" 030302 0310 0404/0408/0419/0423/0431/0444
110101/110102/110104/110401/110402/111201/1115/1124/112701/112702/1129/1139/1143/1144
Para cuestiones prácticas, ejemplificamos el alelo MAT como el alelo MATERNO y el alelo PAT como el alelo PATERNO
46
En la tabla No. 2, por fines prácticos, se agruparon en forma ascendente los alelos
encontrados, al lado derecho del alelo respectivos se encuentran las posibles combinaciones
del alelo.
Tabla No. 2
ALELO ALELO DQB1* ALELO ALELO DRB1*
2 0201/0202, 0202, 0203 1 010101/010102/0104/0105/0107/0108/0111 , 010201/010202
3 030101/0313, 03011/03012/0309/0310/031, 03011/03012/0309/0310/0313, 0302/0307, 030201, 030302, 0304, 0310
3 030101/030501/030502, 0304, 0306/0316/0318
4 0402 4 0402/0414, 040301/0406/040701/040703/0420/0439, 040302/0446, 0404/0408/0419/0423/0431/0444, 0424/0448, 0428
5 050101, 05011, 0502, 050301 7 070101/070102/0703/0704/0705/0706
6 06011/06013, 0602, 0602/06111, 0603, 0603/0614 8 080101/080102/0806/0816, 080201/080202/080203/080401/080402/080403/080404, 080302/0810/0823, 0807/0811
11 1105 9 090102/0902
10 100101/100102
11 110101/110102/110104/110401/110402/111201/1115/1124/112701/112702/1129/1139/1143/1144
12 120201
13 1317, 1334/1352, 1338/1348
14 140101/140701/140702/1426/1439, 1402/1406/1447, 1424
15 150101/150102/150105/150201/150203/1503/1504/1506/1508/1509/1513, 1507/1511, 1510
47
DISCUSIÓN
Como hemos señalado con anterioridad, a pesar de los esfuerzos mundiales y
nacionales por distintas organizaciones, dichos esfuerzos no han podido eliminar del ámbito
Mundial y Nacional la enfermedad. Esto a pesar de su antigüedad, ya que se menciona en
antiguos escrito, como el Antiguo Testamento.
Tal ha sido la dificultad en el tratamiento de dicha enfermedad, que la Organización
Mundial de Salud ( O.M.S. ) cambió el concepto de eliminación de la lepra, que antes
significaba erradicación, al que actualmente significa que la tasa de prevalencia sea menor de
1 caso por cada 10,000 habitantes.
En el ámbito estatal, a pesar de los esfuerzos de las distintas instituciones de salud, y
al programa de poli quimioterapia implementado por la O.M.S., sigue siendo un problema de
Salud Pública, donde dos municipios muestran una tasa de prevalencia mayor de 1 por cada
10,000 habitantes.
Con el nacimiento de la Biología Molecular y con el descubrimiento del Genoma
Humano, hemos podido cambiar el concepto de una enfermedad inmunológica, a una de
naturaleza inmuno-genética, donde aproximadamente el 90% de la población tiene un factor
de resistencia a la enfermedad y, el 5% a 10% restante de la población Mundial tiene un
factor de desarrollar la lepra enfermedad.
48
En la última década, con el apoyo de la biología molecular, se han hecho diversos
estudios a nivel Mundial, con distintas razas y con los diferentes espectros que presenta la
enfermedad misma. En el campo de aplicación del complejo mayor de histocompatibilidad
para poder discernir el factor de predisposición de la enfermedad.
Por ser la lepra un problema de salud estatal, nos enfocamos a determinar dicho factor
a desarrollar la enfermedad, donde interviene el complejo mayor de histocompatibilidad y
revisamos la bibliografía, no encontrando un estudio similar al nuestro. Solamente
encontramos un artículo publicado en el año 1987 por Clara Gorodezky et. al (27). en
pacientes con lepra tuberculoide. Y siendo en el estado de Colima la Lepra Lepromatosa la
que predomina en Colima, y la de mayor discapacidad, nos avocamos a discutir los
resultados obtenidos:
1 ) En cuanto a la relación de la enfermedad con respecto al sexo, en nuestra
población estudiada que consta de 31 individuos ( 54.84% hombres y 45.16% mujeres ) no
encontramos una diferencia significativa ( P>0.05 ). Lo que indica que la posibilidad de
contraer la enfermedad no depende del género. Resultados que concuerdan con la literatura
mundial y con la tendencia nacional por sexo publicada por la Secretaría de Salud. (Ver
anexo D ).
2 ) Locus DQB1*. En cuanto al grupo sanguíneo, el grupo sanguíneo predominante es
el “0” con el 58.1% de los casos, seguido del “A1” con el 25.8%, el “A2” con el 12.9% y por
último el Grupo Sanguíneo “B” con el 3.2%. Estadísticamente se rechaza la hipótesis nula de
igualdad de frecuencias, ya que existe una diferencia significativa y el tipo sanguíneo
prevaleciente es el “0”. Lo que concuerda con el grupo sanguíneo predominante en la
población mexicana. Es importante señalar que reporte emitido por cruz roja mexicana, en la
Ciudad de México, el 65% de la población tiene sangre tipo “0”, el 25% es “A”, el 8.5% “B”
y tan solo el 1.5% le corresponde al grupo “AB” (33). Datos que deben ser similares a los datos
estatales, tendencia similar a la reportada por diversos autores a nivel Mundial(31,32,34,26).
49
Es importante recalcar que la identificación del grupo sanguíneo, lo que arroja son
frecuencias de su aparición en nuestra población estudiada; y la frecuencia es aplicable a la
población, no al individuo.
3 ) En el estudio de las frecuencias de los alelos del loci DQB1* en nuestra población,
encontramos que el alelo 3 se presenta en el ( 33.87% ) de los casos, seguido del alelo 6 con
el ( 19.35% ), los alelos 2 y 5 con el mismo porcentaje de ( 16.13% ), el alelo 4 con el
(12.90% ) y por último el alelo 11. Donde el análisis estadístico reportó que había diferencia
significativa entre ellos rechazando la hipótesis nula. Se procedió a realizar el análisis
estadístico para saber cual alelo era el que estaba presente con mayor frecuencia en los
pacientes con lepra lepromatosa, eliminado el alelo 11 que era el que se presentaba con
menor frecuencia. Donde no se rechazó la hipótesis nula con una confiabilidad del 95%,
donde resultó que ninguno de los alelos ( 2, 3, 4, 5 y 6 ) estaba asociado con los pacientes
estudiados. Resultados que no concuerdan con los encontrados por la literatura mundial
donde dice que el loci DQB1* están asociados a las formas multibacilares (8); Pero a pesar
que no se encontró significancia estadística en los resultados, podemos mencionar que el
alelo 2 está disminuido en la lepra multibacilar (6) en una población del Norte de la India. Lo
que podemos rescatar del presente análisis es que el alelo 6, que es el que se presenta en
segundo lugar ( 19.35% ) concuerda que está más frecuente en pacientes con todas las formas
de lepra que en controles, pero la asociación es más fuerte en la lepromatosa. (9) (7)
4 ) Aunque no encontramos relación entre el loci DQB1* y los alelos con respecto al
sexo en la literatura mundial, en nuestro análisis encontramos que los alelos 2, 3 y 11
predominan en el sexo femenino, mientras que los hálelos 4, 5 y 6 predominaron en el sexo
masculino. Pero nuestro análisis estadístico con una ( P>0.05 ), se encontró que no había
ninguna relación entre los alelos encontrados y el sexo. Por que el sexo no influye en el alelo
encontrado. Resultados que esperábamos, ya que los alelos estudiados son autosómicos.
50
5 ) En relación con el loci DQB1* y el grupo sanguíneo, encontramos que el grupo
sanguíneo “0” que se presenta en el alelo 3 con mayor número de frecuencias ( 16% ), y el
comportamiento de los grupos sanguíneos “A1” y “A2” se expresaron de la misma forma en
los alelos 2, 3, 4, 5 y 6. Para saber si existe dependencia entre alelos y grupo sanguíneo se
realizó un análisis estadístico solamente para el grupo “0”, donde se rechazó la hipótesis
nula, donde vemos que el alelo 3 es el que se presenta en mayor número de frecuencias.
Donde encontramos una clara diferencia en la reportada en la literatura (27), en la cual no
encuentran relación entre grupo sanguíneo y el alelo.
6 ) Con lo que respecta a la frecuencia de los alelos del loci DRB1*, encontramos que
los alelos 4 ( 17.86% ) y 15 ( 19.64% ) son los que se presentan con mayor frecuencia
(P>0.05 ). Y en segundo lugar de frecuencias son los alelos 1 y 14 con el ( 12.50% ) de
frecuencia respectivamente. Resultados que concuerdan totalmente con la literatura
mundial(14) donde reportan que éstos alelos están fuertemente asociados a la lepra
multibacilar, mencionando que el alelo HLA-DRB1*1501 podría tener un papel importante
en la patogénesis de la lepra en algunas poblaciones.
Nuestros resultados expresan que el alelo HLA-DRB1*12, que encontramos con una
frecuencia del ( 1.79 % ), se encontró que es el que se presenta con el menor número de
frecuencias en nuestra población estudiada. Lo que pudiera sugerir que la enfermedad está
negativamente asociado con la lepra en cualquiera de sus tipos. (6) Esto quiere decir que la
resistencia a la enfermedad está asociada a HLA-DRB1*12, que puede tratarse de un
marcador sugerente de resistencia.
Podemos expresar que también el alelo DRB1*15 se encuentra más frecuente en todas
las formas de lepra, pero más fuertemente en los casos LL, con lo que concuerda con lo
reportado por Meyer, C. (9).
51
7 ) Con lo que respecta a la relación de sexo con la frecuencia de los alelos,
encontramos que el alelo 4 predomina en el sexo masculino y el alelo 15 en el sexo
femenino. Pero al realizar el análisis estadístico, encontramos con una P>0.05, que no tiene
ninguna relación el sexo y el alelo. Por que el sexo no influye en el alelo encontrado.
Resultados que esperábamos, ya que los alelos estudiados son autosómicos.
8 ) El grupo sanguíneo predominante en el locus DRB1* es el “0” que predomina en
todos los alelos, Aunque resalte más en el alelo 4, al realizar el análisis estadístico,
rechazamos la hipótesis nula ( P>0.05 ), donde no existe relación entre el grupo sanguíneo
“0” y el alelo.
Con lo que podemos concluir, que al investigar la asociación entre tipos específicos
de alelos y la lepra dentro de la familia, ya que en el anexo F), que los casos previos nuevos
reportados por la S.S.A. según su parentesco son el primer lugar el hermano, seguido del
padre; y en el anexo H ) donde se reporta el porcentaje de convivientes según su parentesco
del caso nuevo, se presenta en primer lugar el hijo, seguido del cónyuge. Con lo que podemos
asumir que cualquier enlace estaría presente entre individuos estrechamente emparentados.
Podemos encontrar en el anexo O), el análisis estadístico de solamente 28 pacientes,
ya que tres de ellos son familiares. Haciendo ésta modificación, los resultados se expresan
igualmente que en el análisis de los 31; a excepción del análisis estadístico de los alelos
DQB1* donde la 2calχ es mayor que la χ tablas, lo que nos podría significar matemáticamente
que algunos de los alelos si tendría relación con la enfermedad.
Es importante destacar que se necesita corroborar con muestras de estudio más
grandes y con la inclusión de miembros de la familia para hacer el estudio más determinante
y asegurar cualquier distribución sesgada de alelos. Pero es un primer paso para documentar
el precedente en el estado para la búsqueda inmunogenética de la enfermedad que durante
muchos años es y ha sido un problema de Salud Pública.
52
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56
ANEXOS B ). - Situación Lepra en 110 países en el 2002
SituaciSituacióóóóóóóón de la lepra reportada por 110 pan de la lepra reportada por 110 paííííííííses ses a nivel mundial, 2002.a nivel mundial, 2002.
Fuente: OMS, 2004
100620,672100524,311TOTAL
0.005340.00845Europa
1.1537,1542.16111,335Pacifico Occidental
83.882520,63273.517385,458Sureste de Asia
0.7524,6651.5067,899Este Mediterráneo
6.43539,93914.43575,686 América
7.77348,24810.27753,888África
%*N°%*N°
INCIDENCIAPREVALENCIAREGIÓN
57
C ).- Tendencia de Lepra del Periodo 1990 – 1999.
Tendencia 1990 - 1999Tendencia 1990 - 1999
Número de entidades con lepra no eliminada en 1990: 18Número de entidades con lepra no eliminada en 1999: 2
58
D ).- Incidencia por Sexo de 1998 al 2002.
ResultadosResultados
0.47
0.35
0.40
0.35
0.56
0.440.47
0.42
0.33
0.39
0.26
0.33
0.28
0.11
0.28
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
1998 1999 2000 2001 2002
TOTALHOMBRESMUJERES
Gráfica. Nº 1. Tendencia de incidencia acumulada por sexo y nacion al,
México 1998 al 2002.
TASA*
IncidenciaIncidencia
Por 100,000 habs.Fuente: Cédulas de casos nuevos de lepra, SSA, CENAVECE. México, 1998-2002.
59
F ).- Antecedentes Previos de Lepra y Contactos.
0 50 100 150 200
N°
Padre
Madre
Hermano
Hijo
Abuelo
Tío
Primo
Consanguíneo
Cónyuge
P. Político
Vecino
Amigo
Par
ente
sco
N° de Casos nuevos que tienen antecedentes de casos previos según su parentesco, México 1998 - 2002.
26
14
39
72
23
28
71
32
50
192
88
129
Fuente: Cédulas de casos nuevos de lepra, SSA, CENAVECE. México, 1998-2002.
b) b) Antecedentes de casos previos de lepra y contactos Antecedentes de casos previos de lepra y contactos entre los casos nuevosentre los casos nuevos
Gráfica Nº 7
N=764/1,849
IncidenciaIncidencia
60
G ).- Tiempo de Convivencia con Antecedentes de Lepra.
Rango y media del tiempo de convivencia de los ante cedentes previos de lepra según parentesco con el caso nuevo de lepra,
México 1998 al 2002
26 2723 25
15
20
29
16
26
18
26
11
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Papá
Mamá
Herm
ano Hijo
Abuelo Tí
o
Primo
P/Con
sC
ónyug
ue
P/Pol
Vecino
Ami go
Parentesco
Año
s
Med
ia
1 1
63
74 75
1 <1
35
64
<1
58
5
62
<1
54
1 3
52
2
72
2
57
2
44
Fuente: Cédulas de Casos nuevos de lepra, 1998-2002, SSA
Rango y media de tiempo de convivencia de los antec edentes previos de lepra según parentesco con el caso nuevo de lepra,
México 1998 al 2002
26 2723 25
15
20
29
16
26
18
26
11
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Padre
MadreHer
mano Hijo
Abuelo Tí
o
Primo
Cons an
guín
eoCón
yugeP.P
olíti
coVec
ino
Ami go
Parentesco
Año
s
Med
ia
1 1
63
74 75
1 <1
35
64
<1
58
5
62
<1
54
1 3
52
2
72
2
57
2
44
Fuente: Cédulas de Casos nuevos de lepra, 1998-2002, SSA
22a
Rango y media del tiempo de convivencia de los ante cedentes previos de lepra según parentesco con el caso nuevo de lepra,
México 1998 al 2002
26 2723 25
15
20
29
16
26
18
26
11
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Papá
Mamá
Herm
ano Hijo
Abuelo Tí
o
Primo
P/Con
sC
ónyug
ue
P/Pol
Vecino
Ami go
Parentesco
Año
s
Med
ia
1 1
63
74 75
1 <1
35
64
<1
58
5
62
<1
54
1 3
52
2
72
2
57
2
44
Fuente: Cédulas de Casos nuevos de lepra, 1998-2002, SSA
Rango y media de tiempo de convivencia de los antec edentes previos de lepra según parentesco con el caso nuevo de lepra,
México 1998 al 2002
26 2723 25
15
20
29
16
26
18
26
11
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Padre
MadreHer
mano Hijo
Abuelo Tí
o
Primo
Cons an
guín
eoCón
yugeP.P
olíti
coVec
ino
Ami go
Parentesco
Año
s
Med
ia
1 1
63
74 75
1 <1
35
64
<1
58
5
62
<1
54
1 3
52
2
72
2
57
2
44
Fuente: Cédulas de Casos nuevos de lepra, 1998-2002, SSA
22a
Gráfica Nº 8
Incidenciab) Antecedentes y contactos b) Antecedentes y contactos
61
H ).- Convivientes según parentesco del caso nuevo.
6.12
8.20
9.70
28.39
0.61
0.76
0.66
10.51
26.28
7.87
0.36
0.43
0.10
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
%
Padre
Madre
Hermano
Hijo
Abuelo
Tío
Primo
P.Consanguíneo
Cónyuge
P.Político
Vecino
Amigo
Empleado
Par
ente
sco
Porcentaje de convivientes según parentesco del caso nuevo, México, 1998 - 2002.
Fuente: Cédulas de casos nuevos de lepra, SSA, CENAVECE. México, 1998-2002.
Gráfica Nº 12
Incidenciab) Antecedentes y contactos b) Antecedentes y contactos
62
I ).- Estratificación Municipal por Entidad Federativa.
Estratificación municipal
FUENTE: INFORME DE PREVALENCIAS ESTATALES 2002.SSA, CENAVECE. MÉXICO 1998 AL 2002.
Mapa Nº 10Estratificación municipal por entidad federativa. M éxico, periodo 1998 al 2002.
63
J ). - Tabla Histórica de la Incidencia de Lepra de 1990 al 2005.
COLIMA HISTORICO LEPRA INCIDENCIA
MUNICIPIO 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
COLIMA 13 21 22 17 20 21 21 13 23 15 18 23 10 10 13 8
1 ARMERIA 0 2 1 2 4 2 4 0 2 2 1 2 0 2 2 1
2 COLIMA 2 5 4 1 1 4 3 7 9 2 8 2 4 3 3 1
3 COMALA 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0
4 COQUIMATLAN 0 2 1 0 0 2 0 0 0 1 0 1 0 0 2
5 CUAUHTEMOC 0 2 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
6 IXTLAHUACAN 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
7 MANZANILLO 7 7 9 6 3 3 4 0 3 4 4 8 2 1 1 1
8 MINATITLAN 0 1 1 6 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
9 TECOMAN 3 1 4 1 10 8 9 6 8 4 5 7 3 2 4 2
10 VILLA DE ALVAREZ 1 1 1 0 2 0 0 0 0 1 0 2 1 1 1 3
64
K ). - Histórico de Lepra en Prevalencia de 1997 al 2005.
“ HISTORICO DE LEPRA 1997 – 2005 “
PREVALENCIA
AÑO CASOS TASA 1997 37 0.76 1998 65 1.31 1999 57 1.13 2000 59 1.08 2001 67 1.20 2002 38 0.65
2003 42 0.72 2004 35 0.59 2005 32
TASA : por 10,000 habitantes.
65
M ). - Programa Nacional de Control de Lepra al Diciembre del 2004 en el Estado de Colima.
SECRETARIA DE SALUD SUBSECRETARIA DE PREVENCION Y PROTECCIÓN DE LA SALU D
CENTRO DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA PROGRAMA NACIONAL DE CONTROL DE LEPRA
CIERRE A DICIEMBRE DEL 2004
PREVALENCIA CASOS CURADOS TOTAL DE CASOS
REGISTRADOS
TOTALES CASOS EN PQT SIN PQT
VIGILANCIA POSTRATAMIENT
O TERMINO DE VIGILANCIA
ESTADO MUNICIPIO J.S. MB PB MB PB TASA MB PB MB PB MB PB
-15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó + -15 15 Ó +
COLIMA 1 0 7 0 1 0 0 0 0 0.56 0 41 0 9 0 74 0 16 0 123 0 26 149 C COMALA 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0.48 0 2 0 0 0 5 0 0 0 7 0 0 7 O COQUIMATLAN 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0.99 0 8 0 1 0 19 0 0 0 30 0 1 31 L CUAUHTEMOC 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 23 0 1 0 26 0 1 27 I VILLA DE ALVAREZ 1 0 2 0 1 0 0 0 0 0.34 0 15 0 4 0 28 0 0 0 44 0 4 48
M ARMERIA 2 0 5 0 1 0 0 0 0 1.96 0 37 0 9 0 30 0 28 0 71 0 37 108 A TECOMAN 2 0 9 0 1 0 0 0 0 0.94 0 26 0 11 0 9 0 1 0 49 0 11 60
IXTLAHUACAN 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0.00 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 2 MANZANILLO 3 0 4 0 0 0 0 0 0 0.22 0 60 0 2 0 51 0 66 0 128 0 68 196 MINATITLAN 3 0 1 0 0 0 0 0 0 1.22 0 7 0 4 0 0 0 0 0 8 0 4 12
TOTAL 10 0 31 0 4 0 0 0 0.6 0 200 0 41 0 239 0 112 0 487 0 153 640
66
N ). - Programa de Control de Lepra de Enero a Septiembre del 2005.
SECRETARÍA DE SALUD SUBSECRETARÍA DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
CENTRO NACIONAL DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA Y CONT ROL DE ENFERMEDADES PROGRAMA DE PREVENCIÓN, CONTROL Y ELIMINACIÓN DE LA LEPRA
ENERO SEPT 2005 COLIMA
PREVALENCIA EX-ENFERMOS (CURADOS) TOTAL DE REGISTROS
TOTALES CASOS EN PQT SIN PQT VIGILANCIA
POSTRATAMIENTO TERMINO DE VIGILANCIA
ESTADO MUNICIPIO J.S. MB PB MB PB TASA MB PB MB PB MB PB
<5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + <5 15 ó + COLIMA 1 0 6 0 1 0 0 0 0 0.480 0 41 0 9 0 78 0 16 0 124 0 25 149 COMALA 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0.482 0 2 0 0 0 5 0 0 0 8 0 0 8
C COQUIMATLAN 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0.980 0 8 0 1 0 20 0 0 0 28 0 1 29 O CUAUHTEMOC 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0.000 0 3 0 0 0 23 0 1 0 26 0 1 26 L VILLA DE ALVAREZ 1 0 3 1 2 0 0 0 0 0.560 0 14 0 4 0 29 0 0 0 46 1 4 51 I ARMERIA 2 0 5 0 0 0 0 0 0 I.600 0 37 0 9 0 30 0 28 0 71 0 36 107
M TECOMAN 2 0 7 0 1 0 0 0 0 0.740 0 26 0 10 0 19 0 1 0 52 0 10 62 A IXTLAHUACAN 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0.000 0 1 0 2 0 0 0 0 0 1 0 1 2
MANZANILLO 3 0 1 0 1 0 0 0 0 0.220 0 59 0 1 0 65 0 67 0 125 0 67 192
MINATITLAN 3 0 1 0 0 0 0 0 0 1.090 0 7 0 4 0 0 0 0 0 8 0 4 12
TOTAL 10 0 26 1 5 0 0 0 0 0.540 0 198 0 40 0 269 0 113 0 491 1 149 638 EX-ENFS. MPIOS. CASOS CTRL T.V. TOTALES: 10 35 238 382 SIN ELIMINACIÓN 2 7 57 58 Tasa igual o mayor a 1 EN CONSOLIDACIÓN 8 28 181 324 Tasa menor a uno, con casos nuevos en los últimos años y prevalencia oculta SILENCIO OPERACIONAL 0 0 0 0 Tasa menor a uno, sin casos nuevos en los últimos 5 años, y no realiza búsqueda intencionada. SILENCIO EPIDEMIOLÓGICO Tasa menor a uno, sin casos nuevos en los últimos 5 años, y demuestra que realiza búsqueda intencionada. SIN ENDEMIA ACTUAL 0 Sin casos en los últimos 10 años. NO ENDÉMICOS 0 Nunca hubo casos de lepra
67
O) Análisis estadístico donde se eliminó tres pacientes del estudio por ser familiares, donde se obtuvo los siguientes resultados.
Cuadro 1B
Cuadro 1B. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias por tipo sanguíneo
Tipo Sanguíneo observados Esperados (o-e)^2/e
A1 6 10.33333333 1.817 A2 3 10.33333333 5.204 o 18 10.33333333 5.688 B 1 10.33333333 8.430
Total 28 Xcal= 12.710 Xtablas 7.810
Para corroborar si éstas diferencias son estadísticamente significativas se aplicó la prueba estadística Chi-Cuadrada, comparando los tipos sanguíneos. El juego de hipótesis que se probó es siguiente: ):( 21 oBAA ppppHo === , donde 1Ap es la probabilidad del
grupo sanguíneo “A1”, el 2Ap es la probabilidad del grupo sanguíneo “A2”, el op es la
probabilidad que el grupo sanguíneo “O” y el Bp es la probabilidad que el grupo sanguíneo “B”, tengan relación con la enfermedad .Se encontró que se rechaza la hipótesis nula( Cuadro 1B: 22
tablascal χχ > y 05.0<P ), es decir que en efecto existe diferencia significativa entre las
proporciones, por lo que en efecto existe diferencia significativa y el tipo sanguíneo prevaleciente es el “O”, seguido del “A1”.
68
Cuadro 2B
Cuadro 2B. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos en locus DQB1*
Frecuencias Totales Allelo Frecuencias Porcentaje Observados Esperados (Oi-Ei)^2/Ei
2 10 17.86 10 10.33 0.01 3 20 35.71 20 10.33 9.04 4 6 10.71 6 10.33 1.82 5 9 16.07 9 10.33 0.17 6 10 17.86 10 10.33 0.01 11 1 1.79 1 10.33 8.43
Total 56 100 Xc= 19.484 Xtablas 11.07
Para analizar si las diferencias observadas en las frecuencias son reales se probó la siguiente hipótesis: 11654320 : ppppppH ===== vs. :aH Al menos una proporción es
diferente. Se rechazó la hipótesis nula (Cuadro 2B) con un nivel de significancia del 5% (Cuadro 2B: 22
tablascal χχ > y 05.0<P ). Sin embargo, dado que deseamos saber cual es el
alelo asociado con la enfermedad, se procedió a probar el siguiente juego de hipótesis:
654320 : pppppH ==== vs :aH al menos una proporción es diferente, es decir se quito
del análisis el alelo 11 el cual es el que menor frecuencias presentó. Bajo esta modificación no se rechazo la hipótesis nula Cuadro 3: 22
tablascal χχ > y 05.0<P ), por lo tanto con una
confiabilidad del 95% se concluye que ninguno de los alelos ( 2, 3, 4, 5 y 6 ) esta asociado mayormente con la enfermedad.
69
Cuadro 3B
Cuadro 3B. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos eliminando del análisis las frecuencias del alelo 11.
Frecuencias Totales Allelo Frecuencias Porcentaje Observados Esperados (Oi-Ei)^2/Ei
2 10 17.86 10 12.20 0.40 3 20 35.71 20 12.20 4.99 4 6 10.71 6 12.20 3.15 5 9 16.07 9 12.20 0.84 6 10 17.86 10 12.20 0.40 9.77
Total 55 100 9.49
Cuadro 4B Cuadro 4B. Distribución de frecuencias por sexo
Frecuencias
por sexo Allelo Femenino Masculino Total
2 3 7 10 3 6 14 20 4 3 3 6 5 4 5 9 6 6 4 10
11 0 1 1 Total 22 34 56
Para probar si existe dependencia entre los alelos y el sexo se planteó la
hipótesis: :0H existe independencia entre alelos y el sexo :aH no existe independencia entre
los alelos y el sexo. La hipótesis planteada no contempla al alelo 11, el cual se eliminó del
análisis debido a que presenta frecuencias de cero en el sexo femenino. En este caso no se
rechazó la hipótesis nula (Cuadro 5B) con un nivel de significancia del 5% : ( 22tablascal χχ < y
05.0>P ). Esto significa que existe independencia entre alelos y sexo.
70
Cuadro 5B. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos eliminando del análisis las frecuencias del alelo 11.
Cuadro 5B allelo Femenino Masculino total
1 3 7 10 4.000 6.000 2 6 14 20 8.000 12.000 3 3 3 6 2.400 3.600 4 4 5 9 3.600 5.400 5 6 4 10
Cuadro 6B
Cuadro 6B. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo
0 1 2 3
Allelo A1 A2 B O Total 2 3 2 0 5 10 3 4 0 0 16 20 4 1 0 0 5 6 5 3 1 2 3 9 6 1 3 0 6 10
11 0 0 0 1 1 Total 12 6 2 36 56
71
Para analizar si existe dependencia entre los alelos y el grupo sanguíneo se aplicó el siguiente juego de hipótesis: :0H los alelos y el grupo sanguíneo son independientes vs :aH
los alelos y el grupo sanguíneo no son independientes. Dado que se tienen frecuencias observadas muy bajas y en muchos casos iguales a cero para los tipos sanguíneos A1, A2 y B, no fue posible realizar el análisis correspondiente. Utilizando únicamente las frecuencias del tipo sanguíneo “O” se aplicó la siguiente hipótesis 654320 : pppppH ==== vs
:aH al menos una proporción es diferente para el grupo sanguíneo “O”. En este caso se
rechaza la hipótesis nula ( Cuadro 7B: 22tablascal χχ > y 05.0<P ), por lo que se concluye que
existe diferencia significativa entre las frecuencias de los alelos, y el que mayor frecuencias presenta es el alelo 3 y el que menos presenta es el alelo 11
Cuadro 7B. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias para el tipo sanguíneo “O”.
Cuadro 7B Allelo O Observados Esperados (o-e)^2/e
2 5 5 6 0.167 3 16 16 6 16.667 4 5 5 6 0.167 5 3 3 6 1.500 6 6 6 6 0.000
11 1 1 6 4.167 Total 36 36 Xcal 22.667
Xtablas 11.07
72
Para nombrar si las diferencias observadas, Figura 6, en las frecuencias son reales se
probó la siguiente hipótesis
1514131211109874310 : ppppppppppppH =========== vs :aH al menos una
proporción es diferente. Se rechazó la hipótesis nula (Cuadro 8) con un nivel de significancia
del 5% ( Cuadro 8B: 22tablascal χχ > y 05.0<P ). Así los alelos que mayores frecuencias
presentan son el 4 y el 15.
Cuadro 8B. Prueba de 2χ (Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos del locus DRB1*.
Cuadro 8B
Allelo Frecuencias Porcentaje observados Esperados (O-E)¨^2/E 1 6 12.00 6 4.667 0.381 3 3 6.00 3 4.667 0.595 4 10 20.00 10 4.667 6.095 7 1 2.00 1 4.667 2.881 8 4 8.00 4 4.667 0.095 9 1 2.00 1 4.667 2.881
10 1 2.00 1 4.667 2.881 11 4 8.00 4 4.667 0.095 12 1 2.00 1 4.667 2.881 13 4 8.00 4 4.667 0.095 14 7 14.00 7 4.667 1.167 15 8 16.00 8 4.667 2.381
Total 50 100 Xcal= 22.429 Xtablas0 19.68
73
Cuadro 9B . Distribución de frecuencias por sexo para el locus DRB1*
Cuadro 9B Allelo Femenino Masculino Total
1 3 3 6 3 0 3 3 4 4 6 10 7 0 1 1 8 3 1 4 9 1 0 1
10 0 1 1 11 0 4 4 12 1 0 1 13 4 0 4 14 1 6 7 15 5 3 8
Total 22 28 50
Para nombrar si existe dependencia entre los alelos y el sexo se probó el siguiente juego de hipótesis: :0H existe independencia entre alelos y el sexo :aH no existe
independencia entre los alelos y el sexo. El juego de hipótesis planteado contempla únicamente a los alelos 1,4, 8 14 y 15, los restantes se eliminaron del análisis debido a que presenta frecuencias de cero. En este caso no se rechazo la hipótesis nula (Cuadro 10B) con un nivel de significancia del 5% ( Cuadro 10B: 22
tablascal χχ < y 05.0>P ). Esto significa que
existe independencia entre alelos y sexo.
Cuadro 10B. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los hálelos por sexo eliminando los hálelos con frecuencias de cero, para el loci DRB1*.
Cuadro 10B Fem Mas Total 1 3 3 6 2.4 3.6 2 4 6 10 4 6 3 3 1 4 1.6 2.4 4 0 1 1 0.4 0.6 5 0 4 4 1.6 2.4
Total 10 15 25
74
Cuadro 11B. Distribución de los alelos por tipo sanguíneo para el locus DRB1*
Cuadro 11B Allelo A1 A2 B 0 Total
1 2 0 1 3 6 3 0 2 0 1 3 4 4 0 0 6 10 7 0 0 0 1 1 8 1 0 0 3 4 9 0 0 0 1 1
10 1 0 0 0 1 11 0 0 0 4 4 12 0 0 0 1 1 13 0 0 0 4 4 14 2 0 1 4 7 15 2 2 0 4 8
Total 12 4 2 32 50
Como se tienen frecuencias observadas muy bajas en varios alelos y en algunos casos iguales a cero para los tipos sanguíneos A1, A2 y B, no fue posible realizar el análisis correspondiente a la dependencia entre alelos y tipo sanguíneo. Por lo que se evaluaron únicamente las frecuencias del tipo sanguíneo “O” Se probó la siguiente hipótesis
1514131211109874310 : ppppppppppppH =========== vs :aH al menos una
proporción es diferente para el grupo sanguíneo “O”. En este caso no se rechaza la hipótesis nula ( Cuadro 12B: 22
tablascal χχ < y 05.0>P ), por lo que se concluye que no existe
diferencia significativa entre las frecuencias de los alelos en el grupo sanguíneo “O”.
75
Cuadro 12B. Prueba de 2χ ( Chi-Cuadrada ) para las frecuencias de los alelos en tipo sanguíneo “O” en el locus DRB1*.
Cuadro 12B Allelo 0 Observados Esperados (o-e)^2/E
1 3 3 2.667 0.042 3 1 1 2.667 1.042 4 6 6 2.667 4.167 7 1 1 2.667 1.042 8 3 3 2.667 0.042 9 1 1 2.667 1.042
10 0 0 2.667 2.667 11 4 4 2.667 0.667 12 1 1 2.667 1.042 13 4 4 2.667 0.667 14 4 4 2.667 0.667 15 4 4 2.667 0.667
Total 32 Xcal 13.75 Xtablas 19.68
76
O).- Descripción Técnicas de Laboratorio
Procedimiento de micrométodo de extracción de ADN por CTAB/DTAB.
1.- Tomar 300 µl de sangre periférica con EDTA como anticoagulante y colocarla en un
microtubo de 2.0 ml previamente rotulado (6 tubos para cada muestra).
2.- Añadir 750 µl de buffer de lisis DTAB, mezclar suavemente.
3.- Incubar durante 5 min. A 68° C.
4.- Retirar los tubos de la incubación e inmediatamente añadir 900 µl de cloroformo, tapar
bien los tubos y agitar vigorosamente durante 1 min.
5.- Centrifugar 15 min. A 10,000 rpm. En esta etapa se formarán tres capas: la capa inferior de
cloroformo, la intermedia corresponde a la lisis celular y la superficie acuosa donde se
encuentra el ADN.
6.- Transferir a tubos nuevos la capa superior acuosa con una pipeta de punto estéril
(cuidadosamente).
7.- Adicionar 100 µl de CTAB y 800 µl de agua inyectable y agitar suavemente.
8.- En este paso se puede refrigerar los tubos a 4° C durante 5 min. Para agilizar la
precipitación del ADN ( paso opcional ).
9.- Centrifugar a 10,000 rpm durante 10 min.
77
10.- Desechar el sobrenadante y recuperar el botón de ADN, añadir 100 µl de NaCl 1.2 M más
1 ml de etanol absoluto frío, mezclar suavemente.
11.- Centrifugar a 10,000 rpm durante 10 min.
12.- Descartar el sobrenadante y recuperar el precipitado, añadir 1,000 µl de etanol al 70%,
mezclar suavemente.
13.- Centrifugar a 5,000 rpm durante 5 min., eliminar el sobrenadante.
14.- Repetir 3 veces los pasos 12 y 13.
15.- Juntar en un solo tubo los botones de ADN de la misma muestra, extraídos en diferentes
tubos.
16.- Eliminar completamente el etanol ( evaporar )
17.- Resuspender el ADN en buffer TE ( Tris HCI 10mM, EDTA 0.2 Mm, pH8 ), agitar
suavemente y refrigerar a 4° C hasta su procesamiento.
78
DRB1* ( PCR )
Uso al que esta destinado:
El kilt INNO-LiPA HLA-DRB1 Amplification, de uso in vitro, está diseñado para la
amplificación de los ácidos nucleicos del segundo exón del locus DRB1 del antígeno
leucocitario humano ( HLA ). La reacción se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de
la polimerasa ( PCR ).
Principio del ensayo:
La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en una mezcla de
reactivos que contiene un tampón con un exceso de desoxinucleósido 5’ –trifosfatos (dNTPs)
“primers” ( oligonucleótidos cebadores ) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los
primers amplificarán el exón 2 del locus DRB1.
Las dos cadenas de la hélice de ADN se separan ( desnaturalización ) por
calentamiento, exponiendo las secuencias diana de los primers. Tras enfriar la mezcla a una
temperatura concreta, estos primers se ligan a regiones complementarias de secuencias que
flanquean a la secuencia diana ( anillamiento ). A otra temperatura concreta, la ADN
polimerasa termoestable utiliza el exceso de dNTPs, extendiendo los primers anillados a lo
largo del ADN molde diana ( extensión ). De esta forma, tras un ciclo se obtienen 2 copias
exactas, biotiniladas, de la secuencia diana. Tras 35 ciclos se obtiene un número mayor de
copias biotiniladas de la secuencia diana. ( Número de referencia de manuales de reactivos:
80339, INNO-LiPA HLA-DRB1 Amplification ), de la marca INNOGENETICS.
Para el tipaje molecular de los alelos del locus DRB1 del antígeno leucocitario
humano (HLA) a nivel de grupo de alelos (DRB1*01 hasta DRB1*16 ).
79
Principio del Ensayo de Hibridación Reversa
Las pruebas de tipaje INNO-LiPA HLA se basan en los principios de hibridación
reversa. En material de ADN biotinilado amplificado se desnaturaliza químicamente, y las
hebras separadas se hibridan con sondas de oligonucleótidos específicos, inmovilizadas en
líneas paralelas sobre tiras basadas en membranas. Esto va seguido de una fase de lavado
estringente a fin de eliminar cualquier material amplificado incorrectamente emparejado.
Tras el lavado estringente, se añade estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, que
queda ligada a cualquier híbrido biotinilado que se haya formado con anterioridad. La
incubación con una solución substrato que contiene un cromógeno produce un precipitado de
color púrpura / marrón. La reacción se interrumpe mediante una fase de lavado, tras la que se
registra el patrón de reactividad de las sondas.
Junto con el equipo INNO-LiPA HLA-DRB1 se dispone de un kilt de amplificación
(INNO-LiPA HLA-DRB1 Amplification) que permite la preparación estandarizada de
material amplificado biotinilado. El kilt de amplificación se basa en la reacción en cadena de
polimerasa ( PCR ).
Posteriormente, los productos de la amplificación se hibridan utilizando una tira de
tipaje que lleva fijadas 37 sondas con una secuencia específica, así como 2 líneas de control.
( Número de referencia de manuales de reactivos: 80338 INNO-LiPA HLA-DRB1, de la
marca INNOGENETICS )
80
DQB1* ( PCR )
Uso al que esta destinado:
El kilt INNO-LiPA HLA-DQB1 Multiplex, de uso in vitro, está diseñado para la
amplificación de los ácidos nucleicos del segundo y tercer exón del locus DQB1 del antígeno
leucocitario humano ( HLA ). La reacción se lleva a cabo mediante la reacción en cadena de
la polimerasa ( PCR ) en un formato multiplex.
Principio del ensayo:
La muestra de ADN a amplificar mediante la PCR se introduce en una mezcla de
reactivos que contiene un tampón con un exceso de desoxinucleósido 5’ –trifosfatos ( dNTPs
) “primers” ( oligonucleótidos cebadores ) biotinilados, y ADN polimerasa termoestable. Los
primers amplificarán la región especificada en el apartado “uso al que esta destinado”.
Las dos cadenas de la hélice de ADN se separan ( desnaturalización ) por
calentamiento, exponiendo las secuencias diana a los primers. Tras enfriar la mezcla a una
temperatura concreta, estos primers se ligan a regiones complementarias de secuencias que
flanquean a la secuencia diana ( anillamiento ). A otra temperatura concreta, la ADN
polimerasa termoestable utiliza el exceso de dNTPs, extendiendo los primers anillados a lo
largo del ADN molde diana ( extensión ). De esta forma, tras un ciclo se obtienen 2 copias
exactas, biotiniladas, de la secuencia diana. Tras múltiples ciclos se obtiene un número
mayor de copias biotiniladas de la secuencia diana. ( Número de referencia de manuales de
reactivos: 80337, INNO-LiPA HLA-DQB1 Multiplex ), de la marca INNOGENETICS.
Para el tipaje molecular de los alelos del locus DQB1 Update es un ensayo de sondas
en tira in vitro, diseñado para el tipaje molecular de alelos del locus DQB1 del antígeno
leucocitario humano ( HLA ).
81
Principio del Ensayo de Hibridación Reversa
Las pruebas de tipaje INNO-LiPA HLA se basan en los principios de hibridación
reversa que se resumen en la figura 1. En material de ADN biotinilado amplificado se
desnaturaliza químicamente, y las hebras separadas se hibridan con sondas de
oligonucleótidos específicos, inmovilizadas en líneas paralelas sobre tiras basadas en
membranas. Esto va seguido de una fase de lavado estringente a fin de eliminar cualquier
material amplificado incorrectamente emparejado. Tras el lavado estringente, se añade
estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina, que queda ligada a cualquier híbrido
biotinilado que se haya formado con anterioridad. La incubación con una solución de
substrato que contiene un cromógeno produce un precipitado de color púrpura / marrón. La
reacción se interrumpe mediante una fase de lavado, tras la que se registra el patrón de
reactividad de las sondas.
Junto con el equipo INNO-LiPA HLA-DQB1 Update se dispone de un kilt de
amplificación ( INNO-LiPA HLA-DQB1 Multiplex ) que permite la preparación
estandarizada de material amplificado biotinilado. El kilt de amplificación se basa en la
reacción en cadena de polimerasa ( PCR ).
Posteriormente, los productos de la amplificación se hibridan utilizando una tira de
tipaje que lleva fijadas 37 sondas específicas de secuencia, así como 2 líneas de control. (
Número de referencia de manuales de reactivos: 80336 INNO-LiPA HLA-DQB1 Update, de
la marca INNOGENETICS )
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