trabajo practico de laboratorio ndeg2 (reparado)
Post on 06-Jul-2018
212 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
1/8
UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DECIENCIAS AGRARIAS
BIOQUÍMICA DE LOS ALIMENTOS
Trabajo Práctico de Laboratorio N°2:Extracción, purifcación y caracterización de proteínas de tejido
ania!
P"#$E"% P%"TE: Extracción, purifcación y cuantifcación de
proteínas
#NT"&'())#*N
Es conocido que hasta cerca de los años 80 ha sido excepcional la
extracción y purifcación de proteínas para uso alimentario a excepción de
aquellas moléculas que poseen actividades enzimáticas, hormonales o
armacoló!icas" #umerosos productos de uso com$n en la alimentación están
disponi%les en estado puro o casi puro &sacarosa, #a'l(, o %ien en mezclas de
compuestos de propiedades comunes &aceites, mar!arinas, etc"(" )in
em%ar!o, existe %astante reticencia a$n al consumo de preparaciones de
proteínas purifcadas"
*a purifcación de proteínas es realizada para+
Estudiar la estructura, las unciones y sus interrelaciones, en estos
casos una pequeña cantidad de proteínas es sufciente y su pureza
de%e ser la máxima posi%le"
so industrial y particularmente tecnolo!ía alimentaria" En este caso la
pureza no -ue!a un rol undamental sino la disponi%ilidad de las
uentes proteicas, los costos de producción y las necesidades"
.or lo tanto, los o%-etivos de la extracción de proteínas pueden
ser++unciona!es, nutriciona!es o econóicas"
*a elección de la uente de proteína a extraer y purifcar depende
entonces de estos fnes posteriores" .or e-emplo, para las proteínas de
/
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
2/8
actividad enzimática, las uentes ele!idas serán aquellas donde esa proteína
es más a%undante y esta%le"
En este caso es undamental el estado nativo para que la preparación
presente una actividad tecnoló!ica &propiedad uncional deseada( o una
actividad específca lo más elevada posi%le"
*a estructura nativa de una proteína de ori!en animal o ve!etal es
alterada !eneralmente durante el proceso de extracción por las condiciones
adoptadas &1, tratamientos mecánicos o químicos, etc"( y tam%ién por el
contacto con proteasas naturales presentes, que pueden ser li%eradas y
puestas en contacto con la proteína durante el tratamiento de extracción"
Esto puede ser me-orado disminuyendo la temperatura &12 a /01' reducen
la actividad de proteasas en !eneral( o utilizando inhi%idores de las mismas"
am%ién el control del p3 es necesario para evitar la desnaturalización"
.ara extraer las proteínas intracelulares es necesario romper por
métodos ísicos o químicos las mem%ranas y paredes celulares impermea%les
a esas macromoléculas"
*a extracta%ilidad de las proteínas depende de su localización y
solu%ilidad en el medio acuoso, sensi%ilidad a la desnaturalización, tamaño,
orma y polaridad, etc"
4entro de las uentes proteicas animales la más importante la
constituye la carne, tanto de especies terrestres como marinas" El m$sculo
está constituido por 50678 de a!ua, /96:: de proteínas, /6/9 de lípidos,
/6: de !l$cidos y / de sales" Estas ciras indican que las proteínas
representan entre el 906;0 de la materia or!ánica de la carne" Esta es la
razón por la cual la mayor parte de los estudios so%re la calidad de las
propiedades de la carne se realizan so%re las proteínas musculares &
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
3/8
:( Proteínas iofbri!ares &solu%les en alta uerza iónica, 0,960,5m >'l
o #a'l:(
?( Proteínas de! estroa o de! tejido conectio &insolu%les en las
condiciones anteriores(
En peces las proteínas miof%rilares son las más a%undantes,
constituyendo aprox" un 79 del te-ido muscular, siendo mínimo el contenido
de proteínas del estroma" *as proteínas miof%rilares además de constituir el
sistema contráctil @in vivoA son las responsa%les de las propiedades
uncionales de la carne tales como capacidad li!ante de a!ua, poder
emulsifcante, capacidad de !elación, etc"
&-.ET#/&: Extraer, purifcar y cuantifcar miof%rillas de pescado
P"&)E'#$#ENT&:
a( )e utilizarán e-emplares de merluza &Merlucciushubbsi(, los cuales
serán fleteados" Estos serán posteriormente picados para tomar unamuestra homo!énea de te-ido y lue!o se pesarán los !ramos indicados
en el esquema que se detalla a continuación &punto %("
%( Extracción y purifcación de miof%rillas de pescado"
Bateriales+
• .escado &merluza(• 'uchilla y ta%la de picar• Calanza• 3omo!enizador DB#B'l• .ro%etas• I!ua destilada ría• u%os de centriu!a de :90 ml de capacidad• 3ielo• 'entriu!a reri!erada
?
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
4/8
E01(E$% 'E ET"%))#*N 3 P("#+#)%)#*N 'E $#&+#-"#LL%0:
=
4 5r de 6scu!o desenuzado y
3omo!eneizar en /00ml de %uGer estándar &ris6maleato :0mB a p3 7H 0,/B >'l(durante ?min" &? pulsos de 90se! con intervalos de /0 se!( en un 3omo!eneizador
+i!trar por
)entri7u5ar a 489 x 5 durante 8
0&-"EN%'%NTE
&descartar(
P"E)#P#T%'&
Fesuspender en 90 ml de %uGer std y repetir dos veces
0&-"EN%'%NTE
&descartar(
P"E)#P#T%'&
Fesuspender en 90 ml de
$#&+#-"#LL%0
P("#+#)%'%0
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
5/8
Nota: Todos los procedimientos deben realizarse a 2-4°C
a( )uantifcación de !as proteínas: la cuantifcación de las proteínas
se realizará utilizando el método de *oJry y col" &/;9/(, utilizando
al%$mina de suero %ovino como estándar"
%( 'on la concentración de proteína calculada se procederá a determinar
el rendimiento &!ramos de miof%rillas por /00 !ramos de te-ido( y
tomar alícuotas para la caracterización de las mismas &Parte 2("
0E;(N'% P%"TE: )aracterización de iofbri!!as de pescado
#NT"&'())#*N
*as miof%rillas pueden ser caracterizadas a través de medidas de sus
propiedades %ioquímicas y fsicoquímicas" 4entro de los indicadores
%ioquímicos se determinan las actividades B!:K y B!:K &ELI(6I. asas que
están relacionadas con la interacción actina6miosina del comple-o
actomiosina en presencia yMo ausencia de calcio endó!eno" 4urante esta
interacción la ca%eza ener!izada de miosina conteniendo I4. y osatoinor!ánico, hace contacto con actina por activación de la troponina por el
calcio" Bientras la determinación de la enzima 'a:K6I.asa indica la
uncionalidad de la miosina en el comple-o actomiosina" .or otra parte la
electrooresis en !eles de )4)6poliacrilamida, permite monitorear la
existencia de las %andas polipeptídicas que constituyen el comple-o proteico
y determinar el porcenta-e relativo de cada componente a través del análisis
densitométrico de los mismos"
&-.ET#/&0:
• 'aracterización de miof%rillas de merluza a través de la
determinación de la actividadB!:K 'a:K6 I.asay B!:K &ELI(6
I.asa y electrooresis en !eles )4)6.ILE"
9
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
6/8
$%TE"#%LE0 3 $ET&'&0
$uestras:
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
7/8
Tab!a : )ondiciones específcas para !as enzias $52? )a2?< %TPasa
y $52? @E;T%> )uantifcación de 7ós7oro:
"eactio de co!or:
6: vol$menes de a!ua destilada
6/ volumen de ácido sul$rico 5#
6/ volumen de moli%dato de amonio :,9
6/ volumen de ácido ascór%ico /0
6)olución estándar de osato monopotásico de : N!Mml
Protoco!o:
T&'" E%#*a+ * ,-%,"+" Ag&a *%ila*a M&%+a Ra.i" * ."l"+
Bla#.
"--- 2,0 ml --- 2 ml
0 0,5 ml (1μg Pi) 1,5 ml --- 2 ml
7
-
8/17/2019 Trabajo Practico de Laboratorio Ndeg2 (Reparado)
8/8
2 1,0 ml (2μg Pi) 1,0 ml --- 2 ml
1 1,5 ml (3μg Pi) 0,5 ml --- 2 ml
2,0 ml (4μg Pi) --- --- 2 ml
3 --- 1,7 ml 0,3 ml 2 ml
)e a!ita vi!orosamente al a!re!ar el reactivo de color" )e de-a en %año a
?71' por /h ?0 min", se enría y se lee en espectrootómetro a 8:0nm" 3acer
la curva de cali%ración con el estándar y calcular los micro!ramos de ósoro
li%erado en cada muestra"
c> E!ectro7oresis en 5e!es 0'0 Po!iacri!aida @0'0
I cada tiempo serán tomadas alícuotas de las suspensiones para
electrooresis en !eles )4)6 poliacrilamida /0" *as mismas serán
desnaturalizadas por calentamiento a /001' durante 9minutos en %uGer
desnaturalizante &ris63'l / B p3 5,8, )4) /0, !licerol, %eta6
mercaptoetanol, a!ua destilada(" )e usará una relación /+/ muestra+ %uGer
desnaturalizante"*a electrooresis se llevará a ca%o en !eles /0 de acuerdo
al procedimiento de *aemmli &/;70( usando un equipo microsla% &)LBI( o
CDFI4 en el ran!o de 5900 a :09000 4a"
8
top related