tecnica histologica corta

Escuela de Medicina Luis RazettiDepartamento de Ciencias Morfológicas

Cátedra de Histología y Embriología

Dr. Luis Alberto Isea MMédico Cirujano

Octubre 2011

HISTOLOGÍA

- Ciencia que estudia los tejidos de los seres vivos

Anatomía

Macroscópica

Microscópica

Histo + LogíaTejidos Ciencia

- Correlación Estructura - Función

Proceso Patológico

Clínica

TÉCNICA HISTOLÓGICA

Tejido

Corte Histológico

Procedimientos

Microscopio

Pasos de la Técnica Histológica

1) Obtención del material

Biopsia

Incisional

Excisional

Autopsia Citología

TÉCNICA HISTOLÓGICA2) Fijación

- Preserva morfología y estructura del tejido

- Detiene procesos celulares dinámicos

- Elimina posibles patógenos

- Aumenta la consistencia del tejido

Autolísis

- No produce Artefactos

- No dificulta etapas ulteriores de la técnica

- Buena penetración al tejido

Idealmente:

Mec. de Acción: Forman Enlaces cruzados entre las Proteínas (Grupos Amino)

Gel insoluble

TÉCNICA HISTOLÓGICA

Fijación

Inmersión

Perfusión Debe colocarse inmediatamente

Volumen de fijador de 10 a 20 veces la muestra

Dejar por 6 a 24 horas

Fijadores

Físicos

Químicos

Simples

Compuestos

a) Formolb) Alcoholc) Glutaraldehidod) Tetraóxido de Osmio

Liquido de FlemingLiquido de Zenkere) Líquido de Bouin

TÉCNICA HISTOLÓGICAa) Formol: - Mas utilizado - Mal fijador de membranas

- Bajo precio

- Buena efectividad

- Poca retracción tisular

- Disuelve el glucógeno

b) Alcohol - Fija por deshidratación

- Útil para citologías. «Lacas o spray»

c) Glutaraldehido

d) Tetraoxido de Osmio

- Excelentes fijadores

- Suelen usarse para la Microscopía Electronica

- No para coloraciones convencionales

TÉCNICA HISTOLÓGICAe) Líquido de Bouin - Ácido Pícrico + Formaldehído + Ácido Acético

- Tejidos blandos, núcleo, glucógeno

- No dejar mas de 48 hr en inmersión

- Eliminar ácido pícrico antes de la inmersión

3) Inclusión

Combinación del tejido con ceras (insolubles en agua) para formar un bloque de corte

Debe eliminarse el agua de la preparación

DESHIDRATACIÓN

Batería de alcohol etílico

Concentraciones crecientes (50-100%)

TÉCNICA HISTOLÓGICA

- Se mezcla con un líquido miscible en parafina y agua

Xilol

ACLARAMIENTOTejido Transparente

Disuelve las grasas

- Se realiza la mezcla con las ceras (Parafina)

a) Impregnación: Se pasa por parafina caliente, removiendo el xilol

b) INCLUSIÓN: Se baña completamente con parafina

Otorga la dureza al tejido para realizar el CORTE

TÉCNICA HISTOLÓGICA4) Corte

- Una vez en el bloque de parafina, se cortan rebanadas de 5 – 10 mcm (M. óptica)

MICROTOMO

- Se coloca el corte en un baño de flotación

- Se monta en una lámina portaobjeto

TÉCNICA HISTOLÓGICA5) Tinción

- Necesitamos diferenciar las estructuras del corte.

- Los colorantes presentan diferente afinidad por ciertos elementos, dando CONTRASTE al preparado histológico

- La mayoría de los colorantes son HIDROSOLUBLES

Rehidratar el tejido

- Se elimina la parafina con xileno

- Se añade alcohol a concentraciones decrecientes

Colorantes

Ácido - Básico

Especializados (MEC)

Sales Metálicas (M. Electronica)

TÉCNICA HISTOLÓGICAHematoxilina – Eosina (Coloración mas utilizada)

- Se basan en las propiedades de BASOFÍLIA y ÁCIDOFILIA

Hematoxilina: - Colorante Básico (al unirse con una Laca)

- Carga Positiva

- Es Hidrosoluble, colocar antes de deshidratar

Tiene afinidad por estructuras con carga NEGATIVA (BASOFILICAS)

ÁCIDOS NUCLEICOS (NÚCLEO CELULAR)

COLOR PÚRPURA

TÉCNICA HISTOLÓGICAEosina: - Colorante Ácido

- Carga Negativa

- Tiene afinidad con estructuras de Carga Positiva (ÁCIDOFILAS)

- Unión con componentes CITOPLASMATICOS

COLOR ROJO - ROSADO

TÉCNICA HISTOLÓGICA

6) Montaje

- Antes de ver el preparado al microscopio, debe colocarse una lámina cubreobjetos

- Debe colocarse una sustancia conservadora a la muestra, para fijar ambas láminas

HIDROFÓBICA

- Volver a deshidratar el tejido y colocar xileno

TÉCNICA HISTOLÓGICADesventajas de la H - E

- No permite evaluar: a) Elastina b) Fibras reticulares c) Membranas basales d) Lípidos

Coloraciones Especiales (Histoquímica)

TÉCNICA HISTOLÓGICASudan III Tinción Lípidos (Corte Congelado)

Rojo Sudan (TAG) Negro Sudan (Neuronas)

Tricrómico de Mallory Fibras Colágenas (Azul)

Wright y Giemsa Células Hemáticas

Azul de Toluidina Metacromasia

- La coloración depende de la agregación de las moléculas

- Se ve en tejidos con gran cantidad de polianiones

- Azul --------------------- Púrpura

-Glucosaminoglicanos MEC, Gránulos Mastocitos

Reactivo de Schiff

(Reacciona con grupos aldehídos)

PAS: Carbohidratos, Glucogeno (Rojo)

Feulgen: DNA

TÉCNICA HISTOLÓGICA

Inmunohistoquímica

- Se basa en la interacción ANTÍGENO – ANTICUERPO para la identificación de moléculas

Antígeno: Toda sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmune

Anticuerpo: Sustancia capaz de unirse a un antígeno de manera específica

- Se colocan anticuerpos, de laboratorio, específicos para la molécula que queremos Identificar

- Una vez producida la interacción debe colorearse o demostrarse su presencia

Enzimas Radiación Fluorescencia

TÉCNICA HISTOLÓGICA

- Puede ser

a) Directa: El anticuerpo colocado esta marcado dando directamente la coloración

b) Indirecta: Se coloca un Auto-anticuerpo, el cual interactúa con el anticuerpo colocado inicialmente, de darse la reacción

TÉCNICA HISTOLÓGICAHibridación

- Capacidad de hebras monocatenarias de DNA o RNA de unirse a hebras complementarias

- Se aísla DNA o RNA de la célula a examinar, y se mezcla con una sonda Con nucleotidos conocidos, con un marcaje (fluorescencia, radiación)

- El fragmento de la sonda interactuara con su hebra complementaria identificandoSu presencia en la célula a estudiar

TÉCNICA HISTOLÓGICAArtefactos

- Falla en la preparación histológica

- Errores en metodología (falla en el calculo de tiempos o selección de colorantes)

- Equipo inadecuado (cuchillas desafiladas)

- Reactivos con poca pureza

TÉCNICA HISTOLÓGICAInterpretación del Corte histológico

MICROSCOPÍAMicroscopio. Concepto

- Permite ver imágenes ampliadas y detalladas de estructuras no visibles a simplevista

Clasificación

Óptico (Luz)ElectrónicoEfecto TúnelFuerza Atómica

M. Óptico

Simple (1 lente)

Compuesto(2 o más lentes)

(fuente de luz)

a) Campo Clarob) Campo Oscuroc) Contraste de Fased) Luz Polarizadae) Fluorescenciaf) Confocal

MICROSCOPÍAMicroscopios Ópticos

a) Campo Claro

- La luz atraviesa la muestra (Transiluminación)

- El corte debe ser delgado (5 – 10 mcm)

- La coloración permite el contraste entre las estructuras

Partes

Mecánica Óptica

Da soporte y estructura

Iluminación y aumento

MICROSCOPÍAParte Mecánica

Pie

ColumnaRevolver

Tubo

Platina

TMacrometrico

TMicrometrico

MICROSCOPÍAParte Óptica Observación

1) Objetivo: - Tubo metálico constituido por varias lentes

- Forman una imagen aumentada, dan resolución

Límite de resolución

Capacidad de una lente de distinguir dos objetos cercanos como independientes

Poder de resolución

Distancia mínima entre 2 objetos para que sean identificados como objetos separados

A MAYOR PODER DE RESOLUCIÓN

MENOR LÍMITE DE RESOLUCIÓN

MAS NÍTIDEZ EN LA IMAGEN

0,2 – 0,5 mcm (M. óptica)0,2 mm (Ojo humano)

MICROSCOPÍA

Número de Aumento: Depende de las lentes, es el grado de magnificación de la imagen

10X, 40X, 100X

Abertura Numérica: Capacidad de captar rayos luminosos

10X40X100X

0,300,651,30

LR = K x λ / AN MAYOR ABERTURA MAYOR RESOLUCIÓN

Objetivo

MICROSCOPÍADistancia mecánica:

- Longitud máxima en mm del tubo

Medio de inmersión: (Secos vs. Húmedos)

- Presenta un índice de refracción similar al del vidrio

- Disminuye la desviación de los rayos de luz

Espesor del cubreobjetos:

- Grosor máximo de la lámina cubreobjetos

2) Ocular

- Cilindro hueco con un lente convergente en cada extremo

- Amplifica 10 X la imagen, no da resolución

www.olympusmicro.com

MICROSCOPÍAAumento total = Aumento del Ocular x Aumento del objetivo

Aumento vacío = Aumento sin resolución

MICROSCOPÍAParte Óptica Iluminación

3) Condensador y Diafragma

- Reciben la luz y la enfocan a la platina por medio de lentes

- Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa a la preparación

4) Fuente de luz

- Bombillo de halógeno. Ilumina la muestra

MICROSCOPÍARecomendaciones al utilizar el microscopio:

1) Coloque el preparado con el cubre objetos hacia ARRIBA

2) Use siempre el objetivo de MENOR aumento primero

3) Use ambos ojos para ver la preparación

4) Realice un primer enfoque con el tornillo MACROMETRICO

5) Si desea enfocar aun mas, oriente la región hacia el centro de la lámina

MICROSCOPÍAOtros microscopios…

b) Campo Oscuro

- Utiliza un filtro en el condensador que evita que los rayos centrales lleguen a lamuestra

- Solo llegan rayos difractados, indirectos

- Partículas brillantes sobre un campo oscuro

- Igual resolución, pero mayor contraste

IMPORTANCIA MÉDICA?

MICROSCOPÍAc) Contraste de Fase

- Diferente índice de refracción de las estructuras retrasan (desfasan) los rayos

Diferencia de amplitud

Diferencia de intensidad

- Se una en células vivas

- Puede compararse con un rayo de referencia

M. De Interferencia

Cuantitativo

MICROSCOPÍAd) Luz Polarizada

- Orientación molecular de los componentes del material

- La luz incidente viaja en un solo plano (polarizador)

Muestra

Birefringente (anisotropa)

Isotropa

Divide a la luz en 2 componentes

- Diferencia estructuras en base a su refringencia.

- Musculo estriado y Cel. De Leydig (testiculo) muestran birrefringencia

www.olympusmicro.com

MICROSCOPÍAe) Fluorescencia

Fluorescencia

Natural

Colorantes (fluoresceína)Absorbe Luz AzulIrradia Luz Verde

- Se usan filtros para la λ incidente e irradiada

- Usos: - Marcaje molecular

- Estudios celulares

- Inmunología

Para evitar distorsión de rayos de luz M. Confocal

MICROSCOPÍAf) Confocal

- Evita la distorsión provocada por los rayos reflejados desde otros planos de corte

- Se excluye la luz no emitida por el plano focal

- Se coloca un detector con una hendidura en conjunción con el plano focal de la lente

- Puede dar imágenes 3D

MICROSCOPÍAMicroscopio Electrónico

- Se calienta un filamento de tungsteno (cátodo)

- Se genera una ΔV entre cátodo y ánodo Haz de electrones

(Baja λ)

Mayor ResoluciónLR = 0,2 nm

- Se usan bobinas electromagnéticas como guía

Lente condensadora Lente objetivo

- Requiere una preparación especial

Fijadores: Glutaraldehído + Tetraóxido de Osmio Dan Densidad Electrónica

Infusión: Se usan Resinas epoxi plásticas

Corte: Cuchillas de diamante. Cortes muy delgados (25-100 nm)

Tinción: Metales Pesados. Resaltan la estructura

MICROSCOPÍA

M. Electrónico

Transmisión (El haz atraviesa la muestra)

Barrido (No atraviesa la muestra)

Transmisión:

- Los elementos celulares y la tinción le restan energía a los e-, los cuales chocancon una pantalla fluorescente o placa fotográfica

- Su energía cinética se interpreta en relación a las características del tejido

Barrido

- Se tiñe la superficie de la muestra con materiales pesados

- Los e- chocan contra la superficie y se reflejan, siendo captados y procesados

MICROSCOPÍAM. de Efecto Túnel

- Se coloca una punta afilada a corta distancia de la muestra

- Se le da voltaje a la punta, creando una ΔV en relación a la muestra (conductor)

- Se crea un flujo de electrones (túnel)

- Puede operar en 2 modos: Altura o Corriente constante

M. de Fuerza Atómica

- Se coloca una punta pequeña, adherida a una barra flexible (cantilever)

- La punta experimenta fuerzas de atracción o repulsión con la muestra generando flexiones del cantilever, que son medidas con un laser

- Se puede estudiar cualquier tipo de muestra

- LR: 50 pm

GRACIAS!

@Luisalbertoisea

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