microbiología predictiva

Microbiologia predictiva

Profa. Rosa María García Gimeno

Dpto. Bromatología y Tecnología de los Alimentos

Universidad de Córdoba

Grupo de Investigación HIBRO , AGR-0170

¿Qué es y como surge

la microbiología predictiva?

¿Cómo se hacen los modelos?

¿Qué tipos hay?

¿Qué aplicaciones tiene

en los alimentos?

¿Qué es la microbiología predictiva ?

La microbiología predictivamicrobiología predictiva comprendeel estudio de la respuesta de crecimientorespuesta de crecimiento,o de inhibición,de microorganismos que crecen en alimentos,en función de factores factores que les afecten(temperatura, pH, gases, etc.)y a partir de estos datos predecirpredecir lo que sucederá durante el almacenamiento,procesado, etc

¿Qué es?

Figura. Teoría de los salto de obstáculos

¿Qué es?

•Nutrientes•pH y capacidad tampón•Potencial redox•Actividad de agua•Constituyentes antimicrobianos•Estructuras antimicrobianas

Factores intrínsecos

•Humedad relativa•Temperatura•Atmósfera gaseosa

Factores ambientales o extrínsecos

•Velocidad decrecimiento específico•Sinergismo•Antagonismo•Comensalismo

Factores implícitos

•Cortado en rodajas•Lavado•envasado•Irradiación•Pasterización•Otros

Factores de la elaboración otratamiento

¿Qué es?

•DISEÑO

•ACUMULACION DE DATOS

•AJUSTE DE LA CURVA DECRECIMIENTO / INHIBICIÓN

•MODELO

•VALIDACIÓN

•PREDICCIÓN

¿Cómo se hacen?

Estrategia para Diseño experimental (Davies 1993):

• Definir objetivo experimental

4.6

6.0

7.4

51710

0

pH

Temperatura

NaCl30

• Enumerar todas las variablesy grado importancia

• Rango de fluctuación devariables

• Selección del medio o sustrato

• Características del inóculo

• Competencia con otrosmicroorganismos

¿Cómo se hacen?

2. Acumulación de datos

tiempo

log(

ufc)

/g

¿Cómo se hacen?

2. Acumulación de datosMétodos directos

Métodos indirectos

Recuento en placas

! ‘ ! material, tiempo y de esfuerzoMétodos instrumentales

• Métodos eléctricos: conductancia, impedancia

• Turbidimetría

• Citometría de flujo

• Bioluminiscencia

•Espectroscopía de infrarrojos

¿Cómo se hacen?

Ventajas:rapidez, fiabilidad,

no destructiva,económica

Tiempo (horas)

Log

núm

ero

de c

élul

as

Datosexperimentales

MODELOSPRIMARIOS

AJUSTE

Parámetros decrecimiento

fase de adaptación (λ)

tasa de crecimiento(µmax)

densidad max población(yEnd)

3. Ajuste de la curva

¿Cómo se hacen?

Tasa de crecimiento específica máxima (µmax)

Tiempo de generación (g) o tiempo de duplicación(Td) (“doubling time”)

Tiempo de adaptación ((lag-time))

Tiempo en alcanza X nivel o ufc/ml

Tiempo en incrementarse 2 unidades logarítmicas

.....

¿Cómo se hacen?

Parámetros cinéticos que estima el modelo

tiempo (horas)

log

núm

ero

de c

élul

as 25 °C

15 °C10 °C

Comportamiento general de microorganismos

¿Cómo se hacen?

tiempo (horas)

log

núm

ero

de c

élul

as

25 °C

15 °C10 °C

Cuando la temperatura aumentala tasa de crecimiento también aumenta

¿Cómo se hacen?

tiempo (horas)

log

núm

ero

de c

élul

as 25 °C

15 °C10 °C

Cuando la temperatura aumentael tiempo de adaptación disminuye

Lag

¿Cómo se hacen?

4. ModelizaciónParámetros de crecimiento Variables

tasa de crecimientotasa de crecimiento

fase de adaptaciónfase de adaptación

nivel máximo de crecimientonivel máximo de crecimiento

Modelossecundarios

Ecuación de ArrheniusModelo de Raíz Cuadrada

Modelo de Respuesta en SuperficieRedes neuronales

Competencia entremicroorganismos

Competencia entremicroorganismos

CO2CO2

Acidos orgánicosAcidos orgánicosConservantesConservantes

pH pHTemperaturaTemperatura

¿Cómo se hacen?

5. Validación del modelo

1º. Validación matemática

2º. Validación en el alimento

•Representación gráfica

verifica la precisión de los modelos generados

MÉTODO

CRITERIOS DE DECISIÓN

•Indices

DATOS OBSERVADOS

¿Cómo se hacen?

demostrar que predicen con exactitud el comportamiento demicroorganismos durante procesado, almacenamiento y distribución

Evolución de E. coli O157:H7 en productos cárnicos cocidosEvolución de E. coli O157:H7 en productos cárnicos cocidos

JAMÓN COCIDO

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25 30

tiempo (días)

log

N (u

fc/g

) 2.3ºC

6.5ºC

10ºC

13.5ºC

17.7ºC

10ºC 0.0338 h-1

13.5ºC 0.0426 h-1

17.7ºC 0.0426 h-1

Tasa decrecimiento

0.000

0.200

0.400

0.600

0.000 0.200 0.400 0.600

Tasa de crecimiento OBSERVADA

Tasa

de

crec

imie

nto

PRED

ICTI

VA

AfBf>1lado seguro

Bf<1lado peligroso

Bf: factor sesgo; Af: factor exactitud

y=x

MÉTODO DE VALIDACIÓN

6. Predicción

Quantitative Risk Assessment (QRA)

PMP (Pathogen Modelling Program)Food MicroModel ? Combase

MODELOS TERCIARIOS

Objetivo práctico finalelaborar gráficos y predicciones

SSP (Seafood Spoilage Predictor)

MIRINZ-software

Decision support system (DSS)Chefcad software

Food Spoilage Predictor (FSP)

¿Cómo se hacen?

Tipos de modelos matemáticos• Según su finalidad:

– Modelos probabilísticos• microorganismos patógenos• ej. Cl. botulinum : se calculará la probabilidad de

producción de toxina

¿Qué tipo hay?

– Modelos cinéticos• microorganismo alterantes• ej. Lactobacillus plantarum: se buscará predecir

el tiempo de generación, la tasa específica decrecimiento o el tiempo de adaptación

Tipos de modelos matemáticos

• Según el fundamento matemático

¿Qué tipos hay?

– Modelo mecanístico: parte deuna base teórica biológica.

– Modelo empírico: ajuste apartir de los datos obtenidosexperimentalmente

Modelos PRIMARIOSCambio en el

número de microorganismos en el tiempobajo ciertas condiciones ambientales

Ecuación Gompertz

Ecuación Baranyi y Roberts

Modelo lineal en 3 fases

Esquema propuesto por Whiting y Buchanan (1993)

Modelos SECUNDARIOS Cambios en los

parámetros de crecimiento frente a losfactores ambientales

Modelos TERCIARIOS Programasinformáticos

Modelos Raíz cuadrada

Ecuaciones polinómicas

Redes NeuronalesArtificiales

¿Qué tipos hay?

Quantitative Risk Assessment (QRA)

PMP (Pathogen Modelling Program)Food MicroModel ? Combase

SSP (Seafood Spoilage Predictor)

MIRINZ-software

Decision support system (DSS)Chefcad software

Food Spoilage Predictor (FSP)

Modelos TERCIARIOS

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 20 40 60 80 100tiempo (h)

abso

rban

cia

MODELO PRIMARIO

Baranyi y RobertsGompertz

Lecturas absorbancia

¿Qué tipos hay?

Ecuación de Ratkowsky

( )µ = ∗ −b T Tmin

õ

T (°C)

MODELO SECUNDARIO ¿Qué tipos hay?

RespuestaenSuperficie

MODELO SECUNDARIO ¿Qué tipos hay?

Nº de niveles o capas

Capa de entrada

NaCl

NaNO2

pH

T

h1

h2

h4

h3

h5

Parámetro decrecimiento

Capa oculta

Capa desalida

REDESNEURONALESARTIFICIALES

Nº de neuronaspor capa

Grado de conectividadentre nodos:pesos

Tipo de conexiónentre neuronas

MODELO SECUNDARIO ¿Qué tipos hay?

Modelo de probabilidad

MODELO SECUNDARIO ¿Qué tipos hay?

MODELO SECUNDARIO ¿Qué tipos hay?

MODELOTERCIARIO

Direcciones web

• FMM:• ComBase: http://www.ifr.ac.uk/ComBase/• PMP 6.1:

http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm• Seafood Spoilage Predictor (SSP)

http://ww.dfu.min.dk/micro/ssp

¿Quéaplicacionestienen losmodelos en losalimentos?

Conjunto de condiciones en función de la temperatura, pH y ClNabajo las cuales E. coli O157:H7 es capaz o no de crecer

4.55.5

6.57.5

8.5

01

23

45

67

8

11

13

15

17

19

21

4.55.5

6.57.5

8.5

01

23

45

67

8

11

13

15

17

19

21

pHNaCl (%)

T (ºC)

7ºC

7-8% 5

0-200ppm

NO2Na

PREDICCIONES

GRÁFICOS

0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.059 0.069 0.079 0.089 0.099 above4.5

5.56.5

7.58.5

24

68

0.020.040.060.080.100.120.140.16

Tas a de crecimien to (h-1)

pHNaCl(% )

15ºC

30ppm NaNO2

Por medio de la computarización de los datos

Educación y formación: Mostrar apersonas no técnicas oespecializadas como sería elcomportamiento microbiano segúnlos factores presentes en el medio.

¿Qué aplicaciones?

Escherichia coli O157:H7E.E.U.U en 1982 por consumo de ternerainsuficientemente cocinada

•Buenas Prácticas de Fabricación (GMP)

•Sistema de Análisis de Peligros y Controlde Puntos Críticos (APPCC)

•Análisisde

Riesgos

Evaluación del Riesgo

Control del Riesgo

Comunicación del Riesgo

PATÓGENO

EMERGENTE

ALIMENTOSSEGUROS

4º. Caracterización del riesgo

2º. Evaluación de la exposición3º. Caracterización del peligro

1º. Identificación del peligro

EVALUACIÓN DEL RIESGO

1º. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO

Serogrupos de E. coli:Enteropatógenos (EPEC)

Enterotoxigénico (ETEC)

Verocitotoxigénico(VETC)

Enteroinvasor (EIEC)

Enteroagregante (EaggEc)

Difusamente adherente (DAEC)

E. coli O157:H7157º antígenosomático7º antígenoflagelar

bacilo Gram-negativo flagelos peritricosaerobio/anaerobio facultativooxidasa y catalasa negativo

1. Característicasgenerales

se identifica el microorganismopara determinar si constituye unpeligro potencial en el alimento

EVALUACIÓN DEL RIESGO

1º. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO

2. Factores de virulencia

AdherenciaPlasmido 60Mda

Gen eaeA157

Shiga toxina Shiga toxina 2Shiga toxina 1

Otros factores de virulencia Exopolisacarido

Hemolisina EHECCatalasa KatP

3. Incidencia de la enfermedadCanadáJapón

EuropaInglaterra

Gales

Alemania

Finlandia

Hungría

Italia

España

1er brote en EEUU en 1982

Escocia

BarcelonaSeptiembre 2000

158 afectados

EVALUACIÓN DEL RIESGO

1º. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO

4. Reservorios

Ganado vacuno

CiervosOvejasCabrasCaballosPerrosPájarosMoscas

PersonasNiños pequeños

Leche

Carne

SalchichasHamburguesasCarne guisadaSandwichsSalami

AguaLechugaRábanosMelónSidra de manzanaBrotes de alfalfaBrotes de judías

Estiercol

EVALUACIÓN DEL RIESGO

2º. EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN

Estudio de la inactivación o multiplicación de E. coliO157:H7 durante el proceso de fabricación del alimento

MODELOS PREDICTIVOS

Producción de la materia prima

Elaboración del producto

Envasado

Distribución y venta

Consumidor

EVALUACIÓN DEL RIESGO

3º. CARACTERIZACIÓN DEL PELIGRO

1º Enfermedad producida por E. coli O157:H7

2º Factores que influyen en el crecimiento y supervivenciade E. coli O157:H7

Temperatura

pH

Aw

100 CÉLULAS

3º Relación dosis-respuesta

Estudios epidemiológicos

EVALUACIÓN DEL RIESGO

4º. CARACTERIZACIÓN DEL RIESGO

Estimación de la PROBABILIDAD de que ocurra el peligro yde la severidad de los efectos adversos sobre la salud

2º. EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN

3º. CARACTERIZACIÓN DEL PELIGRO

1º. IDENTIFICACIÓN DEL PELIGRO

Incorpora al estudio las estrategias paracontrolar el riesgo analizado y el estudia elporcentaje de reducción de la enfermedad

Producción de la materia prima

Elaboración del producto

Envasado

Distribución y venta

Consumidor

•EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN

MODELOSPREDICTIVOS

pH: 6.35

NaCl: 1.84%

NaNO2: 30ppm

Jamón de cerdo cocido

T: 13.5ºC?2 células/g dealimento

EVALUACIÓN DEL RIESGO

•EVALUACIÓN DE LA EXPOSICIÓN

Predicciones de crecimiento de E. coli O157:H7según redes neuronales

0123456789

0 25 50 75 100 125tiempo (h)

log N

(ufc)

MODELO DEREDES

Tasa decrecimiento0.0822h-1

T: 13.5ºC

• CARACTERIZACIÓN DEL PELIGRO

0102030405060708090

100

0 2 4 6 8 10Dosis ingerida (log10ufc)

% P

roba

bilida

d de

enfer

meda

d

3.57

55%

• CARACTERIZACIÓN DEL RIESGO

0

20

40

60

80

100

0 25 50 75 100

Tiempo de abuso de temperatura (h)

% p

roba

bilid

ad d

e en

ferm

ar

T: 13.5 ºC

Jamónde

cerdococido

TIEMPO ?

PredicciónREDES

VIDA COMERCIAL PREDICTIVA

y(t)= y0+ µmax A(t) - Ln 1+eµmax A(t) -1

eymax- y0

Baranyi y Roberts (1994)

λ

µmax

yEnd

MODELOS SECUNDARIOS

ESTIMACIÓN DE VIDA COMERCIAL

VIDA COMERCIAL OBSERVADA

ANÁLISIS SENSORIAL

CALIDAD SENSORIAL GLOBAL

106-108 ufc/g

Korkeala y Björkroth, 1997García-Gimeno y col., 1998

¿Qué aplicaciones?

Vida comercialPRED (días)T (ºC) Vida comercial

OBS (días)

13.517.710.5

17.7

13.7

10.5

13.5

10.5

17.7

106.5

BAL

211625

20

21

27

22

31

12

201724

17

19

23

21

22

16

PAVO

POLLO

JAMÓN

Vida comercialPRED (días)

Vida comercialOBS (días)

VIDA COMERCIAL PREDICTIVA

ESTIMACIÓN DE VIDA COMERCIAL

¿Qué aplicaciones?

FORMULACIÓN DE NUEVOS PRODUCTOS

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

10 12 14 16 18 20 22 24 26

Temperatura (ºC)

Tas

a m

ax c

reci

mie

nto

(h-1

) 0% NaCl

1.2% NaCl

2.4% NaCl

0.403 h-1

0.234 h-1

0.187 h-1

% NaCl

T= 17.5ºC

pH= 6.22

NaNO2= 55 ppm

¿Qué aplicaciones?

SCOOP

TEMPERATURA DEALMACENAMIENTODE ALIMENTOSPERECEDEROS

¿Qué aplicaciones?

Etapa 1º P ELIGRO

MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs

Identificación de peligros

Ejemplo:Materia prima contaminada con diferentes

patógenos.a) ¿Cual de ellos tiene mayor capacidad parareproducirse en esas condiciones? Y en su caso,b) ¿Que probabilidad tenemos que crezca ennuestras condiciones?c) ¿Podemos estimar el efecto del procesado sobreestos patógenos sin recurrir al análisis?

¿Qué aplicaciones?

Etapa 1º P ELIGRO

MICROBIOLOGIA PREDICTIVA Y APPCCs

Identificación de peligros

Ejemplo: Efecto de la formulación del producto enel crecimiento de Aeromonas hydrophila a 7°C.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 200 400 600

ABC

log N

tiempo (h)

A: sal 2.3%; pH 6.1;B: sal 4.3%; pH 6.1;C: sal 2.3%; pH 5.6

¿Qué aplicaciones?

T (ºC) En 15 minutos En 120 minutos7

1520253035

0310203556

030108321978

3386

Podemos valorar las consecuencias microbiológicas del proceso ydeterminar objetivamente que etapas son críticas para la calidad yseguridad del producto.

Etapa 2º Determinación de puntos críticosEj: ¿Que ocurriría si se perdiera el control de unadeterminada etapa del proceso consistente en mantener una temperaturade 7ºC/15 minutos necesarios para mantener a St. aureus a nivelesaceptables?.

¿Qué aplicaciones?

Incremento estimado (%) en el número de Staphylococcusaureus para varias combinaciones tiempo-temperatura