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Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para
Prosthenorchis spp. basada en PCR
Ana Carolina Falla Beltrán
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá D.C., Colombia
2015
Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para
Prosthenorchis spp. basada en PCR
Ana Carolina Falla Beltrán
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Salud Animal
Director:
M.Sc, Ph.D., Biólogo. Paul Bloor
Codirectora:
MSc, MV. Claudia Brieva
Línea de Investigación:
Microbiología y Epidemiología-Animales Silvestres
Grupo de Investigación:
Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
Bogotá D.C., Colombia
2015
La vida me ha enseñado que un camino se
recorre paso a paso, saboreando la
satisfacción de recoger los frutos y
aprendiendo como esquivar los obstáculos.
Porque las caídas, son solo el aviso de lo que
debemos llevar en la maleta para emprender
el siguiente viaje.
A mi Mari y mi Juan, la razón de mi existir y a
ti mamita por estar conmigo siempre.
Agradecimientos VII
Agradecimientos
A Paul Bloor, Profesor especial, Coordinador del Grupo de Biodiversidad y Recursos
Genéticos, Instituto de Genética, por su acertada dirección, sabiduría y grandes aportes
con el diseño y ejecución del trabajo.
A Claudia Brieva, Directora del Departamento de Salud Animal y Directora de la Unidad
de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres (URRAS) de la Facultad de
Medicina Veterinaria y de Zootecnia por la co-dirección del trabajo y su apoyo
incondicional durante toda la Maestría.
Al Programa Internacional de Conservación de Saguinus leucopus (ACOPAZOA-EAZA)
por su apoyo económico y paciencia para la presentación de este trabajo.
Al Contrato 09F y 39, entre FONAM, Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia-
Universidad Nacional de Colombia y WCS, por la financiación de la fase de campo.
A WCS por colectar las muestras de vida silvestre.
A todos los profesionales y directivos de URRAS de la Universidad Nacional de
Colombia, del Centro de Recepción de Fauna y Flora Silvestres de la Secretaría Distrital
de Ambiente (SDA), del Centro de Atención y Valoración del Area Metropolitana del Valle
de Aburrá (AMVA), del Centro de Atención de Fauna Silvestre (CAFS) de la Fundación
Zoológica de Cali, del Centro de Rescate de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas
(CRFSOC) y del Centro de Montelindo de CORPOCALDAS, y, por la colaboración en la
toma de muestras de materia fecal y envío de parásitos.
VIII Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
A Rafael Torres Quin, Presidente de la Asociación Colombiana de Parques Zoológicos y
Acuarios y Gerente del Parque Jaime Duque, por su apoyo y comprensión para poder
realizar la tesis.
A Manuel Hoyos, Sebastián Arciniégas, Carolina Ibañez, Thomas Viloria y Angélica
González del Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos del Instituto de Genética,
por su compañerismo, paciencia y aportes para la realización del trabajo de laboratorio.
A Nicolás Contreras y Henry Rodríguez, estudiantes del Laboratorio 7 del Instituto de
Genética, por su apoyo para la realización de las fotos y el préstamo de equipos.
A Jimmy Vargas, Profesor Asistente, Universidad Nacional de Colombia, por su
colaboración en las fotografías e identificación del parásito.
A mi Madre y mi suegra, por cuidar a mi hija durante las extensas jornadas de trabajo.
IX
Resumen
El objetivo de este estudio fue desarrollar una prueba diagnóstica que permitiera la
identificación de Prosthenorchis sp. mediante la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Se recibieron 37 parásitos, identificados morfológicamente como
Prosthenorchis elegans, colectados de necropsias y cirugías de Saguinus leucopus y
Cebus albifrons, para aislar y caracterizar la secuencia de citocromo oxidasa subunidad
I (COI) específica para P. elegans, por medio del proceso de extracción de ADN,
amplificación y secuenciación, encontrando seis haplotipos ubicados en dos haplogrupos
diferentes. Se diseñaron primers específicos para la amplificación, por medio de una
PCR semi-anidada, de un fragmento de P. elegans de 178 pb, siendo altamente
sensibles para detectar P. elegans en muestras de heces de titi gris (S. leucopus) que
habían sido negativas al coprológico. Se recomienda continuar con la estandarización
de la prueba, siendo desde ya una herramienta diagnóstica y ecológica de gran utilidad
para la conservación de primates del Nuevo Mundo.
Palabras clave: Diagnóstico, parásito, genética, conservación de especies, ADN,
primates
Abstract
The goal of this study was to develop a diagnosis test to allow the identification of
Prosthenorchis sp., through the polymerase chain reaction (PCR). 37 parasites were
received, morphologically identified as Prosthenorchis elegans, collected from necropsies
and surgeries from Saguinus leucopus and Cebus albifrons, for the isolation and
X Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
characterization of the cytochrome oxidase subunit I (COI) specific for P. elegans,
through the DNA extraction, amplification and sequencing, we found six haplotypes
divided into two different haplogroups. Two specific primers were designed for the
amplification through a semi nested PCR of a 178 bp fragment of P. elegans, being highly
sensitive to detect P. elegans from white footed tamarin (S. leucopus) feces previously
negatives at coprology. We recommend to continue the standardization of the diagnostic
test, being since now a diagnosis and ecology skill of great utility for the conservation of
New World Primates.
Keywords: Diagnosis, parasite, genetics, conservation of species, DNA, primate
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XIII
Lista de tablas .............................................................................................................. XV
Lista de Abreviaturas .................................................................................................. XVI
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Prosthenorchis sp. en primates: Breve revisión y perspectivas diagnósticas moleculares ..................................................................................................................... 5
Resumen ...................................................................................................................... 6 Summary ..................................................................................................................... 7 1.1 Introducción ...................................................................................................... 8 1.2 Características de Prosthenorchis ......................................................................... 9
1.2.1 Taxonomía y Morfología .......................................................................... 9 1.2.2 Aspectos epidemiológicos......................................................................... 9 1.2.3 Ciclo de vida ......................................................................................... 10 1.2.4 Transmisión y hospederos intermediarios ................................................. 11 1.2.5 Hospederos definitivos ........................................................................... 12 1.2.6 Cuadro clínico ....................................................................................... 13 1.2.7 Patogenia .............................................................................................. 13 1.2.8 Tratamiento .......................................................................................... 14
1.3 Diagnóstico de Prosthenorchis sp. ...................................................................... 15 1.4 Implicaciones para la conservación ..................................................................... 16 1.5 Pruebas de ADN para el diagnóstico de los parásitos ............................................ 17 1.6 Trabajos en Acantocéfalos ................................................................................. 20 1.7 Perspectivas de la aplicación de metodologías de ADN en el diagnóstico ................ 21 Referencias ................................................................................................................ 25
2. Mitochondrial DNA diversity in the acanthocephalan Prosthenorchis elegans in Colombia based on cytochrome C oxidase sequence ............................................... 40
Abstract ..................................................................................................................... 42 2.1. Introduction ......................................................................................................... 43 2.2 Materials and methods .......................................................................................... 45
2.2.1 Sample collection ........................................................................................ 45 2.2.2 Amplification and sequencing of DNA ........................................................... 46 2.2.3 Data Analyses ............................................................................................. 47
XII
2.3. Results ................................................................................................................ 48 2.3.1 Morphological identification ......................................................................... 48 2.3.2 Sequence variation and genetic diversity ......................................................... 48
2.4. Discussion ........................................................................................................... 50 References ................................................................................................................. 55
3. Una alternativa diagnóstica para Prosthenorchis elegans basada en el gen mitocondrial COI por medio de una PCR semi-anidada ............................................. 69
Resumen .................................................................................................................... 70 Abstract ..................................................................................................................... 71 3.1 Introducción ......................................................................................................... 72 3.2 Metodología ......................................................................................................... 75
3.2.1 Diseño de los primers ................................................................................... 75 3.2 .2 Extracción de ADN a partir de parásitos ........................................................ 76 3.2.3. Materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris) utilizada para la prueba ................ 77 3.2.4. Extracción de ADN de materia fecal .............................................................. 78 3.2.5. PCR y condiciones de la amplificación .......................................................... 79 3.2.6. Evaluación de los primers en los parásitos ..................................................... 80 3.2.7 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus ................................ 80
3.3 Resultados ............................................................................................................ 81 3.3.1 Obtención de heces de Saguinus leucopus ....................................................... 81 3.3.2 Extracción de ADN de materia fecal .............................................................. 82 3.3.3 Evaluación de los primers en los parásitos ...................................................... 82 3.3.4 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus ................................ 83
3.4 Discusión ............................................................................................................. 85 3.5 Conclusiones ........................................................................................................ 88 Referencias ................................................................................................................ 90
4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 105 4.1 Conclusiones .................................................................................................... 105 4.2 Recomendaciones ............................................................................................ 107
A. Anexo: Guía para autores capítulo 1 y 3 ......................................................... 109 1.7.1 Lista preliminar para la preparación de envíos .................................. 115 1.7.2 Aviso de derechos de autor ............................................................... 116 1.7.3 Declaración de privacidad ................................................................. 116
B. Anexo. Guía para autores Capítulo 2............................................................... 118
Lista de figuras
Pág. .
Figuras capítulo 1...............................................................................................
Figura 1.1. Prosthenorchis spp. en el intestino de un Saguinus leucopus. Foto
tomada de la necropsia de un especimen de U.R.R.A.S.............................
Figura 1. 2. Remoción quirúrgica de Prosthenorchis spp. en un Saguinus
leucopus de U.R.R.A.S........................................................................................
Figura 1. 3. Nódulos característicos de Prosthenorchis elegans, detectados
por palpación abdominal. Foto tomada de un S. leucopus de U.R.R.A.S previo
a la cirugía............................................................................................................
Figuras capítulo 2...............................................................................................
Figure 2.1. The photo is showing the characteristic morphology of P.
elegans................................................................................................................
Figure 2.2. SEM of Prosthenorchis elegans. A. Whole detail of the parasite. B.
Proboscide of P. elegans......................................................................................
Figure 2.3 Haplotype network of Prosthenorchis elegans. Network shows the
relationships of haplotypes A-F from a 633 bp of the COI mitochondrial gene,
described in the current study from Saguinus leucopus and Cebus albifrons.
Network is based on statistical parsimony. Small, unlabeled circles indicate
hypothetical haplotypes separated by a single nucleotide change from adjacent
sequences. Labelled ovals represent distinct haplotypes.........
Figure 2.4. NJ tree obtained for Prosthenorchis elegans isolates obtained from
Colombia based on partial cytochrome oxidase I (COI) sequence using MEGA
2 software. Bootstrap support values are provided..............................................
Figure 2.5. Distribution of haplotypes and haplogroups by locality and
individuals............................................................................................................
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XIV Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figure 2.6 Graphic abstract..................................................................................
Figuras capítulo 3...............................................................................................
Figura 3.1. Diseño de primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H1 y
ProsCOI_H2.1......................................................................................................
Figura 3.2. Muestras de heces de S. leucopus utilizadas para el estudio,
distribuidas por localidad y departamento, de acuerdo a su
procedencia..........................................................................................................
Figura 3.3. Extracción de ADN de materia fecal de S. leucopus en las
muestras C2 y C3, mediante el método de sílice/guanidina
tiocianato..............................................................................................................
Figura 3.4. PCR semi-anidada probando el producto puro y diluciones 1:100 y
1:1000 del producto amplificado para el fragmento grande. Se observa doble
banda o manchas para las muestras puras y para algunas de las diluciones
1:100. Concentración del primer 0,1
µM.........................................................................................................................
Figura 3.5 Amplificación semi-anidada de materia fecal con el conjunto de
primers nuevos, diluciones 1:1000 del producto de amplificación del fragmento
de 234 pb y 0,1 µM de
primer...................................................................................................................
68
100
100
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B
XV
Lista de tablas
Pág.
Tablas Capítulo 2...............................................................................................
Table 2.1. Description of Prosthenorchis elegans sequences analyzed in the
current survey......................................................................................................
Table 2.2. Haplogroups and haplotypes found in P. elegans...............................
Table 2.3. Prosthenorchis elegans haplotypes based in COI mitochondrial
gene.....................................................................................................................
Tablas Capítulo 3...............................................................................................
Tabla 3.1. P. elegans utilizados para el desarrollo de la prueba........................
Tabla 3.2. Muestras de materia fecal de Saguinus leucopus utilizadas para el
desarrollo de la prueba........................................................................................
Tabla 3.3. Tipo de muestra y diagnóstico para Prosthenorchis sp. previo a las
pruebas moleculares..........................................................................................
Tabla 3.4 Resultados de las pruebas efectuados en los parásitos con los
primers diseñados...............................................................................................
Tabla 3.5. Resultados de las pruebas semi-anidadas en las muestras de
materia fecal........................................................................................................
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XVI Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Lista de Abreviaturas
AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá
CAFS: Centro de Atención de Fauna Silvestre-Zoológico de Cali
CRFSOC: Centro de Rescate de Fauna Silvestre del Oriente de Caldas
COI: Citocromo Oxidasa Subunidad I
H1: Primer ProsCOI_H1
L1: Primer ProsCOI_L1
H2: Primer ProsCOI_H2
H2.1: Primer ProsCOI_H2.1
Numts: Pseudogenes mitocondriales nucleares
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
SDA: Secretaría Distrital de Ambiente
U.R.R.A.S: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres
WCS: Wildlife Conservation Society
Introducción
Este trabajo surge con el ánimo de responder a varios interrogantes médicos y
ecológicos, dada la importancia clínica del Prosthenorchis sp. en los centros de
rescate y zoológicos de Colombia. La principal preocupación es la dificultad para
el diagnóstico y la alta mortalidad presentada en monos titi gris (Saguinus
leucopus), especie endémica de Colombia, altamente amenazada de extinción y
situada en las listas de mayor tráfico de fauna en Colombia. El diagnóstico in vivo
del género Prosthenorchis se realiza a través de coprológicos y la especie de
Prosthenorchis se atribuye intuitivamente de acuerdo a la especie hospedera; en
ocasiones signos como nódulos a la palpación abdominal son sugestivos del
parásito. Sin embargo, el coprológico, no ha mostrado ser eficiente y animales
con resultados negativos, mueren con altas cargas parasitarias de Prosthenorchis
sp. Por otra parte, la palpación abdominal requiere previa captura del animal y
de un médico veterinario experimentado en su detección, útil cuando los nódulos
intestinales son evidentes. La falta de un diagnóstico eficiente, se refleja en
tratamientos médicos y control del hospedero intermediario de forma retardada,
que junto con el estrés del cautiverio resulta en altas mortalidades.
Explorando las posibilidades diagnósticas y con el auge del diagnóstico molecular
y su alta especificidad y sensibilidad comparada con otras técnicas diagnósticas,
se encontró que para Prosthenorchis sp. no existían secuencias reportadas para
desarrollar una prueba diagnóstica basada en ADN, por lo que encontrar la
secuencia debería ser el primer paso. Por otra parte, fue relativamente difícil
2 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
poder asegurar que la especie de Prosthenorchis que íbamos a ahondar era P.
elegans, ya que la mayor parte de la literatura reciente se remite al número y
arreglo de los ganchos en la probóscide para diferenciar entre las dos especies
reportadas para primates: P. elegans y P. spirula, tarea que debe ser realizada
por expertos, utilizando técnicas especiales y una adecuada preservación de los
ganchos; solamente artículos antiguos dieron claves claras para la identificación.
El objetivo principal de este trabajo es desarrollar una prueba diagnóstica que
permita la identificación de Prosthenorchis elegans mediante la técnica de
reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los objetivos específicos son
enunciados a continuación, en donde los objetivos 1 al 4 serán abarcados en el
capítulo dos y los objetivos 5 y 6 serán abarcados en el capítulo tres: 1) Identificar
morfológicamente los parásitos recolectados corroborando que corresponden a
especies de Prosthenorchis, 2) estandarizar un protocolo para la extracción de
ADN de individuos de Prosthenorchis elegans, 3) aislar y caracterizar la
secuencia de ADN específica de Prosthenorchis elegans, 4) identificar
polimorfismos/marcadores que permitan la discriminación del género
Prosthenorchis elegans, 5) diseñar primers que permitan la amplificación
específica de la secuencia de Prosthenorchis elegans y 6) estandarizar un
protocolo para la amplificación del ADN de Prosthenorchis elegans, por medio de
la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) a partir de heces que contengan
huevos.
Por primera vez se reporta la secuencia específica para Prosthenorchis elegans y
se avanza en el desarrollo de una prueba diagnóstica molecular específica para
detectar el parásito. Igualmente, la caracterización de la diversidad genética del
parásito ofrece un sin número de hipótesis acordes con el proceso de tráfico de
fauna que se presenta con las especies de primates más afectadas, ya que el
diagnóstico se da, en la mayoría de los casos, una vez los animales han sido
3
capturados y han pasado por diferentes ambientes en donde pudieron haber
adquirido el parásito. Con este trabajo, se demuestra la utilidad del gen
mitocondrial citocromo oxidasa subunidad I (COI) para evaluar la diversidad
genética del parásito y diseñar primers específicos. Los logros para la medicina
veterinaria y la ecología son innumerables, ya que la disponibilidad de poder
realizar la identificación específica por PCR abre un campo valioso de
investigación.
Este trabajo contó con 63 parásitos de Prosthenorchis elegans, obtenidos de
centros de rescate y vida libre, a los cuales se les extrajo el ADN y se amplificó un
fragmento parcial de COI por medio de primers universales para obtener la
secuencia de COI específica del parásito. Treinta y siete de las secuencias
obtenidas permitieron estimar la diversidad genética de las muestras que pasaron
exitosamente el proceso de amplificación y secuenciación. Una vez obtenida la
secuencia, se diseñaron primers específicos para detectar el parásito, los cuales
fueron probados en los parásitos y en materia fecal sospechosa y confirmada
positiva para la presencia del parásito. Luego se realizaron pruebas con materia
fecal que había presentado resultados negativos al coprológico.
El desarrollo exitoso de los objetivos, abre las puertas a varias investigaciones
genéticas, ecológicas y médicas, siendo crucial la información que se aporta
desde este trabajo. Con una colecta en varias localidades y a largo plazo de
parásitos de Prosthenorchis se podrá ampliar el conocimiento genético a nivel de
filogenia y taxonomía. Con primers específicos del parásito se podrá investigar a
fondo acerca del hospedero intermediario en vida libre y en cautiverio, así como
los diferentes hospederos definitivos y su patogenicidad. El desarrollo de la
prueba, permitirá realizar un diagnóstico oportuno del parásito e investigar acerca
de la eficacia del uso de antiparasitarios y procedimientos quirúrgicos, utilizados
para el tratamiento contra el parásito.
4 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Los avances de este trabajo van a beneficiar ampliamente la conservación de
especies de primates del Nuevo Mundo, como Saguinus leucopus y Saguinus
oedipus, especies endémicas y altamente amenazadas de Colombia. Los
resultados permiten mejorar los protocolos médicos, beneficiosos para el
mantenimiento en cautiverio y para los procesos de liberación o reintroducción de
estas especies a su medio natural.
5
1. Prosthenorchis sp. en primates: Breve
revisión y perspectivas diagnósticas
moleculares
Formato: Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria
y de Zootecnia
6 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Prosthenorchis elegans: Breve revisión y perspectivas diagnósticas moleculares
Prosthenorchis elegans: A brief review and perspectives in molecular diagnosis
A.C. Falla1*, C.I. Brieva
2, P. Bloor
3
Resumen
La presente revisión, explora los campos de conocimiento necesarios para poder aproximarse a la
realización de un diagnóstico molecular para Prosthenorchis elegans, un acantocéfalo que se ha
caracterizado por causar altas mortalidades en primates del Nuevo Mundo en cautiverio. Se revisa la
importancia de la PCR para el diagnóstico en parasitología, contemplando algunos ejemplos en
parásitos de relevancia para la salud pública. Se nombran algunos trabajos en acantocéfalos, los cuales
se han enfocado principalmente en revisar aspectos filogenéticos y específicamente para
Prosthenorchis, ni siquiera existe una secuencia reportada. Igualmente, se revisan algunas
consideraciones con la escogencia del gen para la amplificación, la cual debe basarse en los estudios
previos sobre acantocéfalos y los ejemplos reportados en la literatura. Se analiza el caso de P. elegans,
su conocimiento y principales vacíos y controversias, para analizar los retos diagnósticos que se deben
enfrentar como la extracción de ADN en materia fecal y los inhibidores que pueden afectar la PCR. El
1 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-
Colombia 2 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 cll 45. Bogotá-
Colombia 3 Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-Colombia
*Autor para correspondencia. acfallab@unal.edu.co
Capítulo 1 7
desarrollo de una prueba diagnóstica para P. elegans abre los campos para varias investigaciones
filogenéticas, médicas, ecológicas y epidemiológicas, que traerán beneficio para las especies de
primates afectadas y para la formulación de protocolos de manejo médico con fines de conservación.
Palabras clave: Acantocéfalos, reacción en cadena de la polimerasa, diagnóstico
Summary
This review explores knowledge necessary to develop a PCR-based approach for the diagnosis of
Prosthenorchis elegans, an acanthocephala known to cause high mortalities in New World Primates in
captivity. A review is presented regarding the importance of PCR for diagnosis in parasitology,
including some examples of parasites affecting the public health. Work on acanthocephala has mainly
focused on phylogenetic aspects, however, for Prosthenorchis, no genetic data has been reported.
Similarly, some considerations with respect to gene choice for molecular diagnosis are reviewed, based
on previous studies on acanthocephala and literature reports. The case of P. elegans is presented; its
knowledge and key gaps and controversies, as well as diagnostic challenges faced to develop a
molecular diagnostic assay are presented. The development of P. elegans diagnosis test opens fields to
new phylogenetic, medical, ecological and epidemiological research, which will benefit species of
primates affected and for developing medical protocols for conservation.
Key Words: Acanthocephala, polymerase chain reaction, diagnosis
8 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
1.1 Introducción
Los acantocéfalos (Acanthocephala) son gusanos de cabeza espinosa, llamados así porque poseen una
proboscis retráctil armada con ganchos, con los cuales se adhieren al intestino del hospedero vertebrado
(Baker 2008). Son parásitos especializados del tracto digestivo de peces, aves y mamíferos,
caracterizados por tener ciclos indirectos (Simón Vicente and Simón Martín 2000). En este grupo de
parásitos se encuentra clasificado el parásito Prosthenorchis elegans. Como los demás acantocéfalos,
es un endoparásito obligado que requiere de un hospedero intermediario para desarrollar parte de su
ciclo de vida, reportado en cautiverio como la cucaracha alemana (Blatella germanica) y sin datos en
vida silvestre (Shoeb 1989). La identificación del parásito, se hace principalmente por el hospedero
que parasita, la morfología del parásito y sus lesiones características en íleon y ciego. El diagnóstico
actual, se realiza a través de la presencia de huevos en coprológicos, sin embargo se presentan falsos
negativos y los animales mueren con altas cargas parasitarias. Esto es particularmente importante,
cuando los primates que se ven afectados están amenazados de extinción como el titi gris (Saguinus
leucopus) y el titi cabeciblanco (Saguinus oedipus), especies endémicas de Colombia, los cuales
ingresan a los centros de rescate en grandes cantidades y necesitan encontrar estrategias de
conservación. Además del diagnóstico, existen varios interrogantes alrededor del parásito, como su
hospedero intermediario en vida libre, el origen de transmisión (vida libre o cautiverio), efectividad de
los tratamientos y del control, diferenciación de especies, así como su conocimiento desde el punto de
vista genético. En este artículo, ofrecemos una breve revisión de los aspectos epidemiológicos, clínicos
y diagnósticos de la especie y las perspectivas diagnósticas moleculares.
Capítulo 1 9
1.2 Características de Prosthenorchis
1.2.1 Taxonomía y Morfología
En primates se han descrito dos especies de Prosthenorchis: P. elegans y P. spirula (Dunn 1963), sin
embargo, la mayoría de reportes se centran en P. elegans. P. spirula ha sido menos reportado y se le
han asignado otros nombres como P. luehei (Thatcher and Nickol 1972) y Oncicola spirula (Tantaleán
and Chávez 2011, Tantaleán et ál. 2005). P. elegans se diferencia morfológicamente porque posee un
collar entre la probóscide y el tórax que no posee P. spirula (Machado Filho 1950). Prosthenorchis
elegans presenta dimorfismo sexual, siendo los machos más pequeños que las hembras. En
acantocéfalos se ha descrito la utilidad de la morfometría de los ganchos para diferenciar especies
(Wayland 2010), por medio de técnicas de aclaramiento para poder contar y diferenciar los ganchos.
Sin embargo, las diferencias morfológicas de los ganchos para las dos especies de Prosthenorchis son
muy sutiles (Müller 2007) y deben ser inspeccionadas por expertos. Existen ambigüedades en los
reportes literarios con respecto a la longitud de los machos y las hembras (Baker 2008), en Colombia se
reportaron medidas de 3 a 6 cm de largo para los parásitos adultos (Perez et ál. 2008), mientras que
Baker (2008) reporta que los machos miden de 20-40 mm y las hembras de 30-50 mm.
1.2.2 Aspectos epidemiológicos
Prosthenorchis elegans es el parásito de mayor importancia médica en primates del Nuevo Mundo,
especialmente en calitrichidos (Potkay 1992). P. elegans está distribuido naturalmente en Centro y Sur
América (Alfaro et ál. 2012), encontrándolo frecuentemente en especies de Saguinus, Saimiri, Ateles,
Cebus, Callicebus y Cebuella como infecciones adquiridas de su hábitat original (Kindlovits and
Kindlovits 2009). En cautiverio se ha reportado fuera de su área de distribución en zoológicos y
laboratorios (Schoeb 1989).
10 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
El grado de infección y mortalidad por P. elegans suelen ser altos (Takos and Thomas 1958). En el
Parque Zoológico de Lincoln (Chicago), estaba presente en el 90% de los callitrichidos (Wolff et ál.
1990) y en el Centro de Atención y Valoración de Fauna Silvestre del Área Metropolitana del Valle de
Aburrá (CAV) (Antioquia-Colombia), en donde se atienden las especies de tráfico ilegal, se encontró
una infección del 26% de los primates con este parásito (Perez et ál. 2008). En el Centro de Rescate de
Fauna Silvestre del Oriente de Caldas (CRFSOC) el 17.85% (10 casos) de tití gris (S. leucopus)
presentaban P. elegans y de estos la mitad murió (Jimenez 2009). Teniendo en cuenta que no siempre
se detectan los huevos en los coprológicos, estas prevalencias podrían ser mayores.
Müller (2007) encontró mayor infección en hembras, relacionándolo posiblemente con el mayor
consumo del hospedero intermediario. Nielsen (1980) reportó mayor presentación de Prosthenorchis
elegans en adultos, mientras que Trejo-Macías y Estrada (2012), reportaron mayor presentación en
juveniles.
1.2.3 Ciclo de vida
El ciclo de vida para Prosthenorchis elegans no ha sido descrito, sin embargo, se sabe que requiere de
un hospedero intermediario como la cucaracha (Blatella germanica). En general, para los
acantocéfalos, los huevos son liberados por el acantocéfalo hembra conteniendo una larva acantor, y
salen del hospedero definitivo por las heces al medio ambiente. El hospedero intermediario ingiere los
huevos embrionados, el huevo eclosiona y se libera el acantor. El acantor liberado del huevo penetra la
pared del intestino y se ubica en el hemocele del artrópodo en donde se transforma en acantela. Luego
de un periodo de uno a tres meses se desarrolla el cistacanto que es la forma infectiva para el hospedero
Capítulo 1 11
vertebrado o definitivo (Baker 2008, Nielsen 1980). Frecuentemente, el cistacanto puede reenquistarse
en su hospedero definitivo en lugar de madurar, como ocurre con el P. elegans, donde se encuentran
parásitos adultos en el lumen intestinal del mono y cistacantos enquistados en la membrana peritoneal
(Bowman and Georgi 2009). Una vez el artrópodo es ingerido por el hospedero definitivo, se adhiere a
la pared intestinal y madura, periodo que dura de 5 a 12 semanas, completando de esta forma el ciclo
(Wolff et ál. 1990).
1.2.4 Transmisión y hospederos intermediarios
La transmisión se realiza a través de la ingestión de artrópodos infectados con cistacantos.
Aparentemente no se ha comprobado el hospedero intermediario de Prosthenorchis sp. en vida
silvestre, pero experimentalmente las cucarachas y ciertos escarabajos pueden transmitirlo. Se conoce
que la cucaracha Blatella germanica es el hospedero intermediario en cautiverio y experimentalmente
se ha podido comprobar en las cucarachas Blabera fusca y Rhyparobia maderae. La Periplaneta
americana y P. orientalis fueron refractarias a Prosthenorchis. También experimentalmente los
escarabajos Lasioderma serricone y Stegobioum paniceum sirvieron como hospederos intermediarios al
final de tres meses, mientras que el Tenebrio molitor, Tribolium confusum y Orizaephilus surinamensis
fueron refractarios (Stunkard 1965). En el dosel del bosque lluvioso tropical es común encontrar
cucarachas (Basset 2001). Sin embargo, sería importante evaluar el comportamiento alimentario de los
primates afectados en vida libre, ya que en algunas especies de calitrichidos (Saguinus fuscicollis y
Saguinus mystax) se ha visto que no es común el consumo de cucarachas y es más frecuente el
consumo de escarabajos (Wenz et ál. 2010).
12 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
1.2.5 Hospederos definitivos
Es importante conocer la especificidad que tiene Prosthenorchis por el hospedero. En Colombia, se ha
encontrado que el Saguinus leucopus es uno de los primates más afectados (Jimenez 2009),
coincidiendo con los índices de tráfico de la especie. Los primates del Nuevo Mundo en los que se ha
reportado la presencia de Prosthenorchis elegans son: Alouatta villosa, Aotus nancymae, Aotus
trivirgatus, Ateles paniscus, Callicebus cupreus, Callicebus moloch, Callithrix humeralifer
chrysoleuca, Callithrix jhacchus geofroyi, Callithrix jhacchus jacchus, Cebus albifrons, Cebus apella,
Lagothrix lagotricha, Leontopitecus rosalia rosalia, Leontopithecus chrysomelas, Saguinus fuscicollis,
Saguinus imperator, Saguinus labiatus, Saguinus leucopus, Saguinus midas midas, Saguinus midas
niger, Saguinus mystax, Saguinus nigricollis, Saguinus oedipus geofroyii, Saguinus oedipus oedipus,
Saimiri boliviensis, Saimiri oerstedii y Saimiri sciureus. En monos del Viejo Mundo se ha reportado el
parásito en las siguientes especies: Pan sp., Pongo sp.; Gorilla sp.; Hylobates sp.; Macacca sp;
Periodictius sp.; Galago sp., Nycticebus coucang (Chinchilla et ál. 2010, Monteiro et ál. 2007, Nielsen
1980, Tantaleán et ál. 2005, Wolff et ál. 1990).
Como hospederos del P. spirula se han reportado primates del Nuevo Mundo: Callithrix jacchus
jacchus, Cebuella pygmaea, Cebus apella, Leontopitecus rosalia rosalia, Saguinus oedipus oedipus,
Saimiri sciureus y primates del Viejo Mundo y prosimios como Eulemur coronatus, E. mongoz, E.
fulvus, E. albifrons, E. macaco, E. mongoz, Lemur catta y Cheirogaleus major (Irwin and Raharison
2009, Tantaleán et ál. 2005).
Capítulo 1 13
1.2.6 Cuadro clínico
Para la infección con Prosthenorchis se ha descrito el síndrome agudo y el síndrome crónico. El curso
crónico se caracteriza por diarrea acuosa de varios meses de duración, acompañada de debilidad y
emaciación progresiva. El curso agudo dura menos de un día y es causado por una peritonitis
bacteriana aguda como consecuencia de la perforación de la pared intestinal (Bowman and Georgi
2009). Los signos de parasitismo por Prosthenorchis elegans son inespecíficos, siendo los más
reportados, en su orden: pérdida de peso, anorexia, debilidad, diarrea, pelaje hirsuto y depresión (Brack
2002, Cubas 1996, Jimenez 2009, Ludlage and Mansfield 2003, Pissinatti et ál. 2007, Potkay 1992,
Toft 1982). Otros signos reportados son inapetencia, dolores abdominales, deshidratación, anemia y
distensión abdominal, aunque también se reporta la ausencia de signos clínicos y complicaciones como
intususcepción y prolapso rectal (Baskin 2013, Joslin 2003, Wallach and Boever 1983). La mayoría
de autores coinciden en que la muerte se puede presentar en caso de infecciones severas o peritonitis
(Brack 2002, Cubas 1996, Jimenez 2009, Mansfield and Weston-Murphy 2009, Müller 2007, Toft
1982, Wallach and Boever 1983).
1.2.7 Patogenia
Prosthenorchis elegans entierra su probóscide entre la mucosa del íleon, ciego y colon, creando túneles
en la pared intestinal y nódulos de color amarillo de 2 a 6 mm de diámetro en la superficie serosa del
intestino (Cubas 1996, Perez et ál. 2007, Weber and Junge 2000) (Figura 1.1). Algunas referencias
describen que P. spirula se encuentra en el íleon distal y P. elegans en el ciego y colon proximal.
Nielsen (1980), especifica que P. elegans tiene una localización primaria en el área íleo-cecal, pero en
infecciones severas puede encontrarse en todo el intestino, como también se reporta en un Saimiri
sciureus (Michaud et ál. 2003). Las lesiones pueden ser desde úlceras en los sitios de adherencia en el
14 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
intestino hasta perforación del mismo, con la consecuente septicemia, peritonitis y muerte (Kindlovits
and Kindlovits 2009, Weber and Junge 2000). Aunque P. spirula también penetra la pared intestinal,
no se ha asociado con peritonitis (Wallach and Boever 1983). Las infecciones severas pueden causar
bloqueo mecánico (Baskin 2013, Nielsen 1980), obstrucciones, intususcepciones, o prolapso rectal
(Toft 1982). Frecuentemente los parásitos no contribuyen directamente a la muerte del animal, pero
producen lesiones que permiten que patógenos secundarios se establezcan, resultando en el
debilitamiento y posterior muerte del primate (Takos and Thomas 1958, Toft 1982, Weber and Junge
2000). Se ha planteado un periodo de incubación de 1 a 3 meses en el hospedero definitivo (Brack
2002).
1.2.8 Tratamiento
En la actualidad los clínicos prefieren la remoción quirúrgica de los parásitos ya que la tasa de
infección y la mortalidad son altas (Figura 1.2), y los tratamientos con antihelmínticos no han dado
resultado (Perez et ál. 2008, Wolff et ál. 1990). Algunas veces es necesario la realización de varias
cirugías en el mismo animal. Igualmente, se plantea que cuando los primates siguen eliminando
huevos en las heces, puede deberse a que al momento de la cirugía el parásito se encontraba en la fase
de desarrollo de cistacanto (Wolff et ál. 1990). La cirugía puede ser complementada con tratamientos
antiparasitarios. Incluso se ha planteado, de manera extrema, la eutanasia de la colección de primates
para acabar con el parásito (Nielsen 1980). Los objetivos deben ir encaminados a romper el ciclo de
vida más que a la aplicación de un tratamiento determinado (Nielsen 1980).
Capítulo 1 15
Se sugiere que las semillas, usualmente grandes, que ingieren los calitrichidos en vida silvestre, pueden
tener un rol curativo ya que pueden arrastrar los parásitos que están cambiando de sitio de adherencia
de la mucosa, pueden dañar la adherencia inicial, o pueden causar daño al parásito, haciendo que este
muera (Garber and Kitron 1997).
1.3 Diagnóstico de Prosthenorchis sp.
Ante mortem la palpación abdominal puede detectar los nódulos característicos de la infección por
Prosthenorchis (Perez et ál. 2008), cuando estos se presentan (Figura 1.3). La comprobación se da por
medio del coprológico con técnicas de sedimentación (Wolff et ál. 1990). También pueden encontrarse
esporádicamente los gusanos en las heces (Toft 1982). La mayoría de estudios utilizan la técnica de
frotis directo, y la técnica de sedimentación, ya sea con formalina/éter (Jimenez 2009), centrifugación
con acetato etílico/formalina (Stoner 1996, Stoner and González Di Pierro 2006) o la técnica
concentrada de Ritchie (Carrasco et ál. 2008) para estimar la intensidad de la infección del parásito.
Esta técnica se emplea debido a que los huevos no flotan y las técnicas convencionales de flotación no
funcionan (Toft 1982). También se reporta el uso de la técnica de centrifugación sin solventes
orgánicos, que utiliza una filtración fuerte para asegurar la concentración de huevos y larvas (Phillips et
ál. 2004). Sin embargo, el examen de las heces da resultados variables, debido a que los animales no
eliminan huevos todos los días y pueden necesitarse varias muestras para confirmar la presencia del
parásito (Cubas 1996, Nielsen 1980, Potkay 1992, Wolff et ál. 1990). Los huevos de acantocéfalos
pueden confundirse fácilmente con los huevos de Trichuris sp. (Nielsen 1980). En el estudio de
Jiménez (2009), solo cinco tití gris (S. leucopus), de los siete que murieron, habían sido positivos por
la técnica de sedimentación mencionada.
16 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Los hallazgos típicos de necropsia, de los gusanos de cabeza espinosa, color blanco pálido o bronceado,
adheridos a la mucosa intestinal del íleon, ciego o colon, son considerados diagnósticos (Mansfield and
Weston-Murphy 2009, Toft 1982). Algunas veces se encuentran parásitos adultos en la cavidad
abdominal (Kindlovits and Kindlovits 2009). El número de gusanos por infección puede variar desde 8
a más de 30 (Potkay 1992); se han reportado incluso hasta 110 parásitos por animal (Takos and
Thomas 1958).
1.4 Implicaciones para la conservación
Recientes hallazgos sugieren que las enfermedades parasitarias son capaces de reducir el tamaño y
alterar la estructura de las poblaciones de monos amenazados de extinción como el tamarino león
dorado (Leontopithecus rosalia) (Monteiro et ál. 2007). También se ha visto que factores
demográficos (densidad), factores ambientales (estacionalidad o humedad), interacciones sociales,
clase edad-sexo, condición reproductiva, hábitat, fragmentación y dieta, influyen en las infecciones
parasitarias en primates no humanos (Vitazkova and Wade 2007). La estructura social de los primates,
en grupos cerrados, favorece la transmisión de parásitos (Stoner and González Di Pierro 2006).
Estudios sobre la reintroducción de Callithrix jacchus y Callithrix penicillata a la zona del amenazado
tamarino león dorado (Leontopithecus rosalia) en Brasil, reveló la presencia de huevos de acantocéfalo
con una prevalencia de 32% encontrándolo en todas las edades y en ambos sexos, incluso en hembras
preñadas (Dos Santos et ál. 2010).
Capítulo 1 17
Hay reportes en los que se afirma que los Prosthenorchis elegans que se han encontrado en vida
silvestre, podrían provenir de la liberación de animales procedentes del tráfico ilegal (Pissinatti et ál.
2007). Por otra parte, existe la teoría que Prosthenorchis ha sido introducido entre las colecciones
establecidas, por el ingreso de animales silvestres parasitados capturados (Weber and Junge 2000). La
transmisión de Prosthenorchis elegans en cautiverio se ve favorecida por la diversidad de especies de
primates mantenidos conjuntamente, asociado a un manejo deficiente que permite la proliferación del
hospedero intermediario (Pissinatti et ál. 2007). El tráfico de fauna que existe en algunos países como
Colombia, ha permitido encontrar bastantes reportes de Prosthenorchis sp. en los primates recién
ingresados a los centros de rescate o que ya han llevado un tiempo considerable en cautiverio. Aunque
Prosthenorchis sp. está distribuido en vida silvestre y en cautiverio, es importante encaminar estudios
de diversidad genética del parásito, distribución geográfica, cargas parasitarias y hospederos
intermediarios, ya que en Colombia es común la liberación de primates procedentes del tráfico ilegal de
especies, luego de pasar por procesos de rehabilitación en centros de rescate donde se encuentra el
hospedero intermediario y diferentes especies de primates.
1.5 Pruebas de ADN para el diagnóstico de los parásitos
Las limitaciones de los métodos basados en microscopía y serología, han guiado a los parasitólogos a
explorar las técnicas moleculares (Ndao 2009). Las pruebas basadas en ácidos nucleicos son una
alternativa sensible, rápida y no invasiva para detectar parásitos (Rodríguez 2007). Teniendo en cuenta
lo anterior, la PCR es una herramienta de gran poder para el diagnóstico de parásitos. Los tipos de
PCR más utilizados para diagnóstico son la PCR anidada, la PCR multiplex y la PCR en tiempo real
(TR-PCR) (Ndao 2009).
18 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
La PCR ha sido una herramienta muy útil en parasitología ya que existen dificultades en la
identificación morfológica de los parásitos (Xiao et ál. 2004), en la detección del parásito en fases
avanzadas de la enfermedad (Pavia et ál. 2003), en la diferenciación de cadenas estrechamente
relacionadas o subespecies de parásitos, como en el caso de huevos de Taenia solium y Taenia
saginata; o en la identificación de la etiología para un síntoma específico, como el caso de una lesión
cutánea causada por Leishmania en donde hay más de 15 especies que afectan a los humanos (Barker
1989). Desde el punto de vista epidemiológico la PCR ha sido una herramienta muy poderosa, pues ha
permitido encontrar agentes en materia fecal, tejido, agua y alimento, entre otros, siendo de gran
utilidad para el control de las enfermedades (Gasser R. B. and Zarlenga 2004). Otros usos de técnicas
basadas en PCR han sido el desarrollo de vacunas y estudios de la resistencia a medicamentos (Gasser
Robin B. 1999, Prichard 1997).
Existen parásitos, como el Cryptosporidium spp., que no han podido discriminarse por especie con las
técnicas morfológicas convencionales, el análisis genético ha permitido demostrar gran cantidad de
especies dentro del género, algunas de ellas con importancia para la salud pública (Xiao et ál. 2004),
además de estudios de diversidad genética (Connelly et ál. 2013). Otras enfermedades zoonóticas
como la Leishmaniasis también han encontrado utilidad en el uso de herramientas moleculares, en
donde la sensibilidad y especificidad de la PCR están directamente relacionadas con los primers usados
para la amplificación, el número de copias del blanco de ADN que se va a amplificar, el método de
extracción de ADN utilizado, el tipo de material para analizar y el mismo protocolo de PCR (Cortes et
ál. 2004, Salam et ál. 2010).
Capítulo 1 19
Para el diagnóstico se aprovechan características de los parásitos, como en el caso de Trypanosoma
cruzi en los que el diagnóstico diferencial se hace previa identificación de un gen (unidad 1.2 kb del
H2A) que no existe en el T. rangeli (Pavia et ál. 2003). Igualmente, se han desarrollado pruebas en
tenias, para identificación de especies en roedores y carnívoros (Al-Sabi and Kapel 2011) y como
prueba diagnóstica de ADN en heces (Mathis and Deplazes 2006). Elmore et ál. (2013) identificó dos
linajes distintos de Sarcocystis sp. en zorros árticos, a través de técnicas moleculares y análisis
filogenéticos. Nichols et ál. (2003), detectó bajas densidades de ooquistes de Cryptosporidium spp. en
agua mineral natural y aguas de bebida a través de técnicas moleculares.
La utilidad de las herramientas moleculares de ADN ha sido descrita para el diagnóstico específico de
parásitos de primates como Oesophagostomum bifurcum, entendiendo la epidemiología del parásito y
guiando al descubrimiento de múltiples variantes distintas genéticamente de O. bifurcum (Gasser R. B.
et ál. 2009). Otros parásitos que están siendo estudiados por técnicas moleculares de ADN son
Entamoeba histolytica, mostrando una sensibilidad de 96% y una especificidad de 98% en la prueba de
PCR comparada con otras pruebas diagnósticas; Giardia lamblia, usada para detectar la variación
genética y diferenciar entre genotipos de G. lamblia y distinguir entre quistes vivos y muertos; Fasciola
hepática, utilizada para detectar ADN en el caracol infectado; y Opisthorchis viverrini, utilizada como
diagnóstico de huevos en heces de humanos infectados, entre otros (Weiss 1995).
20 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
1.6 Trabajos en Acantocéfalos
Investigaciones filogenéticas moleculares unieron a los Rotífera con los Acantocéfalos en el phylum
Syndermata (Rotífera) (Garey et ál. 1996, Miquelis et ál. 2000), sin embargo para efectos de esta
revisión nos referimos al Phylum Acantocephala. Dentro de los acantocéfalos se ha descrito el genoma
mitocondrial completo para los siguientes parásitos Leptorhynchoides thecatus (Steinauer et ál. 2005),
Oncicola luehei (Gazi et ál. 2012), Pallisentis celatus(Pan and Nie 2013), Echinorhynchus truttae,
Paratenuisentis ambiguus y Macracanthorhynchus hirudinaceus (Weber et ál. 2013), considerando que
los genes contenidos en el genoma mitocondrial son relativamente conservados para la mayoría de
metazoarios.
Los estudios en acantocéfalos se han enfocado en investigaciones filogenéticas a través de los datos de
secuencia del gen ARN ribosomal (rRNA) 18S (García-Varela et ál. 2000, Garey et ál. 1996, Miquelis
et ál. 2000, Near T. J. 2002, Near Thomas J. et ál. 1998), ADN ribosomal nuclear de la subunidad
pequeña SSU y la subunidad grande LSU (García-Varela and Nadler 2005, García-Varela et ál. 2011);
los genes nucleares ITSs y LSU (Martinez-Aquino et ál. 2009) 5.8S y espaciador de transcripción
interna han sido usados para dilucidar controversias del género Corynosoma que afecta a mamíferos y
aves marinos (García-Varela et ál. 2005) y para diferenciar especies de acantocéfalos que afectan peces
en Taiwan (Shih et ál. 2010). Otros estudios han involucrado al gen citocromo c oxidasa subunidad 1
(cox 1), para resolver controversias taxonómicas y evaluar relaciones entre géneros de diferentes
acantocéfalos (García-Varela et ál. 2011, García-Varela and Nadler 2006, García-Varela and Pérez-
Ponce de León 2008, García-Varela et ál. 2009, Gazi et ál. 2012, O'Mahony et ál. 2004, Perrot-Minnot
2004), así como para estudios de biogeografía y detección de especies crípticas en acantocéfalos
marinos (Goulding and Sarah Cohen 2014, Steinauer et ál. 2007). Alcantar-Escalera et ál. (2013),
Capítulo 1 21
utilizan solo la citocromo c oxidasa subunidad I para conocer si los estadios larvales de Polymorphus
brevis, un acantocéfalo que afecta a aves que se alimentan de peces, son genéticamente similares y
están vinculados con los adultos. Se ha reportado que las muestras obtenidas en campo para
acantocéfalos de peces, pueden estar incompletas o presentar problemas con la forma de preservación,
lo cual puede reducir la claridad de las estructuras internas. Por esta razón se ha optado por las técnicas
moleculares para su diferenciación (Shih et ál. 2010).
Desde el punto de vista diagnóstico, los acantocéfalos no han sido suficientemente explorados
molecularmente (Hunt and Lello 2012, Perrot-Minnot 2004). Particularmente para Prosthenorchis, no
existe reporte de su secuencia ni de investigaciones moleculares sobre el género, constituyendo un gran
campo por investigar.
1.7 Perspectivas de la aplicación de metodologías de ADN en el diagnóstico
De acuerdo a la revisión anterior, está claro que el diagnóstico por ADN podría ser una alternativa
viable a los métodos existentes para la identificación de Prosthenorchis sp. Sin embargo, existen
varios desafíos para el desarrollo de una prueba molecular para Prosthenorchis. En la actualidad no
existe secuencia publicada o diversidad genética caracterizada para Prosthenorchis: dos obstáculos
importantes para el desarrollo de una prueba de ADN.
Los niveles de divergencia que se encuentran en la citocromo c oxidasa subunidad I (COI) para otras
especies, sugieren que este gen podría ser un buen candidato para la descripción de las diferencias
22 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
inter-específicas e intra-específicas (Derycke et ál. 2010). Teniendo en cuenta los estudios más
recientes en acantocéfalos (Alcantar-Escalera et ál. 2013, Goulding and Sarah Cohen 2014) y el
creciente movimiento por los códigos de barra de la vida (Paz et ál. 2011), el uso de (COI), constituye
una buena alternativa para avanzar en el conocimiento genético de Prosthenorchis elegans. Además, el
éxito de primers universales utilizado en otras especies sugiere que su uso también sería posible en
Prosthenorchis sp. (Folmer et ál. 1994). Estos primers sirven para generar secuencias que pueden
contener polimorfismos específicos para poder diseñar los primers específicos. Los primers no deben
ser complementarios, es decir que se puedan unir con el mismo primer o con los otros primers usados
en las reacciones de PCR. Aunque la especificidad del primer es dependiente de la longitud del
mismo, deben ser escogidos de tal forma que una secuencia única dentro del ADN pueda ser
amplificada (Abd-Elsalam 2003). De esta forma, se debe comparar con otras secuencias de especies
cercanas a Prosthenorchis sp. y probar que los polimorfismos identificados son específicos para el
parásito.
El uso de COI también tiene limitaciones que hay que tener en cuenta a la hora de analizar las
secuencias, ya que pueden aparecer secuencias no-idénticas similares al ADN mitocondrial que pueden
amplificar con los primers universales. Estas secuencias son llamadas pseudogenes mitocondriales
nucleares (Numts), definidas como copias de genes de ADN mitocondrial o de genoma mitocondrial
casi completo que han sido trasladadas al genoma nuclear (Kim et ál. 2006, Lopez et ál. 1994). Los
pseudogenes han sido descritos en acantocéfalos (Benesh et ál. 2006), por lo que se deben evitar e
identificar en estudios que involucren COI. Estos pueden identificarse por la presencia de indeles,
mutaciones puntuales o codones de parada en el marco de lectura de la secuencia (Song et ál. 2008).
Capítulo 1 23
Adicionalmente, hay que tener en cuenta las heteroplasmias, o la ocurrencia de más de un haplotipo
dentro de un solo organismo, que se pueden presentar en las amplificaciones del ADN mitocondrial
por PCR (Frey and Frey 2004).
Otro reto para el diagnóstico por PCR es la extracción de ADN en materia fecal. En acantocéfalos, el
procedimiento para extraer ADN de la materia fecal no está descrito. Sin embargo, en la literatura se
pueden encontrar diferentes protocolos y kits para extracción de ADN de heces, para parásitos
gastrointestinales como Giardia intestinalis (Asher et ál. 2012), coccidias (Elmore et ál. 2013),
Cryptosporidium parvum (Neira et ál. 2010), Echinococcus multilocularis (Nonaka et ál. 2009),
Dientamoeba fragilis (Menghi et ál. 2006), entre otros parásitos que pueden tener implicaciones en
salud pública. Por otra parte, sabemos que los huevos de los acantocéfalos presentan cutícula doble
(Müller 2007), lo que podría ser un obstáculo para la extracción de ADN. En la literatura se encuentran
varios protocolos para la extracción de ADN de parásitos como los céstodos, ya que los embrióforos de
los huevos de céstodos son difíciles de digerir (Dinkel et ál. 1998). También hay que tener en cuenta,
que existen inhibidores de la PCR y por esto se deben adoptar medidas para evitarlos, especialmente
cuando se extrae ADN de materia fecal (Mathis and Deplazes 2006, Nonaka et ál. 2009). La materia
fecal es considerada uno de las muestras de más difícil extracción de ADN, debido a que se pueden
encontrar proteasas bacteriales, nucleasas, células de debridación, ácidos biliares, entre otros, que
actúan como inhibidores debido a efectos fisicoquímicos y enzimáticos (Wilson 1997). Se han
reportado sustancias como harina de papa (Deuter et ál. 1995) y camas magnéticas que absorben las
sustancias inhibitorias (Flagstad et ál. 1999). También se ha usado tiocianato de guanidina, mediante el
protocolo de sílica guanidina tiocianato (Boom et ál. 1990), por su actividad para la desnaturalización
de las proteínas. Igualmente, existen kits como el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) que usa una
24 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
combinación de absorción y desactivación de sustancias inhibitorias (Menghi et ál. 2006, Nonaka et ál.
2009). Otro aspecto a tener en cuenta es que las heces de tamarinos son escasas y los procesos de
obtención en vida silvestre o de identificación cuando se encuentran en grupos en cautiverio puede ser
complicado, por lo que muchas veces se hace necesario la captura de individuos y la utilización de
lavados rectales para obtener la muestra. La conservación de materia fecal también es un reto, ya que
en la mayoría de reportes diagnósticos, utilizan heces frescas para el diagnóstico molecular.
Por medio de la PCR se podrá comprobar si los primers diseñados son útiles para detectar
Prosthenorchis sp. en muestras de materia fecal positiva para el parásito. Es importante que los
controles, tanto negativo como positivo, cumplan su función para evitar falsos positivos y negativos.
El próximo paso es optimizar los parámetros de amplificación de la reacción con ADN purificado. La
optimización de los componentes de la reacción (cloruro de magnesio, ADN polimerasa, nucleótido
trifosfato, y primers), la selección de la temperatura para hibridización y el tiempo de duración de cada
paso del ciclo termal influenciarán la sensibilidad y especificidad de la reacción. Luego de esto, hay
que especificar el punto de corte para determinar si la reacción es positiva o negativa, y si es necesario
determinar el rango de especificidad del ensayo (Weiss 1995). En el caso de parásitos se acostumbra a
realizar pruebas incrementando la cantidad de huevos para detectar la sensibilidad (Dinkel et ál. 1998).
La sensibilidad analítica del ensayo se debería determinar con el organismo entero, si es posible, o
puede substituirse por ADN blanco clonado o ADN genómico (Weiss 1995).
Capítulo 1 25
En el caso de Prosthenorchis elegans y su diagnóstico por medio de PCR, hay que preguntarse la razón
de la no aparición de huevos en los coprológicos aun cuando los animales se encuentran severamente
infectados en la necropsia. Dinkel et ál. (1998) analiza interrogantes similares con Echinococcus
multilocularis, dando como posibles hipótesis que los gusanos no están con la suficiente madurez para
poner huevos o que los huevos no son puestos continuamente y que además, los huevos no están
distribuidos uniformemente en las heces. Sin embargo, se cree que el ADN procedente de los gusanos
también se puede llegar a detectar (Dinkel et ál. 1998).
Las oportunidades que generan los avances en el conocimiento genético de Prosthenorchis elegans, son
útiles para responder las inquietudes que generan muchos aspectos relacionados con esta especie,
como la taxonomía, caracterización genética, ciclo de vida, transmisión, hospederos intermediarios,
ecología y epidemiología. Igualmente, desde el punto de vista diagnóstico, se abre una gran cantidad
de posibilidades para la investigación en cuanto a la especificidad por el hospedero, la resistencia a los
tratamientos, la eficacia de los tratamientos, entre otros. Sin embargo, lo más importante son las
implicaciones que tiene para los planes de conservación de los primates del Nuevo Mundo que se ven
más afectados por este parásito.
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Capítulo 1 37
Figuras Capítulo 1
Figura 1.1. Prosthenorchis spp. en el intestino de un Saguinus leucopus. Foto tomada de la necropsia
de un especimen de U.R.R.A.S
38 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figura 1. 2. Remoción quirúrgica de Prosthenorchis spp. en un Saguinus leucopus de U.R.R.A.S
Capítulo 1 39
Figura 1. 3. Nódulos característicos de Prosthenorchis elegans, detectados por palpación abdominal.
Foto tomada de un S. leucopus de U.R.R.A.S previo a la cirugía.
2. Mitochondrial DNA diversity in the
acanthocephalan Prosthenorchis elegans in
Colombia based on cytochrome C oxidase
sequence
Sometido a: International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife
Capítulo 2 41
Mitochondrial DNA diversity in the acanthocephalan Prosthenorchis elegans in Colombia
based on cytochrome C oxidase sequence
Ana Carolina Falla a*
, Claudia Brieva a, Paul Bloor
b
a Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Carrera 30 #
45-03 Edificio 481, Bogotá DC 111321, Colombia
b Grupo de Biodiversidad y Recursos Genéticos, Instituto de Genética, Universidad Nacional de
Colombia, Carrera 30 # 45-03 Edificio 426, Bogotá DC 111321, Colombia
* Corresponding author: Ana Carolina Falla, Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia, acfallab@unal.edu.co, Tel.: +57-1-8106654, +57-3006628396, Cra 74A #
168A-85 Interior 20 Apto. 202, Bogotá DC, Colombia, 111156.
E-mail addresses: acfallab@unal.edu.co (C. Falla), cibrievar@unal.edu.co (C. Brieva),
pbloor@unal.edu.co (P. Bloor),
E-mail addresses: acfallab@unal.edu.co (C. Falla), cibrievar@unal.edu.co (C. Brieva),
pbloor@unal.edu.co (P. Bloor),
42 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Abstract
Prosthenorchis elegans is an acanthocephalan affecting New World Primates in the wild in South
America and in captivity around the world. P. elegans contributes to high mortality in tamarins in
captivity and it presents difficulties of diagnosis and treatment, since coprologic exams are often
negative in animals severely infected at the death; also the control of cockroaches (the intermediate
host in captivity) is very difficult. The first description of sequence information and genetic diversity
is presented for Prosthenorchis elegans based on analysis of partial cytochrome oxidase subunit I
(COI) gene sequence from 37 parasites from Saguinus leucopus and Cebus albifrons from rescue
centres for wild animals and from the wild. Six hundred and thirty-three bp of COI was obtained for all
parasites analysed. Six distinct haplotypes were identified which grouped into one of two well-
supported mtDNA lineages. No association between haplogroup/haplotype, holding facility and
species was found. This study confirms the utility of mitochondrial gene COI as a marker to detect
genetic diversity in acanthocephalan and to identify species. Illegal wildlife trade, stress and releases
of primates into the wild could have implications on the genetic diversity of the parasite and
conservation of the species. Further research is necessary, analyzing larger size samples from the wild
and captivity in different primate hosts and the intermediate host for P. elegans.
Keywords: acanthocephala, Prosthenorchis elegans, cytochrome c oxidase subunit I, endoparasite,
Saguinus leucopus, Cebus albifrons
Capítulo 2 43
2.1. Introduction
Prosthenorchis sp. belongs to the acanthocephala phylum or group of thorny-headed worms,
endoparasites living part of their life in arthropods and part in the digestive tract of vertebrates (Baker,
2008). It is of importance in New World Primates, where it is the cause of high mortality in captive
individuals, especially in callitrichids species (Garber and Kitron, 1997; Martin, 1978; Potkay, 1992).
Mortality in animals results from secondary bacterial infection due the lesions caused by the adult
parasite in the intestinal tract of the definitive host (Takos and Thomas, 1958; Toft, 1982). Two
species have been recognized for nonhuman primates on the basis of morphological differences: P.
elegans and P. spirula (Pissinatti et al., 2007). Differentiation of the two species is based mainly on
differences in the number and arrangement of hooks on the proboscide (Müller, 2007; Stunkard, 1965),
and the presence of a collar between the proboscide and the body in P. elegans (Machado Filho, 1950).
Infection with the parasite is a serious problem for the management of primate species in captivity.
The species has been reported in the wild in New World primates and some carnivores of South
America and in captivity around the world, affecting several species of primates in zoos, rescue centres
and laboratories (Perez et al., 2007; Schoeb, 1989). Efficient control is, in part, dependent on reliable
epidemiologic information, which implies the accurate identification of the parasite as well as its early
identification. For species-specific diagnosis of Prosthenorchis elegans, current diagnostic methods are
unsatisfactory. Currently, the diagnosis of Prosthenorchis elegans is based on the detection of eggs by
microscopic observation of fecal samples or coprological examination. This technique lacks both
sensitivity and specificity, since eggs of most members of the genus are morphologically
44 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
indistinguishable and are shed intermittently (Machado Filho, 1950). Where infection is identified,
treatments appear to be ineffective (Jimenez, 2009; Johnson-Delaney, 2009; Nielsen, 1980) with
surgical removal being the best option.
The application of DNA based analyses has provided unique insights into genetic diversity where they
have revealed cases of cryptic diversity (Steinauer et al., 2007), i.e., the identification of distinct
evolutionary lineages where morphological differentiation is low (Varcasia et al., 2006). Such
approaches are also useful in parasite diagnosis, where they can potentially contribute to the accurate
detection of species (Al-Sabi and Kapel, 2011). Molecular based DNA approaches for the differential
diagnosis of parasites have been developed for numerous species (Ndao, 2009); polymerase chain
reaction (PCR) based assays, using oligonucleotide primers derived from species-specific sequences,
providing the greatest sensitivity. While numerous studies have published sequence data for
acanthocephalans (García-Varela et al., 2013; Pinacho-Pinacho et al., 2014; Westram et al., 2011), so
far, no sequence data has been published for the genus Prosthenorchis, thus its phylogenetic
relationship with other acanthocephala or genetic variation within species is unknown. In addition, the
absence of genetic information for Prosthenorchis presents an obstacle to the development of
molecular-based diagnostic tools for the genus.
The present study aimed to provide the first analysis of mtDNA genetic diversity in P. elegans. The
primary objectives were to: 1) obtain the first DNA sequence of the mitochondrial cytochrome oxidase
subunit I (COI) gene specific to P. elegans and 2) provide the first description of intra-specific
Capítulo 2 45
diversity among different isolates obtained from primate hosts in Colombia. This information will help
pave the way to the development of molecular-based diagnostic tools for the detection of P. elegans as
well as furthering research into the life cycle, intermediate hosts and epidemiological aspects of the
species.
2.2 Materials and methods
2.2.1 Sample collection
A total of 37 adult parasites were used for this study. All parasites were collected opportunistically
from the intestines of primates. Twenty-two were obtained from four captive wild individuals of
Saguinus leucopus and 13 collected from a single captive wild individual of Cebus albifrons held
within wildlife rescue facilities in Colombia. In addition, two adult parasites were obtained from two
wild-caught individuals of S. leucopus collected by the Wildlife Conservation Society – Colombia.
Full details of parasites analysed are given in table 2.1. Adult parasites were either obtained during
post-mortem examination or surgical intervention carried out by qualified veterinarians following
ethical practices and according to the surgical procedure described in Perez et al. (2008). All post-
mortem examinations were carried out on individuals that died of natural causes. Adult parasites were
stored in either 10% formaldehyde (10 samples) or absolute ethanol (27 samples). Samples received in
formaldehyde were washed three times in saline solution and placed in absolute ethanol for long-term
storage. The parasites were stored at -20 C until processing. Morphology of adult parasite was
examined under a dissecting stereoscope and an electron microscope.
46 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
2.2.2 Amplification and sequencing of DNA
Total DNA was isolated from adult parasites using protocols of proteinase K digestion and
silica/guanidinium thiocyanate extraction or standard phenol-chloroform extraction and ethanol
precipitation. For silica DNA extraction, samples were digested overnight at 55°C using 2.0 mg/ml
proteinase K in lysis buffer (EDTA 0.5 M, Tris 10 mM, NaCl 100 mM, SDS buffer 2% and Triton X-
100 0.5%). Binding buffer (GuSCN 5 M, NaCl 25 mM and Tris 50 mM) and silica suspension (Sigma-
Aldrich, 0.5 to 10 microns particle size) were added, incubated for 3 h at room temperature and spun at
15,000 rpm for 2 min to pellet the silica. The supernatant was removed and the silica pellet was washed
twice using wash buffer (ethanol 50% v/v, NaCl 125 mM, EDTA 1 mM, and Tris 10 mM). The silica
pellet was dried at room temperature and DNA was recovered using ultra-pure water.
A fragment of 703 base pairs (bp) of the mitochondrial cytochrome oxidase I (COI) gene was amplified
using the forward primer 5'- CTAATCATAARGRTATYGG - 3' and reverse primer 5'-
TAAACYTCAGGRTGACCAAARAAYCA - 3' modified from Folmer et al. (1994). M13 sequence
(M13REV or M13[-21]) was added to the 5’end of each primer in order to facilitate sequencing.
Polymerase chain reactions (PCRs) were carried out in a final reaction volume of 35 µL containing 1 ×
PCR reaction buffer [75 mM Tris-HCl, 20 mM (NH4)2SO4, 0.01% (v/v) Tween 20; Fermentas], 2.0
mM MgCl2, 0.2 mM of each dNTP, 0.875 U recombinant Taq polymerase (Fermentas) and 0.5 µM of
each primer. After an initial denaturation steps of 2 min at 94°C, 34 cycles of 30 sec at 94°C, 30 sec at
48°C and 60 sec at 72°C were followed by a final extension of 72ºC for 1 min. PCR products were
purified by agarose gel extraction using spin columns (MinElute Gel Extraction Kit – Qiagen;
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit – Zymo Research) and sequenced using Big-Dye (Applied
Capítulo 2 47
Biosytems) cycle sequencing reactions with the M13REV or M13(-21) sequencing primers.
Sequencing products were run on an ABI 3500 Genetic Analyzer automated sequencer (Applied
Biosytems). Resulting sequence traces were checked and edited using the program CodonCode
Aligner ver. 4.2. (CodonCode Corporation; www.codoncode.com). Six hundred and thirty-three bases
of reliable COI gene sequence was obtained from all individuals analysed.
2.2.3 Data Analyses
Sequences were aligned using “Clustal W” (Thompson et al., 1994) as implemented within the
program BioEdit ver. 7.0 (Hall, 1999) and translated into amino acid sequences using the program
MEGA ver. 5 (Tamura et al., 2011) to check for the presence of premature stop codons. There were no
premature stop codons, insertions, or deletions, and therefore pseudogenes were not suspected. Final
alignment resulted in 633 bp of homologous sequence for all adult parasites. A single site exhibited
heteroplasmy in five parasites from the same individual. This site was removed from analyses.
Phylogenetic relationships among sequences were estimated using maximum parsimony (MP) and
neighbor-joining (NJ) methods. MP analyses (un-weighted) were performed in PAUP* version 4.0b10
(Swofford, 1998) with 1,000 bootstrap samples from the sequence data (heuristic search, 10 random
addition replicates). NJ analyses were carried out with the program MEGA ver. 5 (Tamura et al., 2011)
assuming a K2P distance between sequences and confidence determined by bootstrap (1,000
iterations). In addition, relationships among sequences were also estimated by an unrooted parsimony
network based on a statistical parsimony procedure (Templeton et al., 1992) using the 95% probability
of parsimony criterion to connect sequences using the program TCS ver. 1.21 (Clement et al., 2000).
48 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
2.3. Results
2.3.1 Morphological identification
All parasites were reviewed by stereoscope, confirming the morphological identification of
Prosthenorchis sp, cylindrical body with creases along its length, and a proboscis armed with hooks.
However, only one of the articles found provided clarity on stereoscope differentiation between P.
elegans and P. spirula (Machado Filho 1950), the two species reported for primates: detection of the
number and arrangement of proboscis hooks, described by some authors (Baker 2008, Müller 2007),
requires other specialized methodologies (Wayland 2010). The distinguishing characteristic between
the two species at the stereoscope level was the presence of a collar, formed by folds, between the body
and the proboscis of P. elegans (Machado Filho 1950) (Figure 2.1). No morphometric analyses were
performed on parasites because preservation methods resulted in distorted morphology. In addition,
the proboscis were reversed and the hooks broken in most Prosthenorchis evaluated as a result of
opportunistic nature of the sampling. However, it should be noted that the hooks were more evident in
parasites of shorter length. In electron microscopy pictures you can see the details of the parasite and
hooks present in the proboscis (Fig. 2.2).
2.3.2 Sequence variation and genetic diversity
The final alignment of 633 pb partial COI sequence contained 11 variable sites (all parsimony
informative) resulting in six distinct haplotypes (Table 2.2, Fig. 2.3). Three variable sites (49, 274 and
293) resulted in changes in amino acid. All three amino acid changes corresponded to fixed differences
Capítulo 2 49
separating the two main haplogroups detected (see later). Uncorrected divergence among sequences
was 0.0-1.6% . None of the sequences matched with acanthocephalan sequences available in GenBank.
The MP and NJ trees provided evidence of two well-supported groupings (hereinafter referred to as
haplogroups I and II) (Fig. 2.3). The unrooted parsimony network (Fig 2.4) revealed that at least eight
mutational steps separate haplogroups I and II. Differentiation is generally low among the remaining
haplotypes (maximum three mutational steps between neighboring haplotypes). Haplogroup I was
formed by haplotypes C, D, E, F and haplogroup II by haplotypes A and B (Table 2.3).
No association was found between haplogroup, species or holding facility (Fig 2.5). Haplogroup I was
present in all holding facilities and both species (with the exception of S. leucopus 3 from AMVA).
Haplogroup II was present in both species (with the exception of S. leucopus 1 from URRAS and in S.
leucopus 6 from Puerto Berrío-Antioquia). The haplogroup II was predominant in AMVA (five
samples vs two samples) and haplogroup I was predominant in URRAS (17 vs 10 samples).
Haplogroup I was the most abundant haplogroup, being found in 21 adult parasites followed by
haplogroup II being found in 16 parasites.
No association was detected between holding facility and haplotype, with individual haplotypes shared
between individuals from distinct rescue centres with the exception of haplotype B and E which were
only found in URRAS. Haplotype A and C were most frequently found. Furthermore, even distinct
haplogroups and individual haplotypes were found to be shared between species, with the exception of
haplotype D which was only detected in a single parasite from a single wild-caught S. leucopus. The
haplotype D was absent in Cebus albifrons. All the haplotypes were present in Saguinus leucopus. In
AMVA the haplotype A was predominant, with haplotypes C and F with frequencies of one. In
50 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
URRAS haplotype C was the predominant haplotype (n=10) followed by haplotype A (n=7) haplotype
E (n=5), and haplotypes B (n=3) and F (n=2). Haplotype diversity detected was not the same among
individuals, with some individuals containing 5 haplotypes (C. albifrons and S. leucopus 5) and others
containing 1 (S. leucopus 3). Furthermore, both haplogroups were detected within the same individual
(for example, S. leucopus 5 contained three parasites from haplogroup I and two parasites from
haplogroup II).
2.4. Discussion
One of the biggest challenges in this study was the identification of the species of Prosthenorchis.
From morphological point of view, most published reports describe slight differentiation between P.
elegans and P. spirula based on the number and arrangement of hooks on the proboscis (Baker, 2008;
Müller, 2007). As parasites were collected opportunistically and sent without any prior collection and
storage protocol, most specimens displayed an inverted proboscis and presented broken hooks. As
such, it was almost impossible to obtain an accurate hook count by conventional methods, with the
need for specialized clearance methods to perform this procedure (Alcantar-Escalera et al., 2013;
Wayland, 2010). Machado Filho (1950), however, provided an alternative method to discriminate
between the two species in which the presence of a collar in P. elegans, can be used to separate P.
elegans from P. spirula. The authors recommend this morphological characteristic to recognize P.
elegans for future studies. For future studies we recommend the use of sample collection protocols that
preserve the morphological characters of the species. This should include the careful removal of
parasites from the host tissue in such a way as not to damage taxonomically important characters, with
the removal of the front end and back end of the parasite for morphological analysis following the
Capítulo 2 51
methodology by Alcantar-Escalera et al. (2013), the remaining tissue should be preserved in absolute
ethanol for molecular analysis. It would also be interesting to carry on morphometry using the tool
proposed by Wayland (2010).
The DNA extraction fenol-cloroform protocol had good results, however the silice protocol was more
efficient with samples conserved in formol. The silice protocol has shown be effective to recover DNA
from museum samples, being valuable for samples degradated (Rohland et al., 2010).
The study provides the report of sequence data for a member of the genus Prosthenorchis. Although
the determination of the phylogenetic position of Prosthenorchis was not an objective of the present
study, a Blast search of the GenBank data base clearly grouped the sequences reported here within the
Acanthocephala. With this study, sequence data from Prosthenorchis is made available to scientific
community, permitting studies on biology, ecology and diagnosis of infection. The importance of these
tools has been highlighted by Criscione et al. (2005), with three main uses: 1) identification of known
species in which life stages are morphologically indistinguishable, 2) elucidation the life cycle of the
parasites, and 3) investigation of species morphologically similar but genetically distinct (cryptic
species).
One of the most important findings of this study was the presence of two mitochondrial DNA lineages
(corresponding to haplogroups I and II) of Prosthenorchis elegans, confirming one more time the
utility of COI as a mitochondrial gene to describe genetic diversity below the species level in
acanthocephalans (Alcantar-Escalera et al., 2013). There is no clear explanation for the origin of the
two mtDNA lineages. One possible explanation is that the distinct mtDNA lineages detected here
52 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
originated in different species or in the same species but in different geographical areas but were
subsequently mixed as primates carrying different haplotypes/haplogroups were also mixed in the same
holding facilities. The alimentary habits of the definitive host and the presence of the intermediate host
as part of the diet are fundamental to acquire the infection. Since the consumption of the intermediate
host in the wild or in captivity may occur in different times, the definitive host may carry adult
Prosthenorchis from different environments taking into account that studies on longevity of other
acanthocephalans showed a life span of 50 to 365 days (Kennedy, 1985). Clearly, analysis of parasites
from wild caught individuals from throughout the species distribution is required if actual patterns of
distribution of genetic diversity within Prosthenorchis elegans as well as possible causes are to be
understood. Also is possible that the lineages could come from wildlife and captivity.
Gaps in knowledge on intermediate hosts limit interpretation of the current findings, however the
presence of different haplotypes in one individual could be related to the consumption of different
intermediate hosts in the wild, during the pet trade and in the rescue centers. The illegal trade of
wildlife is an important problem at both local and international level, because pathogens may be
transmitted between regions and species. The pathogenicity is a factor that needs to be taken into
account, since the magnitude of the health risk could be potentiated for the ability of the parasite to
persist in an environment (Gomez and Aguirre, 2008). Prosthenorchis elegans is a parasite found in
wildlife and in captivity; however mortality has only been reported in captivity, where increased stress
seems to be relevant to the deleterious effects on the host (Jimenez, 2009). Stress in captivity must be
present because the illegal trade includes inappropriate methods of capture, transport, housing and
feeding. When the animals arrive at rescue centers they have already suffered from elevated levels of
stress having shared spaces with humans, pets and other animals.
Capítulo 2 53
Although most of the sequences were obtained from parasites from URRAS located in Bogotá, the
sequences from CAV of Medellín shared four of the haplotypes present in Bogotá. Since the S.
leucopus , is the most trafficked primate species in Colombia, and most of the P. elegans were obtained
from this species, it is important to better understand the distribution of genetic diversity of P. elegans
in this species throughout its natural distribution (Tolima, Caldas, Antioquia and Bolivar) (Roncancio
et al., 2011). In addition, Bogota is not within the natural distribution of S. leuocopus. Thus all
individuals present in in Bogotá are the consequence of illegal trade in this species. The White-fronted
capuchin (C. albifrons) has a broad distribution in Colombia and Latin America, however it coexists in
some areas with S. leucopus. The white-fronted capuchin included in this study, was an old female
that has lived a long time in captivity, and it was rejected by its co-specifics. It is most likely that this
individual acquired the parasite at the centre. The genetic diversity found in P. elegans is most likely
an under representation of haplotypes found in the wild. It is interesting that in a same definitive host
there were several haplotypes, confirming that infection of definitive host with multiple haplotypes is
common and is related with the presence in the intermediate host (Gesy et al., 2014).
As suggested by Gesy et al. (2014) analysis of haplotypes from definitive and intermediate hosts from
the same locality could help to find similarities between haplotypes and to detect the rank of action for
each haplotype. Likewise, more samples are required to strengthen the findings reported here.
Prosthenorchis elegans could be important in a threatened species like S. leucopus. The species has
suffered severe declines in available habitat and habitat that is available is severely fragmented,
increasing population densities (Roncancio et al., 2013). This situation is likely to lead to conditions
that result in increased stress which in turn could result in high mortality in the future as consequence
54 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
of P. elegans infection. In addition, this primate has been involved in several release or reintroduction
programs possible creating even more interaction between the parasites and intermediate hosts in
captivity and wild life. Being such a threatened primate species, elucidating the mechanisms to combat
Prosthenorchis will bring positive consequences for the conservation of the species and other species
threatened such as Saguinus oedipus, Callithrix pygmaea, Cebus albifrons, Cebus apella,
Leontopithecus sp., etc.
If the presence of parasites from distinct haplogroups is the result of bringing together animals from
different geographical origins then this could have severe consequences for management practices.
Independent of the presence or absence of geographical structure in S. leucopus, the distribution of the
two parasite lineages may need to be taken into account when considering liberations. Each lineage
could represent the delicate balance between host-parasite interactions that could be disrupted if
liberated animals incorporate a parasite lineage previously not present in the natural populations.
Finally, the present study is the first report of genetic diversity for P. elegans. As such it provides an
important baseline to develop molecular diagnosis tools and pharmacology treatment, helpful for the
management of New World primates in captivity. Furthermore, it provides useful information to help
clarify species identification of the parasite, the intermediate host in the wild and all the ecological
processes affecting its interaction. All the research performed will help to develop protocols for future
liberation programs of primates and for sanitary requirements in the importation and exportation of
primates. Most importantly, this information generated in this study will help jump start in situ
research on how the parasite affects small populations in fragmented habitat.
Capítulo 2 55
Acknowledgements
Funding resources were provided by the International Conservation Programme for Saguinus leucopus
(EAZA, ACOPAZOA) and Agreement 09F and 39 between FONAM, Universidad Nacional de
Colombia and WCS. Samples were provided by: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales
Silvestres -Universidad Nacional de Colombia (URRAS), Centro de Atención y Valoración del Area
Metropolitana del Valle de Aburrá (AVMA) y Wildlife Conservation Society-Colombia (WCS).
Credits for some photos to Dr. Jimmy Vargas and Nicolás Contreras.
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basada en PCR
Tablas Capítulo 2
Table 2.1. List of Prosthenorchis elegans sequences analyzed in the current survey
Samples Host Locality* Source
Date
of Collection Collection Storage**
9 Saguinus leucopus 1 URRAS-Bogotá Rescue centre <2011 Unknown Absolute ethanol
13 Cebus albifrons URRAS-Bogotá Rescue centre 2011 Necropsy Absolute ethanol
7 Saguinus leucopus 2 AMVA-Medellín Rescue centre 2011 Surgery 10% Formaldehyde
1 Saguinus leucopus 3 AMVA-Medellín Rescue centre 2010 Surgery 10% Formaldehyde
5 Saguinus leucopus 5 URRAS-Bogotá Rescue centre 2010 Surgery Absolute ethanol
2 Saguinus leucopus 6 WCS- Puerto Berrío Wild 2013 Necropsy 10% Formaldehyde
* URRAS: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres, Universidad Nacional de Colombia;
AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá; WCS: Wildlife Conservation Society-Colombia
**Sample storage prior to receipt
Capítulo 2 61
Table 2.2. Prosthenorchis elegans haplotypes based in COI mitochondrial gene
Haplotype freq (N) ID Position
49 90 108 156 186 225 274 293 345 447 561
A 13 #12-A31-2 A C G G A T C C C A G
B 3 #15-A58b-1 . . . . . . . . T . .
C 12 #11-A04-1 G T C T . C A T . G A
D 1 #16-A62-3 G T C T . . A T . G A
E 5 #11-A03-1 G . C T . C A T . G A
F 3 #12-A45-2 G . C T G C A T . G A
62 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Table 2.3. Haplogroups and haplotypes found in P. elegans
Parasite ID Host Source Institution* Haplogroup Haplotype
A3 S. leucopus 1 Captivity URRAS I E
A4 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A5 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A8 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A10 S. leucopus 1 Captivity URRAS I E
A11 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A12 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A13 S. leucopus 1 Captivity URRAS I E
A14 S. leucopus 1 Captivity URRAS I C
A15 C. albifrons Captivity URRAS II A
A16 C. albifrons Captivity URRAS II A
A17 C. albifrons Captivity URRAS II A
A19 C. albifrons Captivity URRAS II B
A20 C. albifrons Captivity URRAS II A
A21 C. albifrons Captivity URRAS I C
A22 C. albifrons Captivity URRAS I F
A24 C. albifrons Captivity URRAS I C
A25 C. albifrons Captivity URRAS II A
A26 C. albifrons Captivity URRAS II A
A27 C. albifrons Captivity URRAS I E
A28 C. albifrons Captivity URRAS I C
A30 C. albifrons Captivity URRAS II B
A31 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A
A32 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A
A34 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A
A36 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A
A41 S. leucopus 2 Captivity AMVA II A
A45 S. leucopus 2 Captivity AMVA I F
A46 S. leucopus 2 Captivity AMVA I C
A47 S. leucopus 3 Captivity AMVA II A
A53 S. leucopus 5 Captivity URRAS II A
A54 S. leucopus 5 Captivity URRAS I C
A57 S. leucopus 5 Captivity URRAS I E
A58a S. leucopus 5 Captivity URRAS I F
A58b S. leucopus 5 Captivity URRAS II B
61 S. leucopus 6 Wild- Puerto Berrío WCS I C
62 S. leucopus 6 Wild- Puerto Berrío WCS I D
Capítulo 2 63
Figuras Capítulo 2
Figure 2.1. The photo is showing the characteristic morphology of P. elegans
64 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figure 2.2. SEM of Prosthenorchis elegans. A. Whole detail of the parasite. B. Proboscide of P. elegans
B A
Capítulo 2 65
Figure 2.3 Haplotype network of Prosthenorchis elegans. Network shows the relationships of haplotypes A-F
from a 633 bp of the COI mitochondrial gene, described in the current study from Saguinus leucopus and Cebus
albifrons. Network is based on statistical parsimony. Small, unlabeled circles indicate hypothetical haplotypes
separated by a single nucleotide change from adjacent sequences. Labelled ovals represent distinct haplotypes..
66 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figure 2.4. NJ tree for Prosthenorchis elegans isolates obtained from Colombia based on partial cytochrome
oxidase I (COI) sequence using MEGA 2 software. Bootstrap support values are provided
11-A11-1
21-A28-1
11-A14-1
21-A24-1
11-A12-1
16-A61-3
15-A54-1
21-A21-1
11-A04-1
11-A08-1
11-A05-1
12-A46-2
11-A10-1
11-A03-1
11-A13-1
21-A27-1
15-A57-1
21-A22-1
12-A45-2
15-A58a-1
16-A62-3
12-A41-2
21-A15-1
15-A58b-1
21-A19-1
21-A30-1
15-A53-1
12-A31-2
21-A25-1
12-A32-2
21-A20-1
21-A17-1
21-A26-1
12-A34-2
12-A36-2
13-A47-2
21-A16-1
63
63
52
100
Haplogroup I
Haplogroup II
B
A
A
C
D
F
E
Capítulo 2 67
Figure 2.5. Distribution of haplotypes and haplogroups by locality and individuals.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
I II I I II I II II I
URRAS URRAS URRAS AMVA AMVA WCS
C. albifrons S. leucopus
1
S. leucopus 5 S. leucopus 2 S. leucopus
3
S. leucopus
6
F
E
D
C
B
A
68 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figure 2.6 Graphic abstract
Capítulo 3 69
3. Una alternativa diagnóstica para
Prosthenorchis elegans basada en el gen
mitocondrial COI por medio de una PCR
semi-anidada
Formato: Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
70 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Una alternativa diagnóstica para Prosthenorchis elegans. basada en el gen
mitocondrial COI por medio de una PCR semi-anidada
An alternative for the diagnosis of Prosthenorchis elegans based on the mitochondrial
gen COI through a seminested PCR
A.C. Falla4*, C.I. Brieva
5, P. Bloor
6
Resumen
Prosthenorchis elegans es un acantocéfalo que afecta a primates del Nuevo Mundo en
cautiverio y en vida silvestre. El parásito adulto se adhiere al ciego, colon e íleon del
primate causando granulomas inflamatorios, en algunos casos peritonitis y muerte, debido
a contaminación bacteriana secundaria. El ciclo de vida de P. elegans necesita de un
hospedero intermediario, que en cautiverio se sabe que es la cucaracha alemana (Blatella
germanica). Su diagnóstico coprológico no ha sido consistente, ya que frecuentemente
4 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll
45. Bogotá-Colombia 5 Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 cll
45. Bogotá-Colombia 6 Instituto de Genética. Universidad Nacional de Colombia. Cra 30 Cll 45. Bogotá-Colombia
*Autor para correspondencia. acfallab@unal.edu.co
Capítulo 3 71
mueren individuos con altas cargas parasitarias y coprológicos negativos. El objetivo de
este estudio es avanzar en el desarrollo de una prueba diagnóstica por PCR para P. elegans
en materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris). Se trabajó con muestras de parásitos
provenientes de S. leucopus y Cebus albifrons (mono cariblanco), así como muestras de
materia fecal de titi gris. Los parásitos se utilizaron previamente para obtener la secuencia
de citocromo oxidasa subunidad I (COI) (Capítulo 2). Las secuencias se alinearon para
diseñar primers específicos, los cuales fueron probados en el parásito y en muestras de
materia fecal procedentes de 25 individuos de Saguinus leucopus. El protocolo descrito
permitió la detección más eficiente de P. elegans comparada con otras técnicas
diagnósticas. El desarrollo de la prueba traerá grandes beneficios para las especies de
primates afectadas y su conservación, mejorando el diagnóstico y el seguimiento
terapéutico. Además abrirá las puertas a varias investigaciones ecológicas,
epidemiológicas y farmacológicas.
Palabras clave: Acantocéfalos, endoparásito, diagnostico, PCR, Saguinus leucopus
Abstract
Prosthenorchis elegans is an acanthocephalan affecting captive and wild New World
Primates. The adult worm attaches to cecum, colon and ileon causing inflammatory
granuloms, in some cases peritonitis and death, due to secondary bacterial contamination.
The life cycle of P. elegans needs an intermediate host, known in captivity to be the
german cockroach (Blatella germanica). Coprologic diagnosis has been difficult and
72 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
unreliable, since individuals often die with high numbers of parasites and negative
coprologics. The goals of this study was to develop a diagnostic test based on PCR for P.
elegans in fecal material of Saguinus leucopus (white footed tamarin) based on previously
obtained partial mitochondrial COI gene sequence. Sequences of COI (chapter 2) were
aligned with available sequences for other acanthocephalan and species-specific primers
designed. Primers were tested in 25 fecal samples from S. leucopus using semi-nested
PCR. The current protocol allowed more effective noninvasive detection of the presence
of P. elegans compared with more traditional techniques. The development of this test will
bring great benefits to species of primates affected by this parasite, improving the
diagnosis and the therapeutic monitoring. Furthermore, this test will open the doors to
further research into aspects of ecology, epidemiology and pharmacology.
3.1 Introducción
Actualmente se han desarrollado pruebas diagnósticas basadas en la técnica de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de parásitos de importancia en salud
pública y para la producción pecuaria, demostrando así, las ventajas de la PCR sobre la
microscopía convencional (Carneiro et ál. 2013, ten Hove et ál. 2007) y sobre el
inmunodiagnóstico (Ndao 2009), ya que no depende de la inmunocompetencia del
hospedero ni de la presentación histórica de la enfermedad. La exploración de pruebas
basadas en PCR puede ser de utilidad para el manejo de animales silvestres en cautiverio y
para planes de conservación que involucren protocolos médicos para liberación y
Capítulo 3 73
reintroducción (Almberg et ál. 2012); así como para la detección de patógenos en vida
silvestre, y para la epidemiología y ecología de las infecciones en vida libre.
Prosthenorchis elegans es un parásito que tiene implicaciones para la conservación de
especies de callitrícidos amenazados de extinción como Leontopithecus rosalia (tamarino
león dorado) de Brasil (Dos Santos et ál. 2010) y Saguinus leucopus (titi gris) de
Colombia (Perez et ál. 2007), entre otros. Lo anterior, debido a que causa altas
mortalidades en cautiverio, posiblemente asociado al estrés generado por situaciones como
el tráfico de fauna y el hacinamiento en centros de rescate (Jimenez 2009), todo ello
potenciado con la presencia del hospedero intermediario, la cucaracha alemana (Blatella
germanica), necesaria para cumplir el ciclo de vida del parásito, siendo común encontrarla
en condiciones de cautiverio. El problema reportado para Prosthenorchis radica en su
difícil diagnóstico, puesto que los animales mueren con altas cargas parasitarias, que no
han sido detectadas por los métodos rutinarios de coprológico. Igualmente, el reporte de
tratamientos farmacológicos no ha sido consistente, y los parásitos tienen que ser extraídos
quirúrgicamente, cuando logran detectarse nódulos a la palpación abdominal (Perez et ál.
2008).
De acuerdo al conocimiento del autor, no existen reportes en la literatura acerca de
aspectos genéticos para Prosthenorchis sp. El aislamiento y caracterización de la
secuencia específica de Prosthenorchis constituye un gran avance para comenzar a
74 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
explorar alternativas para el área diagnóstica (capítulo 2). Los estudios genéticos para
otros acantocéfalos se han centrado más en estudios filogenéticos y de caracterización
molecular (García-Varela and Nadler 2005, García-Varela et ál. 2011, García-Varela et ál.
2005, García-Varela and González-Oliver 2008, García-Varela et ál. 2012, García-Varela
et ál. 2002), que en su potencial diagnóstico. Recientemente, Alcantar-Escalera et ál.
(2013) logró relacionar los cistacantos y parásitos adultos de Polymorphus brevis, sin
embargo es poco usual utilizar estudios con propósitos diagnósticos.
Si se observa más a fondo lo que pasa con Prosthenorchis, su hallazgo tanto en vida
silvestre como en cautiverio y la diferente patogenicidad que se evidencia en esos
ambientes, surgen una gran cantidad de interrogantes en torno al papel que está jugando el
parásito en poblaciones naturales y las implicaciones que puede traer la liberación de
primates con cargas parasitarias caracterizadas por amplia diversidad genética (capítulo 2).
Por otro lado, al evaluar caso a caso especies en peligro de extinción, en donde muchas
veces la pérdida de hábitat hace que se concentren densidades más altas de individuos en
fragmentos pequeños, como el caso de Saguinus leucopus (Roncancio et ál. 2011), vale la
pena investigar lo que sucede con las poblaciones de parásitos, ya que está reportado que
dichas condiciones podrían afectar la reproducción de sus hospederos y en caso de ocurrir
mortalidad, podrían incluso causar la extinción de las especies (Pérez et ál. 2006).
Capítulo 3 75
En este estudio se propone una alternativa diagnóstica para la detección de P. elegans en
materia fecal, a través de la implementación de una PCR semi-anidada basada en la
amplificación de un fragmento específico de citocromo oxidasa subunidad 1 (COI).
3.2 Metodología
La prueba consistió en una PCR semi-anidada en extracciones de ADN de parásitos
adultos y de materia fecal de monos titi gris (Saguinus leucopus), en donde se diseñaron
tres primers específicos. Los dos primeros primers sirvieron para amplificar un
fragmento externo "outer" de COI, para utilizarlo como templete de una segunda
amplificación. En la amplificación semi-anidada se utilizó el mismo primer de inicio de la
amplificación anterior con un tercer primer para obtener un fragmento interno "inner" más
corto de COI.
3.2.1 Diseño de los primers
Para el diseño de los primers se utilizaron 37 secuencias de parásitos adultos de
Prosthenorchis elegans, identificados morfológicamente de acuerdo a Machado Filho
1950. Las secuencias correspondían a un fragmento parcial del gen mitocondrial COI,
caracterizadas en Falla et ál (capítulo 2). Se identificaron los sitios más conservados entre
las secuencias obtenidas de P. elegans y se realizaron alineamientos con secuencias de
otros parásitos acantocéfalos cercanos de acuerdo a GenBank, como Oncicola sp.,
Macracanthorhynchus_ingens, Macracanthorhynchus hirudinaceus, Mediorhynchus
76 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
gallinarum, Mediorhynchus sp., Moniliformis sp., Oligacanthorhynchus sp., identificando
polimorfismos específicos a P. elegans. Se utilizó el programa Primer3 (Rozen and
Skaletsky 2000, Untergasser et ál. 2012) para diseñar primers que amplificaran regiones
cortas (entre 120 a 200 pb). Se seleccionaron los primers ProsCOI_L1: 5’-GTT TTG GTT
ATT ACC AGT GTC CA-3’, ProsCOI_H1: 5’-CGA AGC TAA CAC AGA AGA AAC
C-3’ y ProsCOI_H2: 5’-TCT CAA ATC TCA CCC CCA TA-3’, con el fin de realizar una
PCR semi-anidada. Un fragmento “outer” de 236 pb fue amplificado con los primers
ProsCOI_L1 y ProsCOI_H2. Un fragmento “inner” de 178 pb fue amplificado con los
primers ProsCOI_L1 y ProsCOI_H1. Todos los primers fueron seleccionados por ser
específicos para Prosthenorchis elegans en el extremo 3’ pero diferentes con lo que
respecta a otras especies. También se modificó el primer ProsCOI_H2 para generar otra
alternativa con menor temperatura de anillamiento: ProsCOI_H2.1: 5’-TCA AAT CTC
ACC CCC ATA-3’ (Figura 3.1) .
3.2 .2 Extracción de ADN a partir de parásitos
Se realizaron extracciones de ADN de ocho parásitos con el método de sílice
guanidina/tiocianato (Boom et ál 1990), seis de ellos habían sido previamente utilizados
para la obtención de la secuencia de P. elegans. Así mismo, se utilizaron extracciones de
ADN de siete parásitos, previamente utilizados para la caracterización de la secuencia
(capítulo 2), los cuales fueron utilizados como controles positivos en las diferentes
pruebas y están identificados con la letra "A" en la Tabla 3.1.
Capítulo 3 77
3.2.3. Materia fecal de Saguinus leucopus (titi gris) utilizada para la prueba
Con el objetivo de evaluar los primers en materia fecal se utilizaron muestras de 25
individuos de Saguinus leucopus, 13 muestras de materia fecal procedentes de animales de
vida silvestre y 12 muestras de animales de cautiverio (Tabla 3.2). Las muestras fueron
remitidas en etanol absoluto (una parte de la muestra por nueve partes de etanol absoluto)
y correspondían a materia fecal en 14 casos y a lavados rectales en 11 casos (Tabla 3.2).
El protocolo de muestreo de los lavados rectales consistió en instilar 10 ml de solución
salina vía sonda rectal y recuperar el volumen, diluyéndolo luego en etanol absoluto 1:10,
este protocolo fue utilizado cuando la materia fecal no pudo obtenerse fresca, dado el
nerviosismo de la especie en los animales de cautiverio y la dificultad de obtener muestras
en el caso de animales de vida silvestre. Las muestras fecales en cautiverio fueron tomadas
por el autor y las muestras en vida silvestre fueron remitidas por Wildlife Conservation
Society (WCS). Las muestras se recolectaron durante los años 2011 a 2013 y fueron
almacenadas a -20°C hasta su análisis.
De las 25 muestras de materia fecal, se seleccionaron 10 muestras que eran positivas, ya
sea por coprológico, necropsia e histopatología; 6 sospechosas de tener Prosthenorchis, ya
que los primates presentaron nódulos a la palpación abdominal pero habían sido negativas
al coprológico; y 9 muestras negativas al parásito por examen coprológico (Tabla 3.3).
Las muestras positivas correspondieron a individuos silvestres, de las cuales seis fueron
78 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
positivas por coprológico, una por necropsia, una por histopatología y dos positivas por
necropsia e histopatología, procedentes de individuos que murieron después de la captura.
3.2.4. Extracción de ADN de materia fecal
Para la extracción de ADN de materia fecal se tomó una porción de 3 mm
aproximadamente y de los lavados rectales se tomó parte del sedimento. Todas las
muestras de materia fecal fueron extraídas por el método de sílice/guanidina tiocianato
(Boom et ál. 1990). Para el protocolo de sílice/guanidina tiocianato se usó el buffer de
unión (GuSCN 5 M, NaCl 25 mM and Tris 50 mM) y suspensión de sílice (Sigma-Aldrich,
tamaño de partícula 0.5 a 10 micrones), incubados por 3 horas a temperatura ambiente o
por una hora a 55°C y centrifugados a 15,000 rpm por 2 min para formar un sedimento
(pellet) de sílice. Se removió el sobrenadante y el pellet de sílice fue lavado dos veces
usando buffer (ethanol 50% v / v, NaCl 125 mM, EDTA 1 mM, y Tris 10 mM). El pellet
de sílice se dejó secar a temperatura ambiente y el ADN fue recuperado usando el buffer
de recuperación (Tris-HCl 10 mM and EDTA pH 9 0.5 mM). Para visualizar las
extracciones se realizaron geles de agarosa al 0,8%.
Se realizaron dos ensayos con el fin de asegurar y ajustar la metodología para la extracción
de ADN de materia fecal, en el primer ensayo se realizó extracción de la totalidad de la
muestra dividida en varias porciones y en el segundo se utilizaron sólo dos extracciones
tomando una parte de la muestra. Para el primer ensayo se escogieron tres muestras: C1
que era una muestra de materia fecal en etanol de un animal con nódulos a la palpación
Capítulo 3 79
abdominal pero negativo a coprológico; C2 que era un lavado rectal en etanol de un animal
positivo a Prosthenorchis sp. por necropsia e histopatología y negativo al coprológico; y
C3 que era una muestra de materia fecal en etanol positiva al examen coprológico. Todas
las muestras tuvieron una extracción positiva en la electroforesis (se observó la presencia
de ADN de alto peso molecular). Se utilizó como control positivo una extracción de ADN
del parásito. Para el segundo ensayo, luego de verificar los resultados del primer ensayo,
se utilizaron solo dos repeticiones de cada muestra, con el fin de eliminar posibles errores
humanos en el procedimiento. De esta forma, se procesaron en total 25 muestras de
materia fecal procedentes de S. leucopus: C1 y C3 (11 repeticiones), C2 (5 repeticiones), y
C4-C25 (2 repeticiones).
3.2.5. PCR y condiciones de la amplificación
Las reacciones PCR se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 35-µL conteniendo 1
× PCR DreamTaq buffer, 2.0 mM MgCl2, 0.2 mM de cada dNTP, 0.875 U DreamTaq y
0.5 µM de cada primer. Las condiciones del ciclo utilizadas con los primers ProsCOI_L1,
ProsCOI_H2 y ProsCOI_H1 fueron: 2 min a 94ºC seguido por 34 ciclos de 30 s a 94ºC, 30
s a 55ºC, 1 min a 72ºC y 1 min a 72 ºC. También se probó con 0,1 µM de cada primer.
Las condiciones del ciclo utilizadas con los primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H2.1 y
ProsCOI_H1 fueron las ya mencionadas, exceptuando que la temperatura de anidación fue
de 53ºC para el fragmento "outer" y la temperatura de anidación para el fragmento "inner"
80 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
fue de 56 ºC. Se preparó un gel de agarosa al 2% para visualizar los productos de
amplificación, utilizando 5 µL de la muestra.
3.2.6. Evaluación de los primers en los parásitos
Se realizaron diluciones de las extracciones de ADN 1:10, 1:50 y 1:100 y se realizaron
amplificaciones utilizando los primers diseñados. Los controles positivos utilizados
fueron extracciones de ADN de adultos de P. elegans previamente secuenciadas (capítulo
2). Los controles negativos consistieron en la adición de agua en lugar de ADN. Se
realizaron pruebas con los primers de forma independiente y con los primers de forma
anidada. Los primers utilizados con los parásitos fueron ProsCOI_L1, ProsCOI_H2 y
ProsCOI_H1.
3.2.7 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus
Se realizaron amplificaciones con el ADN extraído de las heces de Saguinus leucopus, los
primers se probaron de forma independiente y luego se realizó la amplificación semi-
anidada, con las condiciones de amplificación mencionadas anteriormente. Igualmente, se
realizaron diluciones del ADN de las heces 1:10 y 1:50 y se realizaron múltiples pruebas
para probar las condiciones de la amplificación, incluyendo controles positivos y
negativos. También se realizaron diluciones de los productos de la amplificación del
fragmento "outer" 1:100 y 1:1000 previa amplificación del fragmento "inner". Se
montaron controles positivos y al menos dos controles negativos en todas las
Capítulo 3 81
amplificaciones. Para visualizar las amplificaciones se realizaron geles de agarosa al 2%,
utilizando 5 µL del producto amplificado. Se seleccionaron al azar 16 amplificaciones, las
cuales fueron sometidas a purificación y secuenciación para confirmar la identidad de los
resultados. Para purificar, se preparó un gel de agarosa al 1,5% con el objetivo de cortar
banda. Las bandas fueron purificadas con columnas de centrifugación (ZimocleanTM,
MinElute©) de acuerdo a las instrucciones. Los productos de PCR purificados fueron
secuenciados usando el Kit terminator BigDye 3.1 (Applied Biosytems) y los productos se
corrieron en un analizador de secuencias automático ABI 3500 Genetic Analyzer (Servicio
de Secuenciación y Análisis Molecular, Instituto de Genética, Universidad Nacional de
Colombia, Bogotá).
3.3 Resultados
3.3.1 Obtención de heces de Saguinus leucopus
Para el desarrollo de la prueba se escogieron muestras que habían sido positivas o
sospechosas de tener Prosthenorchis sp. y muestras negativas desde el punto de vista de
sintomatología y coprológico con resultados negativos (Tabla 3.3), incluyendo muestras
de todas las localidades para cautiverio y vida silvestre utilizadas para este estudio. De
esta forma se obtuvo también una representación por sexo que resultó ser equitativa para el
estado de desarrollo biológico adulto y juvenil. Se procesaron muestras de cuatro centros
de rescate y tres localidades de vida silvestre, logrando representar tres de los cuatro
departamentos en los cuales está distribuido el titi gris en forma natural (Figura 3.2).
82 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
3.3.2 Extracción de ADN de materia fecal
Se logró visualizar la extracción de las 25 muestras procesadas, sin importar el tipo de
muestra, el tiempo de haber sido colectadas o la metodología empleada en este estudio
para la extracción. En el ensayo inicial, en donde se trató de extraer la mayor cantidad de
ADN posible por medio de gran cantidad de repeticiones de la misma muestra, se
obtuvieron unas buenas extracciones (Figura 3.3), que al compararlas con el control
positivo mostraban el mismo tamaño de banda obtenido para el parásito. El siguiente
ensayo, utilizó solamente una parte de la muestra utilizando dos repeticiones de cada
muestra y se logró visualizar en el gel, al menos una de las repeticiones. Las únicas
muestras en las que no se visualizó extracción para ninguna de las repeticiones en los geles
fueron la C9 y la C18.
3.3.3 Evaluación de los primers en los parásitos
La evaluación inicial en los parásitos permitió probar los primers, así como detectar
algunos inconvenientes antes de probar el procedimiento en materia fecal. De las
diluciones realizadas del ADN del parásito, la única que no salió a la amplificación fue la
dilución 1:100 (datos no mostrados), por lo que indistintamente se probó con el ADN puro
o las otras dos diluciones (1:10 y 1:50). Inicialmente se realizó la prueba amplificando
cada uno de los fragmentos y luego se realizó la PCR semi-anidada con las extracciones
del parásito. En la tabla 3.4 se pueden observar los resultados que se obtuvieron para las
diferentes pruebas efectuadas con los parásitos, evidenciando en general resultados
positivos, especialmente con el fragmento "inner" y en la PCR semi-anidada. Se presentó
Capítulo 3 83
una contaminación en el control negativo del primer "outer" posiblemente porque el
laboratorio y las pipetas se encontraban en mantenimiento, y se realizó en una misma sala
el Post-PCR y la preparación de PCR, que para la prueba semi-anidada requería trabajar
con los productos de la primera amplificación en una sala separada. Para corregir la
contaminación, se desecharon todas las alícuotas del proceso, se utilizaron puntas con
filtro y se trabajó en sala separada, con cambio constante de guantes. Sin embargo el
primer reverso del fragmento "outer" apareció contaminado en varias amplificaciones y
utilizando diferentes alícuotas del mismo, por lo que se solicitaron nuevos primers. Se
observó la presencia de primer dimer en las amplificaciones iniciales, los cuales dejaron
de ser observados al disminuir la cantidad de primer de la mezcla maestra de 0,5 µM a 0,1
µM. Adicionalmente se presentaron dos bandas en la amplificación semi-anidada, lo que
hizo necesario probar diluciones 1:100 y 1:1000 de los productos de amplificación del
fragmento grande, estandarizando una dilución de 1:1000 del producto de amplificación
inicial.
3.3.4 Evaluación de los primers en materia fecal de S. leucopus
Para la amplificación de ADN en materia fecal se probaron los primers ProsCOI_L1 (L1)-
ProsCOI_H2 H2) para el fragmento "outer" y ProsCOI_L1 (L1)- ProsCOI_H1(H1) para el
fragmento "inner", de forma independiente. Solamente se tuvieron en cuenta aquellas
pruebas en los que los controles negativos y positivos validaron la prueba, obteniendo solo
cinco muestras positivas, dos muestras para el fragmento "outer" (C14 y C15) y tres
muestras para el fragmento "inner" (C1, C2 y C3).
84 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Se realizó la PCR semi-anidada, tomando los productos de amplificación del fragmento
"outer" de 236 pb (L1-H2) y sometiéndolo a una nueva amplificación (L1-H1). Se probó
con el producto puro y con diluciones 1:100 y 1:1000. Además se probaron las muestras
C1, C2 y C3, que teniendo en cuenta el tipo de muestra y las consideraciones expuestas en
la tabla 3.3, es posible que tuvieran diferentes concentraciones de ADN del parásito. Para
las muestras C1, materia fecal procedente de un animal con nódulos a la palpación
abdominal, se obtuvieron bandas más fuertes que para las otras muestras, siendo las
diluciones 1:1000 las más recomendadas para evitar bandas dobles o manchas (Figura 3.4).
En esta ocasión no se obtuvo primer dimer, por lo que la concentración de 0,1 µM se
considera apropiada. Con el resto de extracciones de ADN (C4-C25) se realizó la primera
amplificación para el fragmento "outer", luego se hicieron diluciones 1:1000 del producto
de amplificación y se realizó la PCR del fragmento "inner". Solamente se obtuvo una
muestra negativa (C19) en las dos repeticiones, lo cual fue comprobado con el nuevo
conjunto de primers ProsCOI_L1(L1), ProsCOI_H2.1(H2.1) y ProsCOI_H1(H1) en
donde se pudo verificar la repetibilidad de las pruebas (Tabla 3.5). En la figura 3.5 se
puede observar un ejemplo de la PCR semi-anidada con los nuevos primers. Se enviaron a
secuenciar 16 muestras purificadas cortando banda, como se describe en la metodología,
para verificar la identidad de los resultados, confirmando P. elegans en todas las
secuencias. Por medio de la prueba se pudo confirmar la sospecha (nódulos a la
palpación) de P. elegans en seis casos, confirmar los resultados de coprológico, necropsia
e histopatología en 10 casos, y encontrar falsos negativos en 8 casos de los evaluados. De
esta forma, solamente una de las 25 muestras analizadas tuvo un resultado negativo.
Capítulo 3 85
3.4 Discusión
La materia fecal es considerada uno de las muestras de más difícil extracción de ADN,
principalmente porque se pueden encontrar inhibidores de la PCR debido a efectos
fisicoquímicos y enzimáticos (Wilson 1997). En otros estudios se han utilizado kits como
el QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen) que usa una combinación de absorción y
desactivación de sustancias inhibitorias (Menghi et ál. 2006, Nonaka et ál. 2009). Sin
embargo, la metodología de sílice/guanidina tiocianato, permitió obtener excelentes
resultados a un costo más bajo, debido a su habilidad de evitar los inhibidores de PCR
(Boom et ál. 1990, Boom et ál. 2000). Por otra parte, las muestras analizadas, llevaban
de dos a tres años desde que se tomaron y se logró extraer ADN, aún cuando en la mayoría
de los estudios utilizan heces frescas (Khademvatan et ál. 2013). Podría ser recomendable
centrifugar las muestras para tomar el sedimento antes de realizar la extracción.
Los primers diseñados, descritos en la metodología, obedecieron a una PCR semi-anidada,
buscando incrementar la sensibilidad y especificidad de una PCR convencional
(McPherson 2000). El segundo set de primers fue más específico, logrando resultados
más limpios y evitando bandas dobles. La PCR semi-anidada incrementó notablemente la
sensibilidad en la detección de P. elegans en todas las pruebas realizadas, con los dos sets
de primers. La alta sensibilidad de la PCR semi-anidada se ha demostrado con otros
parásitos como Taenia solium en donde se compararon los resultados con una prueba de
86 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
oro estándar (Mayta et ál. 2008), que en nuestro caso aún no se tiene. Es importante tener
controles positivos y negativos a la hora de realizar la prueba (Prichard 1997), puesto que
al trabajar con productos amplificados, se corre mayor riesgo de contaminación cruzada
(da Silva et ál. 2013). El problema de contaminación en las PCRs y las posibles formas de
resolverla ha sido objeto de discusión, desde que se reportó por primera vez en 1988 (Borst
et ál. 2004). De acuerdo a las descripciones de Borst et ál. (2004), la contaminación que
se observó en nuestro estudio, una vez superada la contaminación inicial y cambiados los
primers, fue ocasionada por la contaminación de una muestra, ya que no se observó en la
totalidad de las muestras.. Esto puede haber sido generado, en nuestro estudio, porque las
muestras de los controles positivos no fueron diluidas, lo que pudo haber generado una
gran cantidad de amplicones por tratarse de ADN extraído directamente del parásito y
probablemente ocurrió una contaminación hacia la muestra contigua. Son numerosos los
artículos que se encuentran en la literatura para lograr reconocer y resolver los posibles
falsos positivos que se presentan (Neumaier et ál 1998). Literatura reciente describe el uso
de Uracilo-N-Glycosilasa en la PCR anidada, lo cual degrada los amplicones que se han
generado previamente (Sharma et ál. 2013). Aunque la contaminación estuvo presente,
no fue constante en todas las pruebas y la repetibilidad de los resultados junto con la
obtención de controles negativos para el fragmento "inner" son razones suficientes para
descartar una contaminación generalizada. Aunque en las pruebas que se realizaron se
tuvieron todas las precauciones para que no ocurriera la contaminación, se recomienda
adicionalmente trabajar con diluciones del control positivo desde un comienzo, montar un
pequeño número de muestras por prueba y utilizar otras metodologías como la utilización
de un solo tubo o un solo paso (da Silva et ál. 2013). Para los falsos negativos, que
Capítulo 3 87
generalmente ocurren por errores de pipeteo o por inhibición, se recomienda incorporar un
control interno como indicador de la eficiencia de la reacción (Ballagi-Pordany and Belak
1996) y realizar dos repeticiones por muestra, desde la extracción hasta la amplificación
anidada. Sin embargo la repetibilidad de los resultados y la obtención de controles
negativos en cada prueba son importantes para valorar la especificidad de los primers.
El registro de primer dimer en las amplificaciones iniciales, pudo deberse al exceso de
primer (McPherson 2000), lo cual fue confirmado con la desaparición de estos al disminuir
la cantidad de primer de 0,5 µM a 0,1 µM. Para el fragmento "outer" las bandas
obtenidas fueron muy tenues, posiblemente debido a que había muy poco ADN o estaba
contaminado con inhibidores. Se esperaba obtener resultados negativos de las muestra
C17 a la C25, ya que no presentaron signos clínicos compatibles con Prosthenorchis sp.,
ni hallazgos de laboratorio positivos, lo que demuestra la alta sensibilidad de la prueba
para detectar bajas cantidades de ADN (Mens et ál. 2007).
En este estudio se evidencia la presencia de P. elegans en vida libre en Colombia, en las
localidades de Puerto Berrío-Antioquia, Norcasia-Caldas y Puerto Rico-Bolivar. Es
necesario evaluar localidades de Tolima, para revisar la presencia del parásito en su área
de distribución (Roncancio N. et ál. 2013). Igualmente, las muestras analizadas
procedentes de cautiverio representan a cuatro centros de rescate distribuidos en Medellín,
Caldas y Bogotá, demostrando la distribución amplia del parásito. La alta presencia de P.
88 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
elegans en dos centros de rescate en Bogotá son el reflejo del tráfico de fauna que se vive
con la especie, en donde los titi gris son trasladados desde sus zonas naturales hacia estos
centros, pasando por varios eventos estresantes y por escenarios en donde pueden estar
adquiriendo éste y otros patógenos.
Se demostró la alta sensibilidad de la prueba al detectar Prosthenorchis elegans en materia
fecal que había sido negativa al coprológico y en cuyos animales no se detectó ningún
signo clínico característico de Prosthenorchis. Igualmente se confirmaron casos de
nódulos a la palpación abdominal que habían salido negativos al coprológico. La
sensibilidad también se demostró en la capacidad de la prueba para detectar ADN de tejido
del parásito o de los huevos en lavados rectales, en los cuales, en condiciones de cargas
parasitarias bajas, sería probablemente imposible detectarlo en un coprológico. Aunque
no se corrieron ensayos con otros parásitos (Dinkel et ál. 1998), se sabe que algunas de las
muestras habían sido positivas a Strongyloides sp. en el examen coprológico, demostrando
así la especificidad de la prueba.
3.5 Conclusiones
El presente estudio, muestra una alternativa diagnóstica explorada por primera vez para
Prosthenorchis sp. y constituye una línea base para encaminar más investigaciones en
torno al perfeccionamiento de la prueba como diagnóstico. Con los resultados obtenidos
Capítulo 3 89
se confirma la presencia de Prosthenorchis elegans en cautiverio y en vida libre en la
especie titi gris (Saguinus leucopus).
Sería importante establecer el punto de corte en el que la prueba es sensible, tanto con
huevos como con tejido parasitario. Así mismo, estudiar los diferentes estadios de ciclo de
vida del parásito, para establecer su sensibilidad diagnóstica y estudiar los métodos de
transmisión. Se recomienda ampliar el número de muestras y probar con materia fecal
procedente de otras especies. Adicionalmente, es recomendable incorporar en la
metodología medidas para evitar la contaminación cruzada.
Esta prueba no solamente constituye un gran avance para el diagnóstico de la enfermedad
en Saguinus leucopus, sino que abre un gran campo de investigación para probar en
muestras de otros primates y en los hospederos intermediarios. El ciclo de vida del
parásito podrá ser esclarecido con mayor propiedad, no solamente en cautiverio sino en
vida silvestre, dilucidando de esta forma los interrogantes en la ecología del parásito. Esta
prueba constituye una gran herramienta para poder ahondar en las implicaciones de la
infección por Prosthenorchis elegans e investigar sobre perspectivas terapéuticas y de
control. Igualmente, sería importante encaminar estudios epidemiológicos
correlacionando los fragmentos de bosque donde habita el primate con asentamientos
humanos y hospederos intermediarios. Con el desarrollo de esta prueba se ven
beneficiados primates altamente amenazados de Colombia y otros países de Centro y Sur
América, al poder complementar los protocolos y planes de conservación encaminados a
preservar las especies y su ecosistema.
90 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Agradecimientos
Este proyecto contó con el apoyo y financiación del Contrato 09F y 39 de FONAM,
Universidad Nacional de Colombia y Wildlife Conservation Society y del Programa
Internacional de Conservación de Saguinus leucopus (EAZA y ACOPAZOA). Especiales
agradecimientos al Centro de Atención y Valoración del AMVA, al CAFS de la Fundación
Zoológica de Cali, al CRFSOC de CORPOCALDAS, al CRFFS de la Secretaría Distrital
de Ambiente y a la Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres de la
Universidad Nacional de Colombia por el envío de parásitos y la colaboración en la toma
de las muestras de materia fecal. Igualmente, a Wildlife Conservation Society por el envío
de las muestras de vida silvestre.
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Capítulo 3 95
Tablas Capítulo 3
Tabla 3.1. P. elegans utilizados para el desarrollo de la prueba
Institución* Especie ID** Procedencia Ciudad
URRAS S. leucopus 1 B1 Cautiverio Bogotá
URRAS C. albifrons B15 Cautiverio Bogotá
URRAS C. albifrons B21 Cautiverio Bogotá
AMVA S. leucopus 2 B31 Cautiverio Medellín
AMVA S. leucopus 3 B47 Cautiverio Medellín
CAFS S. leucopus 4 B49 Cautiverio Cali
URRAS S. leucopus 5 B55 Cautiverio Bogotá
WCS S. leucopus 6 B60 Vida Silvestre Puerto Berrío-Antioquia
URRAS S. leucopus 1 A2 Cautiverio Bogotá
URRAS S. leucopus 1 A3 Cautiverio Bogotá
URRAS S. leucopus 1 A4 Cautiverio Bogotá
URRAS S. leucopus 1 A 11 Cautiverio Bogotá
URRAS S. leucopus 1 A12 Cautiverio Bogotá
URRAS S. leucopus 1 A14 Cautiverio Bogotá
URRAS C.albifrons A19 Cautiverio Bogotá
* URRAS: Unidad de Rescate y Rehabilitación de Animales Silvestres-Universidad
Nacional de Colombia, AMVA: Area Metropolitana del Valle de Aburrá, CAFS: Centro
de Atención de Fauna Silvestre-Fundación Zoológica de Cali, WCS: Wildlife Conservation
Society
** La letra A corresponde a los controles positivos y la letra B corresponde a las nuevas
extracciones de ADN
96 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Tabla 3.2. Muestras de materia fecal de Saguinus leucopus utilizadas para el desarrollo de
la prueba
ID Marca Año
Colecta Edad Sexo Procedencia Localidad Departamento Origen
Coordenadas Muestra
* N W
26 C2 2013 Adulto Macho WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06º33'20,2
" 074º35'0,4" LR
34 C3 2013 Adulto Macho WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06°31'47,9
" 074°34'43,6
" MF
13 C9 2012 Juvenil Hembra WCS Norcasia Caldas Vida
Silvestre 05°40'0,01
" 074°45'04,8
" MF**
23 C10 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06º33'20,2
" 074º35'0,4" LR
24 C11 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06º33'20,2
" 074º35'0,4" LR
25 C12 2013 Adulto Macho WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06º33'20,2
" 074º35'0,4" MF
33 C13 2013 Juvenil Hembra WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06°31'47,9
" 074°34'43,6
" LR
42 C14 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Rico Bolivar Vida
Silvestre 08°34'18,7
" 074°12'03,8
" MF
38 C15 2013 Adulto Macho WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06°31'47,9
" 074°34'43,6
" MF
43 C16 2013 Adulto Macho WCS Puerto Rico Bolivar Vida
Silvestre 08°34'18,7
" 074°12'03,8
" MF
30 C18 2013 Adulto Hembra WCS Puerto Berrío
Antioquia Vida
Silvestre 06º33'20,2
" 074º35'0,4" LR
39 C19 2013 Adulto Macho WCS Puerto Rico Bolivar Vida
Silvestre 08°34'18,7
" 074°12'03,8
" MF
40 C20 2013 Adulto Macho WCS Puerto Rico Bolivar Vida
Silvestre 08°34'18,7
" 074°12'03,8
" MF
6071 C4 2012 Adulto Hembra URRAS Bogotá Cundinamarc
a Cautiverio
MF
8471 C23 2012 Adulto Macho URRAS Bogotá Cundinamarc
a Cautiverio
LR
9003 C25 2012 Adulto Macho URRAS Bogotá Cundinamarc
a Cautiverio
LR
3783 C8 2012 Adulto Hembra SDA Bogotá Cundinamarc
a Cautiverio
MF
9539 C6 2012 Juvenil Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio
LR
2318 C7 2011 Adulto Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio
MF
4366 C17 2012 Adulto Hembra CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio
MF
2237 C22 2012 Adulto Macho CRFSOC Victoria Caldas Cautiverio
MF
5099 C1 2012 Adulto Macho AMVA Medellín Antioquia Cautiverio
MF
7186 C5 2012 Juvenil Hembra AMVA Medellín Antioquia Cautiverio
LR
6054 C21 2012 Adulto Hembra AMVA Medellín Antioquia Cautiverio
LR
7285 C24 2012 Adulto Macho AMVA Medellín Antioquia Cautiverio
LR
*Los tipos de muestras que se recibieron correspondieron a materia fecal (MF) y lavado
rectal (LR) una parte en nueve partes de etanol
**La muestra venía con muy poco o nada de etanol
Capítulo 3 97
Tabla 3.3. Selección de muestras para evaluar los primers diseñados para Prosthenorchis
elegans
Procedencia Origen ID Prosthenorchis Nódulos a la palpación Coprológico Necropsia Histopatología
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C10 +
x
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C11 +
X
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C12 +
x X
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C13 +
x
Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C14 +
x
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C15 +
x
Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C16 +
x
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C2 +
x X
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C3 +
x
Norcasia-Caldas Vida Silvestre C9 +
x
AMVA-Medellín Cautiverio C1 ? x
URRAS-Bogotá Cautiverio C4 ? x
AMVA-Medellín Cautiverio C5 ? x
CRFSOC-Caldas Cautiverio C6 ? x
CRFSOC-Caldas Cautiverio C7 ? x
SDA-Bogotá Cautiverio C8 ? x
CRFSOC-Caldas Cautiverio C17 -
Puerto Berrío-Antioquia Vida Silvestre C18 -
Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C19 -
Puerto Rico-Bolivar Vida Silvestre C20 -
AMVA-Medellín Cautiverio C21 -
CRFSOC-Caldas Cautiverio C22 -
URRAS-Bogotá Cautiverio C23 -
AMVA-Medellín Cautiverio C24 -
URRAS-Bogotá Cautiverio C25 -
98 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Tabla 3.4 Resultados de las pruebas efectuados en los parásitos con los primers diseñados
ID 1
2
3
4
L1H2 L1H1
L1H2 L1H1
L1H2 L1H1
Semi-anidada
B1 Positivo Positivo
Positivo Positivo
Negativo Positivo B15 Positivo Positivo
Positivo Negativo
Negativo Positivo
B21
Negativo Positivo
B31
Positivo Positivo
Positivo
B47
Positivo Negativo
Positivo
B49
Negativo Leve positivo
B55 Negativo Negativo
Positivo Positivo
Negativo Positivo B60
Negativo Positivo
A2 Positivo Positivo
Positivo Positivo A3 Positivo Positivo
Positivo Positivo
A4 Positivo Positivo
Positivo Positivo A 11
A12 A14
Negativo Positivo
Positivo
A19 Leve positivo Positivo Positivo
*El número corresponde a la prueba realizada.
Capítulo 3 99
Tabla 3.5. Resultados de las pruebas semi-anidadas en las muestras de materia fecal
ID L1H2-L1H1
L1H2-L1H1
L1-H2.1-L1H1
L1-H2.1-L1H1
Diagnóstico previo*
Tipo de muestra Procedencia
C1
Positivo Positivo Sospechoso MF AMVA-Medellín
C2 Positivo
Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-
Antioquia
C3 Positivo
Positivo Positivo Positivo MF Puerto Berrío-
Antioquia
C4
Positivo Positivo
Sospechoso MF URRAS-Bogotá
C5
Positivo Positivo Positivo Sospechoso LR AMVA-Medellín
C6
Positivo Positivo
Sospechoso LR CRFSOC-Caldas
C7
Positivo Positivo Positivo Sospechoso MF CRFSOC-Caldas
C8
Positivo Positivo
Sospechoso MF SDA-Bogotá
C9
Positivo Positivo
Positivo MF Norcasia-Caldas
C10
Positivo Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-
Antioquia
C11
Positivo Positivo
Positivo LR Puerto Berrío-
Antioquia
C12
Positivo Positivo Positivo Positivo MF Puerto Berrío-
Antioquia
C13
Positivo Positivo Positivo Positivo LR Puerto Berrío-
Antioquia
C14
Positivo Positivo Positivo Positivo MF Puerto Rico-Bolivar
C15
Positivo Positivo
Positivo MF Puerto Berrío-
Antioquia
C16
Positivo Positivo
Positivo MF Puerto Rico-Bolivar
C17
Positivo Positivo Positivo Negativo MF CRFSOC-Caldas
C18**
Positivo Positivo Positivo Negativo LR
Puerto Berrío-Antioquia
C19
Negativo Negativo Negativo Negativo MF Puerto Rico-Bolivar
C20
Positivo Negativo Positivo Negativo MF Puerto Rico-Bolivar
C21
Positivo Positivo Positivo Negativo LR AMVA-Medellín
C22
Positivo Positivo Positivo Negativo MF CRFSOC-Caldas
C23
Positivo Positivo Positivo Negativo LR URRAS-Bogotá
C24
Positivo Positivo Positivo Negativo LR AMVA-Medellín
C25
Positivo Positivo Positivo Negativo LR URRAS-Bogotá
*Diagnóstico previo: Positivo (coprológico, necropsia y/o histopatología), sospechoso (nódulos a la palpación
abdominal) y negativo si no había indicio de tener Prosthenorchis.
**La muestra C18 fue positiva a Strongyloides sp.
100 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figuras Capítulo 3
Figura 3.1. Diseño de primers ProsCOI_L1, ProsCOI_H1 y ProsCOI_H2
ProsCOI_L1 ----GTTTTGGTTATTACCAGTGTCCA-----------------------
ProsCOI_H1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------
Prosthenorchis_elegans_004E7_1 TTAGGTTTTGGTTATTACCAGTGTCCATGGTGTTTCTAATAGTCTCTATG
Prosthenorchis_elegans_004WO_1 TTAGGTTTTGGTTATTACCAGTGTCCATGGTGTTTATAATAGTCTCTATG
Oncicola TTAGGTTTTGACTACTTCCAGTTTCTATGACGTTTATAATAATGTCCCTG
Macracanthorhynchus_ingens TTAGGTTTTGATTACTTCCTATCTCATTGGTCTTTTTGATGCTATCTATG
Macracanthorhynchus_hirudinace TTAGATTTTGGTTACTTCCTACTTCGTTGATGTTTTTGATGGTGTCTATG
Mediorhynchus_gallinarum TTAGATTCTGGTTATTGCCTTGTTCATTGGTATTGATGATAATATCTATG
Mediorhynchus_sp. TTAGATTTTGATTGTTACCTGTGGCTTTAGGGTTATTATTAATATCAATA
Moniliformis TTAGGTTTTGGCTCCTTCCAGCATCATTGGCGGTTTTTTTAGCATCTTTG
Mediorhynchus TTAGTTTTTGATTACTTCCTATTTCTTTGGTTATTATAGTTATATCTATG
Oligacanthorhynchus TTAGATTCTGACTACTTCCCGTATCATTGGTGATGTTCACTCTGTCTGTA
ProsCOI_L1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------
Prosthenorchis_elegans_004E7_1 CTAACAGGTGGGTCTGGTTCTGGGTGGACTATTTATCCTCCTTTGAGTAG
Prosthenorchis_elegans_004WO_1 CTAATAGGTGGGTCTGGTTCTGGGTGGACTATTTATCCTCCTTTGAGTAG
Oncicola ATGATAGGGGGTTCTGGTTCAGGGTGGACTATTTACCCTCCTTTAAGTAG
Macracanthorhynchus_ingens CTTACAGGGGGTGCAGGAACAGGGTGAACTATTTACCCTCCTTTGAGCAC
Macracanthorhynchus_hirudinace TTTGTTGGCGGAGCTGGGACCGGGTGAACTATCTATCCTCCACTGAGTAG
Mediorhynchus_gallinarum ATTTCAGGTGGTGCTGGTGCTGGGTGGACAATGTATCCTCCATTAAGTGG
Mediorhynchus_sp. GTATCAGGTGGAGCTGGTGCTGGATGAACTATGTATCCTCCGTTAAGGTC
Moniliformis CTTATTGACGGGGCTGCTACAGGATGGACTTTGTATCCTCCCCTAAGGTC
Mediorhynchus CTATCTGGGGGAGCTAGAGCAGGTTGGACAATATATCCTCCTTTGAGGTC
Oligacanthorhynchus CTTGTAGATGGGGCAGGTGCAGGGTGAACTTTTTATCCTCCCTTGAGGGG
ProsCOI_L1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------
Prosthenorchis_elegans_004E7_1 GTGGGCCTATAGAAGTGGGCTGTCTGTGGATTTAATAGTTTTGGCTTTAC
Prosthenorchis_elegans_004WO_1 GTGGGCCTATAGAAGTGGGCTGTCTGTGGATTTAATAGTTTTGGCTTTAC
Oncicola GTGGGTTTATAGAAGTGGAGCATCTGTGGATTTGATGGTTTTAGCCTTAC
Macracanthorhynchus_ingens TAGGATTTACAGGAGAGGGGTGTCTGTAGACTTAATAGTGCTGTCATTAC
Macracanthorhynchus_hirudinace GGGGGAGTTCAGTGGGGGAGTTTCAGTTGATTTTATAGTTTTATCTTTAC
Mediorhynchus_gallinarum CTATGGGTACAGATCTGGAATTTCTATAGATTTGATGGTTTTAGCCCTTC
Mediorhynchus_sp. TTATGGGTTTAGATCTGGGGTTAGTATAGATTTATTGGTCTTATCTTTGC
Moniliformis CTATGGGTTTAGCAGGGGGATTTCTGTTGATCTAATGATCTTGTCCCTCC
Mediorhynchus TTATGGATTTAGATCTGGTGTGTCTATAGATTTAATAATTTTATCTCTTC
Oligacanthorhynchus GGCATCTTTTAGAAGGGGGATTTCAATAGATTTAGCTATTTTATCCCTTC
ProsCOI_L1 --------------------------------------------------
ProsCOI_H1 ----------GGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCG------------------
ProsCOI_H2.1 --------------------------------------------------
Prosthenorchis_elegans_004E7_1 ATGTGGCGGGGGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCGGTGAATTTGGTGTCTACT
Prosthenorchis_elegans_004WO_1 ATGTGGCGGGGGTTTCTTCTGTGTTAGCTTCGGTGAATTTGGTGTCTACT
Oncicola ATGTGGCGGGTATTTCATCTGTATTAGCTTCTGTGAATCTGATGGCCACT
Macracanthorhynchus_ingens ATGTGGCGGGTTTATCTTCTATTCTTGCCTCTGTTAACATAATTTCTACA
Macracanthorhynchus_hirudinace ATGTAGCTGGGCTTTCTTCTATTTTAGCTTCTGTTAATATGATCTCCACT
Mediorhynchus_gallinarum ATGTAGCAGGTATTTCATCAGTTTTGGCTTCTGTGAATATGATTTCAACT
Mediorhynchus_sp. ATGTGGCAGGTATTTCTTCTGTTCTTGCTTCGGTAAATATAGTATCAACT
Moniliformis ATGTAGCCGGATTGTCATCTATTTTAGCTTCTATTAATATAATATCTACA
Mediorhynchus ATGTAGCTGGGGTGTCTTCTATTTTAGCTTCTGTAAATGTAATCTCTACT
Oligacanthorhynchus ATCTTGCAGGTATTTCTTCTATTTTGGCATCTGTAAACATAATTACCACT
ProsCOI_L1 ---------------------------------------
ProsCOI_H1 ---------------------------------------
ProsCOI_H2.1 --------------------TATGGGGGTGAGATTTGA-
Prosthenorchis_elegans_004E7_1 GTGTGAGGAGCGTGTAAGGATATGGGGGTGAGATTTGAG
Prosthenorchis_elegans_004WO_1 GTGTGAGGGGCGTGTAAGGATATGGGGGTGAGATTTGAG
Oncicola GTATGGGGTGCATGTAGTGATAGTGGGGTAAGTTTTGAG
Macracanthorhynchus_ingens GTTTGGGGAACATATAAAGTTAGAGGTGTGAGTTTTGAA
Macracanthorhynchus_hirudinace GTTTGAGGATGTTGTAAAGCAAATAATATCGGTTTTGAA
Mediorhynchus_gallinarum ATTTGTGGGGTGTACTTTCAAGTAGGGTTGAGCTTTGAG
Mediorhynchus_sp. ATTTGTGGGTCTTATAGTGAGTTCGGTTTACGCTTTGAA
Moniliformis GTATGGGGGGTATATAAAGAGATGGGGGTGAGTGTTGAG
Mediorhynchus ATTTGAGGGGTATTTGCTGAGGCAGGGCTGCGTTTTGAA
Oligacanthorhynchus GTATGGGGGAGGACAGCTGGAATGGGGGTGAGATTAGAG
Capítulo 3 101
Figura 3.2. Muestras de heces de S. leucopus utilizadas para el estudio, distribuidas por
localidad y departamento, de acuerdo a su procedencia.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Medellín Puerto Berrío Puerto Rico Norcasia Victoria Bogotá
Antioquia Bolivar Caldas Cundinamarca
Cautiverio
Vida Silvestre
102 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figura 3.3. Extracción de ADN de materia fecal de S. leucopus en las muestras C2 y C3,
mediante el método de sílice/guanidina tiocianato.
Capítulo 3 103
Figura 3.4 PCR semi-anidada probando el producto puro y diluciones 1:100 y 1:1000 del
producto amplificado para el fragmento grande. Se observa doble banda o manchas para
las muestras puras y para algunas de las diluciones 1:100. Concentración del primer 0,1
µM.
104 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Figura 3.5 Amplificación semi-anidada de materia fecal con el conjunto de primers
nuevos, diluciones 1:000 del producto de amplificación del fragmento de 234 pb y 0,1 µM
de Primer.
B
Conclusiones y Recomendaciones 105
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
Al inicio de este trabajo se desconocía la especie de Prosthenorchis en la que se iba a
trabajar, sin embargo, luego de una extensa búsqueda de literatura antigua, se pudo
encontrar una característica morfológica para distinguir entre las dos especies de
Prosthenorchis reportadas para primates: P. elegans y P. spirula, comprobando que
todos los parásitos obtenidos correspondían a P. elegans y que el collar presente entre la
probóscide y el cuerpo del parásito es la forma más fácil de diferenciar morfológicamente
esta especie. Las extracciones de ADN de los parásitos se lograron estandarizar
utilizando el método de sílice tiocianato/guanidina y el método de fenol cloroformo. Sin
embargo, el método de sílice permitió extraer ADN de los parásitos que habían sido
conservados en formol. La problemática para poder llegar a un proceso final de
secuenciación de todas las extracciones realizadas posiblemente fue la forma de
conservación previa a la llegada al laboratorio, puesto que los parásitos fueron
colectados oportunísticamente por las entidades colaboradoras.
Se logró aislar y caracterizar una secuencia parcial de 633 pb de COI en base a 37
secuencias analizadas. Se identificaron 11 sitios variables resultando en seis haplotipos
distintos agrupados en dos haplogrupos diferentes. Los haplotipos y haplogrupos no
estuvieron relacionados con el hospedero definitivo ni con la localización geográfica de
su colecta, sin embargo se logró encontrar una gran diversidad de haplotipos en
Saguinus leucopus y Cebus albifrons en cautiverio. Por el contrario, aunque solamente
se evaluaron dos muestras, en vida silvestre se encontraron dos haplotipos y uno de
106 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
ellos estaba ausente en las poblaciones en cautiverio. Estos resultados, además de que
dejan visualizar las consecuencias del tráfico de fauna, también sugieren que se debe
tener cuidado con las liberaciones de individuos y la diversidad genética del parásito.
Se identificaron polimorfismos específicos para Prosthenorchis elegans que permiten
diferenciarlo de las otras especies de acantocéfalos reportadas en Gen Bank. Gracias a
estos polimorfismos fue posible diseñar primers específicos para el desarrollo de la
prueba. De esta forma, se diseñaron unos primers específicos para el parásito, que
permitieron amplificar el ADN de P. elegans en heces, los cuales fueron modificados en
dos bases para hacer más específica la reacción.
La estandarización de la prueba comenzó desde la extracción de ADN en heces, para
lograr la amplificación del fragmento seleccionado, utilizando un protocolo basado en
sílice guanidina/tiocianato. La prueba consistió en una PCR semi-anidada, en donde la
mezcla maestra tenía una concentración de primers de 0,1 µM y en una primera reacción
se obtuvo un fragmento de 234 pb con una temperatura de anidación de 53°C. Los
productos de esa reacción fueron diluidos 1:1000 y se sometieron a una nueva reacción
con los primers para obtener un fragmento de 178 pb, utilizando la misma concentración
de primers y una temperatura de anidación de 56°C. Se lograron obtener resultados
repetibles en todas las pruebas analizadas, encontrando ausencia del parásito, en solo
una de las 25 muestras analizadas. La prueba fue sensible para detectar ADN en
lavados rectales y muestras tomadas hace más de dos años, superando los resultados
obtenidos por medio de coprológicos.
El campo investigativo que se abre con los resultados aquí reportados, se considera de
gran magnitud para dilucidar muchos de los vacíos en torno a la especie y muchos
interrogantes acá generados. Con la secuencia del parásito y el diseño de los primers
específicos, se podrán realizar pruebas en materia fecal de otras especies de primates,
en posibles hospederos intermediarios en vida libre y en cautiverio, en diferentes
estadios del parásito, con el fin de contribuir a la ecología y epidemiología del parásito
para describir el ciclo de vida de Prosthenorchis elegans, sus hospederos intermediarios
en vida libre y su forma de transmisión. Igualmente, el campo de la medicina se ve
Conclusiones y Recomendaciones 107
beneficiado, presentando una alternativa diagnóstica altamente sensible, clave para
efectuar medidas preventivas y terapéuticas oportunas. Teniendo en cuenta la alta
prevalencia que se presenta en individuos de Saguinus leucopus y otras especies
amenazadas, las implicaciones que tiene para la conservación son de gran beneficio
para las especies afectadas.
4.2 Recomendaciones
Se recomienda obtener más secuencias de parásitos de P. elegans, así como de P.
spirula para profundizar en el estudio de la diversidad genética del parásito. Las
muestras deberían obtenerse tanto de vida libre como en cautiverio, tratando de abarcar
un amplio número de hospederos definitivos y localidades geográficas representativas de
su distribución. Sería muy importante realizar estudios comportamentales en vida libre,
detectando los hospederos intermediarios consumidos y realizando pruebas para
corroborar los artrópodos que están actuando en el ciclo de vida. Igualmente, podrían
aislarse secuencias basadas en otro gen para hacer estudios comparativos con los datos
encontrados.
Es aconsejable explorar otras técnicas de PCR, como la PCR en tiempo real, o incluso la
PCR anidada pero logrando realizar las dos reacciones de amplificación en un mismo
tubo, para no manipular productos de amplificación que puedan estar contaminando las
muestras generando falsos positivos. Se recomienda incorporar un control interno a la
prueba de tal forma, que se verifique la eficacia de la reacción de PCR. Igualmente es
importante realizar pruebas de sensibilidad para establecer el punto de corte en el que la
prueba detecta el ADN. Una vez sea superado el problema de contaminación, se pueden
realizar gran cantidad de estudios de prevalencia del parásito en vida libre y en
cautiverio. Así mismo, correlacionar la diversidad genética con el desarrollo de la prueba,
podría dar luces para estudios de patogenicidad y estudios evolutivos basados en los
parásitos analizados.
108 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Es importante incorporar estos resultados a los protocolos de liberación de especies
amenazadas, de tal forma que no se intervenga en la diversidad natural de las especies,
lo que puede traer consecuencias para la supervivencia de las especies a largo plazo, al
alterar el equilibrio y la diversidad genética que hay en el parásito, hospederos
intermediarios y hospederos definitivos.
Anexos 109
A. Anexo: Guía para autores capítulo 1 y 3
NSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES
Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia
ISSN 0120-2952
La Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia publica reportes de caso y
artículos científicos, de revisión y de opinión de todas las áreas de la medicina veterinaria y la
zootecnia.
Para el envío de artículos a consideración del comité editorial de la revista es indispensable
cumplir con los siguientes requisitos:
1. Los artículos deben ser inéditos y no deben haber sido publicados o sometidos a consideración
en otras revistas o publicaciones técnico-científicas (excepto cuando hayan sido publicados como
tesis de grado o como resumen en un congreso). Enviar simultáneamente un mismo artículo a
consideración de dos o más revistas es una falta grave a la ética académica.
2. Los autores transfieren los derechos de publicación a la revista, tanto en su versión impresa
como en línea, incluyendo esta última las diferentes bases de datos en las que se encuentre
indexada la revista.
3. La publicación del artículo debe haber sido aprobada por todos los coautores (si los hubiese) y
por las autoridades responsables de la institución donde se llevó a cabo la investigación.
4. El documento debe cumplir a cabalidad con las instrucciones para autores establecidas por el
comité editorial descritas en el presente documento. Los artículos que no se ajusten a estas
pautas serán devueltos los autores sin haber sido considerados para evaluación.
Los artículos que sean aceptados para evaluación serán enviados a un mínimo de dos pares
académicos reconocidos para su evaluación. En caso de una decisión dividida por parte de los
evaluadores, será el editor o el comité editorial en pleno quien determine la inclusión o el rechazo
del documento. Si los artículos son aceptados para publicación, los autores deberán corregirlos de
acuerdo con las observaciones de los pares y el comité editorial dentro del tiempo otorgado para
ello. Las observaciones que no sean aceptadas por los autores deberán contar con un sustento
apropiado que será evaluado por el editor correspondiente. El editor y el comité editorial se
reservan el derecho de rechazar o aceptar los materiales enviados para su publicación.
TIPOS DE CONTRIBUCIÓN
110 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
La revista acepta los siguientes tipos de contribuciones originales:
• Artículo científico: artículo científico original que presenta los resultados de investigaciones que
se rigen bajo el método científico. Típicamente consta de cuatro partes esenciales: introducción,
metodología (materiales y métodos), resultados y discusión (presentados en secciones
individuales o en una sola) y conclusiones.
• Reporte de caso: reporte de un caso clínico de relevancia, ya sea por ser el primero en su
contexto específico o por sus características particulares que lo hacen de interés para la
comunidad científica y por ende publicable.
• Artículo de revisión: revisión crítica de un tema específico desde una perspectiva analítica,
interpretativa y crítica del autor, que recurre siempre a fuentes originales. Se recomienda solo
para autores con experiencia investigativa demostrada en el tema. Idealmente una revisión debe
presentar un resumen crítico de las investigaciones hasta ahora realizadas y proponer nuevos
temas por investigar.
• Ensayo científico: reflexiones críticas de un autor que presenta su visión y juicio sobre un tema
científico.
REMISIÓN DE MANUSCRITOS
Las contribuciones pueden ser enviadas en español, inglés o portugués, al correo
electrónicorev_fmvzbog@unal.edu.co una vez el manuscrito cumpla con las normas de
presentación aquí descritas; en respuesta, los autores recibirán el Formato de Información
Personal, que deberá ser diligenciado para cada uno de los autores y enviado al mismo correo
electrónico, y el Formato de Autorización de Publicación, que deberá ser firmado por todos los
autores y devuelto en físico a la oficina de la revista: Unidad de Extensión, Facultad de Medicina
Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D. C. Cra. 30 con Cll 45.
FORMATO
El texto del artículo debe enviarse en MS-Word®, sin incluir tablas o figuras, las cuales deben
presentarse en archivos separados. Se recomienda que el texto no tenga más de 30.000
caracteres sin espacios o 20 páginas en tamaño carta numeradas consecutivamente en el lado
inferior derecho, con márgenes de 2,5 cm por cada lado, con fuente Times New Roman, tamaño
de 12 puntos a doble espacio, , y cada línea del documento deberá estar enumerada
consecutivamente (en MS-Word®: Diseño de página/Números de línea/Continua).
Las tablas y las figuras (fotografías, gráficos, dibujos, esquemas, diagramas de flujo, diagramas
de frecuencia, etc.) deberán enumerarse consecutivamente en números arábigos, y además de
enviarse insertadas en un archivo MS-Word® deberán incluirse los archivos originales (por
ejemplo jpg o MS-Excel®), de acuerdo con el programa con el que hayan sido elaboradas. Todas
las tablas y figuras deben haber sido citadas en el texto.
Título y autores
El título del artículo se debe presentar en español (o portugués) e inglés, en negrilla y centrado. Si
incluye nombres científicos se deberá usar la nomenclatura indicada anteriormente (sistema
binomial). Bajo el título se escriben los nombres y apellidos de los autores de la siguiente manera:
iniciales de los nombres (con punto), seguidos del primer apellido completo, sin títulos académicos
ni cargos laborales y separando cada autor con una coma. El autor para correspondencia debe
identificarse con un asterisco. Como pie de página debe indicarse la filiación institucional de cada
autor incluyendo la dirección, ciudad y país, y la dirección de correo electrónico del autor para
correspondencia.
Resumen y palabras clave
Los artículos deben incluir un resumen en español (o portugués) y uno en inglés, de no más de
250 palabras. El resumen debe registrar brevemente todas las partes del documento: los
Anexos 111
propósitos del estudio o investigación, materiales y métodos (selección de los sujetos del estudio
o animales de laboratorio; métodos de observación y de análisis), resultados y discusión
(consignando información específica o datos y su significancia estadística siempre que sea
posible), y las conclusiones principales. Deberán destacarse las observaciones y aspectos más
novedosos y relevantes del estudio.
Las palabras clave (máximo cuatro) son términos para indexación del artículo en las bases de
datos y los buscadores de Internet. Estas deben identificar el contenido del artículo y se deben
colocar después del resumen en su correspondiente idioma. Para seleccionar las palabras clave
del documento, se sugiere consultar y usar los descriptores del tesauro agrícola multilingüe
Agrovoc, creado por la FAO, el cual abarca terminología de la agricultura, silvicultura, pesca,
medioambiente y temas afines (http://aims.fao.org/website/Search/sub) o los Descriptores en
Ciencias de la Salud
(http://decs.bvs.br/E/homepagee.htm y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=mesh).
Estas herramientas permiten seleccionar las palabras clave adecuadas para que el artículo sea
difundido de forma más efectiva en Internet.
Introducción
Debe presentar una breve revisión de los trabajos previos relacionados con el tema por investigar
y finalizar con la justificación y los objetivos de la investigación. La introducción no incluirá datos o
conclusiones del trabajo que se está publicando.
Materiales y métodos
En esta sección se deben describir de forma clara, concisa y secuencial, los materiales (animales,
implementos de laboratorio) utilizados en desarrollo del trabajo, además de los procedimientos o
protocolos seguidos y el diseño experimental escogido para el tratamiento estadístico de los
datos. La información aquí consignada debe permitir a otros investigadores reproducir el
experimento en detalle. Este apartado puede tener subtítulos y no debe incluir ningún resultado ni
discusión de los hallazgos.
Resultados
En esta sección se deben describir los resultados en orden lógico y de manera objetiva y
secuencial, apoyándose en las tablas y figuras. Este apartado puede también incluir subtítulos y
no debe discutir los datos presentados.
Discusión
La discusión debe ser una síntesis de la confrontación de los datos obtenidos en el estudio con
respecto a la literatura científica relevante que además interprete las similitudes o los contrastes
encontrados. Se enfocará hacia la interpretación de los hallazgos experimentales y no repetirá los
datos presentados en la introducción ni la información suministrada en los resultados. Las
secciones correspondientes a resultados y discusión pueden combinarse en una sola.
Conclusiones
En esta sección se relacionan los hallazgos más relevantes de la investigación, es decir, aquellos
que constituyan un aporte significativo para el avance del campo temático explorado, además de
considerar un direccionamiento sobre futuras investigaciones.
Agradecimientos
Si se considera necesario, se agradecen contribuciones importantes en cuanto a la concepción,
financiación o realización de la investigación: financiadores, especialistas, firmas comerciales,
entidades oficiales o privadas, asociaciones de profesionales y operarios de campo y laboratorio.
Tablas
- Se deben evitar las tablas demasiado grandes. Si se tienen muchos datos en una tabla,
se recomienda dividirla en dos o más.
- Cada tabla debe tener un título corto y explicativo en la parte superior, sin abreviaturas.
112 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
- No deben emplearse líneas verticales para separar las columnas y, por tanto, debe
existir suficiente espacio entre ellas.
- Cualquier explicación esencial para entender la tabla debe presentarse como una nota
en la parte inferior de esta.
- Los encabezados de columna deben ser breves pero suficientemente explicativos.
- Cada tabla debe haber sido referenciada en el texto.
Figuras
- Las gráficas deben ser a una sola tinta con porcentajes de negro para las variaciones de
las columnas, las líneas de las curvas deben ser de color negro, punteadas o continuas
usando las siguientes convenciones: ▲, ■, ●, ♦, ◊, ○, □, ∆.
- En caso de fotografías o mapas (originales o escaneados) estos deben enviarse en
archivos independientes, en formato tiff o jpg con un mínimo de 600 dpi de resolución y
adicionalmente dentro de un archivo MS-Word® en el que se incluya su título (corto y
explicativo) en la parte inferior.
- Al igual que las tablas, deben enumerarse con números arábigos en forma consecutiva,
y debe hacerse referencia en el texto a cada una de las figuras presentadas.
Nomenclatura
- Las unidades deben expresarse de acuerdo con el Sistema Métrico Decimal (SI).
- Los autores aceptarán la normatividad colombiana, así como la trazada por
el International Code of Botanical Nomenclature, el International Code of Nomenclature of
Bacteria, y el International Code of Zoological Nomenclature.
- Toda la biota (cultivos, plantas, insectos, aves, mamíferos, peces, etc.) debe estar
identificada en nomenclatura binomial (nombre científico), a excepción de los animales
domésticos comunes.
- Todos los medicamentos, biocidas y demás sustancias de uso comercial deben
presentar el nombre de su principio activo principal o nombre genérico.
- Para la nomenclatura química se usarán las convenciones determinadas por
la International Union of Pure and Applied Chemistry así como por la Comission on
Biochemical Nomenclature.
Referencias
La citación de referencias bibliográficas que sustentan frases dentro del texto se debe ceñir a las
normas de estilo del Council of Science Editors (CSE) algunas de las cuales se muestran a
continuación: dentro del texto se hará uso del sistema “autor(es) año” si se trata de uno o dos
autores: (Jiménez 2009), (Pineda y Rodríguez 2010); si la publicación citada tiene tres o más
autores, se cita el apellido del primer autor acompañado de la expresión latina et ál. sin cursivas:
(Bernard et ál. 2003). Si se citan varias referencias seguidas, deberán organizarse en orden
alfabético, separadas por punto y coma (;): (Hänsel y Gretel 1990; Hergé et ál. 1983). Si el autor o
autores se citan directamente en el texto se utiliza la misma notación pero con el año entre
paréntesis: Wagner (1982) encontró que el agua es vida, mientras que Vivaldi y Pergolessi (1988)
Anexos 113
afirman lo contrario; los investigadores Magendie et ál. (1845) descubrieron que los perros tienen
cuatro patas. Las referencias bibliográficas completas van al final del artículo en orden alfabético
de autores; si en la lista de referencias se citan varias publicaciones del mismo autor o autores se
listan en orden cronológico desde la más antigua hasta la más reciente.
Las contribuciones que no cumplan con las normas de estilo bibliográfico serán devueltas sin ser
consideradas para evaluación.
Para obtener más ejemplos sobre el sistema de citación del Council of Science Editors (CSE)
recomendamos remitirse a los siguientes enlaces:
http://www.scientificstyleandformat.org/Tools/SSF-Citation-Quick-Guide.html
Libros
Gilman AG, Rall TW, Nies AS, Taylor P. 1990. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 8th ed.
New York: Pergamon Press. 1811 p.
Capítulos de libro
Diaz GJ. 2001. Naturally occurring toxins relevant to poultry nutrition. In: Leeson S, Summers JD
editores. Scott’s Nutrition of the Chicken. 4th ed. Guelph: University Books. p. 544-591.
E-Book
Rollin, BE. 1998. The unheeded cry: animal consciousness, animal pain, and science [Internet].
Ames(IA): Iowa State University Press. [Citado 2008 agosto 9]. Disponible en:
http://www.netlibrary.com.
Artículo de revista
Hepworth PJ, Nefedov AV, Muchnik IB, Morgan KL. 2010. Early warning for hock burn in broiler
flocks. Avian Pathol. 39:405-409.
Nota: se deben anotar las iniciales de todos nombres que tengan los autores. Los nombres de las
revistas se deben registrar en su forma abreviada; para consultar el nombre abreviado de las
revistas sugerimos consultar el ISI Journal Title Abbreviations.
Artículo de revista publicada en Internet
Leng F, Amado L, McMacken R. 2004. Coupling DNA supercoiling to transcription in defined
protein systems. J Biol Chem [Internet]. [citado 2007 July 24]; 279(46):47564-47571. Disponible
en: http://www.jbc.org/cgi/reprint/279/46/47564
Otras fuentes de información
Memorias de eventos
Cheeke PR. 2010. Agricultural and pharmaceutical applications of Chilean soapbark tree (Quillaja
saponaria) saponins. In: 8th International Symposium on Poisonous Plants; 2009 mayo 4-8, João
Pessoa, Paraíba, Brazil, p. 38.
114 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Tesis
Murcia HW. 2010. Identificación funcional de citocromos involucrados en la biotransformación in
vitro de aflatoxina B1 por medio de sustratos modelo e inhibidores específicos en cuatro especies
de aves. [Tesis de maestría]. [Bogotá, Colombia] Universidad Nacional de Colombia.
NORMAS DE ESTILO
• Se debe redactar en voz activa (se evaluaron dos metodologías, y no: dos metodologías fueron
evaluadas) y en forma impersonal, es decir, tercera persona del singular (se encontró, y no:
encontré o encontramos).
• En cuanto a los tiempos verbales, el uso común es el pasado para la introducción,
procedimientos y resultados, y el presente para la discusión.
• En general, se recomienda evitar el uso del gerundio. Recurra a esta forma verbal sólo para
indicar dos acciones simultáneas; en los demás casos, redacte diferente la frase (reemplazar: un
protocolo fue establecido, minimizando el efecto negativo..., por: se estableció un protocolo con el
cual se minimizó el efecto negativo...).
• Las letras cursivas o itálicas se usan para los nombres científicos (sistema binomial) y palabras o
expresiones en idioma extranjero.
• El significado de las siglas y abreviaturas debe explicarse cuando se mencionan por primera vez
en el texto. Posteriormente, se debe usar solamente la sigla o abreviatura.
• Las siglas no tienen forma plural; este se indica en las palabras que la acompañan: las ONG,
dos ELISA.
• Las abreviaturas del SI no deben ir con punto, en plural o en mayúscula: 1 kg, 25 g, 10 cm, 30 m,
etc. Las abreviaturas más usadas en esta revista son las siguientes:
km kilómetro
m metro
cm centímetro
mm milímetro
µm micrómetro
nm nanómetro
kg kilograno
g gramo
mg miligramo
µg microgramo
ng nanogramo
l litro
ml mililitro
µl microlitro
m mol
M molar
mM milimolar
µM micromolar
N normal
ppm partes por millón (1 x 10-6)
Anexos 115
ppb partes por billón (1 x 10-9)
cpm cuentas por minuto
dpm desintegraciones por minuto
s segundos
min minutos
h hora
sc subcutáneo
im intramuscular
ip intraperitoneal
iv intravenoso
po oral
• Entre el valor numérico y el símbolo debe ir un espacio: 35 g (no 35g), p > 12 (no p>12); excepto
para los signos: °C, %, +, - (estos dos últimos cuando indican positivo y negativo). Ejemplos: 99%,
+45, -37.
• En una serie de medidas, el símbolo va al final: hileras a 3, 6 y 9 m, o 14, 16 y 18%).
• La barra oblicua (/) es un signo lingüístico que en alguno de sus usos significa “por”: tres
perros/perrera, 4 tabletas/día, 2 l/matera, 10 frutos/rama. Uno de sus usos no lingüísticos es
expresar los cocientes de magnitudes y unidades de medida: 80 km/h, 10 ml/min, 10°C/h.
• Uno de los usos no lingüísticos del punto (·) es indicar la multiplicación de dos cantidades, caso
en que se coloca separado de éstas y a media altura: 6 · 3 = 18; 2 · (x + y) = 30.
• El punto (.) se usa para separar los miles y la coma (,) se usa para separar decimales.
• Las unidades que se basan en nombres se usan en minúsculas: un siemens (con algunas
excepciones como cuando el símbolo se deriva de un nombre propio: °C, grados Celsius).
1.7.1 Lista preliminar para la preparación de envíos
Como parte del proceso de envíos, los autores están obligados a comprobar que su envío cumpla
todos los elementos que se muestran a continuación. Se devolverán a los autores aquellos envíos
que no cumplan estas directrices.
1. El envío no ha sido publicado previamente ni se ha enviado previamente a otra revista (o se ha
proporcionado una explicación en Comentarios al / a la editor).
2. El archivo enviado está en formato Microsoft Word.
3. Se han añadido direcciones web para las referencias donde ha sido posible.
4. El texto tiene interlineado doble; el tamaño de fuente es 12 puntos; se usa cursiva en vez de
subrayado (exceptuando las direcciones URL); y todas las ilustraciones, figuras y tablas están en
archivos independientes, segun el programa en que fueron creados.
5. El texto cumple con los requisitos bibliográficos y de estilo indicados en las Normas para autores,
que se pueden encontrar en la sección "Acerca de la revista".
6. Si esta enviando a una sección de la revista que se revisa por pares, tiene que asegurase que las
instrucciones enAsegurando de una revisión a ciegas) han sido seguidas.
116 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
1.7.2 Aviso de derechos de autor
FORMATO AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN Por la cual los autores confieren a la dirección
editorial de la Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia (ISSN 0120-2952)
autorización para publicación de manuscritos inéditos y originales sometidos para su publicación,
de acuerdo a los siguientes criterios: a) Somos los autores intelectuales del manuscrito, que éste
es inédito, es decir, que no ha sido remitido, aceptado o publicado en otras revistas o
publicaciones técnico-científicas impresas ni electrónicas y aceptamos que sea publicado en la
Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia en caso de ser aprobado. b) El
contenido total o parcial del manuscrito remitido no será sometido para su publicación en otra(s)
revista(s) durante la duración de los procesos de evaluación por pares y edición de la Revista de
la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. c) Todos los autores han leído la versión
definitiva del artículo presentado y se hacen responsables por todos los conceptos e información
de texto e imágenes allí contenidos ante la Universidad Nacional de Colombia y ante terceros. La
dirección editorial de la Revista no se hace responsable por la veracidad y autenticidad de dicha
información, ni será responsable de dirimir conflictos relacionados con la autoría del manuscrito.
d) El artículo sometido a consideración del Comité Editorial de la Revista de la Facultad de
Medicina Veterinaria y de Zootecnia cumple las normas establecidas en la política de publicación
y las instrucciones a los autores. En caso contrario el manuscrito será rechazado hasta no haber
acogido la totalidad de la normativa de presentación de manuscritos. e) Los autores se dan por
informados que el proceso de arbitraje y edición del artículo puede tomar varios meses y que su
recepción no implica ni la aprobación ni la publicación del mismo. f) Una vez terminado el proceso
de evaluación los autores se comprometen a atender y consolidar, estrictamente en los plazos de
tiempo establecidos por el editor, todas las observaciones, correcciones o sugerencias hechas por
los pares evaluadores del artículo y por el editor. Durante el proceso de corrección de estilo y
edición, se verificará la consolidación de las observaciones de los evaluadores, razón por la cual,
en caso de encontrar que no han sido integradas al documento, éste no será publicado hasta que
sus autores no las consoliden; sin embargo, en caso de que alguna(s) de las correcciones
formuladas por los pares evaluadores no puedan ser adicionadas a la versión definitiva del
artículo, los autores podrán sustentar sus razones al editor de la revista en el oficio de remisión
del artículo definitivo. g) La totalidad de los autores aprueba la publicación del documento
completo en sus versiones impresa y digital, lo que incluye las diferentes bases de datos en los
que la Revista es y será incluida para promover su visibilidad. h) Los autores conocen que la
autorización incluye la posibilidad para la Revista de comercializar la publicación a través de los
canales tradicionales y de Internet, o cualquier otro medio conocido, y aceptan que la autorización
de publicación se hace a título gratuito, por lo tanto renuncian a recibir remuneración alguna por la
publicación, distribución, comunicación pública y cualquier otro uso que se haga en los términos
en que la obra es publicada. i) La Revista se compromete a indicar siempre la autoría de sus
contenidos incluyendo el nombre de los autores y la fecha de publicación. De igual forma, los
autores se comprometen a citar los trabajos publicados en esta publicación de acuerdo con los
estándares internacionales de citación, incluyendo el nombre completo o abreviado de la Revista
(Rev. Med. Vet. Zoot. )
1.7.3 Declaración de privacidad
Los nombres y direcciones de correo-e introducidos en esta revista se usarán exclusivamente
para los fines declarados por esta revista como los procesos de indexación ante Publindex de
Anexos 117
Cociencias y no estarán disponibles para ningún otro propósito u otra persona. Toda la
información estará a cargo del Coordinador Editorial.
118 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
B. Anexo. Guía para autores Capítulo 2
INTERNATIONAL JOURNAL FOR PARASITOLOGY: PARASITES AND WILDLIFE Sponsored by the Australian Society for Parasitology
AUTHOR INFORMATION PACK
GUIDE FOR AUTHORS .
INTRODUCTION The International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife (IJP:PAW) publishes the
results of original research on parasites of all wildlife, invertebrate and vertebrate.
This includes free-ranging, wild populations, as well as captive wildlife, semi-
domesticated species (e.g. reindeer) and farmed populations of recently domesticated
or wild-captured species (e.g. cultured fishes). Articles on all aspects of wildlife
parasitology are welcomed including taxonomy, biodiversity and distribution,
ecology and epidemiology, population biology and host-parasite relationships. The
impact of parasites on the health and conservation of wildlife is seen as an important
area covered by the Journal especially the potential role of environmental factors, for
example climate. Also important to the journal is 'one health' and the nature of
interactions between wildlife, people and domestic animals, including disease
emergence and zoonoses.
Types of articles The principal form of publication is the full-length article which contains substantial,
original research. The journal accepts brief reports that have similar subject scope as
the full-length article, but do not merit a full-length publication. In addition, the
journal commissions articles with emphasis on shorter, focused reviews of topical and
emerging issues as well as strategically important subjects. The journal encourages
critical comment and debate on matters of current controversy in the area of parasites
and wildlife via "Current Opinions".
Contact details for submission General enquiries prior to submission should be directed to the Editorial Office:
IJPPAW@elsevier.com
Submission Submission to this journal proceeds totally online at http://ees.elsevier.com/ijppaw
and you will be guided stepwise through the creation and uploading of your files. The
system automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is
used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files
Anexos 119
are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are
needed for further processing after acceptance. All correspondence, including
notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail
removing the need for a paper trail. The final pdf should be no larger than 5 MB.
If file size cannot be reduced to less than 10 MB, the author should contact the
IJPPAW Editorial Office for instructions (IJPPAW@elsevier.com). Required Information:
Name, affiliation, email, telephone and fax numbers and mail address information for
one corresponding author.
This must be the same person nominated as corresponding author on the manuscript
title page and this person must submit the manuscript on-line.
The corresponding author, through the web access, is responsible for actions with
respect to each paper. E-mail prompts will be delivered only to the corresponding
author. Articles can also be tracked by the corresponding author via the online
system.
Name and affiliations of all other authors.
Cover letter is mandatory for all submissions and should address the novelty,
significance of the work.
Order of files
Manuscript should contain (in order) Title, Authors and addresses, Corresponding
Author and address, Abstract, Keywords. In numbered sections: 1. Introduction; 2.
Materials and methods; 3. Results; 4.Discussion; then Acknowledgements;
References; Legends to Figures. Tables with their legends (in
separate or combined files, numbered, in order). Figures (in separate files); preferred
formats: JPEG, EPS or PDF. Supplementary and multimedia files.
Format
The preferred format for the text is Microsoft Word. The title page, abstract and text
should be formatted with line numbers. The manuscript should be formatted to A4
size paper, in English, double spaced and with 2 cm margins.
Further journal requirements
During submission you will also have to confirm that all authors have read the
manuscript and accept responsibility for its contents and agree to an 'Ethics in
Publishing' document.
Referees Please submit, with the manuscript, the names, addresses and e-mail addresses of 3
potential referees. Note that the Editors retain the sole right to decide whether or not
the suggested reviewers are used.
PREPARATION The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as
possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the
article. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When
preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual
table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align
columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of
conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier:
http://www.elsevier.com/guidepublication. Note that source files of figures, tables and
text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the "spell-check" and
"grammar-check" functions.
120 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Article structure Subdivision - numbered sections
Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be
numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section
numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer
to 'the text'. Any subsection may be given a brief heading. Each heading should
appear on its own separate line. Introduction
State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a
detailed literature survey or a summary of the results. Material and methods
Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already
published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be
described. Results
Results should be clear and concise. For brief reports, the Results and Discussion
sections need to be combined. Discussion
This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. A
combined Results and Discussion section is often appropriate. Avoid extensive
citations and discussion of published literature. Conclusions
The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section,
which may stand alone or form a subsection of a Discussion or Results and Discussion
section. Appendices
This journal does not publish appendices. Information should be included within the
manuscript text or provided as supplementary material.
Essential title page information • Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems.
Avoid abbreviations and formulae where possible. • Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a
double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses
(where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a
lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the
appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the
country name and, if available, the e-mail address of each author. • Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages
of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that phone numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up to date by the corresponding author.
• Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the
article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent
address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which
the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address.
Superscript Arabic numerals are used for such footnotes. Abstract
A concise and factual abstract is required. The abstract should state briefly the
purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is
Anexos 121
often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this
reason, References should be avoided, but if essential, then cite the author(s) and
year(s). Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if
essential they must be defined at their first mention in the abstract itself. The
maximum length of the abstract is 300 words.
Graphical abstract A Graphical abstract is mandatory for this journal. It should summarize the contents
of the article in a concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide
readership online. Authors must provide images that clearly represent the work
described in the article. Graphical abstracts should be submitted as a separate file in
the online submission system. Image size: please provide an image with a minimum
of 531 × 1328 pixels (h × w) or proportionally more. The image should be readable
at a size of 5 × 13 cm using a regular screen resolution of 96 dpi. Preferred file types:
TIFF, EPS, PDF or MS Office files. See http://www.elsevier.com/graphicalabstracts for
examples.
Authors can make use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure the
best presentation of their images also in accordance with all technical requirements:
Illustration Service.
Highlights Highlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet
points that convey the core findings of the article and should be submitted in a
separate file in the online submission system. Please use 'Highlights' in the file name
and include 3 to 5 bullet points (maximum 85 characters, including spaces, per bullet
point). See http://www.elsevier.com/highlights for examples.
Keywords Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using British
spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for
example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly
established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing
purposes.
Abbreviations Avoid the use of abbreviations, but if necessary, authors should use the list (click here
to see list) as a guide to those terms that need not be given in full, or define each
abbreviation on first use.
Acknowledgments Authors should provide confirmation of consent from persons acknowledged in
manuscripts for example personal communications. This can be provided in a covering
letter or by e-mail to the editorial office.
Units Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of
units (SI). If other units are mentioned, please give their equivalent in SI.
Database linking Elsevier encourages authors to connect articles with external databases, giving their
readers oneclick access to relevant databases that help to build a better
understanding of the described research. Please refer to relevant database identifiers
using the following format in your article: Database: xxxx
(e.g., TAIR: AT1G01020; CCDC: 734053; PDB: 1XFN). See
http://www.elsevier.com/databaselinking
for more information and a full list of supported databases.
Footnotes
122 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Footnotes should only be used in tables. Indicate each footnote in a table with a
superscript lowercase letter.
Artwork Electronic artwork General points
• Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork.
• Embed the used fonts if the application provides that option.
• Aim to use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times New
Roman, Symbol, or
use fonts that look similar.
• Number the illustrations according to their sequence in the text.
• Use a logical naming convention for your artwork files.
• Provide captions to illustrations separately.
• Size the illustrations close to the desired dimensions of the printed version.
• Submit each illustration as a separate file.
A detailed guide on electronic artwork is available on our website:
http://www.elsevier.com/artworkinstructions You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats
If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application (Word,
PowerPoint, Excel) then
please supply 'as is' in the native document format.
Regardless of the application used other than Microsoft Office, when your electronic
artwork is
finalized, please 'Save as' or convert the images to one of the following formats (note
the resolution
requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given
below):
EPS (or PDF): Vector drawings, embed all used fonts.
TIFF (or JPEG): Color or grayscale photographs (halftones), keep to a minimum of
300 dpi.
TIFF (or JPEG): Bitmapped (pure black & white pixels) line drawings, keep to a
minimum of 1000 dpi.
TIFF (or JPEG): Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale), keep to a
minimum of
500 dpi. Please do not:
• Supply files that are optimized for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); these
typically have a
low number of pixels and limited set of colors;
• Supply files that are too low in resolution;
• Submit graphics that are disproportionately large for the content. Color Artwork
Illustrations of all kinds should be listed together under ′ Legend to Figures′ numbered
consecutively
and their positions indicated in the text. Figures should be high quality, of an
adequate size to ensure
clarity, and letters and numbers should be at least 4 mm in height. Magnification
should be indicated
Anexos 123
by inclusion of a scale bar in the figure and its value should be indicated on the figure
or in the legend.
Each figure should be obvious from its file name. If images have been altered,
describe the nature of
changes made and software used. This information should be included in the ′
Materials and methods′ section of the manuscript.
Illustration services Elsevier's WebShop (http://webshop.elsevier.com/illustrationservices) offers
Illustration Services to authors preparing to submit a manuscript but concerned about
the quality of the images accompanying their article. Elsevier's expert illustrators can
produce scientific, technical and medicalstyle images, as well as a full range of charts,
tables and graphs. Image 'polishing' is also available, where our illustrators take your
image(s) and improve them to a professional standard. Please visit the website to find
out more. Figure captions
Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a
description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum
but explain all symbols and abbreviations used.
Tables Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place
footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase
letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data
presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article.
References Correct references are the responsibility of the author. Please ensure that all
references cited in the text are included in the reference list.
References in the text start with the name of the author(s), followed by the
publication date in brackets, e.g. 'Combes (2001) has shown the importance of ...', or
'... has been described (Combes, 2001; Kumar et ál., 2004) ...', using date order.
More than one paper from the same author in the same year must be identified by the
letters a, b, c, etc., placed after the year of publication. In the text, when referring to
a work by two authors, use (Sangster and Dobson, 2002) or for more than two
authors, the name of the first author should be given followed by et ál.
The references in the reference list should be in alphabetical order. References to
journal articles should contain names and initials of all author(s), year of publication,
article title, abbreviation of the name of the journal, volume number and page
numbers.
Unpublished data, personal communications and papers ′ in preparation′ or ′
submitted′ , abstracts (whether published or not) and these should not be listed in the
references (but may be incorporated at the appropriate place in the text); work "in
press" may be listed only if it has been accepted for publication. Personal
communications must be accompanied by a letter or e-mail from the named
person(s) giving permission to quote such information. References to books should
also include the title (of series and volume), initials and names of the editor(s) and
publisher and place of publication. Examples:
Combes, C., 2001. Parasitism. The ecology and evolution of intimate interactions.
University of Chicago Press, Chicago and London.
Kumar, N., Cha, G., Pineda, F., Maciel, J., Haddad, D., Bhattacharyya, M.K.,
Nagayasu, E., 2004.
124 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
Molecular complexity of sexual development and gene regulation in Plasmodium
falciparum. Int. J. Parasitol. 34, 1451-1458.
Pettersson, E.U., Ljunggren, E.L., Morrison, D.A., Mattsson, J.G., in press. Functional analysis and localisation of a delta-class glutathione S-transferase from Sarcoptes
scabiei. Int. J. Parasitol. Sangster, N.C., Dobson, R.J., 2002. Anthelmintic resistance.
In: Lee, D.L. (Ed.), The biology of nematodes. Taylor and Francis, London and New
York, pp. 531-567. Citation in text
Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list
(and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full.
Unpublished results and personal communications are not recommended in the
reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in
the reference list they should follow the standard reference style of the
journal and should include a substitution of the publication date with either
'Unpublished results' or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press'
implies that the item has been accepted for publication. Web references
As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last
accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a
source publication, etc.), should also be given. Web references to published articles
can be included in the reference list. Other web references such as software
programs, databases and individual web pages, should have the reference details
included at the appropriate place within the text. Journal abbreviations source
Journal names should be abbreviated according to the NLM catalogue:
http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html.
Video data Elsevier accepts video material and animation sequences to support and enhance your
scientific research. Authors who have video or animation files that they wish to submit
with their article are strongly encouraged to include these within the body of the
article. This can be done in the same way as a figure or table by referring to the video
or animation content and noting in the body text where it should be placed. All
submitted files should be properly labeled so that they directly relate to the video file's
content. In order to ensure that your video or animation material is directly usable,
please provide the files in one of our recommended file formats with a preferred
maximum size of 50 MB. Video and animation files supplied will be published online in
Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com Please
supply 'stills' with your files: you can choose any frame from the video or animation or
make a separate image. These will be used instead of standard icons and will
personalize the link to your video data. For more detailed instructions please
visit our video instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.
AudioSlides The journal encourages authors to create an AudioSlides presentation with their
published article.
AudioSlides are brief, webinar-style presentations that are shown next to the online
article on ScienceDirect. This gives authors the opportunity to summarize their
research in their own words and to help readers understand what the paper is about.
More information and examples are available at http://www.elsevier.com/audioslides.
Authors of this journal will automatically receive an invitation e-mail to create an
AudioSlides presentation after acceptance of their paper.
Anexos 125
Supplementary data For non-integrated supplementary files, a footnote should be typed on the title page
of the manuscript: ′ Note: Supplementary data associated with this article. A copy of
supplementary material should be submitted at the same time as the manuscript.
Preferred formats are Microsoft Office for text or graphics and AVI for movie files.
Maximum size of files is 10 MB. If files cannot be reduced to 10MB, authors should
contact the IJPPAW Editorial Office at IJPPAW@elsevier.com. Please submit the
supplementary data as one file containing all the supplementary figures and tables.
Submission checklist The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending
it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of
any item. Ensure that the following items are present:
One Author designated as corresponding Author:
• E-mail address
• Full postal address
• Telephone and fax numbers
• Keywords
• All figure captions
• All tables (including title, description, footnotes)
Further considerations
• Manuscript has been "spellchecked" and "grammar-checked"
• References are in the correct format for this journal
• All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa
• Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources
(including the
Web).
AFTER ACCEPTANCE Use of the Digital Object Identifier The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic
documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is
assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The
assigned DOI never changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document,
particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full
bibliographic information. The correct format for citing a DOI is shown as follows (example taken from a document in the journal Physics Letters B):
doi:10.1016/j.physletb.2010.09.059
If you use the DOI to create hyperlinks to documents on the web, they are
guaranteed never to change.
Online proof correction Corresponding authors will receive an e-mail with a link to our online proofing system,
allowing annotation and correction of proofs online. The environment is similar to MS
Word: in addition to editing text, you can also comment on figures/tables and answer
questions from the Copy Editor. Web-based proofing provides a faster and less error-
prone process by allowing you to directly type your corrections, eliminating the
potential introduction of errors.
If preferred, you can still choose to annotate and upload your edits on the PDF
version. All instructions for proofing will be given in the e-mail we send to authors,
including alternative methods to the online version and PDF. We will do everything
possible to get your article published quickly and accurately - please upload
126 Introducción al desarrollo de una prueba diagnóstica para Prosthenorchis spp.
basada en PCR
all of your corrections within 48 hours. It is important to ensure that all corrections
are sent back to us in one communication. Please check carefully before replying, as
inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely
your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article
if no response is received.
Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a personalized link
providing 50 days free access to the final published version of the article on
ScienceDirect. This link can also be used for sharing via email and social networks. For
an extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form which is
sent once the article is accepted for publication. Both corresponding and co-authors
may order offprints at any time via Elsevier's WebShop
(http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/offprints). Authors requiring printed
copies of multiple articles may use Elsevier WebShop's 'Create Your Own Book' service
to collate multiple articles within a single cover
(http://webshop.elsevier.com/myarticleservices/booklets).
Additional information Submission of sequence data to databases
Novel nucleotide or protein sequence data must be deposited in the GenBank™ , EMBL
or DDBJ databases and an accession number obtained before the paper can be
accepted for publication.
Submission to any one of the collaborating databanks is sufficient to ensure entry in
all. The accession number should be included as a footnote on the title page of the
manuscript: 'Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in
the GenBank™ , EMBL and DDBJ databases under the accession number(s)'. If
requested the database will withhold release of data until publication. The
usual method for submitting sequence data is by the World Wide Web to either
GenBank (via BankIt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/), EMBL (via WebIn:
http://www.ebi.ac.uk/subs/allsubs.html) or to DDBJ (via SAKURA:
http://sakura.ddbj.nig.ac.jp/). Special types of submissions, such as genomes, bulk
submissions, segmented sets, and population/phylogenetic/mutation studies, can be
more easily prepared with the Sequin programme (available from the above Web
sites). Authors are encouraged by the databases to update their entries as the need
arises. GenBank/DNA sequence linking. In order for automatic links to be made between
papers and GenBank, authors should type the accession number in bold, underlined
text. Letters in the accession number should always be capitalised. (See the
example). When published they will appear in normal type. Example: ′ GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and BF223228), a B-
cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank accession no. BE675048), and
a T-cell lymphoma (GenBank accession no. AA361117)′ . Additionally, any multiple
alignments of nucleotide or protein data must be submitted to a recognised database
and must also receive a unique accession number. The accession number can appear
in the text in the relevant section of the Results, as: ′ Alignment files are available by
anonymous FTP from FTP.EBI.AC.UK in directory/pub/databases/embl/align or via the
EMBLALIGN database via SRS at http://srs.ebi.ac.uk; under accession(s)′ . The usual
method for submitting alignments is by the World Wide Web to the European
Bioinformatics Institute (via Webin- Align: http://www.ebi.ac.uk). Microarray data, in
MIAME-compliant format, should be submitted to ArrayExpress
(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) or GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).
Anexos 127
Accession identifiers relating to the data should be provided in the manuscript text. Policy on bioinformatics papers. In silico analysis: The following guidelines apply to
papers that exclusively use in silico analysis or rely heavily on this approach for
analysis and conclusions. Such papers should address a significant biological issue or
issues. Bioinformatic data should be supported by novel or published biological data.
Work would typically use information from a number of databases and even from a
number of parasite or host species and use a number of analytical methods. Types of ′
metaanalysis′ are encouraged either across a wide range of parasites or, say,
at a number of points in a metabolic or signalling pathway or an immune cascade. In
silico analysis may be especially suitable for review articles. Guidelines for reporting of protein identifications using mass spectrometry
The following information should be provided for protein or peptide identifications
using mass spectrometry: 1. The program, and version number, used to create peak
lists and the parameters used in the creation of the list.
2. The program, and version number, of the program used for database searching.
Parameters used for searching should be specified, including, but not limited to,
precursor-ion mass tolerance, fragmention mass tolerance, modifications allowed for,
missed cleavages and enzymes used in protein cleavage.
3. The name and version number of the sequence database used in searches. If a
custom-made database is used then complete information on the origin of the
sequences and database size should be disclosed. Given the dependence of scoring on
database size, the use of a small database, or one excluding contaminants, should be
justified. 4. A short description of the methods use to interpret the significance of
search results, including any statistical analysis, confidence thresholds and other
values specific to judging the certainty of the identification.
5. For large-scale experiments a false-positive determination should be reported. This
may be the result of randomized database searches or other approaches.
6. Each protein identification should include the accession number, score generated by
the search algorithm used, sequence coverage and the number of unique peptide
sequences assigned in the protein identification.
7. Single peptide identifications should include an annotated MS/MS spectrum showing
fragment assignments together with the peptide sequence, precursor mass, charge
and error.
8. Identifications arising from peptide mass fingerprinting should include an annotated
mass spectrum. The number of matched peaks, the number of unmatched peaks and
the sequence coverage should also be reported along with all parameters and
thresholds used to analyse the data. This includes mass accuracy, resolution,
calibration methods, contaminant exclusions along with the scoring scheme used and
measure of the false-positive rate. Author inquiries
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