herramientas complementarias para la erradicación de ... · dogma central de la epidemiologÍa...
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Nuevas herramientas complementarias para la erradicación de enfermedades
Dr. Alberto Parra
Asesor Técnico Dep I+D AVESCAL Ser. Vet. S.C.Responsable de I+D Laboratorios Larrasa S.L.
Epidemiología molecular como herramienta dedecisión en la gestión de los programas
sanitarios de erradicación
-Situación actual: largo proceso de erradicación, bajas prevalencias difíciles de reducir, “re emergencia” de la enfermedad, programas de vacunación, sistemas de diagnostico
NECESIDAD DE CAMBIO EN LA GESTION CON LA INCORPORACION DENUEVOS INSTRUMENTOS Y NUEVOS CONCEPTOS
CAMBIO DE GESTION BASADO EN CRITERIOS TÉCNICOSANALISIS EPIDEMIOLOGICO
Ej. C-L de “muestreo confirmatorio en matadero” a SISTEMA DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGICA
MEDIANTE EPI-MOLECULAR
DOGMA CENTRAL DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
Cepa=Individuo con características genéticas concretasPor debajo del nivel de sub-especie.
Cluster o clado=conjunto de cepas genéticamente iguales
Cadena activa de transmisión (reciente)
APLICACIÓN DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR
Juan Maeso, anestesista, 1.933 años de prisión Contagiar la hepatitis C a 275 pacientes Cuatro hospitales de Valencia entre los años 1988-1997.
Herramienta incriminatoria: Genotipado vírico
-Todos los pacientes (176) agrupados en un cluster.-Idéntico genotipo (1a) -Nexo: 4 hospitales, 1988-1997, anestesista. -Anestesista: virus mas viejo (secuencia E-1 y E-2) -Caso indice (cepa mas vieja, nexo común)
Un caso reciente…
´5´ 3´
3´ 5´
Replicación correcta Salto en cadena hija
´5´ 3´´3´ 5´
Salto en cadena madre
Neutral +1 -1
N=4 N=5 N=3
METODOLOGIA DEL SISTEMA
Tipificación molecular MLVA= análisis VNTR multi locus-Al Dahouk et al. 2007 (Journal of Microbiol Meth): MLVA-16-Otros: Whatmore et al 2006; Le Fleche, et al. 2006; Bricker et al. 2003 and 2006.
B. melitensis 16M (DelVecchio et al., 2002)B. suis 1330 (Paulsen et al., 2002) B. abortus strain 9–941 (Halling et al., 2005)
Tipificación molecular mediante MLVA+Análisis filogenético-poblacional+
Integración Sistema de Información geográfica GIS
1 2 3 M -
+
1 2 3 M
Cepa 1
Cepa 2
Cepa 3
Locus VNTR A Locus VNTR B
Cebadores marcadosfluorescencia
Electroforesis en gel.Un sólo locus por PCR
Lectura manual o automática
Productos PCR marcados con fuoróforos alternativos
Lectura con secuenciador de varios locus
P C R
METODOLOGIA DEL SISTEMA
03 01 06 10 02 03 02 04 04 02 03 01 04
PCR simple PCR multiple
1º Esclarecimiento de brotes (zoonosis), origen y evolución espacio temporal (+GIS)
2º Determinación de relaciones epidemiológicas insospechadas y su gestión
3º Valoración de la complejidad epidemiológica de diversos escenarios geográficos
4º Valoración o monitorización estadística del proceso de erradicación
5º Desarrollo de modelos espacio temporales de distribución y evolución de brotes
6º Determinación de factores de riesgos asociados a cond. ambientales, etc
7º Valoración de la efectividad de las medidas de control de brotes
8º Valoración del impacto de reservorios
9º Delimitación precisa de Unidades Epidemiológicas (U. Epi):
-Extensión de las mismas en base a criterios moleculares-Estratégico en la gestión de vacíos sanitarios de mas de una explotación
APLICACIONES DEL SISTEMA
METODOLOGIA DEL MUESTREO
Pequeña escala: explotaciones o unidades epidemiológicas para responderpreguntas sencillas: conclusiones simples, rápidas y de aplicación directa (origen de un brote?).
Gran escala: provincias, comunidades, nacionesConclusiones complejas y revolucionarias, pero aplicativas.
-Fst/H como evaluación de la presión sanitaria-Marcadores como relojes moleculares (idea de “Edad”)-Reloj molecular como indicador de “caso índice”-Factores de riesgos asociados a transmisión -Filogenia como marcador de transmisión entre zonas-Etc.
METODOLOGIA DEL ANALISIS
Pequeña escala:
Gran escala:
Genética poblacional: parámetros poblacionales (AMOVA, Fst, H, Ro, etc.)
Análisis estadístico: Test de Mantel y estadística paramétrica/n.p.
Analisis GIS: modelos geográficos de densidad de riesgo
-Análisis simple: cepas iguales o distintas (EXCEL o similar) (Cluster=100% igual)
-Cepas parecidas: Programas de análisis filogenético (Cluster=95% similitud)
-Cepas emparentadas (madres-hijas): Programas de redes filogenéticas
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: ESCLARECIMIENTO DE BROTES
-Permite confirmar sospechas de contagio: movimientos declarados (o no...)
-Efecto de tratantes-diseminadores, contagios provocados, pastos comunales, etc.
-Permite detectar focos foráneos a distintos niveles: regional, nacional e internacional.
Provincias
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: ESCLARECIMIENTO DE BROTES
-Permite confirmar sospechas de contagio: movimientos declarados (o no...)
-Efecto de tratantes-diseminadores, contagios provocados, pastos comunales, etc.
-Permite detectar focos foráneos a distintos niveles: regional, nacional e internacional.
Ej. Foco foráneo.
CL43CL43
CEA A
CEA B
CEA C
CL43.avi
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DETERMINACION DE RELACIONES EPIDEMIOLOGICAS
INSOSPECHADAS
50% clustes son ambientales
RELACIONES EPI. “NORMALES”
50% otros:
-Movimientos legales
-Movimientos ilegales
-Manejos comunes?
-Reservorios?
Cluster 50
Cluster 50
Cluster 50
Provincia B
Provincia A
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DETERMINACION DE RELACIONES EPIDEMIOLOGICAS
INSOSPECHADAS
50% clustes son ambientales(PROXIMIDAD GEOGRAFICA)
50% otros:
-Movimientos legales (Ej.)
-Movimientos ilegales
-Manejos comunes?
-Reservorios?
CL43CL43
CEA A
CEA B
CEA C
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DE LA COMPLEJIDAD EPIDEMIOLOGICA
(1) CW
(2) DD
(3) FN
(4) HM
(5) LS
(6) NE
(7) QY
(8) YB
(9) ZT
1,39 (0.78)
Media cluster/CEA por provincia (d.e.)
1,28 (0.48)
1,31 (0.6)
1,42 (0.9)
1,39 (0.73)
2,00 (1)
1,6 (0.96)
1,33 (0.71)
1,4 (0.91) 1.4 (±0.75) Kruskal-Wallis test: H ( 8, N= 221) =4,211524 p =,8376
Provincias
Mean ±SD ±1,96*SD 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Codigo provincias
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
nº d
e cl
uste
rs/e
xplo
taci
on
¿ ?Como es de compleja una zona?
Pro
vinc
ias
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Aplicación epidemiológica de genética poblacional
VARIANZA MOLECULAR
Fst=0,1123 (s.d.0,0200) (0,05 to 0,15 moderada0=no existe diferencia)
(0,1578, 0,0782 95 % C.I)
Existen diferencias genéticas moderadas entre las provincias
CW
LS
ZT
DD
FN
NE
QY
YB
HM
N-CL
Provincias
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Aplicación epidemiológica de genética poblacional
HETEROGENEIDAD GENETICAHProvincias
CW
LS
ZT
DD
FN
NE
QY
YB
HM
N-CL
0.2201
0.25220.3460
0.2808
0.2554
0.3160
0.1538
0.35410.2363
0.2555
Ave. heterozygosity/H (unbiased): 0.2936
1,39 (0.78)
1,28 (0.48)1,31 (0.6)
1,42 (0.9)
1,39 (0.73)
2,00 (1)
1,6 (0.96)
1,33 (0.71)
1,4 (0.91)
Complejidad
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Aplicación epidemiológica de genética poblacional
RELOJ MOLECULAR
Deslizamiento de la polimerasa
´5 ´ 3´
3´ 5´
Replicación correcta Salto en cadena hija
´5 ´ 3´´3´ 5´
Salto en cadena madre
Neutral +1 -1
N=4 N=5 N=3
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Ejemplo de Red Filogenética (provincia LS) con Fluxus Softw.
Antecesores
Últimos descendientes
Antecesores“Desaparecidos”
fluxus-engineering.com
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Ejemplo de Red Filogenetica (provincia LS) con Nexus Softw.
03 01 06 10 02 03 02 04 04 03 03 01 04
03 01 06 10 02 03 02 04 04 02 03 01 04
LS.8418.1100271
LS.6682.1100521
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Ejemplo de Red Filogenetica (provincia LS) con Nexus Softw.
LS.8418.1100271LS.6682.1100521
LS.4875.1100051LS.6682.1100521
LS.8174.1100101
LS.6682.1100521
LS.7410.1100122LS.7543.1100463
LS.8040.1100131
LS.7311.1100121
FN.6696.1100011
FN.7339.1101021
FN.6696.1100051FN.7419.1101191
FN.7419.1101941
FN.7419.1100601
FN.6696.1100011
FN.7941.1100081
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACIÓN
Abuelo
Padres
Nieto
Ejemplo de aplicación de Reloj molecular
Abuelo
Padres
Nieto
Abuelo
Padres
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA:VALORACION DEL PROCESO DE ERRADICACION
vs
Baja HElevada Fst
Bajo porcentaje de agrupación clonalBaja tasa de transmisión entre CEAs
Baja complejidad dentro de CEAsMayor edad de las cepas
Mayor Frecuencia de lesiones Iniciales
Elevada HBaja Fst
Elevado porcentaje de agrupación clonalAlta tasa de transmisión entre
ExplotacionesElevada complejidad dentro de los CEAs
Menor edad de las cepasMenor frecuencia de lesiones iniciales
Monitorización estadísticacon nivel de resolución deseado
Baja Prevalencia/Incidencia Elevada Prevalencia/Incidencia
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: MODELOS GEOGRAFICO TEMPORALES DE DISTRIBUCION
INTEGRACION CON GIS
GIS= plataforma informática de integración de información epidemiológica.
Permite un nuevo enfoque de la gestión: dimensión geográfica.
Visión geográfica de la U. Epi, equipos de Saneamiento (vecinos ocultos...)
Mejora de la logística (menos vueltas para llegar a trabajar…)
Mayor homogeneidad de las actuaciones sanitarias (por U.Epi, no municipios)
Desarrollo de planes de contingencia: modelos predictivos, pasillos sanitarios, optimización de logística de intervenciones (Medidas urgentes)
Futuro: GIS como nueva herramienta de gestión de los Programas...??
03 01 06 10 02 03 02 04 04 03 03 01 04
03 01 06 10 02 03 02 04 04 02 03 01 04
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: MODELOS GEOGRAFICO TEMPORALES DE DISTRIBUCION
FN.7419.1101561FN.7419.1101251T3 Equip 213 samples, Matd 3. Insp13 lesiones, tipo crónico3 CMTB, CLUSTER 122
T1 Equio 331 samples, Matd 2. Insp1 lesiones, tipo 11CMTB, CLUSTER 133
Ejemplo_1(2).avi
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: MODELOS GEOGRAFICO TEMPORALES DE DISTRIBUCION
UK, 2000 UK, 2006
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: MODELOS GEOGRAFICO TEMPORALES DE DISTRIBUCION
1.702 muestras en Castilla y León (2005-2006)506 muestras genotipadas por vntr
197 clústeres agrupados en 15 familias506 muestras divididas en 197 clústeres
dPAB90.9wC K77.0
pgC J74.0pgC E52.0wC G69.0
wVU 20.8
wVB13.0
wVG54.0
wC B15.0
wCV131.9
wVU 21.8
pgVN49.9
wAA7.0
wVB10.9
wMA34.9
pgVE96.9
wC G68.0
dSL56.9
wVB110.9
wVL20.9
wMC102.9
wSO63.0
dSJ52.9
wCH70.0
dSL57.9
wMA32.9
wVC11.9
H37Rv
wST67.9
dSK39.0
dSO59.0wVC
14.9P3
wSG28.9
wCA9.0
pgVE42.9wM
C101.9
wSB3.9pgVL97.9
pgVL94.9
wV
G53.0
wS
I58.9dS
J53.9pgV
E45.9
wV
B22.9
pgVI46.9
pgVE
43.9w
VB
15.9pgV
L39.9w
VG
55.0w
SG
29.9w
MA
33 .9w
VB
24.9w
SG
100.9pgC
C30 . 0
pgV
E41
.9 w
VA
5 .0
wS
F27
.9 p
gSH
38.0
dV
O92
.0 f
dDD
54. 9
wS
O60
. 0 d
VM
81.0
wP
AB
88.9
wM
A30
.9 p
gVI4
7.9
dS
U69
.0 w
VB
8.9
dS
S65
.9 c
wS
D10
2.9
dS
B2.
9 c
wSA
D9.
8 d
SAU
98.1
dM
D44
.1 w
MI8
7.1
wM
D59
.0
wSN
31.1
dM
D45
.1
dSO
15.7
dM
D46.1
dMD47.
1
wMF100.0
wSAAE8.1
dSAE116.7
wMI5
5.1
dMD48.1
wMF110.0
dMD53.1
wMD581.0
wVL83.0
wMI61.1
pgCM36.1
wMF101.0
dSAG19.8
wMA22.1
wSAAC16.1
dMD52.1
dMD 49.1
dSAAD13.1
cwSAF18.8
wVL11.8
wC I73.0
pgVE4.8
wC K79.0
wVL12.8
wSA2.0 dSK14.8 wMA20.0 wPJ35.0 wC D 22.0 dVO90.0 wC K80.0 wVK78.0 dMA103.0 wVJ71.0 wC J75.0 dVO91.0 dSP67.0 dSQ76.0 wSM51.0 wST84.0 dAC66.0 wMD 58.0 wMD15.8
dMD43.1 wCF65.0
wSZ73.9 pgVL93.9
dMD54.1 cwVF88.1
wSZ72.9 wVB6.9
pgVL95.9
dMD410.1
dVB4.9 wVH7.9
wVC5.9 wCV13.9
wVB12.9
dPAB89.9
dME4.8
wSAF16.8
wMF991.0
pgVE2.8
wMI51.1
dSN59.9
dVE24.0
dVO70.9
dMD
41.1
dME
3.8
cwS
D104.9
dSJ50.9
cwS
D103.9
wV
E36.9
wS
Y92.9
wV
E25.0
wM
D60.0
wV
B12.0
dME
82. 9
pgVL38.9
wM
A17.0
dVL82.9
dMD
42. 1 w
MF
9 9 .0 w
SA
4 .0
wS
N6 1
.9w
VO
93. 0
wV
L19.
9pg
VL9
8.9
p gV
E23
.0
wV
L18.
9
wS
AC
13.7
wV
F50
.0
pgS
H37
.0
pgS
H35
.0
pgS
H33
.0
pgS
H31
.0
dSA
A84
.9
dSU
68.0
dPR
63.9
dMD
40.1
wMB4
4.0
wSE2
6.9
wMB4
9.0
dSAA
87.9
dSAA
86.9
wMB48
.0
wSAA95.0
wMB43
.0
wMB47.0
wPW94.0
dSN30.1
f dVD41.0
dSN29.1
wCL98.0
dSN28.1
wSAAA67.1
wSAAA66.1dME5.8
wSS71.1pgVL99.9wSA3.0
dSN591.9wAAM18.7wVC16.9wVC 17.9wMD 56.0dVD40.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DETERMINACIÓN DE FACTORES DE RIESGO
Concepto de agrupación clonal
Un 74,64% de las cepasse agrupan en clusters
La mayor parte de los animales participan en procesos activos de transmisión
Que factores hacen que se Agrupen (transmitan)?
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DETERMINACIÓN DE FACTORES DE RIESGO
% DE AGRUPACIÓN CLONAL
p<0,050,0360,0290,08174ZT4,1680,761,78729YB1,960,340,82816QY
2,450,360,96614NE
p<0,052,841,131,9252182LS
1,160,310,61624HM0,90,270,51824FN
p<0,059,21,13,18429DD
1,421,440,832239CW
Provincia %agru %no agrup O.R. (X2 lim) p
Medida relativa de la activad de la transmisión frente a áreas no activas aplicadas a modelos espaciales de riesgo
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DE EFECTIVIDAD DE LA GESTION SANITARIA
Re aislamiento de la misma cepa, tras medidas de gestión sanitaria (vacíos sanitarios, batería de diagnósticos, etc.)
REAISLAMIENTO DE CLUSTER=FRACASO DE ERRADICACIONCLUSTER CEA FECHA
2 LS72551100131 24/11/0521/06/06
3 LS72551100131 24/11/0515/06/0615/09/06
48 QY69441100041 27/10/055/10/06
50 LS85621100651LS85621100691(mismo municipio)
18/08/0619/09/05
62 LS85461100101LS85461100111(mismo municipio)
2/06//0518/12/06
82 LS66091100411 8/09/0515/11/06
Cluster 50 Cluster 2
Cluster 48 Cluster 62
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DELIMITACION PRECISA DE UNIDADES EPIDEMIOLOGICAS
7 CEAS POSITIVOS
2 CEAS POSITIVOS
3 CEAS POSITIVOS
CL 31
CL 31
CL 42
Opción a
3 UE independientesVaciamos solo A
Opción b
2 UE independientesVaciamos A+B
A
B
C
“Gestión drástica”
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: DELIMITACION PRECISA DE UNIDADES EPIDEMIOLOGICAS
A 213173,24 6506,92 6506,92
B
C
Total/año(€)
9295,60 2788,68 1859,12 1859,12
6971,70 2788,68 2788,68 1394,34
229440,54 5577,36 11154,78 9760,38
A 213173,24
B
C
Total/año(€)
23239
6971,70 2788,68 2788,68 1394,34
243383,94 2788,68 2788,68 1394,34
215000
220000
225000
230000
235000
240000
245000
250000
255000
260000
1 2 3 4
ab
Año 1 2 3 4OPa
OPb 997.239,54
966,564,18
-30.675,36
Fuente: AVESCAL, costes directos por indemnización según varemos/censo real (datos disponibles)
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DE RESERVORIOS
Prevalencia elevada(Ej. >3% TB)
Comportamiento compatible con el contagio
Patología y epi. que permita transmisión
Densidades que permitan interacción
Detección molecular de las transmisiones
Otros: genética, m.a. (Aranaz et al., 2003, Gortazar et al 2005, Parra et al, 2003, 2005)
Prev. Ciervos (I)
Prev. Jabalí (I)
Captura Cierv. (D)
Captura Jab. (D)
Temporada
0
1000
2000
3000
4000
5000
-1
1
3
5
7
9
0 2 4 6 8 10
±1.96*Std. Dev.
±1.00*Std. Dev.
Media Jabalí
±1.96*D.e.
±1.00*D.e
Media Ciervos
Prev
. Jab
alí
Prev
. Cie
rvo
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
MonfragüeVilluercas
CoriaSan Pedro
Valencia
Regresion Jabalí95% confid.Regresion95% Ciervo
Prev. Ciervo=0.549 + 0,199 * Temporada
Correlation: r =0,88, p<0,001
Prev. Jabalí= 1.095 +0,221* Temporada
Correlation: r = 0,96 p<0,001
Temporada
Prev
alen
cia
Jaba
líPr
eval
enci
a C
ierv
o
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
97/98 98/99 99/00 00/01 01/02
(Acevedo-Whitehouse et al. 2005)
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DE RESERVORIOS
EJEMPLOS DE APLICACIONES DEL SISTEMA: VALORACION DE RESERVORIOS
Cluster comunes…direccion?
CONCLUSIONES
-Herramienta costo efectiva aplicable en toma de decisiones.
-Herramienta con base tecnica que combinagenetica+GIS
-Aplicable a cualquier enfermedad y cualquier especie
-Nos aclara la situacion, fundamental paragestionar el programa.
dPAB90.9wC K77.0
pgCJ 74.0pgCE52.0wCG69.0wVU20.8
wVB13.0
wVG54.0
wCB15.0
wC V131. 9
wVU21.8
pgVN49. 9
wAA7. 0
wVB10.9
wMA34.9
pgVE96.9
wC G68.0
dSL56.9
wVB110.9
wVL20.9
wMC102.9
wSO63.0
dSJ 52.9
wCH 70.0
dSL57.9
wMA32.9
wVC11.9
H37Rv
wST67 .9
dSK39.0
dSO59.0wVC 14.9
P3wSG28.9wC
A9. 0pgVE42.9
wMC
101. 9wSB3.9
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Personal laboratorio: 1 DVM junior, 1 auxliliar, 1 DVM PhD SeniorPersonal de AVESCAL: 1 DVM junior, 1 Informático Senior , 1 Infor+GIS SeniorMatadero: 5 Inspectores (DVM) dedicando 1 hora al dia. Equipos de campo: 200 DVMs geolocalizando explotaciones. 100€/cepa.
N CEAS investigados: 500N muestras: 2.071 (1.867 representativas) 2005-2006N cepas: 631N de genotipos: 226 Numero de clusters: 207 afectando a mas de 200 CEAS
DATOS PROFIT
Financiación Proyecto FIT010000-2004-127Convocatoria Nacional de Fomento de la Investigación Técnica
Programa Nacional de BiotecnologíaSecretaría del estado de Universidades e Investigación
Ministerio de Ciencia y Tecnología
ADE Agencia de Desarrollo Regional
Agradecimientos
Dr. Olga MinguezD. Lucio CarbajoDña. Francisca Fernandez D. Sergio Márques
D. Fernando FreireDña. Virginia BayonaD. Guillermo MárquesD. Ernesto GarciaDña. Elena Cebada
Dr. Nuria GarciaDña. Belinda CorderoDr. Alfredo GarciaDr. Jose Larrasa
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