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Factores que Influyen laMicrobiología en los

AlimentosDr. Esther Z. Vega

Microbiología Aplicada

Bosquejo

• Métodos de detección y cuantificación

• Factores internos y ambientales quecontrolan el crecimiento bacteriano

• Cinética de crecimiento bacteriano

• Fisiología y metabolismo de microorganismosde origen alimentario

Ecosistemas, homeostasis ytecnología de defensa

• Ecología “the study of the interactions

between the chemical, physical,and structural aspects of a nicheand the composition of its specificmicrobial population”

Commission on Microbial Specificationsfor Foods

Ecosistemas, homeostasis ytecnología de defensa

• Los alimentos son ecosistemas– Organismos– Ambiente

• Factores intrínsecos (pH, Aw, nutrientes)• Factores extrínsecos (temperatura, ambiente

gaseoso, presencia de otras bacterias)• Preservación por manipulación de los factores

– Los alimentos pueden contener múltiplesmicroambientes

Microbiología clásica y suslimitaciones

• Limitaciones en la detección y métodos deenumeración– Contaje de placas– Medio selectivo, diferencial– Método número más probable– Técnicas de enriquecimiento– Células dañadas– Viable no cultivable– Factores intrínsecos que influyen en el crecimiento

microbiano– Factores extrínsecos que influyen en el crecimiento

microbiano• Homeostasis y tecnología de defensa• Cinética de crecimiento

Limitaciones de contaje deplacas

• Asume– Cada célula forma una colonia– Cada colonia proviene de una sola célula bacterial– Algunas colonias puede ser originadas de una

“agrupamiento”de bacterias• Se reporta como

- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo óml.- NO como bacterias totales

Limitaciones de contaje deplacas

• Factores que afectan la formación decolonias por una célula– Estado fisiológico de la célula– Medio de cultivo utilizado en la

enumeración– Temperatura de incubación

Limitaciones del contajede placas

• Sólo se consideran organismos aeróbicos• No se sabe el tipo de bacteria• El medio de cultivo permite el crecimiento de

ciertas bacterias• Limitaciones visuales/Errores humanos• Difícil de distinguir entre partículas de

alimentos y bacterias• No se debe utilizar en alimentos fermentados• Las colonias podrían ser muy pequeñas para

verse

Tipos de muestra• Líquidas

– Líquidos no viscosos se miden con pipetas– Líquidos viscosos se pesan

• Sólidas– Pesar asépticamente

• Hisopo– Tomar muestra pasando un hisopo por un área

definida• Ambientales y de envases

– Enjuage el interior del envase– Abra una placa para tomar una muestra del aire– Placas RODAC

Protocolo para Contaje enPlacas

• Prepare un homogenado de la muestra– Dilución 1:10– 1 parte de la muestra a 10 partes del

volumen total• Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2

minutos10 g/ml muestra 90 ml of diluyente

1:10 Dilución – 10-1

Protocolo para contaje enplacas

• Prepare diluciones seriadas– Diluya hasta que obtenga colonias separadas

entre 25-250 en una placa– Utilice una pipeta estéril entre cada dilución– Ponga la pipeta usada en el área designada

• Mezcle cada botella de dilución 25 veces enun arco de 90 grados por 7 segundos

• Use amortiguador de fosfato ó peptona paradiluir

Diluciones

Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

(1:10) (1:100) (1:1000)(1:10000)

(1:100000)

Sample Homogenate

Placas

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml

Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish

Protocolo Contaje de placas• Añada 18-20 ml de agar (45-50oF), a la placa petri

– El agar no puede estar muy caliente porque mata lasbacterias

• Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar)• Mueve 10x en cada dirección• Deje que solidifique• Incube las placas invertidas a 35-37oC por 48 horas.

– Atmósfera (aeróbico, anaeróbico, microaerófilico)– Temperatura

• Enumeración– Número de colonias promedio por placa

• Placas entre 25 y 250 colonias

Contaje de placa aeróbica

• Provee un estimado general debacterias aeróbicas vivas

• Evalúa calidad• Predictor de “shelf-life”• Monitoreo ambiental• Excluye

– Anaerobos obligados– Microaerofílicos

Resultados del Contaje deplaca aeróbica

• Evalúa la sanitación de una producto• Predice la durabilidad (Shelf-life)• Indicador de seguridad (Safety)• Monitorea el ambiente

Medio microbiológico• Provee nutrientes para

el crecimiento de losmicroorganismos– Caldo

• Usualmente se utilizapara crecer cultivospuros

• Utilizado paraenumeración a travésde la técnica de MPN

Medio microbiológico••Agar Agar sólidosólido

••Agar- Agar- agenteagente gelatinizantegelatinizante sin valor sin valornutricionalnutricional

••LíquidoLíquido a 45 a 45ooC, C, sólidosólido a a temperaturatemperaturaambienteambiente

••CélulasCélulas bacterialesbacteriales estánestán atrapadasatrapadas en el en elagar agar taltal queque puedanpuedan ser ser enumeradasenumeradas

••UtilizadoUtilizado parapara aislaraislar

••PuedePuede ser no- ser no-selectivoselectivo, , selectivoselectivo o o diferencialdiferencial

Medio selectivo y diferencial• Selectivo

– Se añade un ingrediente al medio para inhibir elcrecimiento de ciertos tipos de organismos yayudar el crecimiento de otros

• Diferencial– Se le añade algo para diferenciar entre

organismos diferentesi.e. cambio en color

Métodos de Número másProbable (MPN)

• MPN– Basado en

probabilidadestadística

– NO es contajedirecto

– Técnica líquida

Métodos de Número másProbable (MPN)

• Estima número de organismos enmuestra cuando se encuentran enbajas concentraciones

• Se utiliza comúnmente para E. coli ycoliformes

• Se añaden agentes selectivos• Método de 3 ó 5 tubos• Límite más bajo de sensitividad (3

tubos) <3.0 bacteria/gm

MPN - ContinuaciónEl objetivo es “diluir el organismo• Seleccione la muestra más diluída con

todos los tubos positivos y los próximosdos– 3,2,1 – Nuestra combinación

• Determine el MPN utilizando la tabla deMPN

Técnicas de enriquecimiento

• Cero tolerancia– Salmonella– Listeria monocytogenes– E. coli O157:H7

• ¡No se necesita enumeración!• Detección

– Medio de pre-enriquecimiento con medio selectivoenriquecido

– Se pone en placa en medio selectivo– Confirmación bioquímica y genética

Células dañadas

Una célula puede ser dañada en lugarde matada por niveles sub-letales decalor, radiación, ácidos o agentessanitizantes.

Resultado: Menor resistencia a agentesselectivos o aumento en susrequerimientos nutricionales.

Células dañadas

Tabla 2.3

Valor D55C- tiempo requerido paraeliminar 90% de la población a 55oC.

Figura 2.3

Células dañadas: Causasambientales

• Calor subletal• Congelamiento sub-

letal• Secado “freeze

drying”• Secado• Radiación

• Químicos– Tintes– Sodium azide– Sales– Metales pesados– Antibíoticos– Aceites esenciales– EDTA– Compuestos

sanitizantes

Células dañadas: Factoresinfluyentes

La acción de dañar una célula es unproceso complejo, influeciado por:

• Tiempo• Temperatura• Concentración de agente• Cepa de organismo• Metodología experimental

L. monocytogenes crecida a <28oC expuesta a 52oC reducción por muerte de 3-4 log.Crecida a 37 o 42oC, 2-3 logs de daño cuando se exponen a 52oC.

Células dañadas:Características de las células

• Aumento en el tiempo de la fase lag decrecimiento (efecto de reparación)

• Aumento en la sensitividad a lavariedad de agentes selectivos en elmedio de cultivo– Pérdida de la habilidad de formar colonias

en medio selectivo

Células dañadas: Efecto deestresores ambientales en las

células• Membrana celular

– Daños en los componentes lípidos• Enzimas de ciclo TCA• Otras enzimas

– Coagulasa– Nucleasa termoestable

• Ribosomas– Pérdida de Mg+2

• DNA• RNA

Células dañadas: ¿Quésignifica?

• Imposible recuperar la cantidad verdadera depatógenos– Eficiencia del procesamiento del alimento es

sobreestimada• E.g. valor D menor

• Recuperación de patógenos dañados enalimentos– Problemas de seguridad– Problemas de contaminación

• Agentes selectivos pueden ser ingredientescomunes de los alimentos e.g. sal

Células dañadas: S. aureus

Células de S. aureus dañadas por ácidodurante la fermentación para laproducción de embutidos puede creceren TSA, pero no en TSA 7.5% NaCl.Estas células pueden reparse en elembutido si se mantiene a 35oC (perono a 5oC), crecer y producirenterotoxina.

Células dañadas: Detección

• Pre-enriquecimiento no selectivoseguido de placas con medio selectivos– Agentes que reparan (e.g. piruvato,

catalasa, oxirasa)• Placas de medio no-selectivo y medio

selectivo– No-selectivo: dañadas y no-dañadas– Selectivo: no-dañadas

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): características

de las células• Organismos que no son cultivables con

medio no selectivo• Activos metabólicamente

– Presencia de enzimas metabólicas• Síntesis de nuevas proteínas• Cambios en los lípidos celulares

– “Nutrient uptake”• Cambios morfológicos

– VNBC Campylobacter jejuni

Organismos viables pero nocultivable (VBNC): Detección

• Metabolismo de nutrientes radioactivoso fluorogénicos para viabilidad (acridinaanaranjada:DNA:RNA)

• Sondas de ácidos nucléicos– No provee información de viabilidad

• Contaje directo de células viables pormicroscopía

Patógenos de origen alimentariopueden convertirse a VBNC cuando elalimento es puesto a temperaturas fríasen un medio rico nutritivamente.

Organismos viables pero nocultivable (VBNC): Detección

Resucitación de células VNC es demostrado por unaumento en cultivilidad pero no en un aumento en elnúmero de células.

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Teorías

• Teoría original: parte del ciclo normalde la bacteria

• Resultados recientes: inducido porestrés– Bajas temperaturas (<15oC)– Falta de nutrientes

• Reversión a una forma cultivable– Real?– Pocas células cultivables se multiplican

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Vibrio vulnificus

• Figura 2.7

Organismos viables pero nocultivables (VBNC): Significado

• Campylobacter jejuni• Escherichia coli• Vibrio vulnificus• Salmonella enteritidis• Shigella• Vibrio cholerae

¡Un patógeno que no se detecta!

Factores intrínsecos que influyenen el crecimiento microbiano

Factores intrínsecos- característicasinherentes al alimento

• pH• Contenido de humedad (Aw)• Potencial de oxidación-reducción (Eh)• Contenido nutricional• Constituyentes antimicrobiales• Estructuras biológicas

Rangos de pH óptimos paracrecimiento microbiano

• pHOptimum Maximum Minimum

Bacteria 6.5-7.5 9.0 4.5

Hongos 4.0-6.8 8.0-11.0 1.5-3.5

Levaduras 4.5-6.5 8.0-8.5 1.5-3.5

pH• El pH de un alimento es la medida de la “acidez” o “alcalinidad”

de ese producto. La escala del pH abarca valores que oscilanentre 0 y 14. Un pH inferior a 7 es ácido, un pH de 7 es neutroy un pH superior a 7 es alcalino o básico.

Actividad de agua (Aw )

• Actividad de agua (Aw) -proporción de agua presenteen un alimento. También seconoce como la humedadrelativa.

• Rango: 0-1.0 (agua pura)

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

H2O

Aw

Staphylococcus aureus puede crecer hasta un

Aw de 0.86

Aw de alimentos

• Frutas y vegetales – 0.97-1.00• Carnes – 0.95-1.0• Pan – 0.95-1.0• Queso – 0.68-1.0• Mermeladas- 0.75-0.94• Miel – 0.54-0.75

Potencial de oxidación-reducción(Eh)

• Oxidación – pérdida de electrones• Reducción – ganancia de electrones• Potencial de oxi-reducción – facilidad

en que un sustrato en particular gana opierde electrones (mV)– Eh negativo: sistema anaeróbico– Eh positivo: sistema es aeróbico

• Un producto oxidado es +; uno reducidoes -

Potencial oxi-reductor (O-R)

• El potencial oxi-reductor de losalimentos está influenciado por:–Composición química del

alimento–Tratamiento que se aplica al

procesarlo–Condiciones de almacenaje

Eh de algunos alimentos

• Origen vegetal: +400 mV• Queso: -20 a -200 mV• Carnes

– Pre-rigor: +250 mV– Post-rigor: +10 a -130 mV– Carne molida: +300 mV

¿Cuál de las siguientesrepresenta un Eh + ?

Rango de crecimiento microbiano enrelación a Eh

De +100 a -250 mVDe +100 a -250 mVanaerobiosanaerobios

De +300 a +100 mVDe +300 a +100 mVAnaerobiosAnaerobiosfacultativosfacultativos

De +500 a +300 mVDe +500 a +300 mVaerobiosaerobiosRangoRango de Eh de EhOrganismoOrganismo

Nutrientes

• Los microorganismos muestran diversidad ensus requisitos nutricionales.

• ¿Qué necesitan?– Agua– Fuente de energía– Fuente de nitrógeno– Vitaminas– Factores de crecimiento– Minerales

Factores antimicrobiales naturales

• Lisozima en el huevo• Aglutinina en la leche• Lacteninas en la leche• Eugenol en los clavos• Ácido benzoico en los arándanos

Factores extrínsecos que afectanel crecimiento microbiano

• Temperatura de almacenamiento• Humedad relativa del ambiente• Presencia y concentración de gases en

el ambiente• Presencia y actividades de otros

organismos

Temperatura

Humedad relativa

• Muy alta: condensación, crecimiento• Muy baja: pérdida de humedad,

inhibición de crecimiento

Presencia y concentración degases

• Oxígeno o aire• Atmósfera

anaeróbica• CO2

• Ozono

Presencia y actividades de otrosorganismos

• General– No específica– Inhibición o destrucción de un organismos por otro– Mecanismo

• No está claro– Número de inhibidores > organismos blanco– Variedad de inhibidores

» Competencia por nutrientes» Alteración no-favorable del ambiente» Combinación de factores

Presencia y actividades de otrosorganismos

• Antagonismo por lactato– Sustancias con actividad antimicrobiana de

bacterias productoras de ácido láctico• Metabolitos de oxígeno• Acidos orgánicos• CO2• Diacetil• Acetaldehído• Bacteriocinas• Antibíoticos

Cinética de crecimiento

Fisiología microbiana ymetabolismo

• Fermentaciones de alimentos• Daño de alimentos• Seguridad alimentaria

Fisiología microbiana ymetabolismo

• Bacterias aeróbicas– Glucosa…CO2

(oxidación)– Oxígeno…H2O

(reducción)– 38 ATPs

• Fosforilación oxidativaen el sistema detransporte de electrones

• Oxígeno es elaceptador final deelectrones

Fisiología microbiana ymetabolismo

• Bacterias anaeróbicas– No tienen sistema de

transporte de electrones– Reducción de

compuestos a través defermentación

– 1-2 ATP/mol de hexosa– Fosforilación a nivel de

sustrato• P de compuestos

orgánicos es transferidoa nucleótidos deadenina para formarATP

Glucólisis- Flujo de carbón yfosforilación a nivel de sustrato

Embden Meyerhof pathway

fosfofructocinasa

aldolasa

Ruta EMP

• 2 ATP/mol glucosa• Bidireccional• Enzimas claves:

– Fosfofructocinasa– Aldolasa

Ruta Entner-Doudoroff

Zymomonas y Pseudomonas

1 ATP/mol glucosa1 3C para biosíntesis

Catabolismoheterofermentativo

• Leuconostoc,Lactobacillus

• Basado encatabolismo depentosas

• 1 ATP/mol hexosaRuta heterofermentativa

Catabolismohomofermentativo

Lactococcus,Pediococcus,algunosLactobacillus

Bacterias homolácticas utilizanRuta EMP para producir piruvato

Ciclo TCA• Utilizado por todos los

aeróbicos• Genera NADH2 and

FADH como sustratopara fosforilaciónoxidativa

• Genera ATP por mediode fosforilación a nivelde sustrato

• Relacionado abiosíntesis de aminoácidos

Aeróbicos: regeneración de NADy respiración

• Aeróbico– NADH2…NAD

(oxidación– O2 es el aceptador

final de e-

• Azufre y nitrito en“respiraciónanaeróbica

– Transporte de e-

…gradiente deprotones…ATP

Anaerobos: regeneración deNAD y respiración

• Anaerobos– Metabolismo fermentativo

• El aceptador final de e- es un compuestoorgánico