DNA Presentacion

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FUNDAMENTOSDEL DNA

18 Febrero 2016

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Nobel 1962

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Almacenamiento de información genética

1869 Miescher aisló una sustancia con fósforo de núcleos decélulas, que llamó nucleína

Laboratorio Hoppe-Seyler

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Principio de transformación

Streptococcus pneumoniae

Frederick Grifth

La sustancia pasa desdela bacteria muerta a laviva =FACTOR DE

TRANSFORMACIÓN

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1944

¿DNA O PROTEÍNA?

Realizaron el experimento conlas bacterias de GrifthStreptococcus pneumoniae

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Experimento para la conrmación (1952)

Alfred D. Hershey y Martha Chase

https://www.youtube.com/watch?v=inysl_ydfzQ

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Composición del DNA

Erwin Chargaff

Composición del DNA! La composición del DNA generalmente varía de una

especie a otra.! El DNA aislado de diferentes tejidos de la misma

especie tiene la misma composición de bases.! La composición de bases de DNA no cambia en un

organismo con la edad, estado nutricional o cambiode ambiente.

! En todo el DNA, el número de adenosinas, es igual ael número de timinas (A = T) y el número deguanosinas es igual al número de citosinas (C = G)

! A+G = T+C

Humanos A=30.9 T=29.1 G=19.9

C=19.8

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DNA

Polímero de deoxironucleótidosSe encuentra en cromosomas, mitocondria y

cloroplastos

BASEAZÚCAR

FOSFATO

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Los nucleosidos y bases analógas pueden tener usos como

Anticancerígenos

Su ecacia radica en que seune de forma irreversible ala enzima timidilato sintasa ,esencial para la síntesis denucleótidos de timina .

Leucemia linfoblástica aguda (LLA)

Agentes Antirretrovirales

Azidotimina

Aprobado en 1987 como un medicamento indicado para personasinfectadas con el VIH por su efecto retardador de la extensión de lainfección por VIH,

https://es.wikipedia.org/wiki/VIH

https://es.wikipedia.org/wiki/1987

https://es.wikipedia.org/wiki/Timina

https://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tidos

https://es.wikipedia.org/wiki/Timidilato_sintasa

https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima

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La secuencia del DNA siempre se sintetiza del 5` a 3´

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La estructura secundaria del DNA es unaDOBLE HÉLICE

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! 2 cadenas antiparalelas quegiran sobre el mismo eje

! Los grupos fosfato de lascadenas envuelven la periferia

! Bases ocupan el núcleo

f o r m a n d o b a s e scomplementarias A-T, G-C! Se mantiene unida por puentes

de hidrógeno

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2 puentes de hidrógeno entre A-T3 Puentes de hidrógeno entre C-G

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Apilamiento

Las bases nitrogenadas en el DNA sonplanares y tienen tendencia a apilarse

Fuerzas de apilamiento

Interacciones hidrofóbicas y fuerzas devan der Waals

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Formas estructurales del DNA

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Estructura terciaria

El DNA de doble hélice se enrolla alrededor de las histonas

El DNA se une a para formar bras llamadas nucleosomas (10 nm)

Nucleosomas contienen 146 nucleótidos

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Nucleosoma

Son unidades globulares repetidas de cromatina que consiste en un complejo histona y D

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Compactación del DNA en el cromosoma

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EN RESUMEN

! El DNA esta formado pro 4 bases A, G, T, C, que se encuentran en formaciónlineal por arreglos de enlaces fosfodiéster.

! El DNA está organizado en 2 cadenas antiparalelas por el emparejamiento delas bases A-T y G-C en cadenas complementarias. Estas cadenas forman unadoble hélice alrededor de un eje central.

! Las 3x10 9 pares de bases del DNA humano están organizadas en 23cromosomas

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REPLICACIÓN

Proceso de duplicación de la cadena de DNA(Síntesis de una nueva cadena idéntica)

Participantes

Doble hélice del DNA

DNA Polimerasa I y III

Helicasa

Topoisomerasa

SSB Primasas y ligasas

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Características generales

1. Complementariedad entre las bases del DNA

Recordemos….

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2. Proceso semiconservativo

Cada una de las dos cadenas sirven de molde para la síntesis de nuevas cadenas

3. Dirección de replicación 5´- 3´

4. Primer (cebadores)

Pequeñas unidades de RNA (20 nucleótidos)

5. Primasa

Enzima que introduce el primer

6. DNA polimerasa

Participan en la polimerización del DNA

7. Origen de Replicación

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8. Replicación Bidireccional

FRAGMENTOS DE OKASAKI

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DNA pol I DNA pol II DNA pol III

Estructura Monómero109 kD

Monómero90 kD

Multiméro900 kD

Función

Elongación,

corrección yreparación

Elongación,

corrección yreparación

Elongación,

corrección yreparación

AusenciaAfecta la

reparación delDNA

Ninguna conocida Incompatible con lavida

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PCRReacción en cadena de la DNA polimerasa

Técnica desarrollada en 1985 por Kary B. MullisPremio Nobel Química 1993

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Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la amplicación directa de un geno fragmento de DNA

Amplica millones de fragmentos pequeños de DNA hasta 10 Kb en períodos cortos

Amplicación

Detección

PCR

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FUNDAMENTOS

Mimetiza el proceso de replicación

Complementaridad

Capacidad del DNA para desnaturalizarse y renaturalizarse

PARTICIPANTES

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PARTICIPANTES

1. Molde (Template) DNA

2. Primers

3. DNA PolimerasaMicroorganismos arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth).Generalmente se emplean mezclas del polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).

4. Mg++

5. Deoxynucleótidos dNTP´s

6. Buffer

http://es.wikipedia.org/wiki/Thermus_thermophilus

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Thermococcus_litoralis&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Pyrococcus_furiosus

http://es.wikipedia.org/wiki/Thermus_aquaticus

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MOLDE O TEMPLADO

Es la molécula que contiene la región de DNA que quiere amplicar

Se requiere poca cantidad

No se requiere puro

Tiene que se libre de altas concentraciones de EDTA

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Deben ser especícos para la secuencia a amplicar

Deben tener idealmente entre 40-50% CG

Deben evitar estructuras secundarias

Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb

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Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el DNA target* Un primer compuesto por solo 3 letras, ATT, por ejemplo, tiene una alta probabilidadde encontrar complemento mas de una vez

*A medida que el cebador crece en nucleótidos, la probabilidad de que una secuencia de letras se encuentre repetida se vuelve más remota.

Por ejemplo

Características de un buen Primer

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Características de un buen Primer

Temperatura de fusión (Tm) en el intervalo de 50ºC a 65ºC

Temperatura a la cual el 50% de las cadenas seencuentran separadas

Que no formen horquillas > a 3pb

Bajo contenido de GC para evitar exceso de anidad no complementaria

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Sólo puede existiruna zona complementaria en el DNA donde el primer se una, lo cuasignica que el primer debe ser irrepetible

La composición de las bases afecta la especicidad de la hibridación así como su temperatLa composciión aleatoria de bases es lo mejor.Evitar primers con secuencias de conformación GCGCGC o ATATAA

Un contenido de G+C alrededor de 40-50% nos proporcionará una buena temperatura dealineamiento

Temperatura de hibridación

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Temperatura de hibridación

Se calcula usando la temperatura de fusión (Tm) de los primers

Thibridación = Tm_primer - 4 ºC

Si los primers son complementarios entre si, y se hibridan entre ellos en lugar del DNAmuestra, la eciencia de la PCR se verá afectada drasticamente

La temperatura de hibridación debe ser mutuamente compatible. La máxima diferencia

permisible en la temperatura de los 2 primeros es de 3ºC.

RESUMEN

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RESUMEN

ESPECIFICIDAD: Asegurar que a secuencia complementaria sea única

LONGITUD: 17-28 Bases

COMPOSICIÓN DE BASES: El contenido promedio (C+G) en el intervalo de 40-50% yregiones ricas en (A+T) y (G+C)

TM : intervalo de 55-70ºC

Minimizar la posibilidad de formación de estructuras secundarias, horquillas y dímeros

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La muestra del DNA, Taq o Pfu, el tampón, los núcleotidostrifosfato y los cebadores son vertido en tubos de paredesdelgados y estos puestos en un termociclador de PCR

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CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCGM A F P I P A R Q L F I

CATTTAACCAAGA ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATCD G E W R E P I K K N R U P V

GAC GGA GAG TGG AGA GAA CCC ATT AAA AAA AAT CGC ATA CCC GTCI N P S T E E I I G D I P A A

ATC AAT CCG TCC ACT GAA GAA ATC ATC GGT GAT ATT CCG GCA GCCT A E D V E V A V V A A R R A

ACG GCT GAA GAT GTG GAG GTT GCG GTG GTG GCA GCT CGA AGA GCCF R R N N W S A T S G A H R A

TTT AGG AGG AAC AAT TGG TCA GCA ACA TCT GGG GCT CAT CGT GCCT Y L R A I A A K I T E K K D

ACA TAC TTG CGT GCT ATT GCT GCT AAG ATA ACA GAA AAA AAA GATH F V K L E T I D S G K P F D

CAT TTC GTT AAA CTG GAA ACC ATT GAT TCT GGG AAA CCT TTT GATE A V L D I D D V A S C F E Y F

GAA GCA GTG CTG GAC ATT GAT GAC GTT GCT TCA TGT TTT GAA TAT TTTA G Q A E A L D G K Q K A P V

GCC GGA CAA GCA GAA GCT CTT GAT GGT AAA CAA AAG GCT CCA GTCT L P M E R F K S H V L R Q P

ACC CTG CCT ATG GAA AGG TTC AAA AGT CAT GTT CTC AGG CAG CCCL G V V G L I S P W N Y P L L M

CTT GGT GTT GTT GGA TTA ATA TCC CCA TGG AAT TAC CCA CTT CTA ATGA T W K I A P A L A A G C T A

GCT ACA TGG AAA ATT GCT CCA GCA CTT GCT GCT GGG TGT ACA GCTV L K P S E L A S V T C L E F

GTA CTT AAG CCA TCC GAG TTG GCA TCT GTG ACT TGT CTA GAA TTCG E V C N E V G L P P G V L N

GGT GAA GTT TGC AAC GAA GTG GGA CTT CCT CCA GGC GTG TTG AATI L T G L G P D A G A P L V S

ATC TTG ACA GGA TTA GGT CCA GAT GCT GGT GCA CCA TTA GTA TCAH P D V D K I A F T G S S A T

CAC CCC GAT GTT GAC AAG ATT GCC TTT ACT GGG AGT AGT GCC ACTG S K V M A S A A Q L V K P V

GGA AGC AAG GTT ATG GCT TCT GCT GCC CAA TTG GTT AAG CCT GTTT L E L G G K S P I V V F E D

ACA TTA GAA CTT GGG GGT AAA AGT CCT ATT GTA GTG TTT GAA GATV D I D K V V E W T I F G C F W

CTA GAA GTT GGA GCT GTT TGG GTT AAT TGC TCA CAA CCA TGC TTT GTTQ A P W G G I K R S G F G R E

CAA GCT CCT TGG GGA GGC ATC AAG CGT AGT GGT TTT GGA CGT GAAL G E W G I Q N Y L N I K Q V

CTT GGA GAA TGG GGT ATC CAG AAT TAC TTG AAT ATC AAG CAG GTGT Q D I S D E P W G W Y K S P

ACT CAA GAT ATT TCT GAT GAA CCA TGG GGA TGG TAC AAG TCT CCT

TGA

DNA POLIMERASA

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DNA POLIMERASA

Taq polimerasaComete un error por cada 10000 nucleótidos

Temperatura 72ºCNo posee actividad correctoraNecesita Mg2+ como cofactor

Mg2+ en altas concentracionesafecta la especicidad,

amplicaciones inespecícas,forma complejos con los dNTP´s

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¿CÓMO SE HACE?

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Diseño del Primer

Extracción del DNA

PCR

DETECCIÓN

¿CÓMO SE HACE?

ETAPAS

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ETAPAS

Desnaturalización Alineamiento

ExtensiónELONGACIÓN FINAL

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¿Cómo podríamos monitorear la PCR?

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Microscopiade polímero de

agarosa

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Uso de “colorantes”

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1 BROMURO DE ETIDIO

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1. BROMURO DE ETIDIOEs un agente intercalante

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Syber SafeBromuro de Etidio

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CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCG

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