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DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA DE

UNA MEZCLA DE SUSTANCIAS

Práctica 1

Universidad de GranadaFacultad de Farmacia.

Departamento de Química Física.

Objetivo de la práctica:

Determinar las concentraciones de vitamina B2 y B12

en una mezcla de ambas, utilizando un método

espectrofotométrico.

Fundamentos teóricos

Siendo:

P0= Potencia de la radiación incidente

Ps= Potencia de la radiación a la salida

b= espesor de la cubeta que contiene a

la muestra

Ps Ps / P0 = Transmitancia- log — = - log T = A = a b c A = Absorbancia (adimensional)

P0 a = absortividad molar (L . mol-1. cm-1 )c = concentración molar (moles/L)

A = - log T = - log ( T.100/100) = - log T% + 2 ; A = 2 – log T%

La ley más importante sobre la absorción de radiación electromagnética

en disoluciones, es la de Beer : A = a b c

b

P0 Ps

Determinación de a:

1.- Registro del espectro de la sustancia ( A frente a la longitud de onda, λ )

Longitud de onda λ (nm)

2.- Selección de la longitud de onda máxima ( λmax) en el espectrofotómetro

3.- Preparación de disoluciones patrón de concentraciones conocidas.

4.- Medida de la Absorbancia (A) de cada disolución de concentración conocida a la longitud de onda seleccionada ( λmax)

Concentración Absorbancia (A)C1 A1

C2 A2

C2 A3

C3 A4

C4 A5

C5 A6

5.- Representación de A (absorbancia) frente a C (concentración).

A

C

6.- Trazar la recta que mejor se ajuste

a los datos experimentales. Si pasa

por el origen se cumple la ley de Beer

y la pendiente será a.b

(absortividad . espesor de la cubeta).

y2

y1

x2x1

Nota: Para determinar la pendiente por el método gráfico, se toman dos puntos dela recta (no experimentales): (y2 ,x2) e (y1 , x1) y se plantea la siguiente expresión

12

12

xxyyPendiente

−−

=

Análisis de mezclas

Amezcla = Acomponente 1 + Acomponente 2+ Acomponente 3+ ....

1.- Se escogen tantas λmax como componentes tenga la mezcla.

A

Longitud de onda (nm)

445 nm550 nm

En nuestro caso serán dos: 445 nm (máximo de la vitamina B2) y 550 nm(máximo de la vitamina B12)

2.- Se determinan las absortividades molares de cada vitamina mediante la ley de Beer, a las 2 λmaxseleccionadas:

12445

122445

2445

12550

1212550

122550

2550

BBBBmezcla

BBBBBBmezcla

cbacbaA

cbacbacbaA

⋅⋅+⋅⋅=

⋅⋅=⋅⋅+⋅⋅=

Calculamos cB2 y cB12

Se establece el sistema de ecuaciones:

) esa a absorbe (No 0

; ; 550

2

55012

44512

4452

λ=B

BBB

a

aaa

Método experimental

Esquema de un espectrofotómetro de haz simple.

Lámpara W Rendijas

Red

Muestra

Detector

Indicador

Espectrofotómetros:

El manejo de cada uno de ellos se indica a continuación.

Spectro 23

SP-2100P+

Manejo del SP-2100P+

Encender el espectrofotómetro pulsando el botón rojo.

Seleccionar la longitud de onda mediante las flechas.El modo de medida (transmitancia o absorbancia) con el botón MODE.

ReferenciaMuestra

Abrir la tapa del portamuestras

Colocar las cubetasde la referencia y la muestra en los lugares señalados.

Entre R y S1 se encuentrael obturador (en esa posición intermedia, latransmitancia debe ser0%)

Cuando la radiación atraviesa la referencia, debemos ajustar al 100 %T.

Para ello, pulsar el botón que indica 100%T.

Tirar suavemente del mando externo

Cuando la radiación incida sobre el obturador,la transmitancia debe ser del 0 %. De no ser así,la fijaremos pulsando el botón 0%T

Si seguimos tirando del mando externo, la radiación incide sobre la muestra y podremos leer el valor de transmitancia.

Si deseamos el valor de absorbancia,pulsaremos el botón MODE

Manejo del Spectro 23

Encender el espectrofotómetro

Seleccionar Absorbance pulsando A T / C F,

Ajustar la longitud de onda mediante el mando adecuado.

Abrir la tapa del receptáculo que contiene los portacubetas.

Colocar la referencia en

el camino de la radiación.

Introducimos la muestra en el portacubetas adecuado.

Cerrar la tapa.

Pulsar en 0 de A, 100% T (corresponde a la referencia)

Cuando la referencia es atravesada por la radiación,

el valor de Absorbancia debe ser 0.000

Con la tapa cerrada y tirando del mando suavemente, la muestra queda

colocada en la trayectoria de la radiación.

Efectuar la medida de absorbancia

Método experimental

Partiremos de dos disoluciones de las vitaminas B2 y B12:

1º) Disolución madre (DM) de vitamina B2

que contiene 0’030 g disueltos en 1 L de agua

(peso molecular de la vitamina B2 = 376’4 g/mol).

2º) Disolución madre de vitamina B12

que contiene 0’150 g disueltos en 1 L de agua

(peso molecular de la vitamina B12 = 1355’4 g/mol).

Disoluciones de Vitamina B2 y B12

Células de vidrio de 1 cm de espesor Tubos de ensayo

2 Pipetas graduadas de 10 ml

Material

1.- Registrar los espectros visibles de cada una de las

disoluciones anteriores (vitamina B2 y vitamina B12) y

calcular la longitud de onda a la cual presentan el máximo

de absorción.

λmax B2 = 445 nm

λmax B12 = 550 nm

2 - Preparar 9 disoluciones de vitamina B2, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml

de la disolución madre de vitamina B2 (0,030 g/L)

completando hasta 10 ml con agua destilada.

Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B2 : 0,030 g/L

Expresada en molaridad sería: ( 0,030 g/L) / (376,4 g/mol) = 7.97 10-5 M

donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B2 .

Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal

Tubo 1 (1 mL) 1. 7,97 .10-5 = 10 . C1 C1 = 7,97 .10-6 M

Tubo 1 (2 mL) 2. 7,97 .10-5 = 10 . C2 C2 = 1,59 .10-5 M

Tubo 1 (3 mL) 3. 7,97 .10-5 = 10 . C3 C3 = 2,39 .10-5 M

Tubo 1 (4 mL) 4. 7,97 .10-5 = 10 . C4 C4 = 3,19 .10-5 M

Tubo 1 (5 mL) 5. 7,97 .10-5 = 10 . C5 C5 = 3,99 .10-5 M

Tubo 1 (6 mL) 6. 7,97 .10-5 = 10 . C6 C6 = 4,78 .10-5 M

Tubo 1 (7 mL) 7. 7,97 .10-5 = 10 . C7 C7 = 5,58 .10-5 M

Tubo 1 (8 mL) 8. 7,97 .10-5 = 10 . C8 C8 = 6,38 .10-5 M

Tubo 1 (9 mL) 9. 7,97 .10-5 = 10 . C9 C9 = 7,17 .10-5 M

Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

4.- Medir la absorbancia de cada uno de estos tubos a la longitud

de onda del máximo: 445 nm. La vitamina B2 no absorbe a 550 nm.

Vitamina B2

c (mol/L) A(λ=445 nm)7,97E-061,59E-052,39E-053,19E-053,99E-054,78E-055,58E-056,38E-057,17E-05

5.- Construir una curva de calibrado para la longitud de onda de 445 nm,

representando A (absorbancia) en ordenadas frente a concentración

en moles/L , en abscisas .

0,0000,2000,4000,6000,8001,0001,2001,4001,600

0,00E + 00 2,00E -05 4,00E -05 6,00E -05 8,00E -05

c (m o l/L )

A

6.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la

absortividad molar de la vitamina B2 , por el método gráfico y por

el método de los mínimos cuadrados, a dicha longitud de onda.

a445B2 = ……….. L. mol-1.cm-1

7.- Preparar 9 disoluciones de vitamina B12, tomando 1,2,3,4,5,6,7,8,9 ml

de la disolución madre (DM) de vitamina B12 (0,150 g/l)

completando hasta 10 ml con agua destilada.

Concentración de la disolución madre (DM) de vitamina B12 : 0,150 g/L

Expresada en molaridad sería: ( 0,150 g/L) / (1355,4 g/mol) = 1,107 10-4 M

donde 376,4 g/mol es el peso molecular de la vitamina B12 .

Concentración en cada tubo: VDM . CDM = VFinal . CFinal

Tubo 1 (1 mL) 1. 1,107 .10-4 = 10 . C1 C1 = 1,11 .10-5 M

Tubo 1 (2 mL) 2. 1,107 .10-4 = 10 . C2 C2 = 2,21 .10-5 M

Tubo 1 (3 mL) 3. 1,107 .10-4 = 10 . C3 C3 = 3,32 .10-5 M

Tubo 1 (4 mL) 4. 1,107 .10-4 = 10 . C4 C4 = 4,43 .10-5 M

Tubo 1 (5 mL) 5. 1,107 .10-4 = 10 . C5 C5 = 5,54 .10-5 M

Tubo 1 (6 mL) 6. 1,107 .10-4 = 10 . C6 C6 = 6,64 .10-5 M

Tubo 1 (7 mL) 7. 1,107 .10-4 = 10 . C7 C7 = 7,75 .10-5 M

Tubo 1 (8 mL) 8. 1,107 .10-4 = 10 . C8 C8 = 8,86 .10-5 M

Tubo 1 (9 mL) 9. 1,107 .10-4 = 10 . C9 C9 = 9,96 .10-5 M

Es decir, basta multiplicar la concentración del tubo 1 por: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

Vitamina B12

c (mol/L) A(λ=445 nm) A(λ = 550 nm)1,11 .10-5

2,21 .10-5

3,32 .10-5

4,43 .10-5

5,54 .10-5

6,64 .10-5

7,75 .10-5

8,86 .10-5

9,96 .10-5

8.- Mediremos las absorbancias a 445 y 550 nm de las disoluciones de B12.

9.- Construir las curvas de calibrado para la longitudes de onda de

445 y 550 nm, representando A (absorbancia) en ordenadas frente a

concentración en moles/L , en abscisas .

VitaminaB12

10.- Comprobar el cumplimiento de la Ley de Beer y calcular la

absortividad molar de la vitamina B12 , por el método gráfico y por

el método de los mínimos cuadrados, a las dos longitudes de onda

(445 y 550 nm).

a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1

a445B12 = ……….. L. mol-1.cm-1

Mezclar x ml de vitamina B2 con y ml de vitamina B12 .

Medir la absorbancia de la mezcla a las longitudes de onda

de 445 nm y 550 nm.

Plantear el sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, indicado

en los fundamentos teóricos.

Calcular las concentraciones de ambas vitaminas en la mezcla problema.

Valoración simultánea de una mezcla de vitaminas B2 y B12