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DADAÑÑO INDUCIDO POR LA RADIACIO INDUCIDO POR LA RADIACIÓÓN N

ULTRAVIOLETA EN LOS TEJIDOS ULTRAVIOLETA EN LOS TEJIDOS

OCULARES: OCULARES: VALORACIVALORACIÓÓN IN VITRON IN VITROMargarita Ronquillo

Eva Romero, Carolina Lema, Isabel Jiménez

1

FOTOTOXICIDAD OCULARFOTOTOXICIDAD OCULAR

2

FotoqueratitisPinguécula Pterigium

Cataratas

DMAE

Afecta a las membranas, función mitocondrial, ADN, induce apoptosis celular.

3

In vitro ultravioletIn vitro ultraviolet––induced damage in induced damage in human corneal, lens, and human corneal, lens, and retinal pigment retinal pigment

epithelial cellsepithelial cellsAutores:

Hyun-Yi Youn, David J. McCanna, Jacob G. Sivak,

Lyndon W. Jones

Publicación:Molecular Vision 2011; 17:237-246

Afiliación:School of Optometry,

University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada

Objetivo: Evaluar el daño de la radiación UV en células oculares in vitro y determinar el efecto protector de filtros

UV. Aplicación en biomateriales oftalmológicos

METODOLOGMETODOLOGÍÍAA

4

EMISOR

Irradiancia: 2.76W/m2

Tubos fluorescentes irradiando 3,9 W/m2 a

37ºC, emitiendo de 290 a 370 nm.

Filtros de protección UV

Julio 1999, Waterloo

RECEPTOR

5

RETINACélulas EPR: ARPE-19

CRISTALINOCélulas epitelio: HLEC

CORNEACélulas epitelio: HCEC

Células epiteliales↓

Incubación de las muestras en ambiente

humidificado a 37º

Laboratorios: American Type Culture Collection (#CRL-11421 and #CRL-2302), y RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan (#RCB 2280).

DISEÑOEXPERIMENTA

LExposición luminosa a 30cm, con y sin filtros de protección UV

Tiempos de exposición:1min, 5min, 30min y 1 hora

La preparación de las muestras se hizo en fases:

6

1. Incubación previa de las células durante 24h2. Exposición a la radiación con y sin filtros UV 3. Nueva incubación 24h tinción específica 4. Microscopia confocal láser / lector de

fluorescencia

1 min – 0.0234J/cm25 min – 0.117J/cm230 min – 0.702J/cm260 min -1.407J/cm2

DISEÑOEXPERIMENTA

L

Alamar blue (viabilidad celular, citoplasma)

Hoechst 33342 (núcleo)Rodamina 123 (mitocondria)Anexin V (actividad apoptótica)

7

Alexa Fluor 647 Calcein AM

Etidium Homodímero-1

Test morfología celular

ENSAYOS Y MARCADORES BIOLÓGICOS

CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CORNEALCORNEAL

8Afectación celular dependiente del tiempo

de exposición y del tipo de filtro UV

Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m

FILTRO 320nm FILTRO 400nmSIN FILTRO

↓48%

↓15%

↓79%

↓20%↓31%

CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CORNEALCORNEAL

9

Rodamina 123

Hoechst 3342

Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)

Anexin VTest citotoxicidad

vida/muerte

CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min

5 minutos

Muerte por fototoxicidadMuerte natural

Células vivas

CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CRISTALINOCRISTALINO

10Afectación celular dependiente del tiempo de exposición y del tipo de filtro UV

Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m

SIN FILTRO FILTRO 320nm FILTRO 400nm

↓34%

↓80%↓90%

↓15%↓34%

↓62%

CÉLULAS DEL EPITELIO CRISTALINOCRISTALINO

11

CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min

5 minutos

Rodamina 123

Hoechst 3342

Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)

Anexin VTest citotoxicidad

vida/muerte

Muerte por fototoxicidadMuerte natural

Células vivas

CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO PIGMENTARIO DE RETINAPIGMENTARIO DE RETINA

12

Afectación celular dependiente del tiempo de exposición y del tipo de filtro UV

SIN FILTRO FILTRO 320nm FILTRO 400nm

Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m

↓47%↓61%

↓20%↓52%

CCÉÉLULAS DEL EP PIGMENTARIO LULAS DEL EP PIGMENTARIO RETINARETINA

13

CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min

5 minutos

Rodamina 123

Hoechst 3342

Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)

Muerte por fototoxicidadMuerte natural

Células vivas

Anexin VTest citotoxicidad

vida/muerte

RESULTADOSRESULTADOS

Comparando tiempos de exposición:1minuto alteración mitocondrial y de los núcleos celulares.60 minutos degradación de mitocondrias y núcleos celulares.

14

Comparando tipos celularesMenor supervivencia de células del cristalinoMayor degradación de núcleos y mitocondrias en las cel. del EPR

Comparando el uso de filtros protectores:LPF 400 mayor viabilidad a cualquier tiempo de exposiciónLPF 320 mayor daño PERO NO EN LOS NUCLEOS

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

La radiación ultravioleta afecta a la viabilidad celular, la función

mitocondrial, el daño en el ADN y la actividad apoptótica de células del epitelio corneal, cristalino y retina.

El filtrado de las radiaciones ultravioleta evita el daño

fototóxico. 15

16

Grupo de Neuro-Computación y Neuro-Robótica

Margarita Ronquilloc.o.chapi7@hotmail.com