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DADAÑÑO INDUCIDO POR LA RADIACIO INDUCIDO POR LA RADIACIÓÓN N
ULTRAVIOLETA EN LOS TEJIDOS ULTRAVIOLETA EN LOS TEJIDOS
OCULARES: OCULARES: VALORACIVALORACIÓÓN IN VITRON IN VITROMargarita Ronquillo
Eva Romero, Carolina Lema, Isabel Jiménez
1
FOTOTOXICIDAD OCULARFOTOTOXICIDAD OCULAR
2
FotoqueratitisPinguécula Pterigium
Cataratas
DMAE
Afecta a las membranas, función mitocondrial, ADN, induce apoptosis celular.
3
In vitro ultravioletIn vitro ultraviolet––induced damage in induced damage in human corneal, lens, and human corneal, lens, and retinal pigment retinal pigment
epithelial cellsepithelial cellsAutores:
Hyun-Yi Youn, David J. McCanna, Jacob G. Sivak,
Lyndon W. Jones
Publicación:Molecular Vision 2011; 17:237-246
Afiliación:School of Optometry,
University of Waterloo, Waterloo, Ontario, Canada
Objetivo: Evaluar el daño de la radiación UV en células oculares in vitro y determinar el efecto protector de filtros
UV. Aplicación en biomateriales oftalmológicos
METODOLOGMETODOLOGÍÍAA
4
EMISOR
Irradiancia: 2.76W/m2
Tubos fluorescentes irradiando 3,9 W/m2 a
37ºC, emitiendo de 290 a 370 nm.
Filtros de protección UV
Julio 1999, Waterloo
RECEPTOR
5
RETINACélulas EPR: ARPE-19
CRISTALINOCélulas epitelio: HLEC
CORNEACélulas epitelio: HCEC
Células epiteliales↓
Incubación de las muestras en ambiente
humidificado a 37º
Laboratorios: American Type Culture Collection (#CRL-11421 and #CRL-2302), y RIKEN BioResource Center, Tsukuba, Japan (#RCB 2280).
DISEÑOEXPERIMENTA
LExposición luminosa a 30cm, con y sin filtros de protección UV
Tiempos de exposición:1min, 5min, 30min y 1 hora
La preparación de las muestras se hizo en fases:
6
1. Incubación previa de las células durante 24h2. Exposición a la radiación con y sin filtros UV 3. Nueva incubación 24h tinción específica 4. Microscopia confocal láser / lector de
fluorescencia
1 min – 0.0234J/cm25 min – 0.117J/cm230 min – 0.702J/cm260 min -1.407J/cm2
DISEÑOEXPERIMENTA
L
Alamar blue (viabilidad celular, citoplasma)
Hoechst 33342 (núcleo)Rodamina 123 (mitocondria)Anexin V (actividad apoptótica)
7
Alexa Fluor 647 Calcein AM
Etidium Homodímero-1
Test morfología celular
ENSAYOS Y MARCADORES BIOLÓGICOS
CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CORNEALCORNEAL
8Afectación celular dependiente del tiempo
de exposición y del tipo de filtro UV
Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m
FILTRO 320nm FILTRO 400nmSIN FILTRO
↓48%
↓15%
↓79%
↓20%↓31%
CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CORNEALCORNEAL
9
Rodamina 123
Hoechst 3342
Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)
Anexin VTest citotoxicidad
vida/muerte
CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min
5 minutos
Muerte por fototoxicidadMuerte natural
Células vivas
CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO CRISTALINOCRISTALINO
10Afectación celular dependiente del tiempo de exposición y del tipo de filtro UV
Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m
SIN FILTRO FILTRO 320nm FILTRO 400nm
↓34%
↓80%↓90%
↓15%↓34%
↓62%
CÉLULAS DEL EPITELIO CRISTALINOCRISTALINO
11
CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min
5 minutos
Rodamina 123
Hoechst 3342
Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)
Anexin VTest citotoxicidad
vida/muerte
Muerte por fototoxicidadMuerte natural
Células vivas
CCÉÉLULAS DEL EPITELIO LULAS DEL EPITELIO PIGMENTARIO DE RETINAPIGMENTARIO DE RETINA
12
Afectación celular dependiente del tiempo de exposición y del tipo de filtro UV
SIN FILTRO FILTRO 320nm FILTRO 400nm
Control 1m 30m 60m 1m 30m 60m 1m 30m 60m
↓47%↓61%
↓20%↓52%
CCÉÉLULAS DEL EP PIGMENTARIO LULAS DEL EP PIGMENTARIO RETINARETINA
13
CONTROL 5min- Sin filtro Sin filtro LPF320 LPF400 60 min
5 minutos
Rodamina 123
Hoechst 3342
Mitocondrias (rojo)Mitocondrias (rojo)ADN (azul)ADN (azul)
Muerte por fototoxicidadMuerte natural
Células vivas
Anexin VTest citotoxicidad
vida/muerte
RESULTADOSRESULTADOS
Comparando tiempos de exposición:1minuto alteración mitocondrial y de los núcleos celulares.60 minutos degradación de mitocondrias y núcleos celulares.
14
Comparando tipos celularesMenor supervivencia de células del cristalinoMayor degradación de núcleos y mitocondrias en las cel. del EPR
Comparando el uso de filtros protectores:LPF 400 mayor viabilidad a cualquier tiempo de exposiciónLPF 320 mayor daño PERO NO EN LOS NUCLEOS
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
La radiación ultravioleta afecta a la viabilidad celular, la función
mitocondrial, el daño en el ADN y la actividad apoptótica de células del epitelio corneal, cristalino y retina.
El filtrado de las radiaciones ultravioleta evita el daño
fototóxico. 15
