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Cromatografía de Líquidos

Elba Rojas Escudero

ERE

¿¿¿ Ab o Ad ???

Temario• Fundamentos

– Definiciones básicas

– Aspectos teóricos

• Instrumentación– Elementos básicos

– Columnas

– Inyectores

– Detectores y sistemas acoplados

• Análisis – cualitativo y cuantitativo

Cromatografía de líquidos

• Método físico de separación

• La muestra se distribuye entre dos fases

– Fase estacionaria: sólido o líquido

– Fase móvil: líquido o mezcla de líquidos

Elución• La muestra se aplica al principio de la

columna como una banda fina

• El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos

• Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase móvil

• Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna

Gas Líquido

Columna Plano

CLS CLL CFE CII CE

CPG CFG

CCF CP

Cromatografía

Tipos de CL• PM < 2000

• Cromatografía de intercambio iónico• Adsorción: líquido-sólido• Partición: líquido-líquido

– Cromatografia en fase normal– Cromatografia en fase inversa

• PM > 2000

• Cromatografia de exclusión por tamaño

Requisitos de la muestra

• Soluble en la fase móvil

• “Limpia”

• No debe reaccionar con ningún componente del sistema cromatográfico

HPLC ideal para muestras con:

• Presión de vapor baja

• Compuestos iónicos

• Compuestos de peso molecular elevado

• Compuestos Termolábiles

Instrumentación

Fase móvil Bomba de alta presión

Inyector

Columna

Detector

Muestra

Control de temperatura

Gradientede elución

Registrador

Fase móvil

• Disolventes grado cromatográfico

• Agua de 18 mΩ• Baja viscosidad

• No vólatil

• Miscibilidad

• Filtrada

• Sin oxígeno disuelto (degasificada)

Fase móvil

• Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)

H = f (v)

Cromatografía

FMFE

Inyector Detector

Proceso Cromatográfico

• La fase móvil fluye, arrastrando consigo los solutos

• Los solutos se reparten entre ambas fases

MuestraFase estacionaria Fase móvil

Cromatografía de líquidos

• Se realiza en columna

• Separación por adsorción y partición

• Diversidad de técnicas en función de la muestra

• Análisis cualitativo y cuantitativo

• Separaciones analíticas y preparativas

• Análisis de mezclas “relativamente” complejas

Fase estacionaria (columna)

• Tubo de acero inoxidable

• Dimensiones

– Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm

– Diámetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm

– Tamaño de partícula: 3, 5, 10 µm

– Forma de la partícula: irregular o esférica

Dimensiones de la columna

L

di

dp

Fase estacionaria (columna)

• Empaque

– Sílica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polímeros

• Carga de Carbón 5-20 % w/w

• Intervalo de pH = f (FE)

• Límite de presión de trabajo

• Compatible con la fase móvil

Fase estacionaria

Soportes de la FE

Permeación o exclusión

Cuidados de la columna

• Instalación

• Introducción de muestras “limpias”

• Contaminación por fase móvil o muestra

• Almacenarla y guardarla de forma adecuada

• Lavarla después de utilizarla condisoluciones reguladoras de pH

Precauciones

• No exceder la presión de trabajo

• Cambios bruscos de presión

• Intervalo de pH adecuado

• No utilizar H+ y OH- concentrados

• Filtrar la muestra y la fase móvil

• w de la muestra=f (dimensiones de la columna)

Cromatografía

• Fase Normal

– FE polar

– FM No-polar

• Fase Inversa

– FE No-polar

– FM polar

Cromatografía de fase inversa

• FE

– Sílica químicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl

• FM

– Mezclas: agua/disolventes orgánicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

Cromatografía de fase inversa

• Efecto solvofóbico fuerte:– Parte apolar de la molécula del soluto es mayor

– % C en la FE es mayor

– Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

Fases estacionarias

• Fases impregnadas– Cubren uniformemente el soporte

– Insolubles en la FM

– Compatibles con el detector

– El flujo de la FM no debe ser elevado

NO son Estables

Fases estacionarias

• Fases químicamente unidas (“Bonded phases”)– Unidas al soporte por enlaces covalentes

– Mayor eficiencia que las Fases impregnadas

– Costo elevado

– Son estables

Cromatografía de fase inversa

• Ventajas– Reproducibilidad en las separaciones

– Estabilidad de la FE (pH ≤ 7)

– Mezclas: acuosos/orgánicos H2O +(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

Polaridad

Polaridad

Detectores

• Indice de refracción

• Ultravioleta-Visible

• Fluorescencia

• Electroquímico

• Radioactividad

• Infrarrojo

• Espectrómetro de masas

Instrumentación

Fase móvil Bomba de alta presión

Inyector

Columna

Detector

Muestra

Control de temperatura

Gradientede elución

Registrador

Elución

Problema general de la elución

Gradiente de elución

Gradiente de elución

Elución con alta presión

Elución

Equipo con gradiente de elución

Proceso Cromatográfico

• El lecho cromatográfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna)

• La fase móvil fluye a lo largo del lecho cromatográfico en contacto con la fase estacionaria

Proceso Cromatográfico

• Las móleculas de soluto en fase estacionaria se estancan

• Las móleculas en fase móvil avanzan con ella

Mm

M

M

m m

mm

Proceso Cromatográfico

• La velocidad del soluto varía inversamente con la afinidad por la fase estacionaria

Separación de los solutos

• Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarán

Mm

M

M

MM

M

M

m

m

m

Separación de los solutos

H = f (v)

Ensanchamiento de banda

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FE

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FM“movimiento”

Ensanchamiento de la banda

Transferencia de masa en la FM“estancada”

H= f (ensanchamiento de la banda)

HL = 2γ DM / v HS = 2k´

1+k´

2vta

HF = 2λdp HD = Ωvdp2 / DM

HM = HF + HD

HSM = (1- θ + k´)2 dp2v

30(1-θ)(1+k´)2γDM

H = f (ensanchamiento de la banda)

H = HL + HS + HM + HSM

H = HS + HM + HSM

H = L / N

Ventajas

• Análisis de compuestos iónicos, de alto peso molecular

• Diversidad de columnas y detectores

• Formación de derivados pre-columna y post-columna

• Separaciones con control de pH

• Separaciones preparativas

Limitantes

• Muestras “relativamente” limpias

• Solubilidad de la muestra en la fase móvil

• Viscosidad de la fase móvil

• Dimensiones de la columna

• Presión de trabajo

• Intervalo de pH

• Utilizar un filtro (pre-columna)

Cromatografía de Líquidos

Formación de derivados

ERE

Derivados

• Fuera de línea

• En línea

• Pre-columna

• Post-columna

Equipo para la formación de derivados

FMFE

Inyector Reactor Detector

FMFE

Inyector Reactor Detector

Derivados

Derivados

Cromatografía de Líquidos

Aplicaciones

ERE

CCF - CLAE

FE = f (diámetro interno)

Diferente λ

Cambio de λ

Aplicación

Aminas

Aplicación

Fluorescencia

Polar - No polar

¿¿¿ Qué sucedió ???

Sensibilidad

Sensibilidad

Peso molecular

Propiedades = f (PM)

Oligosacáridos

Oligoglucosa

Ejemplos

Campo Mezclas típicasFármacos Antibióticos, sedantes,

esteroides, analgésicosBioquímica Aminácidos, proteínas,

carbohidratos, lípidosAlimentos Edulcorantes, antioxidantes,

aflatoxinas, aditivosContaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB,

fenolesQuímicaforense

Drogas, venenos, alcohol ensangre, narcóticos