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©2011 Waters Corporation 1
Columnas ACQUITY UPLC - Desarrollos recientes
24 de Enero 2012
MADRID
©2011 Waters Corporation 2
Agenda
Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
©2011 Waters Corporation 3
Columnas Waters
Styragel®
µBondapak™
DeltaPak®
1964 1979 1973
1992
Symmetry®
Spherisorb®
Atlantis ®
Symmetry® 300
XTerra®
XTerraPrep®
1998
Nova-Pak®
ProteinPakTM
Pico-TagTM
SymmetryShield®
1984
1986
2002
1999 1994 2003
Atlantis ® HILIC Silica Prep OBD™
Intelligent SpeedTM
BioSuite™ NanoEase™
2004
ACQUITY UPLC® BEH SunFire™ Columns
PrepPak®
1976
1958
Atlantis® T3
ACQUITY UPLC® HSS T3 AccQTagTM Ultra
2006
2005
XBridge™
2007
ACQUITY UPLC ® HSS C18 and HSS C18 SB
2008
XBridge™ HILIC
2009
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan
XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns
2010
ACQUITY UPLC® BEH200 SEC XSelect CSH HPLC columns
ACQUITY CSH Columns Viridis SFC Columns
ProteinPak High Rs IEX
AccQTagTM
2011
ACQUITY UPLC® HSS Cyano/PFP columns
XSelectTM HSS
Cyano/PFP columns
2.5 µm XP columns
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Launch Date
3 Partículas base y 14 Químicas ACQUITY UPLC, XBridge, XSelect
Jan 2008
Tipo Ligando Tamaños Partícula
Densidad Ligando
Carga Carbono
Endcapping Rango pH
Trifuncional C18 1.7,2.5,3.5,5,10 3.1 µmol/m2 18% Proprietary 1-12
Trifuncional C8 1.7,2.5,3.5,5,10 3.2 µmol/m2 13% Proprietary 1-12
Monofuncional Grupo Polar Embebido
1.7, 2.5, 3.5, 5 3.3 µmol/m2 17% TMS 2-11
Trifuncional C6 Fenilo 1.7,2.5,3.5,5,10 3.0 µmol/m2 15% Proprietary 1-12
Unbonded 1.7, 2.5, 3.5, 5 --- --- --- 1-8
Trifuncional Amide 1.7, 2.5, 3.5, 5 7.5 µmol/m2 12% None 2-11
Trifuncional C18 1.8, 2.5, 3.5, 5 1.6 µmol/m2 11% Proprietary 2-8
Trifuncional C18 1.8, 2.5, 3.5, 5 3.2 µmol/m2 15% Proprietary 1-8
Trifuncional C18 1.8, 2.5, 3.5, 5 1.6 µmol/m2 8% None 2-8
Trifuncional Propilfluorofenil 1.8, 2.5, 3.5, 5 3.3 µmol/m2 7.5% None 2-8
Monofuncional Diisopropil Ciano 1.8, 2.5, 3.5, 5 2.0 µmol/m2
5.5%
None
2-8
Trifuncional C18 1.7, 2.5, 3.5, 5 2.3 µmol/m2 15% Proprietary 1-11
Trifuncional Propilfluorofenil 1.7, 2.5, 3.5, 5 2.3 µmol/m2 10% None 1-8
Trifuncional C6 Fenil 1.7, 2.5, 3.5, 5 2.3 µmol/m2 14% Proprietary 1-11
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La más amplia oferta en columnas UPLC
Tres partículas base [BEH 130Å y 300Å, HSS y CSH]
Todas disponibles en tamaños de partícula HPLC y UPLC
Contrastadas soluciones para aplicaciones específicas Aminoácidos, Oligonucleótidos, Péptidos, Proteínas, Glicanos
AAA, OST, PST, PrST (BEH300 C4) y Glicanos
Escalabilidad con las columnas XBridge, XSelect CSH y XSelect HSS de HPLC
Dimensiones disponibles Diámetro (1.0 mm, 2.1 mm, 3.0 mm)
Longitud (30 mm, 50 mm, 75 mm, 100 mm, 150 mm)
Tecnología eCord
Precolumnas VanGuard (<2 um únicos en el mercado)
Las primeras y únicas precolumnas desarrolladas para trabajar en rutina a presiones de hasta 15.000 psi (1.000 bar)
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Agenda
Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
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¿Qué opciones existen para mejorar la retención de compuestos polares?
Probar HILIC
Analitos Polares – Límitaciones en la Aproximación por Fase Reversa
Inferior sensibilidad en la detección por MS — Los analitos se retienen en un elevado contenido acuoso en la fase
móvil
— Más difícil desolvatar fases móviles acuosas en MS
Retención inadecuada si el analito está cargado — Los analitos con elevado pKa se retendrán menos en las fases
móviles habituales a pH ácido
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¿Qué es HILIC?
HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography
Retención de compuestos altamente polares no retenidos por fase reversa
— Menor interferencia de componentes de la matriz
Selectividad complementaria a la fase reversa — Los pesticidas polares se retienen más que las interferencias
hidrofóbicas Sensibilidad superior en MS
— Fases móviles con elevado contenido orgánico (> 80% ACN) favorece la respuesta ESI-MS
— Inyección directa de extractos altamente orgánicos sin dilución — Facilita el uso de pequeños volúmenes de muestra
Elevado procesamiento de muestras
— Inyección directa de extractos de elevado contenido orgáncio que provienen de PPT, LLE o SPE sin necesidad de diluir o bien
evaporar y reconstituir
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Columnas Acquity BEH [Ethylene Bridged Hybrid]: Químicas HILIC
1.7 µm
UPLC
HPLC
2.5, 3.5, 5 & 10 µm
BEH HILIC — Partícula híbrida puente etileno sin funcionalizar
— Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 2.5, 3.5 y 5 µm [Columnas HPLC
XBridge]
— Rango pH: 1 – 9; Límite temp.: 45°C
— Excepcional forma de pico y retención para analitos básicos polares
BEH Amida — Selectividad alternativa para separaciones HILIC
— Tamaño de partícula: 1.7 µm [UPLC]; 3.5 µm [Columnas HPLC XBridge]
— Rango pH: 2 – 11; Límite temp.: 90°C
— Diseñada para la retención de analitos polares ácidos, neutros y básicos
— Columna ideal para carbohidratos/azúcares y glicanos
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Análisis azúcares en columna 1.7µm BEH Amida
1) Fructose, 2) Glucose, 3) Sucrose, 4) Maltose, 5) Lactose
ACQUITY ELSD – 0.29mL/min, T= 35°C Elución isocrática 0.2%TEA en 75% ACN
Minutes 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Patrón azúcares (1mg/mL)
1
Extracto mermelada arándanos (5mg/mL)
2
3
4
5
1
2
4
P-T
olu
am
ide
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Agenda
Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
©2011 Waters Corporation 12
Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH: 2005
ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl
ACQUITY BEH C18 XBridge C18
ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18
ACQUITY BEH C8 XBridge C8
©2011 Waters Corporation 13
Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, HSS: 2008
ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl
ACQUITY BEH C18 XBridge C18
ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18
ACQUITY BEH C8 XBridge C8
ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB
ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18
ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3
©2011 Waters Corporation 14
Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2010
ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl
ACQUITY BEH C18 XBridge C18
ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18
ACQUITY BEH C8 XBridge C8
ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB
ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18
ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3
ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C18
ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl
ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl XSelect CSH Fluoro-Phenyl
©2011 Waters Corporation 15
Ever-Growing Selectivity Range XBridge/BEH, XSelect CSH & HSS: 2011
ACQUITY BEH Phenyl XBridge Phenyl
ACQUITY BEH C18 XBridge C18
ACQUITY BEH Shield RP18 XBridge Shield RP18
ACQUITY BEH C8 XBridge C8
ACQUITY HSS C18 SB XSelect HSS C18 SB
ACQUITY HSS C18 XSelect HSS C18
ACQUITY HSS T3 XSelect HSS T3
ACQUITY CSH C18 XSelect CSH C18
ACQUITY CSH Phenyl-Hexyl XSelect CSH Phenyl-Hexyl
ACQUITY CSH Fluoro-Phenyl Xselect CSH Fluoro-Phenyl
ACQUITY HSS CN XSelect HSS CN
ACQUITY HSS PFP XSelect HSS PFP
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Nuevos Rellenos XSelect/ACQUITY UPLC
HSS PFP —Selectividad excepcional para
isómeros posicionales, compuestos halogenados y compuestos polares
HSS Ciano —Estable, compatible con RP & NP,
química CN reproducible
—Baja hidrofobicidad y selectividad única comparada con ligando C18
©2011 Waters Corporation 17 Minutes 0.0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00
Condiciones : Columns: 2.1 x 50 mm Mobile Phase A: 0.1% CF3COOH in H2O Mobile Phase B: 0.08% CF3COOH in ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Gradient: Time Profile Curve (min) %A %B 0.0 92 8 6 0.1 92 8 6 4.45 50 50 7 4.86 10 90 6 5.0 92 8 6 6.0 92 8 6 Injection Volume: 1.0 µL Sample Diluent: 50:50 H2O: MeOH with 0.05% CF3COOH Sample Conc.: 100 µg/mL Temperature: 40 oC Detection: UV @ 330 nm Sampling rate: 40 pts/sec Time Constant: 0.1 Instrument: Waters ACQUITY UPLC®, with ACQUITY UPLC® TUV
Compuestos Ácidos 1. Caftaric acid 2. Chlorogenic acid 3. Cynarin 4. Echinacoside 5. Cichoric acid
UPLC® Gama Selectividad Derivados Ácido Caféico
HSS PFP
1
2
3
4
5
4
1
2
3
CSH Fluoro-Fenil 5
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Agenda
Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
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Nuevas Columnas 2.5 um XP eXtended Performance [XP]
Empaquetadas en hardware de baja dispersión – hardware UPLC
Diseñadas para trabajar hasta presiones de 18000psi
Compatibles con tecnología HPLC, UHPLC & UPLC
Configuraciones disponibles:
— Diámetros: 2.1 mm / 3.0 mm /4.6 mm
— Longitudes: 30 mm / 50 mm / 75 mm / 100 mm
— 14 Fases Estacionarias
Empaquetadas con partículas XBridge [BEH], XSelect [CSH&HSS] de 2.5 um con los siguientes ligandos: — BEH C18, Shield RP18, C8, HILIC & Amide
— CSH C18, CSH Fenil-Hexil, CSH Fluoro-Fenil
— HSS C18, T3, C18 SB, Ciano & PFP
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Impacto de la Dispersión del Instrumento en el Rendimiento de la Columna
Instrumento UPLC de Ultra-baja dispersión
mejora el rendimiento de la columna, incluso con diámetros de 4.6 mm
A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido
fórmico Caudal: 1.4 mL/min
Mezcla NSAID (50-100 ug/mL) Detección UV a 270 nm
Gradiente (2.5µm): 35%B mantenido durante 2.37 min, rampa al 65%B en 9.05 min, mantenido durante 0.41
min, re-acondicionamiento al 35%B.
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
Alliance 2695 HPLC XSelect CSH C18 XP
4.6 x 75 mm, 2.5 µm
AU
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
Minutes 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
ACQUITY UPLC H-Class XSelect CSH C18 XP
4.6 x 75 mm, 2.5 µm
Tolm
etin
Nap
roxe
n
Feno
prof
en
Indo
met
haci
n
Dic
lofe
nac
15% disminución anchura pico
30% aumento altura pico
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Resolución, Throughput y Sensibilidad: Comparación entre Columnas 2.5 µm XP y 1.7 µm UPLC
Columna 1.7 µm ACQUITY UPLC ofrece
2X mayor velocidad y 20% mayor sensibilidad
comparado con columnas 2.5 µm XP mientras se
mantiene la selectividad
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
XSelect CSH C18 XP 2.1 x 75 mm, 2.5 µm
Caudal: 0.54 mL/min
A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido
fórmico Mezcla NSAID (50-100 ug/mL)
Detección UV a 270 nm
Gradient e(2.5µm): 35%B al 65%B en 4.85 min, mantenido durante 0.66
min, re-acondicionamiento al 35%B.
Gradiente (1.7µm): 35%B al 65%B en 2.20 min, mantenido durante 0.3
min, re-acondicionamiento al 35%B.
Las 2 columnas se usaron en un sistema ACQUITY UPLC H-Class
ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm
Caudal: 0.8 mL/min
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00
Tolm
etin
Nap
roxe
n
Feno
prof
en
Indo
met
haci
n Dic
lofe
nac
©2011 Waters Corporation 22
Impacto del Tamaño de Partícula en el Rendimiento de la Columna
Columna 1.7 µm ACQUITY UPLC ofrece
15% aumento en Resolución Rs y
Capacidad de picos Pc 20% mayor sensibilidad comparado con columna
2.5 µm XP
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
XSelect CSH C18 XP 2.1 x 75 mm, 2.5 µm
Caudal = 0.54 mL/min
Presión = 5,300 PSI Peak Capacity = 34
AU
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00
ACQUITY UPLC CSH C18 2.1 x 75 mm, 1.7 µm
Caudal = 0.54 mL/min
Presión = 9,200 PSI Peak Capacity = 40
Tolm
etin
Nap
roxe
n
Feno
prof
en
Indo
met
haci
n
Dic
lofe
nac Rs = 5.5
Rs = 6.3
15% aumento en Rs y Pc
20% mayor sensibilidad
40% menor presión
A: agua con 0.1% ácido fórmico B: acetonitrilo con 0.1% ácido
fórmico Mezcla NSAID (50-100 ug/mL)
Detección UV a 270 nm
Gradient e(2.5µm): 35%B al 65%B en 4.85 min, mantenido durante 0.66
min, re-acondicionamiento al 35%B.
Gradiente (1.7µm): 35%B al 65%B en 2.20 min, mantenido durante 0.3
min, re-acondicionamiento al 35%B.
Las 2 columnas se usaron en un sistema ACQUITY UPLC H-Class
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Agenda
Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
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Allowable Adjustments in Chromatography <621>
Variable Allowable Changes
Before Stimuli Article PF 35(6) After Stimuli Article PF 35(6) Particle Size -50% Any allowed as long as column length to
particle size (l/dp) is maintained (±25%) Column Length ±70% Flow Rate ±50% Adjust for length, particle size and column ID Column ID Any allowed Any allowed
Injection Volume Any reduction Any allowed Column Temperature ±10% ±10%
Mobile Phase pH ±0.2 unit ±0.2 unit
When Stimuli Article PF 35(6) [Nov-Dec 2009] Officially Becomes Part of Chromatography <621>, Analysts Will Have More
Flexibility to Utilize Modern Chromatographic Techniques Such as UPLC Technology
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Columnas ACQUITY UPLC
HILIC
Nuevos Rellenos en Fase Reversa — HSS CN
— HSS PFP
Nuevas columnas 2.5 um eXtended Performance [XP]
Cambios en la Farmacopea - USP General Chapter <621>
Herramientas disponibles on line
©2011 Waters Corporation 26
Herramientas disponibles on line: Waters
©2011 Waters Corporation 27
Herramientas disponibles: Waters Vial Selector
©2011 Waters Corporation 28
Herramientas disponibles: Waters Columns Selectivity Chart
©2011 Waters Corporation 29
Herramientas disponibles: Waters Columns Selectivity Chart
©2011 Waters Corporation 30
Waters THE SCIENCE OF WHAT’S POSSIBLE.TM
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