clase identificación
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Microbiologa General
Aislamiento e identificacin de
Microorganismos
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Para qu aislar microorganismos?
Para qu identificar un microorganismo ?
Caracterizacin vs. Identificacin
1. Pruebas bioqumicas Identificacin presuntiva
2. Pruebas Moleculares Identificacin final
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Aislamiento e identificacin de microorganismos
Procedencia Caractersticas Expectativas
Mtodos convencionales Mtodos moleculares
Tratamiento inicial
Siembra Aislamiento Identificacin
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Tratamiento inicial
Siembra
Enriquecimiento (selectivo o no)
Calentamiento Filtracin Homogeneizacin, etc
Seleccin de medios de cultivo Inculo Observacin microscpica
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Agotamiento por estras, diluciones seriadas, etc
Subcultivo
Aislamiento
Criterios de pureza
Cultivo puro
Identificacin
Macroscpicos
Microscpicos
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Muestras
Microorganismos indicadores
Coliformes P. aeruginosa
Deteccin de B. cereus en leche en polvo,miel, arroz
Deteccin de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda
Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados
Agua
Alimentos
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Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Seleccin de esporas
Calentamiento
Enriquecimiento
Agotamiento por estras Mossel
Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))
Repique
Tinciones
Cultivo puro
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Morfologa de las colonias
Forma y tamao de las colonias: Irregular, puntiforme
Bordes: liso, rugoso.
Elevacin: Convexo, elevado, umbonado, liso.
Color: pigmento, opaca, translucida, brillante.
Textura: Mojada, mucosa, seca.
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Bacillus subtilis
Forma de la colonia y tamao: irregular
Bordes: ondulado
Elevacin: umbonada
Color: Blanca crema
Textura : seca
Proteus vulgaris
Tpico aspecto sobre la caja de petri
Klebsiella pneumoniae
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Pruebas bioqumicas
para la identificacin de
Bacterias
Exoenzimas y Endoezimas
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I M Vi C*
Indol
Rojo de Metilo
Vohes Proskauer
Citrato
Identificacin de bacilos entricos
Bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas y fermentadores de
glucosa.
Miembros
Patgenos: Salmonella y Shigella
Patgenos ocasionales: Proteus y Klebsiella
Flora normal: Escherichia y Enterobacter
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Test de produccin de Indol
Determina la capacidad de un microorganismo de degradar triptfano
Triptofanasa
Triptofano Indol + Acido Piruvico + amoniaco
Butanol
Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tubo
HCl
Reactivo Kovac
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positivo negativo
E.coli
Accin de la triptofanasa
El triptofano se adiciona al medio en una
Concentracin 1%. Es una peptona derivada de
la casena. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.
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Rojo de Metilo
Para identificar bacterias que metabolizan glucosa con produccin de altas concentraciones de cidos.
Sirve para diferenciar E.coli de Enterobacter
El medio tiene glucosa al 10% y Rojo Fenol
E. coli : estabiliza el pH bajo producto de la acidificacin del medio
Enterobacter: Convierte los cidos en productos finales neutros como 2,3 butanediol y acetoina lo que
resulta en una elevacin del pH en in valor de 6.
Positive positive negative control.
pH 4 vira al rojo (test positivo)
pH 6 sigue indicando presencia de
acido pero a una concentracin
insuficiente para producir el viraje
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Left: uninoculated control
Right: negative (copper color)
Left: uninoculated control
Right: positive (red color) Left is Barritt's A (alpha-napthol) and right is
Barritt's B (KOH--potassium hydroxide).
Voges-Proskauer (VP)
Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3butanediol como
resultado de la degradacin de glucosa. Positivo para Enterobacter aerogenes
Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo
y se agita ligeramente. Rojo positivo
Glucosa + O2 piruvato a-acetolactato acetoina 2,3 butanodiol
40% KOH
Acetoina + a-naftol Complejo rosado (creatina + diactetilo)
Etanol Absoluto
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Para determinar la capacidad de un m.o. de utilizar la enzima citrato permeasa para usar
como fuente de carbono el citrato nicamente.
Simmon's citrate agar: Es un medio definido que contiene citrato de sodio como fuente carbonada.
Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul
de bromotimol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.
Citrato
Enterobacter cloacae: positive
Escherichia coli: negative
Klebsiella pneumoniae: positive
Citrato permeasa
Glucosa + O2 Ac. piruvico + Ac. Oxalacetico + CO2
Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3
(producto alcalino que eleva pH
vira de verde a azul)
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Catalasa* Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. Micrococcaceae
como Staphylococcus catalasa positivos, Streptococcaceae, Streptococcus
Enterococcus catalasa negativo.
H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no
enzimticas de reduccin de flavoprotenas o por accin enzimtica de radicales
superxido. H2O2 puede daar las bacterias, la enzima catalasa presente en algunas bacterias lo transforma en agua y oxgeno.
Se adiciona perxido de hidrogeno sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta
objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.
2H2O2 2H2O+ O2 Catalasa
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Oxidasa*
Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiracin).
Oxidase negativa Enterobacteriacae y Pseudomonadaceae, Neisseria oxidasa positiva.
La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el
aceptor final de la respiracin (oxgeno). En este test un donor de electrones artificial
(phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo Oxidasa.
Si la enzima esta presente se observar una coloracin purpura.
El test se debe leer a los 15 segundos pues el reactivo puede cambiar de color con el paso
del tiempo.
oxidasa (+)
Pseudomonas
oxidasa (-)
E. coli
Neisseria
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Reduccin de nitrato*
Muestra la capacidad de un m.o. de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2), nitrgeno
molecular (N2) o amoniaco, usando la enzima nitrato reductasa.
Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiracin
anaerobia o por denitrificacin. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como
sustrato.
Determinacin de Nitrito NO2-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY
1. Solucin A: acido sulfanico
2. Solucin B: a-naftilamina
Determinacin de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER
REACCION POSITIVA: aparicin instantnea de una coloracin rojo cereza
Que no se produzca color puede indicar dos cosas: (1) el nitrito no se redujo (2) se redujo
a otros compuestos. Para distinguir esta situacin se adiciona Zinc. Si hay nitrato en el
medio se va a reducir a nitrito y el medio se tornar rojo mostrando una reaccin negativa.
Si al adicionar Zn no sucede nada, se redujo a otros compuestos.
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Pseudomonas aeruginosa: no hay cambio de
color, negativo
Escherichia coli: cambio de color a rojo, positivo
Corynebacterium xerosis: no hay cambio de color,
negativo
Test del nitrato
Reagent A: Sulfanilic Acid
Reagent B: alpha-naphthylamine
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Triple Sugar Iron Agar (TSI)*
Enterobacterias y otros bacilos intestinales Gram negativos
Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o
sucrosa.
TSI contiene tiosulfato de hierro, sustrato para la produccin de sulfuro de hidrogeno y
sulfato ferroso.
Rojo fenol. Fermentacin de carbohidratos vira de rojo a naranja a amarillo en presencia
de cidos.
Se siembra en profundidad con una aguja y luego se estra el pico de flauta.
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Azcar Productos cidos pH (Amarillo)
Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)
Fermentacin (medio cido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)
SH2 + iones frricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)
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Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie
recta acida (amarilla) con o sin produccin
de gas (ruptura o no del agar)
Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie
recta alcalina (rojo) o sin cambios
Agar inclinado acido (amarillo) y
superficie recta acida (amarilla) con y sin
produccin de gas (ruptura o no del agar)
nicamente
fermenta glucosa
No ocurre
fermentacin de
carbohidratos
Puede ocurrir
fermentacin de
lactosa o sacarosa
o ambos
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Test de la Descarboxilasa
Muestra la capacidad de un m.o. para descarboxilar un aminocido.
En esta reaccin se remueve el grupo carboxilo (COOH) de un aminocido produciendo
amina y dixido de carbono.
El indicador de pH (purpura de bromocresol) es adicionado con unas gotas de aceite
mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentacin.
Se necesita un ambiente cido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. pH
alcalino el indicador cambia a purpura (positivo).
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Prueba de fenilalanina-desaminasa
Para identificar accin de la enzima phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir
Morganella, Providencia, y Proteus (phenilalanina-deaminasa positiva) gneros de otros
miembros de Enterobacteriaceae (phenylalanine deaminase negativa).
El medio contiene el aminocido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y
libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la
adicin de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%).
Un cambio de color al verde indica una reaccin positiva.
Negativo Positivo
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Prueba de ureasa Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos
molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa
Indicador de pH: rojo fenol. Presencia de amoniaco aumenta el pH y vira a rosa oscuro
Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3
1. No inoculado
2. Proteus vulgaris: Positivo
3. Escherichia coli: Negativo
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Prueba de hidrlisis de caseina
Determinar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla casena
Agar leche. Contiene caseina la cual le da el color blanco. Algunas bacterias secretan
caseasa, la cual rompe la molcula de casena en pequeos polipentidos los cuales
atraviesan la membrana celular. Esta reaccion de hidrlisis, aclara el area alrededor de la
colonia.
Bacillus subtilis es positivo para la enzima
caseasa.
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Prueba de licuefaccin de Gelatina*
Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preoteltico
(gelatinasas) que licuan gelatina
Protena + H2O Polipptidos
Polipptidos + H2O Aminocidos individuales
Escherichia coli: negativa (gelatina como solido)
Pseudomonas aeruginosa: positiva (gelatina degradada)
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Prueba de hidrlisis de Almidn
Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn mediante
enzimas del tipo amilasas
-amilasa
Almidn dextrinas + maltosa + glucosa
H2O polisacridos disacrido monosacrido
El almidn en presencia de Iodo imparte coloracin azul indicando ausencia de amilasa
(Resultado Negativo)
Si el almidon fue hidrolizado, se vera una zona clara alrededor de las colonias (Resultado
Positivo)
lugol
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Fermentacin de carbohidratos (rojo fenol) Se adiciona un azcar al medio: Lactosa, sacarosa o glucosa
Propsito: Se usa para determinar fermentacin de ciertos azcares y produccin de gases.
Se usa para identificar bacterias entricas Gram negativas.
Durante el proceso de fermentacin el aceptor final de electrones es una molcula orgnica.
Un tubo (Durham) es colocado dentro del medio invertido con el propsito de capturar gases
liberados durante la fermentacin.
El indicador cambia al amarillo por debajo de pH 6.8 y cambia al rojo por encima de pH
7.4.
Si el microorganismo no fermenta el carbohidrato pero usa la peptona se va a acumular
amonio, esto elevara el pH.
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1- Control sin inocular
2- Amarillo: Utilizacin del azcar, produccin de cido sin gas.
3- Amarillo y produccin de gas.
4- Fermentacin negativa. Oscurecimiento del medio
de cultivo producto de utilizacin de peptonas y liberacin
de amonio.
5- Negativo
orgamismos
1. Control Negative
2. S. aureus Acid
3. P. vulgaris Acid, Gas
4. P. aeruginosa Negative
5. E. coli Acid, Gas
resultados
Fermentacin de glucosa
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Identificacin y Caracterizacin
Catalasa Fermentacin de azcares Hemlisis Deteccin de genes de virulencia (toxinas-PCR hblA, B, C, D.)
Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo
Seleccin de esporas
Calentamiento
Enriquecimiento
Agotamiento por estras Mossel
Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))
Repique
Tinciones
Cultivo puro
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