Microbiología General

Aislamiento e identificación de

Microorganismos

¿Para qué aislar microorganismos?

¿Para qué identificar un microorganismo ?

Caracterización vs. Identificación

1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva

2. Pruebas Moleculares Identificación final

Aislamiento e identificación de microorganismos

Procedencia

Características

Expectativas

Métodos convencionales

Métodos moleculares

Tratamiento inicial

Siembra

Aislamiento

Identificación

Tratamiento inicial

Siembra

Enriquecimiento (selectivo o no)

Calentamiento

Filtración

Homogeneización, etc

Selección de medios de cultivo

Inóculo

Observación microscópica

Agotamiento por estrías, diluciones seriadas, etc

Subcultivo

Aislamiento

Criterios de pureza

Cultivo puro

Identificación

Macroscópicos

Microscópicos

Muestras

Microorganismos indicadores

Coliformes

P. aeruginosa

Detección de B. cereus en leche en polvo,miel, arroz

Detección de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda

Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados

Agua

Alimentos

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Selección de esporas

Calentamiento

Enriquecimiento

Agotamiento por estrías Mossel

Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))

Repique

Tinciones

Cultivo puro

Morfología de las colonias

Forma y tamaño de las colonias: Irregular, puntiforme

Bordes: liso, rugoso.

Elevación: Convexo, elevado, umbonado, liso.

Color: pigmento, opaca, translucida, brillante.

Textura: Mojada, mucosa, seca.

Bacillus subtilis

Forma de la colonia y tamaño: irregular

Bordes: ondulado

Elevación: umbonada

Color: Blanca crema

Textura : seca

Proteus vulgaris

Típico aspecto sobre la caja de petri

Klebsiella pneumoniae

Pruebas bioquímicas

para la identificación de

Bacterias

Exoenzimas y Endoezimas

I M Vi C*

Indol

Rojo de Metilo

Vohes Proskauer

Citrato

Identificación de bacilos entéricos

Bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas y fermentadores de

glucosa.

Miembros

Patógenos: Salmonella y Shigella

Patógenos ocasionales: Proteus y Klebsiella

Flora normal: Escherichia y Enterobacter

Test de producción de Indol

Determina la capacidad de un microorganismo de degradar triptófano

Triptofanasa

Triptofano Indol + Acido Piruvico + amoniaco

Butanol

Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tubo

HCl

Reactivo Kovac

positivo negativo

E.coli

Acción de la triptofanasa

El triptofano se adiciona al medio en una

Concentración 1%. Es una peptona derivada de

la caseína. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

Rojo de Metilo

Para identificar bacterias que metabolizan glucosa con producción de altas concentraciones de ácidos.

Sirve para diferenciar E.coli de Enterobacter

El medio tiene glucosa al 10% y Rojo Fenol

E. coli : estabiliza el pH bajo producto de la acidificación del medio

Enterobacter: Convierte los ácidos en productos finales neutros como 2,3 butanediol y acetoina lo que

resulta en una elevación del pH en in valor de 6.

Positive positive negative control.

pH 4 vira al rojo (test positivo)

pH 6 sigue indicando presencia de

acido pero a una concentración

insuficiente para producir el viraje

Left: uninoculated control

Right: negative (copper color)

Left: uninoculated control

Right: positive (red color) Left is Barritt's A (alpha-napthol) and right is

Barritt's B (KOH--potassium hydroxide).

Voges-Proskauer (VP)

Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3butanediol como

resultado de la degradación de glucosa. Positivo para Enterobacter aerogenes

Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo

y se agita ligeramente. Rojo positivo

Glucosa + O2 piruvato a-acetolactato acetoina 2,3 butanodiol

40% KOH

Acetoina + a-naftol Complejo rosado (creatina + diactetilo)

Etanol Absoluto

Para determinar la capacidad de un m.o. de utilizar la enzima citrato permeasa para usar

como fuente de carbono el citrato únicamente.

Simmon's citrate agar: Es un medio definido que contiene citrato de sodio como fuente carbonada.

Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul

de bromotimol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.

Citrato

Enterobacter cloacae: positive

Escherichia coli: negative

Klebsiella pneumoniae: positive

Citrato permeasa

Glucosa + O2 Ac. piruvico + Ac. Oxalacetico + CO2

Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3

(producto alcalino que eleva pH

vira de verde a azul)

Catalasa* Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. Micrococcaceae

como Staphylococcus catalasa positivos, Streptococcaceae, Streptococcus

Enterococcus catalasa negativo.

H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no

enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática de radicales

superóxido. H2O2 puede dañar las bacterias, la enzima catalasa presente en algunas

bacterias lo transforma en agua y oxígeno.

Se adiciona peróxido de hidrogeno sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta

objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.

2H2O2 2H2O+ O2

Catalasa

Oxidasa*

Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiración).

Oxidase negativa Enterobacteriacae y Pseudomonadaceae, Neisseria oxidasa positiva.

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el

aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor de electrones artificial

(phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo Oxidasa.

Si la enzima esta presente se observará una coloración purpura.

El test se debe leer a los 15 segundos pues el reactivo puede cambiar de color con el paso

del tiempo.

oxidasa (+)

Pseudomonas

oxidasa (-)

E. coli

Neisseria

Reducción de nitrato*

Muestra la capacidad de un m.o. de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2), nitrógeno

molecular (N2) o amoniaco, usando la enzima nitrato reductasa.

Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiración

anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como

sustrato.

Determinación de Nitrito NO2-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY

1. Solución A: acido sulfanico

2. Solución B: a-naftilamina

Determinación de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER

REACCION POSITIVA: aparición instantánea de una coloración rojo cereza

Que no se produzca color puede indicar dos cosas: (1) el nitrito no se redujo (2) se redujo

a otros compuestos. Para distinguir esta situación se adiciona Zinc. Si hay nitrato en el

medio se va a reducir a nitrito y el medio se tornará rojo mostrando una reacción negativa.

Si al adicionar Zn no sucede nada, se redujo a otros compuestos.

Pseudomonas aeruginosa: no hay cambio de

color, negativo

Escherichia coli: cambio de color a rojo, positivo

Corynebacterium xerosis: no hay cambio de color,

negativo

Test del nitrato

Reagent A: Sulfanilic Acid

Reagent B: alpha-naphthylamine

Triple Sugar Iron Agar (TSI)*

Enterobacterias y otros bacilos intestinales Gram negativos

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o

sucrosa.

TSI contiene tiosulfato de hierro, sustrato para la producción de sulfuro de hidrogeno y

sulfato ferroso.

Rojo fenol. Fermentación de carbohidratos vira de rojo a naranja a amarillo en presencia

de ácidos.

Se siembra en profundidad con una aguja y luego se estría el pico de flauta.

Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)

Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)

Fermentación (medio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)

SH2 + iones férricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie

recta acida (amarilla) con o sin producción

de gas (ruptura o no del agar)

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie

recta alcalina (rojo) o sin cambios

Agar inclinado acido (amarillo) y

superficie recta acida (amarilla) con y sin

producción de gas (ruptura o no del agar)

Únicamente

fermenta glucosa

No ocurre

fermentación de

carbohidratos

Puede ocurrir

fermentación de

lactosa o sacarosa

o ambos

Test de la Descarboxilasa

Muestra la capacidad de un m.o. para descarboxilar un aminoácido.

En esta reacción se remueve el grupo carboxilo (COOH) de un aminoácido produciendo

amina y dióxido de carbono.

El indicador de pH (purpura de bromocresol) es adicionado con unas gotas de aceite

mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentación.

Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. pH

alcalino el indicador cambia a purpura (positivo).

Prueba de fenilalanina-desaminasa

Para identificar acción de la enzima phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir

Morganella, Providencia, y Proteus (phenilalanina-deaminasa positiva) géneros de otros

miembros de Enterobacteriaceae (phenylalanine deaminase negativa).

El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y

libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la

adición de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%).

Un cambio de color al verde indica una reacción positiva.

Negativo Positivo

Prueba de ureasa Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos

moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa

Indicador de pH: rojo fenol. Presencia de amoniaco aumenta el pH y vira a rosa oscuro

Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3

1. No inoculado

2. Proteus vulgaris: Positivo

3. Escherichia coli: Negativo

Prueba de hidrólisis de caseina

Determinar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla caseína

Agar leche. Contiene caseina la cual le da el color blanco. Algunas bacterias secretan

caseasa, la cual rompe la molécula de caseína en pequeños polipentidos los cuales

atraviesan la membrana celular. Esta reaccion de hidrólisis, aclara el area alrededor de la

colonia.

Bacillus subtilis es positivo para la enzima

caseasa.

Prueba de licuefacción de Gelatina*

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preotelítico

(gelatinasas) que licuan gelatina

Proteína + H2O Polipéptidos

Polipéptidos + H2O Aminoácidos individuales

Escherichia coli: negativa (gelatina como solido)

Pseudomonas aeruginosa: positiva (gelatina degradada)

Prueba de hidrólisis de Almidón

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón mediante

enzimas del tipo amilasas

α-amilasa

Almidón dextrinas + maltosa + glucosa

H2O polisacáridos disacárido monosacárido

El almidón en presencia de Iodo imparte coloración azul indicando ausencia de amilasa

(Resultado Negativo)

Si el almidon fue hidrolizado, se vera una zona clara alrededor de las colonias (Resultado

Positivo)

lugol

Fermentación de carbohidratos (rojo fenol) Se adiciona un azúcar al medio: Lactosa, sacarosa o glucosa

Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares y producción de gases.

Se usa para identificar bacterias entéricas Gram negativas.

Durante el proceso de fermentación el aceptor final de electrones es una molécula orgánica.

Un tubo (Durham) es colocado dentro del medio invertido con el propósito de capturar gases

liberados durante la fermentación.

El indicador cambia al amarillo por debajo de pH 6.8 y cambia al rojo por encima de pH

7.4.

Si el microorganismo no fermenta el carbohidrato pero usa la peptona se va a acumular

amonio, esto elevaría el pH.

1- Control sin inocular

2- Amarillo: Utilización del azúcar, producción de ácido sin gas.

3- Amarillo y producción de gas.

4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del medio

de cultivo producto de utilización de peptonas y liberación

de amonio.

5- Negativo

orgamismos

1. Control Negative

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative

5. E. coli Acid, Gas

resultados

Fermentación de glucosa

Identificación y Caracterización

Catalasa

Fermentación de azúcares

Hemólisis

Detección de genes de virulencia (toxinas-PCR hblA, B, C, D.)

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Selección de esporas

Calentamiento

Enriquecimiento

Agotamiento por estrías Mossel

Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))

Repique

Tinciones

Cultivo puro