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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Materia de Especialización CEBI_E13 Técnicas de formulación y

estabilización de biomateriales

Docente a cargo: Pilar Buera Colaboradores: Florencia Mazzobre, Patricio Santagapita

Desarrollo del curso Lunes 01/10- 18-20 Teórica 1. Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. Transiciones de fase y estado. Problemas 1 a 3.

Lunes 08/10- 18-20 Teórica 2. Metodología para la caracterización de las transiciones. Proc. de congelación. Probl. 4 a 6.

Lunes 20/10- 18-22 TP DSC; Problemas 7 a 10.

Teórica 3: Liofilización. Problemas 11 y 12.

Lunes 05/11- 18-22 Teóricas 4 y 5 y demostraciones prácticas RMN y encapsulación.

Lunes 12/11- 18-20 Teór. 6. Isot. de sorción de agua. Probl. 13 a 18.

Lunes 26/11 - 18-20 Estabilidad/reacciones de deterioro. Problemas 19 a 22.

Miércoles 12/12 18-20 Examen

•Aspectos básicos de las formulaciones para conservación de biomoléculas y microorganismos. •Transiciones de fase y estado.

Teórica 1.

Ciencia de Materiales

Aspectos Estructurales

Ciencia de Polímeros

Estabilidad de biomoléculas

Aplicaciones

Medicina Biotecnología

Tecnología

Farmacia

Biología

embriones

enzimas células

anticuerpos liposomas

hormonas

Objetivo obtener biomoléculas conservables a largo plazo, con actividad recuperable. Para ello: deben estar inhibidas las reacciones químicas y biológicas que son responsables de la degradación. Debe conservarse la estructura física y funcionalidad

Mapa de estabilidad y aW

Opciones:

Congelación

Deshidratación

Pero… Qué pasa si las biomoléculas quedan en ambientes restringidos de agua? Puntos críticos: •Membranas celulares •Proteínas

En ambientes de humedad restringida las biomoléculas sufren estrés causado por alteraciones en sus interacciones con el agua.

La estructura y funcionalidad de biopolímeros está determinada en gran parte por su afinidad por el agua.

También el agua juega un papel decisivo en las estructuras celulares.

Los cambios en el estado físico del agua provocan alteraciones con distinto grado de irreversibilidad.

-El agua y la vida: mecanismos de protección en organismos vivientes en condiciones extremas de humedad y temperatura.

Cómo se busca la solución?

1. Planteando cómo resuelve la naturaleza el mantenimiento de la vida en condiciones extremas? •Muy altas o muy bajas temperaturas

•Muy altas o muy bajas presiones

•Deshidratación

Los organismos que viven bajo condiciones des estrés hídrico o térmico tienen su bioquímica adaptada, o bien tienen los mecanismos que les permiten sobrevivir en estado de latencia hasta que las condiciones ambientales sean favorables:

Extremófilos

Criptobiotes

Anhidrobiotes

Tardigrade 500mm

α, α -trehalosa

O

H

HO

H

HO

H

OHHH

OH

O

H

OH

H

OH

H

HO H

OH

H

O

Células de levadura 3 ~ 8mm

Artemia salina 0.1cm

O

H

HO

H

HO

H

OOHH

H

OH

H

HHO H

H OHO

OH

OH

Sacarosa Plantas de la resurrección

Polen

Plantas de la resurrección

Ej.Selaginella lepidophylla

Anhidrobiosis

OO

CH2

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

rafinosa

OCH2

OCH2OHOH

OH

OH

O

O

OCH2OH

OHOH

OH OH

OH

OH

CH2

OH

sacarosa

OCH2

β -fructofuranósidos

O

O

O

CH2OH

OHOH

OHOH

OH

OHCH2OH

α ,α- trehalosa

α-glucopiranósido

sacarosa

rafinosa β-fructofuranósidos

Semillas

Lecciones de la Naturaleza: Solutos que acumulan organismos resistentes a la deshidratación Proteínas

Sales/ aminoácidos

Azúcares

Contribuyen al ajuste osmótico

Puentes de H

Estabilización de proteínas y membranas

Medios de alta viscosidad

Capturan radicales libres

Vidrios

Protector de proteínas

Protector de membranas

Pereira et al. Biophys J 2004

w.o. T, 200C w.o. T, 52C

+ T 1M, 200C + T 2M, 200C

Efecto de trehalosa sobre membranas biológicas- Altas T

Totalmente hidratado

Parcialmente deshidratado

Deshidratado

Totalmente hidratado

Parcialmente deshidratado Deshidratado

Solutos protectores de biomoléculas

•Sacarosa.

•Manitol.

•Lactosa.

•Trehalosa.

•Sorbitol.

Propiedades estabilizantes de azúcares amorfos.

Inhibición de reacciones químicas

Protección de proteínas

Protección de membranas

Medios de alta viscosidad

Capacidad de interactuar por puentes H

Vidrio

No cristalino (vítreo o sobreenfriado)

}

Pasos para el desarrollo de sistemas de biomoléculas estables:

• Formulación

• Operación y control de proceso

• Evaluación de la calidad

• Estimación de la estabilidad

Principales aspectos: •Características de los comp. activos del producto (proteínas, enzimas, pigmentos, membranas, microorganismos, etc.) •Características de componentes del medio (biopolímeros, azúcares, sales, buffers) •Proceso, equipos •Acondicionamiento final de producto •Estabilidad

Requerimientos: Las biomoléculas lábiles y estructuras deben ser : • preservadas durante el proceso. • preservadas durante su posterior almacenamiento. • su actividad recuperable al rehidratar o descongelar.

Aspectos a considerar:

•Mecanismos involucrados

•Relación vitrificación estabilidad

Las transiciones de fase y estado de las biomoléculas afectan su funcionalidad y pueden servir como índice para predecir estabilidad Esencialmente corresponden a: Vitrificación Transiciones entálpicas

Vitrificación

La estabilidad de muchas biomoléculas en medios congelados o deshidratados se logra mediante la formación de vidrios.

Matriz

Agua

Biomoléculas

Interacciones

Vitrificación.

Los sólidos amorfos son materiales meta-estables con alta viscosidad y baja movilidad molecular, existen en un estado de no-equilibrio

Muchos cambios químicos y estructurales ocurren muy lentamente en los sistemas vítreos, y no se perciben en marcos de tiempo prácticos.

Vidrio (amorfo)

Demasiado quebradizo y muy alta Tm

Vidrio común

vidrios SiO2 en su estado cristalino: cuarzo

cristal

El estudio de los vidrios se realizó inicialmente en sólidos inorgánicos, y se desarrolló en ciencia de polímeros, pero sustancias como azúcares pueden generar estructuras vítreas y están ampliamente relacionados con la estabilidad de biomoléculas.

El cambio en el estado físico que sufre un material amorfo vítreo al pasar al estado de líquido sobreenfriado se conoce como transición vítrea.

Esta transformación ocurre a cierta temperatura, temperatura de transición vítrea (Tg), que depende del contenido de agua y de las características de cada sistema.

Los vidrios dejan de comportarse como sólidos amorfos cuando la temperatura supera el valor de Tg, temperatura de transición vítrea.

En este punto pierden la rigidez que los caracteriza y se tornan flexibles o gomosos.

En sistemas biológicos se le atribuye a este cambio efectos nocivos sobre su conservabilidad.

Colapso estructural por almacenamiento de muestras de maltosa liofilizadas a temperaturas superiores a su Tg.

control Almacenada a T>Tg

Los diagramas temperatura/composición permiten mostrar la influencia de los solutos en las transiciones de fase del agua. Por simplicidad solo se muestran los cambios de fase sólido/líquido, que son los que interesan en la liofilización. Hay que considerar 2 casos: •Sistemas en equilibrio con formación de eutéctico. •Sistemas que forman vidrios fuera del equilibrio.

Reid, 2006

Caso 1. Sistemas en equilibrio termodinámico que forman eutécticos. Ej.: sales, manitol

A

D

C

B E La línea DBE

determina la menor temperatura a la cual puede existir líquido

Tm

Tms

Tm es la temperatura de fusión/cristalización de agua pura (0°C) y Tms es la temperatura de crist/fusión de soluto puro.

A medida que se agrega agua al soluto o soluto al agua, las correspondientes temperaturas de fusión disminuyen (curvas AB y CB).

La curva CB corresponde a la de solubilidad.

Al enfriar una solución inicialmente a la temperatura T y composición C2 , en forma lenta para permanecer en equilibrio, disminuye la temperatura y no hay cambio de fase, permaneciendo líquida hasta T1 que es la temperatura de cristalización correspondiente a esa composición. Se forman los primeros cristales de hielo.

T

T1

solución

Solución + soluto Solución

+ hielo

Al seguir enfriando hay menos agua en la solución, que se concentra. En el punto U tenemos un mezcla de cristales de hielo y una solución de comp. C3

U

Si consideramos ahora una solución de composición C3 a la temperatura T, podemos ver que es necesario enfriarla hasta T2 para que se formen los primeros cristales de hielo. En este punto la solución no congelada de C3 será idéntica a la de C2 enfriada hasta T2. La diferencia entre ambas es la cantidad de hielo formado.

T

T2

T

solución

Solución + soluto Solución

+ hielo

Cuanto más concentrada es la solución inicial, menos cantidad de hielo presente.

Reid, 2006

La realidad:

Muchas veces el equilibrio termodinámico no se alcanza en escalas de tiempo compatibles con los experimentos, y los solutos no cristalizan, dando lugar a una prolongación de la curva AB.

En cierto punto, alcanzamos una T y conc. de soluto donde la cristalización de hielo está cinéticamente impedida, y corresponde a la intersección con la curva del vidrio.

Reid, 2006

A

B

Reid, 2006

En los procesos de deshidratación o congelación se pueden generar sistemas vítreos.

La fusión de sólidos cristalinos, seguido por un enfriamiento rápido también genera estructuras vítreas.

Sólidos amorfos y estado vítreo

Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinos 1. Durante la congelación

Congelado rápido

matriz amorfa

Congelado lento

hielo

agua soluto

Esquema de la formación de sólidos amorfos o cristalinos 2. Durante la deshidratación

Deshidratación rápida

Deshidratación lenta

Cristales de soluto

agua soluto

matriz amorfa

Tem

pera

ture

W 0.25 0.5 0.75 1

2

4

150

100

50

0

-50

-100

-150

0

Diagrama de estado

Compuesto Tg (C) Triosas

Glicerol -93

Pentosas

Ribosa -10

Xilosa -10

Arabinosa -2

Hexosas

Fructosa 13

Glucosa 39

Manitol 30

Sorbitol -3

Disacáridos

Sacarosa 70

Trehalosa 106

Maltosa 87

Trisacáridos

Rafinosa 109

Maltotriosa 100

Tetrasacáridos

Estaquiosa 132

Temperaturas de transición vítrea de compuestos secos.