carrera de especializacion en biotecnologia...
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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN
BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyN-INTI
Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio
CEBI_E1: Cromatografía
Materia de Especialización CEBI_E1
Técnicas de análisis en biotecnología
Módulo I: Moléculas pequeñas.
Módulo II: Macromoléculas.
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Temario clase de hoy
1. Conceptos básicos y tipos de columnas
2. Tipos de cromatografías
3. Instrumentación
Cromatografía
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3
Muestreo y análisis
de las materias
primas
Análisis de
productos
intermedios
Monitorización de
la calidad de los
productos
Monitorización de
la calidad de los
efluentes
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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4
• Técnica que permite separar los diferentes
componentes de una mezcla compleja.
• La separación se logra por diferencias en
la movilidad relativa de los solutos
(interacciones físicas y químicas entre los
componentes).
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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5
Componentes involucrados:
– Fase estacionaria (FE)
– Fase móvil (FM)
– Soluto o muestra
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Generalidades/ terminología
FE. Columna de fase sólida ("matriz", "resina", por lo general algún
tipo de polímero, a menudo un polisacárido) colocado en un tubo de
vidrio
- adsorbente: material sólido o de la matriz, una "fase estacionaria"
a la que algunas moléculas se unen
- elución: el proceso de lavado de aquello que quedó absorbido
(con un buffer de elución)
Cromatografía
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7
• Se pueden clasificar:
• De acuerdo al soporte
• Al tipo de equilibrio que se establece en la
separación
• Al estado de agregación de la fase móvil
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía
FM
LÍQUIDO
GAS
Cromatografía Líquida
(LC)
Cromatografía gaseosa
(CG o GC)
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Técnicas de Análisis
Tipos de cromatografías: se definen según los mecanismos de
interacción FM-FE.
a.Size exclusion chromatography (también llamada Molecular
Sieve o Gel filtration).
b. Afinidad: Affinity chromatography
b1. Hydrophobic interaction chromatography (HIC)
c. Intercambio iónico: Ion exchange chromatography (catiónica y
aniónica)
d. Adsorción (y fase reversa)
Cromatografía
– Adsorción superficial
– Partición
– Intercambio iónico
– Exclusión molecular
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Técnicas de Análisis
Tipos
Cromatografía – Tipos
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Técnicas de Análisis
Generalidades
Cromatografía
Por alguna razón (diferencias de radio hidrodinámico -tamaño + forma),
diferentes afinidades de unión de la columna de la matriz o por
interacciones electrostáticas), algunas moléculas se mantienen más
tiempo en la columna (y en ese caso eluyen posteriormente) y otras se
retienen menos (en ese caso eluyen antes).
Se pasa por la columna
una mezcla de proteínas
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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• Constante de distribución(Kc)= relaciona la
concentración de un soluto entre la fase
móvil y la estacionaria.
Kc = Cs
CmConcentración del analito en
fase estacionaria
Concentración del
analito en fase móvil
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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k= Tr – Tm
Tm
IMPORTANTE: k <<<<< a 1: soluto muy poco retenido
k entre 1 y 5: valor ideal
k 20 o mayor: cromatografías muy largas
Factor de retención (k) = permite comparar la velocidad
de migración de los diferentes solutos. Se puede
determinar experimentalmente.
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Dispersión Caminos múltiples
•Empaquetamiento
•Rango de tamaño de
partícula
•Diámetro de partícula
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Ensanchamiento a flujos bajos
Dispersión
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Transferencia de masa
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Dispersión
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Ecuación de van Deemter:
Multiplicidad
de caminosDifusión longitudinal
Transferencia de masa
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
(vel FM)
(altura
del
“plato”)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
A ∞ Ce dpCe = forma de la partícula
dp = diámetro de la partícula
B DMP
∞
DMP = difusividad de la FM
•Inversamente proporcional al flujo
•Importante en GC (DMP del gas elevada)
dt = diámetro de la columnaC
dt2
DMP
∞
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de exclusión molecular
Animación de la técnica (GE Healthcare)
https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ
BIORAD ©
Otra opción:
http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz0
5/5-6.html
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Principlos de
SEC• Las cápsulas o filtros moleculares se
basan en el tamaño y forma
• La separación de las moléculas se llama
fraccionamiento y se basa en el radio
hidrodinámico de la molécula
• El tamaño de poro de las cápsulas
determina el límite de exclusión y por lo
tanto lo que pasa POR las cápsulas o
ALREDEDOR de estas
BIORAD ©
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
SEC
Hay varios tipos de beads (cápsulas) disponibles (hidratadas, de
polisacáridos porosos (dextrano, agarosa) o de poliacrilamida)
que cubren rangos muy amplios
El volumen de buffer requerido será función del radio
hidrodinámico de las moléculas. Si son de forma similar, la
separación será basicamente por tamaño
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
SEC
Cromatografía
SIGMA ALDRICH ©
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SEC• Las cápsulas de las columna poseen
poros pequeños. Hay tamaños de
poros variables
• Las moléculas más grandes que el
poro viajarán rápidamente por la
columna, ya que no entran entre los
poros
• Las moléculas más pequeñas que el
poro pasarán por estos y tardarán
mucho más tiempo en eluir de la
columna
Técnicas de Análisis
Cromatografía
GRAN DIFERENCIA CON
ELECTROFORESISNelson & Cox, Lehninger Principles of
Biochemistry, 3rd ed.
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SEC
Procedimiento
Existen kits
comerciales
fáciles de utilizar
BIORAD ©
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Principios de
SEC
BIORAD ©
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Asociar quién eluye
primero o después con
la “distancia” que
recorrió cada molécula
de una mezcla.
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SEC
Ejemplo: mezcla
de: hemoglobina
y vitamina B12
• La hemoglobina posee color rojo-marrón
y su PM es de 65 KDa
• La vitamina B12 is rosa y su PM es de
1,35 KDa
• Si el límite de exclusión de las cápsulas
es de 60 KDa, quién eluye primero?
Técnicas de Análisis
Cromatografía
BIORAD ©
La hemoglobina eluye primero, mientras
que luego la vitamina B12
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
SEC
Detección (caso del ejemplo)
Calibración de la columna
- construcción de curva de calibración a partir de la determinación
del volumen de elución en proteínas de PM conocido
- uso de estándar interno
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
SEC
Det. PM polímero modificado (basado en alginato de sodio).
Cal. Patrones de pululanos en el rango de 5.800 a 1.600.000
Viny: 200 uL
Fase móvil:
Buffer pH7
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Animación:
https://www.youtube.com/watch?time_
continue=7&v=FUAQKjKT99Y
Uso de ligandos específicos unidos
covalentemente a la columna
Fundamento de la separación: adsorción
reversible de los ligandos a la matriz
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Etapas (descripto en video)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Ejemplos de columnas afinidad comerciales
SIGMA
ALDRICH ©
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Algunas propiedades físicas de las resinas utilizadas
Thermo Scientific ©
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de
Afinidad
BIORAD ©
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de
Afinidad • Usa tags de afinidad
- permiten que las moléculas se
unan a la columna
- pueden ser específicos hacia la
proteína de interés
• Aquellas proteínas que no se unen
pasan rápidamente por la columna
• Se usa un buffer para luego eluir
las proteínas que si se unieron
BIORAD ©
Ej.: inmunoafinidad
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Buffer de elución: dependiendo de la columna, se usan o una
diferencia en pH (se baja el mismo) o se utiliza un buffer con el
ligando libre específico de la columna (depende de disponibilidad/
costo) que compite por la unión en la columna con la molécula de
interés
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Thermo Scientific ©
Algunos ejemplos
de buffer de elución
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Si luego se debe separar las macromoléculas de ligandos
pequeños o realizar un cambio de buffer (si requiero pasar de una
columna a otra, por ej.): DIALISIS
(uso de membranas semi-permeables a diferenes PM)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Nelson & Cox, Lehninger Principles of
Biochemistry, 3rd ed.
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
muy usadas:
- cromatografía de inmunoafinidad: se usan anticuerpos
inmobilizados en la columna
- polyHis tags= la columna posee iones Ni2+ (o Cu2+, Co2+ o Zn2+)
que unen al grupo imidazol de las histidinas puestas ad hoc en la
producción in vivo de proteínas recombinantes en el C-terminal.
Se utiliza luego un buffer con imidazol para eluir.
- cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).
https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Elusión usando buffer con imidazol – His tag proteins
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
Elección de pH óptimo para elusión – IgG
(usando un gradiente)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de
interacción
hidrofóbica
HIC
• Las cápsulas de la columna son
hidrofóbicas
• La columna se trata con un buffer de
elavada concentración salina
• Aquellas proteínas que son hidrofóbicas
se unen a las cápsulas
• Un buffer de bajo contenido de sal eluye
las proteínas menos hidrofóbicas
• Un buffer sin sales eluye las proteínas de
interés
BIORAD ©
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Paso 1: HICLa muestra se adiciona
a la matriz junto con un
buffer de alto contenido
de sal
- Las proteínas hidrofóbicas
interactúan con la columna
- Los iones de la sal
interactúan con proteínas
menos hidrofóbicas y con
agua
Hydrophobic bead
Técnicas de Análisis
Cromatografía
BIORAD ©
ej. proteína recombinante con GFP
1-2 M sulfato de amonio; 3 M cloruro de sodio
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Paso 2: HIC
Lavar las proteínas
menos hidrofóbicas de
la columna con buffer
con bajo contenido de
sal
- Así se eluirán las proteínas
menos hidrofóbicas
- mi proteína de interés
quedará unida a la columna
O
S
O
O O- -
Hydrophobic
bead
Técnicas de Análisis
Cromatografía
BIORAD ©
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Paso 3: HIC
La proteína de
interés se eluye de la
columna con un
buffer sin sales
Hydrophobic
bead
Técnicas de Análisis
Cromatografía
BIORAD ©
![Page 47: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/47.jpg)
HIC
Técnicas de Análisis
Cromatografía
![Page 48: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/48.jpg)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de afinidad
- polyHis tags
Purificación de una proteína con tag de histidinas a partir de un
extracto sin purificar.
Otro muy usado es GST tag (glutathione S-transferase), y muchas
veces se utilizan en combinación.
La enzima unirá a su substrato.
GST: 211 aa (26 kDa).
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
Animación de la técnica (GE Healthcare)
https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8
Ej. de resina aniónica (+)
http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-5.html
Ej. general – independiente de la resina-
Fundamento de la unión: interacciones electrostáticas
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de
intercambio
iónico
• Las cápsulas de la columna
están cargadas:
-positivamente (+) - aniónica (ej.
grupos DEAE -dietilaminoetil-)
- negativamente (-) - catiónica (ej.
grupos carboximetilos (CM))
• Las moléculas a ser purificadas
deben poseer una carga opuesta
a las de las cápsulas de la
columna
• Aquellas moléculas que no se
unen a las cápsulas, pasan por la
columna rapidamenteBIORAD ©
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de intercambio
iónico
Columna catiónica (carga -)
Todo lo cargado en forma (-)
eluirá primero
Luego eluirá desde lo de menor
carga neta (+) hasta lo de
mayor carga neta (+)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
Las columnas presentan grupos cargados. Si los grupos
ionizables son ácidos o bases débiles → dependerán del pH del
buffer!
La fuerza de unión dependerá:
-carga neta de la proteína (pI)
-concentración de sales en el buffer (competencia con las
proteínas por los sitios de unión de la columna)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
Entonces,
Mientras mayor sea la diferencia (pH buffer y pI) →
> carga neta de la proteína al pH del buffer
→ más fuertemente se unirá a una carga opuesta en la matriz y
→ mayor es la concentración de sal en el buffer para eluirla
Eligiendo adecuadamente el buffer de elución (generalmente se
realiza un gradiente que incrementa la concentración o pH), se
pueden separar proteínas específicas de la columna en forma
diferencial
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Producción de proteínas (completo)
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Protocolo de purificación de proteínas
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de IEX+HIC+SEC
Ver animación
https://www.youtube.com/watch?v=KAkZG
pdmWio&feature=youtu.be
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Ejemplo purificación para una enzima
Nelson & Cox, Lehninger Principles of
Biochemistry, 3rd ed.
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Adsorción:
fenómeno superficial, partículas de soluto
adsorbidas en la fase estacionaria
Técnicas de Análisis
Cromatografía
d) Cromatografía de Adsorción
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• FE: Sólidos muy porosos con capacidad
adsorbente
– Sílica
– Alúmina
• FM:
– Solventes orgánicos
Capacidad de carga
Presentaciones
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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• Solvente y soluto compiten por los sitios de
adsorción en la fase estacionaria
Técnicas de Análisis
Cromatografía
![Page 61: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/61.jpg)
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía de Adsorción
![Page 62: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/62.jpg)
M. Sánchez-CEBI_1a 63
Cromatografía de Adsorción• La fuerza eluyente 0 es la energía de adsorción del disolvente por
unidad de superficie (sílica).
Solvente Fuerza de Elución
Fluorcalcanos -0.20
N-pentano 0.00
N-hexano 0.01
1-clorubutano 0.20
Benceno 0.20
Xileno 0.24
Cloroformo 0.26
Tolueno 0.28
Cloruro de metileno 0.32
Acetato de etilo 0.38
Tetrahidrofurano 0.44
Acetonitrilo 0.50
Metanol 0.70
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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• Tipos de rellenos:Esférico Irregular
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Aplicaciones industriales:
– Separación de isómeros
– Análisis de compuestos poco solubles en agua
– LC preparativa
Técnicas de Análisis
Cromatografía
![Page 65: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/65.jpg)
Ejemplos
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm,
sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano.
Caudal 0.25 mL/min. Detector UV 254 nm.
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Ejemplos
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Cromatografía en fase reversa
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
![Page 68: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL](https://reader036.vdocumento.com/reader036/viewer/2022071223/607f24e566cbf032512d8fa3/html5/thumbnails/68.jpg)
THF
i-PROPANOL
ACETONAETANOL
ACETONITRILO
METANOLAGUA
LONGITUD DE
ONDA MINIMA UV212 nm
205 nm
330 nm210 nm
190 nm
205 nm190 nm
INDICE DE
REFRACCION1.405
1.384
1.3561.359
1.341
1.4571.333
FUERZA DE
SOLVENTE4.4
4.2
3.43.6
3.1
3.00.0
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Cromatografía en fase reversa
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Fase Ligada
Fase
reversa
Fase
normal
C-18 Mas utilizada
en RP-HPLC
C-8 menor retención
que C18
C-3, C-4 Proteínas y
péptidos
CN compuestos de
polaridad
intermedia
NH2 hidratos de
Carbono
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Ejemplo
Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia
de las columnas de siloxano en fase inversa
empaquetadas con partículas de 5 m. Fase
móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 mL/min
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Algunas aplicaciones
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Caso: analitos ionizables (débiles)
pKa=4.6
Muy polar = menos retenidaMenos polar = más retenida
Variar pH de FM
Supresión de iones
Par iónico (IPC)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Estrategias
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Supresión de iones
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Cromatografía de Par Iónico• Utiliza una columna HPLC de fase reversa.
• Se añade a la FM un reactivo (alquilsulfonato) que se aloja en la FE convirtiéndola en un intercambiador iónico.
• Los iones del analito se pueden unir a la fase estacionaria por atracción electrostática con los iones del surfactante.
• Mecanismo de retención: mezcla de interacciones con fase reversa y de intercambio iónico.
SO3
SO3 N
R
R
R
H+
Na+
Fase unida Reactivo de par iónico
Muestra
N+
N+
O C R
O
H2PO4
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Longitud de cadena del reactivo de par iónico
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Instrumentación (general)
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Suministro de solventes:
Funciones básicas:
• Proveer flujo constante y preciso
• Proveer composiciones precisas de fase móvil
• Proveer la fuerza necesaria para empujar la FM a través del empaquetamiento compacto de la fase de la columna
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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• Agua, soluciones buffer acuosas y solventes
orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o
diferentes mezclas. Grado HPLC.
• FM sin elementos particulados. Evitar obstrucciones
en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones
de zafiro y columna muy empaquetada)
Suministro de solventes:
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Columnas• Columnas analíticas: diám. interno: 4.6 mm, < 0.1 mg muestra
• Columnas semipreparativas: diám. interno: 1 a 3 cm, de 1 a 200 mg
muestra
• Columnas preparativas diám. int.: varios cm. Solo para uso industrial.
Requieren equipo especial.
Cuidados físicos con la columna:
• No golpear la columna
• No dejar secar la columna
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Retomando…
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Técnicas de Análisis
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Técnicas de Análisis
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Técnicas de Análisis
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Detectores• Basados en una PROPIEDAD física o físico-química DEL
SOLUTO (no la presenta la FM). Bastante selectivos y muy sensibles.
– UV
– Fluorescencia
– Electroquímicos
• Basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la FM con y sin soluto eluido. Responden a un conjunto amplio de solutos. Poco sensibles.
– Índice de refracción
– Conductividad
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Propiedades del detector
• Sensibilidad adecuada
• Respuesta lineal amplia
• Respuesta rápida y reproducible
• Manejo sencillo
• Límite de detección: relación señal/ruido. No solo depende del detector!
• Límite de cuantificación: límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
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Rango lineal ó dinámico = LOL /LOQ
Patricio Santagapita_CEBI_E1
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UV-Visible
Ley de Beer: A = ɛ l c
Coeficiente de extinción
concentraciónlong. de la celda
ɛ sustancia
longitud de onda
Se analiza una longitud de onda por cada medición
Solvente!!Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Detector UV por arreglo de diodos
Va realizando barridos completos del
espectro UV-Vis
Permite reprocesar el mismo cromatograma
detectando a diferentes l
Se puede obtener el espectro UV-Vis de
cada pico del cromatograma y compararlo
con una base de datos
Rtl
Abs
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Detector de fluorescenciaMuy sensibles y selectivos.
Dos l de trabajo:
-excitación
-emisión
Para analitos fluorescentes
(derivados)
Patricio Santagapita_CEBI_E1
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Detectores de índice de refracción
• ƒ Miden variaciones en el IR del
analito con respecto al de la
FM
• ƒ Sólo se pueden usar si la
elución es isocrática
• ƒ Son universales, pero tienen
baja sensibilidad
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Detectores de conductividad
•Aplicaciones: Iones,
ácidos, bases y sales
•ƒ Baja sensibilidad
•ƒ Sensibles a impurezas
de la fase móvil
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Detectores electroquímicos• Se basan en la reacción redox entre el analito y un
electrodo
• El nivel de reacción es proporcional a la
concentración del analito.
• Se mide y se compara con un electrodo de
referencia.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Detectores por espectrometría de masas
• Introducción de la FM en cámara de vacío
• Vaporización previa de solvente
• Termovaporizador-ionizador
• Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles
• Espectros de impacto electrónico
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Análisis cualitativo
Permite identificar los compuestos individuales
en la muestra
– El parámetro más común es su tiempo de retención
– Dependiendo del detector utilizado la identificación
se puede basar en la estructura química, molecular,
peso o algún otro parámetro molecular.
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Análisis cuantitativo• Detectores dan una respuesta proporcional a la cantidad de
sustancia (m):
• Respuesta = a x m
a: característico para cada sustancia
Como el componente atraviesa el
detector en un período de tiempo Área
f: factor de respuesta. Cantidad de
sustancia por unidad de área
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Análisis cuantitativo
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Método del estándar externo
• Se preparan soluciones del estándar de concentración
conocida.
• Se grafica área vs. concentración
Debe verificarse el rango de linealidad de respuesta!!
Patricio Santagapita_CEBI_E1
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Método del estándar externo
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Método del estándar externo
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Método del estándar interno
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Método del estándar interno
Técnicas de Análisis
Cromatografía
Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Problemas
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
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Técnicas de Análisis
Cromatografía
Análisis de paper
Ref: Balázs Bobály et, al. Recovery of proteins Affected by Mobile
Phase Trifluoroacetic Acid Concentration in Reversed-Phase
Chormatography. Journal of Chromatographic Science 2014;1–6.