caracterizaciÓn de metabolitos secundarios apartir de tejidos vegetales
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UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS
SECUNDARIOS APARTIR DE TEJIDOS
VEGETALES
TESINA
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
T.S.U en Química Área Biotecnología
Presenta
Jairo Arturo Vargas Villegas
Asesor interno
M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez
Asesor Externo
Dr. en C. Eugenio Sánchez Arreola
Xicotepec de Juárez, Puebla. Septiembre 2012
I UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
ÍNDICE
ÍNDICE ........................................................................................................ I
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................... IV
AGRADECIMIENTOS ................................................................................ V
DEDICATORIAS ....................................................................................... VI
RESUMEN ............................................................................................... VII
SUMMARY .............................................................................................. VIII
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1
2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS
PUEBLA.................................................................................................... 4
2.1 Misión ................................................................................................ 5
2.2 Visión ................................................................................................. 5
2.3 Organigrama de la Institución ......................................................... 6
2.4 Ubicación .......................................................................................... 7
3. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................ 9
3.1 Cultivo de Células y tejidos vegetales............................................ 9
3.1.1 Reguladores de Crecimiento Vegetal ........................................ 11
3.1.2 Obtención de Callos ................................................................... 12
3.1.3 Medios de Cultivo ........................................................................ 13
3.1.3.1 Macronutrientes ....................................................................... 14
3.1.3.2 Micronutrientes ........................................................................ 15
3.1.3.3 Vitaminas .................................................................................. 15
3.2 Cinética de Crecimiento Celular ................................................... 16
II UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.3 Metabolitos secundarios ............................................................... 17
3.3.1 Inducción a los Metabolitos Secundarios ................................. 17
3.4 Cromatografía ................................................................................. 18
3.4.1 Tipos de Cromatografía .............................................................. 19
3.4.2 Cromatografía Líquido-Sólido (CLS) ......................................... 20
3.4.3 Cromatografía Líquida de Alta Presión ..................................... 22
3.4.3.1 Proceso de Derivatización ....................................................... 24
3.5 Antecedentes .................................................................................. 26
4. JUSTIFICACIÓN .................................................................................. 32
5. OBJETIVOS ........................................................................................ 33
2.1 Objetivo General ............................................................................. 33
2.2 Objetivos particulares .................................................................... 33
6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................ 34
6.1 Obtención de la materia Vegetal ................................................... 34
6.2 Formación de Callos ...................................................................... 34
6.3 Obtención de los Metabolitos Secundarios ................................. 35
6.3.1 Obtención de los Extractos ........................................................ 35
6.4 Determinación de los Metabolitos Secundarios .......................... 36
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 37
7.1 Resultados ...................................................................................... 37
7.1.1 Obtención de la Materia Vegetal ................................................ 37
7.1.2 Formación de Callos ................................................................... 38
7.1.3 Obtención de Extractos .............................................................. 39
7.1.4 Determinación de Metabolitos Secundarios ............................. 40
III UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
7.2 Discusión ........................................................................................ 42
8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS................................................. 44
8.1 Conclusiones .................................................................................. 44
8.2 Perspectivas ................................................................................... 44
9. FUENTES CITADAS ............................................................................ 45
10. ANEXOS ............................................................................................ 50
11. GLOSARIO ........................................................................................ 54
IV UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Organigrama de la universidad de las Américas Puebla. ................... 6
Figura 2. Mapa de Ubicación de la Universidad de las Américas Puebla. ......... 7
Figura 3. Función de los RCV en cultivos de células y tejidos vegetales. ...... 11
Figura 4. Fases del crecimiento Vegetal. ........................................................ 17
Figura 5. Propiedades de los disolventes más comunes. ................................ 21
Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. ................ 23
Figura 7. Representación Cromatografíca dela fase inversa. .......................... 24
Figura 8. Heterotheca inuloides y Gnaphalium Oxyphyllum. .......................... 37
Figura 9. Formación de Callos. ........................................................................ 39
Figura 10. Maceración. .................................................................................... 40
Figura 11. Muestra lista para HPLC. ............................................................... 41
Figura 12. Análisis de HPLC para H. inuloides. ............................................... 41
Figura 13. Análisis de HPLC para G. Oxyphyllum. .......................................... 42
V UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
AGRADECIMIENTOS
Al creador por haberme guiado en cada uno de los pasos que di, algunos buenos
y algunos malos pero al final de todo el objetivo se cumplió.
A mis padres por ser pilares fundamentales durante toda mi vida, por haberme
llevado por el camino del bien y estar conmigo siempre.
A mis amigos por esas voces de conciencia en todo momento por todos aquellos
momentos de diversión y mas…
A mis pachis Cesar, José, Oscar y Tonys por que mas que ser amigos son como
mis hermanos más a ya de las voces de conciencia fueron los que estuvieron en
las buenas en las malas…
A mi alma mater la universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez, en especial a
la M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez por ser pieza clave en la realización
de este trabajo, asesorándome, aconsejándome y dándome ánimos para seguir…
A la Fundación Universidad de las Américas Puebla por brindarme esta magnifica
oportunidad de realizar este trabajo, también al Dr. en C. Eugenio Sánchez
Arreola por el asesoramiento y los conocimientos obtenidos.
Cabe destacar mi más sincero agradecimiento a mis compañeros del laboratorio
de investigación fitoquimica, Adriana, Priscilla Osnat, Ana y Fanny por el apoyo y
la entrañable amistad creada durante mis 4 meses de estancia en UDLAP.
VI UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
DEDICATORIAS
A mis padres y Hermana mi gratitud eterna…
A mi Familia por el apoyo incondicional…
A mis profesoras, Alma, Zaira y Marcela mi admiración y gratitud…
A mis amigos Coco, Mariela, Lupita, Cesar, Oscar y José Antonio por el apoyo
incondicional y por estar siempre a mi lado…
A Carmen Animas Hernández por enseñarme que: “los Caminos de Dios son
Misteriosos pero Siempre a Nuestro Favor.”
VII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A
PARTIR DE CELULAS VEGETALES
Vargas Villegas Jairo-Arturo1, Vázquez Sánchez Alma-Yolanda
2, Sánchez Arreola Eugenio
3
I. RESUMEN
Actualmente el cultivo in-vitro es una de las herramientas biotecnológicas más
importantes ya que gracias a él se han podido rescatar especies vegetales en
peligro de extinción. Gracias a estos métodos de propagación la medicina
tradicional mexicana ha retomado un importante papel en la ciencia actual ya que
resulta ser más viable la sustracción e identificación de principios biológicamente
activos. Si bien el gordolobo (G. Oxyphyllum) y árnica (H. Inuloides) no están en
peligro de extinción, resulta interesante el estudio de sus partes activas ya que
ambas plantas poseen una gama de beneficios extraordinaria ya sea como
desinflamatorio y cicatrizante (H. inuloides), y para afecciones respiratorias para
(G. oxyphyllum). Por lo cual el presente trabajo tuvo como objetivos inducir la
callogenesis de ambas especies vegetales utilizando técnicas de desinfección
como la asepsia superficial y microbiológica, así como la utilización de
reguladores de crecimiento (auxinas, citocininas) vegetal, puntos clave para la
inducción a callo. Los resultados obtenidos indican que la auxina ácido -
naftalenacético induce callogenesis en explantes de hojas de plantas silvestres
adultas de H. inuloides y esta auxina en combinación con las citocininas cinetina y
6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum. Obteniendo así, el
establecimiento del cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a
partir de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.
Palabras clave: Cultivo in-vitro, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, Reguladores de
Crecimiento Vegetal, HPLC
1Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Química Área en Biotecnología, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilió conocido col. Tierra Negra C.P.
73080. Xicotepec de Juárez Puebla. E-mail: lordfiere@hotmail.com 2Asesor Interno de Estadía. M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Química Área Biotecnología, T.S.U.
Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Juárez Puebla. 3Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Sánchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigación fitoquimica del dapartamento de
ciencias químico Biológicas, Universidad de las Américas Puebla. Santa Catarina Mártir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrés Cholula Puebla.
VIII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A
PARTIR DE CELULAS VEGETALES
Vargas Villegas Jairo-Arturo1, Vázquez Sánchez Alma-Yolanda
2, Sánchez Arreola Eugenio
3
II. ABSTRACT
At present the culture tissue is one of the most important biotechnological tools and
because of this, plant species in danger of extinction have been rescued. As a result of
these extended methods, Mexican traditional medicine has regained an important role in
current research since the subtraction and identification of biologically active principles
turns out to be more feasible. Although Gordolobo (G. Oxyphyllum) and Árnica (H.
Inuloides) plants are not in danger of extinction, the study of their active parts turns out to
be interesting since according to the traditional Mexican medicine both plants possess a
great amount of extraordinary benefits such as anti-inflammatory, cauterizer (H. inuloides),
and against respiratory affections (G. oxyphyllum). That is the reason that the present
work had the purpose to induce the callogenesis of both vegetable species using
disinfection techniques such as superficial and microbiological asepsis, as well as the
utilization of plant growth regulators like auxins and citocininas, which they are key points
to callosity induction. The obtained results indicated that the auxin acid α-naftalenacetic
induces callogenesis in wild adult plant leave implants of H. inuloides and this auxin in
combination with the citocininas cinetina and 6-bencilaminopurine induces callogenesis in
G. oxyphyllum. Concluding this way the establishment of in vitro callosity cultivation of H.
inuloides and G. oxyphyllum from wild adult plant leave implants.
Keywords: culture tissue, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, plant growth regulators,
HPLC
1Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Química Área en Biotecnología, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilió conocido col. Tierra Negra C.P.
73080. Xicotepec de Juárez Puebla. E-mail: lordfiere@hotmail.com 2Asesor Interno de Estadía. M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Química Área Biotecnología, T.S.U.
Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Juárez Puebla. 3Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Sánchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigación fitoquimica del dapartamento de
ciencias químico Biológicas, Universidad de las Américas Puebla. Santa Catarina Mártir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrés Cholula Puebla.
1 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
1. INTRODUCCIÓN
El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido
moderadamente para abarcar tanto el cultivo aséptico de tejidos como el de
células y órganos, dentro de un grupo de técnicas que se fundamentan en varios
principios. Entre estos principios, los mas importantes sin duda son la
totipotencialidad celular propuesta por Haberlandt (1902) y la hipótesis del balance
hormonal sugerida por Skoog et al. (1957). Aun cuando estos principios han sido
cuestionados por diferentes autores como Trewavas (1981,1982) y Firn (1980)
todos ellos parecen encontrar cierto grado de fundamentación en la mayoría de los
modelos biológicos empleados en el estudio de la morfogénesis in-vitro.
Las técnicas de cultivos asépticos han contribuido no solo a un mejor
entendimiento de los eventos de diferenciación celular sino al aprovechamiento de
tales eventos en la explotación más eficiente de las plantas. En este ultimo
aspecto vale la pena mencionar los siguientes usos de las técnicas de cultivo in-
vitro: A) Mejoramiento genético; B) obtención de plantas libres de virus y de otros
patógenos; C) conservación de germoplasma; D) micropropagación. (Murashige,
1974).
En la actualidad el cultivo in-vitro se practica con éxito en especies hortícolas
(Murashige, 1978), ornamentales (Hughes, 1981), y más recientemente en
especies leñosas (Thorpe, 1983). En algunas especies esta metodología ha
mostrado importantes ventajas en comparación con los sistemas convencionales
de propagación; los más importantes son:
Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo.
Reducción del tiempo de multiplicación.
Posibilidad de reproducir grandes cantidades de plantas en una superficie
reducida, a bajos costos y tiempo económicamente costeables.
Mayor control de la sanidad del material que se propaga.
2 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Facilidad de transporte del material in vitro de un país a otro, con menos
restricciones aduanales.
Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual solo existen
pocos individuos. (Murashige, 1974).
La reciente re-valoración del conocimiento tradicional abrió una puerta para el
rescate y promoción de la medicina tradicional, incluyendo modelos tradicionales
de dichas practicas con nuevos modelos que incluyen estudios fotoquímicos
avanzados para la sustracción e identificación de los principios biológicamente
activos y así finalmente de ponerla al día, mantenerla como una práctica
socialmente viva, darle reconocimiento oficial pleno, imprimirle una actualidad
técnica eficiente, y de integrarla como un método pleno de posibilidades
salutíferas en la práctica de la medicina contemporánea.
Árnica Mexicana (Heterotheca inuloides)
Heterotheca inuloides es la planta medicinal con nombre popular de Árnica más
conocida y utilizada en México; en México por lo menos se les conoce con el
nombre de Árnica a 15 plantas diferentes. El género Heterotheca contiene
alrededor de siete especies nativas de Norteamérica, incluyendo México.
Pertenece a la familia de las Compuestas (Asteraceae). Es una de las plantas
medicinales más utilizadas en México. Su uso medicinal es muy similar a la
especie europea (Arnica Montana), se preparan numerosas pomadas y ungüentos
para aplicarse externamente en caso de golpes e inflamaciones. Los antiguos
mexicanos la utilizaban frecuentemente para aplicaciones en forma de cataplasma
en hemorroides, rozaduras en bebes, ronchas y llagas de cualquier origen.
(Martínez, 1969).
3 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Gordolobo (Gnaphalium Oxyphyllum)
Planta mexicana de amplia distribución, existen más de cuarenta especies y
crecen naturalmente en las montañas elevadas (Baytelman B. 1980).
El gordolobo es conocido también con el nombre náhuatl de tzonpotónic. Esta
especie es utilizada en varias regiones de América por ser de mucha utilidad en la
medicina tradicional. Existen otras plantas del mismo nombre, poco diferentes en
forma, con casi las mismas propiedades. Es una planta que mide entre 35-75 cm.
De altura su tallo es velludo, sus hojas son angostas, largas, verdes por la parte
de arriba, el envés es velludo y blanquizco, sus flores son de color blanco en
forma de estrella localizadas en la punta del tallo y no es espinosa (Argueta et al,
1994).
Es utilizada en las afecciones de las vías respiratorias como expectorante,
generalmente en tos seca infecciones de garganta, gripa, asma, bronquitis, en los
trastornos gástricos (ulceras, dolor de estomago, parásitos), en heridas,
quemaduras, cólicos, dolores generalizados en la terapéutica del cáncer,
hidropesía, ciática y lumbago siendo utilizada toda la planta incluidas las flores. Su
distribución es amplia, comprendiendo los estados de Baja California, Durango,
Hidalgo, Michoacán, Morelos, Puebla, Sonora y Tlaxcala ya que la situación
climatológica de estos estados es favorable creciendo en los climas cálidos,
semicálido y templados entre los 20 y 1875 Metros Sobre el Nivel del Mar
(MSNM). Su crecimiento se desarrolla en suelos de cultivo, riego y temporal así
como en cualquier suelo (Argueta et al, 1994; Martínez, 1979).
4 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS
AMÉRICAS PUEBLA
La Universidad de las Américas Puebla ofrece programas de estudio en una gran
variedad de áreas del conocimiento a través de cinco escuelas: Artes y
Humanidades (EDAH), Ciencias (EDEC), Ciencias Sociales (EDCS), Ingeniería
(EDEI) y la de Negocios y Economía (EDNE). En total, se ofrecen 48 programas
de licenciatura, 30 programas de maestría (incluidas 10 maestrías por Internet) y 4
programas de doctorado. Asimismo, cuenta con 300 convenios de cooperación
internacional, que incluyen programas de doble diploma con universidades de alto
prestigio tanto de Europa como de Estados Unidos, en donde los alumnos reciben
el diploma de la UDLAP así como el de la universidad anfitriona.
Actualmente, la UDLAP se encuentra clasificada como Institución de Nivel VI, el
máximo reconocimiento que otorga la Southern Association of Colleges and
Schools (SACS). Esta clasificación acredita que los estudios realizados en la
UDLAP cumplen a plenitud con los más altos estándares de calidad internacional.
La UDLAP participa activamente en diversas asociaciones universitarias
nacionales e internacionales y mantiene con ellas una comunicación permanente.
De estas asociaciones recibe información y asesoría para todo tipo de procesos
de la institución.
La Universidad busca la excelencia académica de sus egresados y una alta
calidad en las investigaciones que realizan sus profesores e investigadores. En tal
sentido, orienta sus esfuerzos a brindar un servicio educativo de alto nivel, lograr
la formación integral de sus estudiantes, mantener un ambiente multicultural
basado en el respeto y promover la comprensión internacional.
Dado su carácter, se organiza legalmente como una fundación. Todos sus
programas académicos guardan la debida acreditación ante la Secretaría de
5 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Educación Pública y tienen plena validez oficial por parte de las autoridades
educativas del Estado de Puebla. Asimismo, sus programas están reconocidos por
diversas universidades de América Latina, Europa y el sistema educativo de los
Estados Unidos de Norte América.
El estudiante puede realizar parte de sus estudios fuera del país y ampliar sus
horizontes o acceder a la práctica profesional en el extranjero. De esta manera, el
ámbito de formación y desarrollo profesional ofrecido por la universidad es más
extenso y variado que el de otros centros educativos de nivel superior en la
República.
2.1. MISIÓN
“Formar profesionistas bien informados, críticos, creativos, innovadores y
altamente capaces en lo técnico, pero sobre todo, conscientes de la alta
responsabilidad social que les exige lograr una distribución equitativa de los
beneficios que la globalización produce”.
2.2. VISIÓN
“Ser reconocida mundialmente como la institución líder en programas académicos,
científicos, culturales y de propuesta de política pública que respondan a los retos
presentados por la globalización”
6 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
2.3. ORGANIGRAMA DE LA INSTITUCIÓN
Fig.1 Organigrama institucional UDALP . Tomado de
http://www.udlap.mx/internas/html/esp/organigrama2.aspx#
7 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
2.4. UBICACIÓN
La universidad de las americas puebla se encientra ubicada en la ex hacienda
Santa Catarina Martir,San Andrés Cholula,Puebla C.P 728010.
Fig 2. Ubicación . tomado de : http://www.udlap.mx/internas/mapaudlap.aspx
8 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de investigacion fitoquimica del
departamento de ciencias quimico biologicas de la Universidad de las Américas
Puebla, bajo la direccion del Dr Eugenio Sanchez Arreola profesor investigador
titular.
9 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3. REVISION DE LITERATURA
3.1. CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES
Las plantas son fuente de diversas sustancias de interés para el hombre, en las
que se incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados
en la industria como colorantes, saborizantes, fragancias y fármacos, entre otros.
De manera general, en las plantas, la acumulación de estos compuestos ocurre
sólo en ciertas épocas del año y en algunos órganos, lo que puede limitar su
abastecimiento. Por ello, el cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) ha sido
considerado como una alternativa biotecnológica para la producción de
metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Después del desarrollo
comercial para la producción de la chiconina con cultivos de células de
Lithospermum erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de
cultivos de células y tejidos vegetales y la identificación de compuestos con
potencial para su producción industrial (Zhao et al., 2005).
El CCTV es un conjunto de técnicas que presenta en común el hecho de que un
explante (semilla, órgano, tejido o célula viva) se inocula asépticamente en un
medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones
controladas. Lo anterior se basa en el principio de totipotencia celular, el cual
establece que a partir de una célula vegetal, es posible regenerar un individuo fértil
con las mismas características del individuo original, manteniendo su información
genética para realizar todas las funciones de una planta completa (Kieran et al.,
1997). Inicialmente las técnicas de cultivo de células y tejidos vegetales fueron
concebidas y empleadas como herramienta de investigación básica, para estudiar
la bioquímica y fisiología vegetal. Sin embargo, estas técnicas evolucionaron a
tecnologías comerciales para la micropropagación, el mejoramiento genético de
10 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Especies y la producción de metabolitos secundarios de interés industrial
(Rodríguez-Monroy et al., 1999).
El CCTV ofrece varias ventajas sobre la recolección de plantas silvestres y el
desarrollo de cultivos en campo, entre las cuales se pueden mencionar: 1) La
independencia de las condiciones ambientales; 2) Establecer condiciones para la
obtención de productos homogéneos; 3) Establecer un sistema de producción
definido, en el lugar donde se requiere del producto; 4) Obtención de productos en
menor tiempo (Doran, 1999; Sajc et al., 2000).
Para establecer un cultivo vegetal in vitro, se parte de la selección de la planta de
interés y de la colecta de material biológico (ejemplares completos y semillas). La
elección del explante apropiado para el establecimiento de cultivos de células y
tejidos vegetales está basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es
obtener plántulas asépticas (libres de virus), el explante ideal es el meristemo
(dependiendo de la especie de 0.2 – 0.5 mm de longitud) o la germinación de
semillas en condiciones asépticas. Para inducir respuesta de callogénesis y/o
morfogénesis, las células meristemáticas de los tejidos obtenidas de plántulas en
condiciones asépticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa
denominada callo) o diferenciada (organogénesis o embriogénesis), mediante la
aplicación de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).
11 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.1.1. REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL
Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgánicas que a
bajas concentraciones influyen en los procesos fisiológicos de las plantas (Fig. 1)
Fig. 3: Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células
y tejidos vegetales. (Frankenberger y Arshadm, 1995).
Los RCV cuando son producidos por las plantas (endógena) se les denominan
fitohormonas, las cuales actúan como mensajeros químicos que regulan el
crecimiento y desarrollo de la planta. También regulan las respuestas a las
señales ambientales (Morgan, 1990). El término regulador de crecimiento vegetal
se refiere a un compuesto sintético o natural que se aplica (exógena) para alterar
el crecimiento y desarrollo de las plantas o cultivos de células y tejidos vegetales.
El término fitohormona y regulador de crecimiento vegetal se utiliza
alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas,
giberelinas y ácido abscísico (Frankenberger y Arshadm, 1995).
12 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.1.2. OBTENCIÓN DE CALLOS
Las células vegetales poseen dos características que las hacen especiales: la
totipotencia, capacidad inherente de una célula para generar una planta completa
y la desdiferenciación, capacidad para volver al estado meristemático de una
célula diferenciada, situación que no ocurre en células animales. Para que una
célula vegetal exprese su totipotencia debe experimentar una desdiferenciación y
luego una nueva diferenciación de acuerdo a las condiciones ambientales del
cultivo. Esto puede lograrse si se colocan partes pequeñas de un tejido u órgano
de la planta (explante) en un medio de cultivo apropiado con los nutrientes y
reguladores de crecimiento, los cuales manipulados convenientemente pueden
generar callos o desarrollar yemas o embriones (Skoog y Miller, 1957).
Los callos se pueden definir como masas de tejido parenquimático indiferenciado
en crecimiento activo. Son agregados celulares amorfos que surgen del
crecimiento desorganizado de explantes sobre un medio de cultivo específico en
condiciones asépticas. Estos agregados celulares no se corresponden con ningún
tejido particular de la planta completa. El término cultivo de callos fue escogido
debido a que la proliferación celular se pensaba era inducida por la herida del
explante durante la escisión. Sin embargo se ha encontrado que es inducido por
reguladores de crecimiento de la planta en el medio de cultivo sólido. Las
hormonas y los reguladores de crecimiento en general son los responsables de la
distribución de los compuestos que la planta biosintetiza y que determinan el
crecimiento activo de todos los órganos (Whahby, 2007); su manera de actuar es
debida a una respuesta compleja sobre factores como la mitosis, polarización,
formación de los primordios y desarrollo de los meristemos. Una vez formados los
callos, puede presentarse una variación somaclonal, normalmente durante los
repetidos subcultivos de mantenimiento de los callos. Este es un período crítico
porque debido a esta variación somaclonal la producción de metabolitos puede
variar de subcultivo en subcultivo (Bourgaud et al., 2001). Después de cierto
13 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Tiempo se alcanza una estabilidad genética y cada callo puede ser considerado
un agregado celular homogéneo.
Uno de los usos principales del cultivo de callos es la obtención de suspensiones
celulares. En muchos casos, para obtener suspensiones celulares finas, es
adecuado aumentar la friabilidad (callo disgregado y esponjoso) del tejido calloso
por incremento de la concentración de la auxina o disminución de la citoquinina en
el medio de crecimiento. Dependiendo de la especie utilizada el ciclo de subcultivo
a partir de callo es de 4 semanas de acuerdo con la especie. Callos con
crecimientos más rápidos deberán subcultivarse cada dos semanas para
renovación de las células. Para crecimientos muy lentos no es conveniente
demorar los subcultivos por más de seis semanas.
3.1.3. MEDIOS DE CULTIVO
Son muchos los medios de cultivo utilizados en suspensiones celulares vegetales
que suministran los elementos esenciales para el desarrollo y mantenimiento
celular. El medio de cultivo más utilizado es el medio MS; éste tiene altos niveles
de nitrógeno inorgánico y de sales minerales, mientras que otras formulaciones,
como NN (Nietsch et al., 1967) tienen niveles muy bajos de nitrógeno inorgánico y
el medio White (1943) tiene bajo contenido de sal. En general, hay una tendencia
a usar niveles más bajos de NH4+ que de NO3
- en medios para cultivos de tejidos
vegetales. La cantidad de NH4+ en el medio MS es casi la mitad que de NO3
-,
mientras otras formulaciones, tales como SH (Schenk y Hildebrandt, 1972), B5
(Gamborg et al., 1968) y GD (Gresshoff y Doy, 1974), contienen niveles aún más
bajos de NH4+. La fuente de carbono comúnmente utilizada es la sacarosa en
concentraciones de 3%, este azúcar es fosforilado y luego forma un compuesto
complejo con una molécula transportadora que facilita su ingreso a la célula a
14 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
través de la membrana plasmática (Vásquez y Torres, 1995). La adición de
vitaminas mejora ostensiblemente el crecimiento de los cultivos vegetales y las
hormonas son necesarias para el alargamiento, crecimiento y división celular.
3.1.3.1. MACRONUTRIENTES
Los macronutrientes proveen los seis principales elementos, nitrógeno (N), fósforo
(P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S), requeridos para el
crecimiento de las plantas. La concentración óptima de cada nutriente para
alcanzar las máximas ratas de crecimiento varía considerablemente entre
especies.
Los medios de cultivo deben contener suficiente nitrógeno inorgánico para un
adecuado crecimiento de la célula vegetal. Las células vegetales pueden crecer
solo en nitratos, pero resultados considerablemente mejores son obtenidos
cuando el medio contiene tanto nitrato como amonio (Roca y Mrogiski, 1991).
Los nitratos son normalmente suministrados en el intervalo de 25-40 mM, mientras
que concentraciones típicas de amonio varían entre 2 y 20 mM. Concentraciones
superiores a 8 mM pueden ser letales para el crecimiento celular de algunas
especies. Las células pueden crecer en un medio de cultivo conteniendo amonio
como única fuente de nitrógeno, si uno o más de los ácidos del ciclo del ácido
tricarboxílico, como citrato, succinato o malato, están presentes en
concentraciones de aproximadamente 10 mM. Cuando las fuentes de nitrógeno,
nitrato y amonio, están presentes en el medio de cultivo, los iones amonio serán
utilizados más rápidamente que los iones nitrato. El potasio es requerido para el
crecimiento celular de muchas especies vegetales. La mayoría de los medios de
cultivo contienen potasio en forma de nitrato o cloruro, a concentraciones de 20-30
mM. Las concentraciones óptimas de P, Mg, S y Ca varían entre 1-3 mM cuando
son satisfechos todos los otros requerimientos para el crecimiento celular; en
ocasiones son necesarias concentraciones más altas si existen deficiencias en
otros nutrientes.
15 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.1.3.2. MICRONUTRIENTES
Los minerales esenciales para el crecimiento de tejidos y células vegetales
incluyen hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y molibdeno
(Mo). El hierro puede ser el más crítico de todos los minerales. Pueden ser usados
citrato y tartrato de hierro en medios de cultivo, pero estos compuestos son
difíciles de disolver y frecuentemente precipitan luego de que los medios son
preparados. El empleo del complejo EDTA-hierro puede superar este problema;
sin embargo estos complejos no son completamente estables, particularmente en
cultivo líquido, y pueden precipitar luego de unos pocos días. Cobalto (Co) y yodo
(I) también pueden ser adicionados a ciertos medios, pero no se han establecido
los requerimientos estrictos de estos elementos para el crecimiento celular. Sodio
(Na) y cloro (Cl) también son utilizados en algunos medios de cultivo pero no son
esenciales para el crecimiento celular. Cobre (Cu) y Co son adicionados
normalmente a medios de cultivo en concentraciones de 0.1 μM, Fe y Mo a 1 μM, I
a 5 μM, Zn a 5-30 μM, Mn a 20-90 μM, y B a 25-100 μM. Sin embargo, el
crecimiento está más limitado por las otras variables, especialmente por las
hormonas, que por los microelementos (Roca y Mrogiski, 1991).
3.1.3.3. VITAMINAS
Las vitaminas son requeridas por las plantas como catalizadores en varios
procesos metabólicos. Las células y tejidos vegetales cultivados in vitro, requieren
algunas vitaminas y se consideran factores muy importantes en el crecimiento
celular. Las vitaminas más frecuentemente utilizadas en medios de cultivo de
células y tejidos vegetales incluyen tiamina (B1), ácido nicotínico, piridoxina (B6), y
myo-inositol. La tiamina es indispensable para los cultivos celulares en
concentraciones de 0.1 a 10.0 mg/L. El ácido nicotínico es utilizado normalmente
en concentraciones de 0.1-5.0 mg/L; la piridoxina es utilizada entre 0.1-10.0 mg/L.
La vitamina que es básicamente requerida por todas las células vegetales para el
crecimiento es la tiamina. El ácido nicotínico y la piridoxina son con
16 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
frecuencia adicionados a los medios de cultivo, pero no son esenciales para el
crecimiento celular en muchas especies. El myo-inositol es comúnmente incluido
en muchas soluciones de vitaminas ya que ha mostrado estimular el crecimiento
en ciertos cultivos de células. Su presencia en el medio de cultivo no es esencial,
pero en pequeñas cantidades estimula el crecimiento celular en muchas especies.
Otras vitaminas como biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, ácido pantoténico,
vitamina E (tocoferol), riboflavina, y ácido p-aminobenzoico han sido incluidas en
algunos medios de cultivo. El requerimiento de estas vitaminas por cultivos de
células vegetales es generalmente despreciable, y no son consideradas factores
limitantes del crecimiento. Son generalmente adicionadas al medio de cultivo solo
cuando la concentración de la tiamina está por debajo del nivel deseado o cuando
es deseable crecer células a muy bajas densidades de población. (Villegas et. Al.
1992).
3.2. CINÉTICA DE CRECIMIENTO CELULAR
Para mantener una suspensión celular en crecimiento continuo, es necesario
identificar el momento apropiado en que los componentes del medio de cultivo se
agotan y deben ser renovados, así como remover las sustancias tóxicas
excretadas por las células durante su metabolismo. Por tanto se hace necesario,
bien sea, un subcultivo en medio fresco o un cambio de determinado volumen del
medio de cultivo para continuar los procesos fisiológicos normales. La etapa
apropiada puede ser determinada a partir de una curva de crecimiento celular con
respecto al tiempo, que depende a su vez de la cantidad de inóculo utilizado para
iniciar las suspensiones y de la composición del medio de cultivo. (Hurtado 1988).
La curva de crecimiento típica de células en suspensión presenta las siguientes
fases, (Figura 4):
17 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Figura 4. Fases del crecimiento celular. I Latente, II Aceleración, III Exponencial,
IV Desaceleración, V Estacionaria, VI Muerte. (Hurtado 1988).
Dependiendo de la especie, la mayoría de los cultivos de células vegetales en
suspensión alcanzan su máxima densidad celular entre 18 y 25 días, aunque
puede haber cultivos bastante activos, que la alcanzan entre los 6 y 25 días
(Hurtado 1988).
3.3. METABOLITOS SECUNDARIOS
Los productos naturales, llamados metabolitos secundarios, son compuestos
generalmente de bajo peso molecular, restringidos con frecuencia a familias o a
géneros especiales de plantas. No son importantes para el metabolismo primario
de la planta, pero en muchos casos son de gran importancia para la supervivencia
de la planta en su ambiente; generalmente se forman después de que el
crecimiento ha cesado (fase estacionaria) de allí que una de las estrategias
utilizadas es el cultivo en dos fases, una para el crecimiento y otra para la
producción. (Ibrahim et al., 2007).
3.3.1. INDUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS
Para que las técnicas de cultivo de células vegetales lleguen a ser
económicamente viables, es importante desarrollar métodos que permitan la
obtención de cantidades apreciables de los compuestos útiles de las células
cultivadas en suspensión. Hasta este momento, varias estrategias se han
18 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
desarrollado para mejorar la producción de metabolitos secundarios con el empleo
de células vegetales. Las células del cultivo de tejidos acumulan normalmente
grandes cantidades de compuestos secundarios solamente bajo condiciones
específicas. Eso significa que la maximización de la producción y de la
acumulación de metabolitos secundarios por las células cultivadas de tejidos
vegetales requiere la manipulación de los parámetros del ambiente y el medio de
cultivo, seleccionar líneas celulares de alta producción, el medio precursor
alimenticio y la elicitación. Numerosas investigaciones han sido realizadas para
estudiar el efecto de algunos factores físicos y químicos tales como el pH,
concentración de los nutrientes en el medio de cultivo, empleo de fitohormonas,
temperatura, aireación, luz y agitación, sobre el crecimiento de células en
suspensión y la producción de metabolitos secundarios (Bourgaud et al., 2001) en
diferentes especies vegetales; específicamente se ha estudiado el efecto de
algunos de los factores mencionados anteriormente (Ibrahim et al., 2009).
Aunque la mayoría de los factores mencionados han sido exitosos para mejorar y
aumentar la producción de metabolitos secundarios en diferentes especies
vegetales, los mejores resultados obtenidos para la transformación de plantas
superiores, especialmente de Nerium oleander, es el derivado del mecanismo
inductor de tumores de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens y
Agrobacterium rhizogenes (Ibrahim et al., 2007). Los cultivos de células u órganos
transformados tienen el potencial de incrementar la producción de metabolitos
secundarios.
3.4. CROMATOGRAFIA
La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de
una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.
a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase
estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.
19 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una
fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.
El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase
estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla
a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el
sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad,
dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las
dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de
modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que
son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el
flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a
la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta
movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas
discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. (Koh, 2006).
3.4.1. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden
distinguir distintos tipos de cromatografía:
a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un
líquido.
b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un
soporte sólido.
c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil
impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.
d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.
20 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla
y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre:
a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de
adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.
b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de
solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que
son ambas líquidas.
c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva
anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por
aquellos iones presentes en la fase móvil. (ASTM, 1979)
3.4.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-SÓLIDO (CLS).
La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que esta
finamente granulado. La superficie específica contiene centros polares aptos para
la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. Al disminuir el
tamaño de las partículas, el número de centros activos por unida es mayor, y la
capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente más utilizado es gel de
sílice aunque también se emplea alúmina activada. En el caso del gel de sílice la
interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales
polares de los compuestos orgánicos. (ASTM, 1979).
La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los componentes de la
mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elución de un
compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil y se puede
utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporción del
disolvente más polar. La retención se realiza en base a la competencia que se
establece entre el soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por
21 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las
moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y
van siendo desplazados por las moléculas polares presentes en la fase móvil.
(ASTM, 1979)
Fig. 5. Propiedades de los disolventes más comunes. (ASTM, 1989)
22 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.4.3. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN (HPLC)
La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en la
separación de componentes de una mezcla y su posterior detección. Las técnicas
cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que
consiste en un fluido (gas, líquido, o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra
con un flujo constante de presión proporcionado por una bomba, hasta llegar al
punto donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presión la lleva a una
columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un sólido o un
líquido fijado en un sólido. (Koh, 2006).
Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase
estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la
fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de haber
pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado, pasan por
un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del
tipo del compuesto, sus partes lo describe la figura 6.
El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase móvil con presión y flujo
constante, el proceso de inyección de la muestra en la actualidad es automática,
las columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y los detectores
su papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparición de los
diferentes componentes que constituyen la muestra, calificarlo cuantitativamente
como cualitativamente. (Koh, 2006).
23 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. Tomado de:
Skoog, Leary. 2000.
El uso de la cromatografía ha demostrado ser muy significativo para el estudio del
ácido lipóico, un tipo de cromatografía utilizado fue el HPLC-fase inversa (figura 4),
porque trabaja con las polaridades de los compuestos que se van analizar en el
futuro, ya que la fase móvil es mas polar que la fase estacionaria. La fase móvil es
agua con un componente menos polar como puede ser: agua/metanol,
24 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
agua/ACN. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza
apolar, tal es el caso del ácido lipóico que es un compuesto apolar, mientras que
las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. (Koh, 2006).
En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se
desgasifique todo componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC,
esto con el propósito de evitar daños futuros. En el análisis de ácido lipóico todos
los solventes, el agua de HPLC, junto con la fase móvil deben ser pasados a
través de un filtro de 4μ y desgasificados al bajo vacío, antes de su uso. (Koh,
2006).
Se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las
fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto
relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. El efecto hidrofobico
disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil.
Fig. 7 Representación de cromatografía de fase inversa. Tomado de: Skoog,
Leary. 2000.
25 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.4.3.1. PROCESO DE DERIVATIZACIÓN
Derivatización pre-columna. Esta acoplada con cromatografía de fase reversa en
lugar de cromatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida
como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor
velocidad de análisis, las ventajas de la metodología de la derivatización pre-
columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere
máxima sensibilidad de detección, un reactivo fluorescente combinado con la
derivatizacion pre-columna es el método más indicado, Cómo desventaja está la
necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la
posibilidad de interferencia con la separación por exceso del reactivo, el medio de
reacción o la producción de diferentes derivados de un componente. Además la
estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatización
pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser
fundamental para los resultados obtenidos. La muestra a analizar es introducida
en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente
dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a
medida que adelantan por la columna. (Snyder, 1997).
26 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
3.5. ANTECEDENTES
El Árnica mexicana (Heterotheca inuloides) es una planta de 1 m de altura con
pelos en el tallo. Las hojas a veces son mas largas y anchas. Las flores están
agrupadas en una cabezuela con cerca de 150 flores todas colocadas en un
disco, parecidas a las margaritas; las brácteas que rodean la cabezuela están
ordenadas de mayor a menor y son velludas como el tallo. Es originaria de
México. Presente en climas cálido, semicálido semiseco y templado desde el nivel
del mar hasta los 2400 m y desde los 2000 a los 3100 MSNM. Cultivada en los
huertos familiares, asociada a bosques de encino, de pino y bosques tropicales
caducifolio y perennifolio, matorral xerófilo, pradera semiárida y bosque de
juníperos. (Barquin Zamora, 1991).
El complejo de plantas medicinales mexicanas conocidas como "Árnica" se
compone de varias especies de plantas: Heterotheca inuloides, conzattii
Mentezlia, pringlei Zexmenia, y especies de Haplopappus. entre otros. La planta
de este complejo, Heterotheca inuloides (Asteraceae), comúnmente denominado
como árnica mexicana, acahual, cuauteteco y xochihuepal, es ampliamente
utilizado en medicina popular para el tratamiento tópico de las contusiones y
magulladuras y para el tratamiento de las heridas de la piel y lesiones.(Camacho
R. 1985).
Esta especie es muy valorada y utilizada con frecuencia en diferentes partes de
México, (Nicholson M. 1993, Lozoya, et-al 1987).algunos de sus usos son
similares a las de Árnica montana. (Willuhn, Röttger 1980). Su principal cualidad
medicinal es que actúa como cicatrizante, desinfectante, desinflamante, y/o
analgésico. Abundan las referencias de su uso en el tratamiento de heridas, lo
cual implica colocar las hojas como emplasto o cataplasma, o con el cocimiento de
27 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
las hojas y/o ramas, lavar y aplicar fomentos sobre éstas. En ocasiones, el
cocimiento se hace junto con ramas de gordolobo (sp. n/r), en este caso, además
de realizar el lavado se ponen por un rato las plantas cocidas sobre las heridas y
se da un mejoral al paciente; esta curación se hace durante tres días. O
simplemente se esparcen las hojas tostadas y pulverizadas. (Barquin Zamora,
1991).
En caso de golpes internos o externos y contusiones, en los que hay dolor, se le
usa a manera de té, aunque para éstos dos últimos, también se aplica en
maceración o en forma de pomada, que se hace con la planta molida revuelta con
manteca. Asimismo, en diversas lesiones cutáneas, infectadas o no, como granos,
llagas, moretones, ronchas, infecciones y rozaduras de bebé, se lavan o se
aplican compresas con su cocimiento. Como analgésico en casos de el dolor de
Úlcera, de estómago o de la boca del estómago, de pulmón, (por pulmonía), de
pecho, muscular, renal (V. dolor de riñón) o de reumas, se bebe la infusión de la
planta como agua de tiempo, o se emplea en fomentos calientes si se padece
dolor de muelas. (Chino, Jacques, 1986).
Para problemas gastrointestinales como ardores de estómago, gastritis o úlceras,
se bebe el cocimiento, ya sea en ayunas o después de cada alimento. Para tratar
úlceras del hígado se toma la infusión de las flores y hojas durante un mes, o más
tiempo si continúan las molestias; asimismo se usa cuando se tiene sensación de
boca amarga, disentería, piorrea, falta de apetito, para el hígado, limpiar el
estómago y descongestionar la vesícula. En afecciones respiratorias, como
bronquitis, tos, pulmonía o dolor de pulmón, se toma la infusión de la planta junto
con cuachalalate, durante nueve días. En la atención del postparto se administra,
por vía oral, el té elaborado con árnica y raíz de capitaneja, mismo que se ocupa
cuando se padece hemorragia vaginal, michicahues de mujer (V. cachán) y para
propiciar la fertilidad femenina, así como en padecimientos cardiovasculares como
almorranas, úlceras en las várices, afecciones del corazón y como tónico cardíaco.
Se menciona que también es útil para darlo a los niños que se orinan en la cama,
28 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
en padecimientos de los riñones, e irritación de la vejiga, contra el cáncer, para los
nervios y lavar los ojos. (Gómez, Chong 1985).
Químicamente, el órgano más estudiado de Heterotheca inuloides, y casi el único,
es la flor. Contiene un aceite esencial en el que se han identificado los
sesquiterpenos cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-iso-cadapeno, calacoreno y
epóxido de cariofileno.(Bohlman, Zdero 1976).
La parte mas estudiada es la flor, para la que se reporta:
Aceite esencial:
Sesquiterpentenos (cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-isocadapeno,
calacoreno, epóxido de cariófileno, 2-3-epoxi-7-hidroxi-beta-calacoreno, 4 hidroxi-
2-iso-propil-4-7-dimetil-nafa-talenona, 7-hidroxi-3,4dihydrocadeleno, 7-
hidroxicadeleno, beta-cariofileno, beta-catiofileno 4,5-alfa-oxido). Flavonoides
(astragalin, cariatín, eterdimetilico de eriodictiol, lutein, tetrametil-eter de
quercetagenin dimetil-eter, tetrametil-eter, alfa-arabinosido, beta-glucoronido, beta-
gluconido-dimetil-éster de quercitín, iso-quercitín, rutin, trifolin). Componente
fenólicos (ácido cefeico, clorogénico , protocatéquico). Cumarinas (umbeliferona,
cariolan-1,9 beta-diol). Triterpenos (alfa-y beta-amirina, cicloartenol, lanosterol).
Esteroides (avenastenolo,campesterol, beta-sitosterol, alfa-espinasterol,
estigmastenol, estigmasterol). Partes aéreas: Sesquiterpenos (cadaleno, 4-hidroxi-
2-isp-propil-4-7-dimetil-naftalenona). Flovonoides (quercetína). Flavonas
(apigenina, kaempferol,luteolina). (Jerga, 1987).
En un estudio de fines del siglo pasado se describe que de las flores de esta
planta se han obtenido, una resina, aceite esencial, grasa, una sustancia colorante
amarilla, tanino, ácidos gálico, oxálicom, goma, almidón, un principio amargo y un
alcaloide.(Jerga,1990).
Dentro de los estudios que se le han hecho, en el área microbiológica se sabe
que ejercen fuerte actividad antimicrobiana sobre (Argueta et al, 1994):
29 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
• Bacillus subtilis
• Escherichia coli
• Pseudomonas aeruginosa
• Candida albicans
• Staphylococcus aureus
De los cuales de destacan los siguientes compuestos: Sesquiterpenos: 7-hidroxi-
3,4-dihidrocadalina y 7-hidroxicadalina muestrando una potente activada contra G
(+), siendo el primero el más notable contra cepas de Staphylococcus aureus
resistente a meticilina (MRSA), a una concentración mínima bactericida (MBC) de
12.5 microgramos/ml. (Kubo, 1994).
Además de poseer actividad anti-inflamatoria in vivo e in vitro, actúa como
inhibidora de la actividad de la Tirosinasa, como analgésica, antioxidante y
tiene actividad citotóxica contra varios líneas tumorales sólidas (Delgado et al,
2001; Gene et al, 1998; Haraguchi et al, 1996; Haraguchi et al, 1997; Kubo et al,
1994; Kubo et al,1996; Kubo et al, 2000; Segura et al, 2000).
GORDOLOBO
Planta erecta bianual o perenne de vida corta con uno o varios tallos ascendentes,
ramificadas desde la base, de 30 a 75 cm de altura, cubiertos con pequeñas
cerdas lanosas largas y entrecruzadas; hojas numerosas, lanosas, apiñadas,
oblongo-lineares, espatuladas de la base, hojas de 1 a 2 cm de ancho por de 5 a
12 cm de largo, pecioladas con la base prolongada sobre el tallo extendida hacia
abajo, submembranosa con lana fina en la parte de abajo, glabros y verde
30 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
opacos en la parte de arriba, aguda a acuminada-apiculada en el ápice
marchitándose pronto de la base. Cabezuelas pocas a muchas, pequeñas, de 3
a 4.5 mm, al momento de abrirse la flor, más o menos globosas muy agrupadas,
Arregladas en panículas en la punta de las ramas, los frutos son aquenios
(Shreve y Wiggins, 1964). Florece de marzo a diciembre.
Es la tos, el padecimiento para el cual se emplea con mayor frecuencia a esta
especie en algunos estados del centro de la República Mexicana (Hidalgo;
Morelos, Puebla, Tlaxcala, Michoacán y Sonora). Asimismo, es muy útil en
problemas pectorales, infecciones en la garganta, bronquitis, asma, y para
descongestionar los bronquios. En trastornos gástricos interviene en el tratamiento
de las úlceras, dolor de estómago y parásitos intestinales (V. lombrices). (Barquin
Zamora, 1991).
Se emplea toda la planta con flores, por ejemplo, para la tos, que es debida al
catarro frío muy intenso, se ingiere el cocimiento de la planta o se prepara un
cocimiento en leche junto con otras plantas del mismo género y se toma en
ayunas durante nueve días; si la tos es crónica sólo se hierven las flores en leche
para tomarse tres veces al día; en ocasiones se hierven las ramas con las hojas
junto con ”ocote” (sp. n/r).También se ocupa en la terapéutica del cáncer, heridas,
fiebre, hidropesía, ciática y lumbago.(Cedillo,1990).
Historia.
En el siglo XVI, Francisco Hernández comenta: “la raíz es calorífica y secante,
triturada y tomada purga los humores flemáticos con seguridad y sin molestia por
el conducto superior”. Para el siglo XX, Maximino Martínez la reporta como:
antirreumático, antitusígeno; contra bronquitis, y dolor de garganta; es emoliente.
La Sociedad Farmacéutica de México la describe como antirreumático y
emoliente. (Martinez, 1944).
31 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Para esta especie se reportan: diterpenos, flavonoides, compuestos
acetilenicos, carotenoides. En estudios recientes se reporta ácido ent-Kaur-16-en-
19-oico, zoapatlin, beta-sitosterol, y estigmasterol (Villagómez-Ibarra et al, 2001).
En un estudio realizado a tres especies mexicanas de Gnaphalium, para la
especie oxyphyllum se reporta que el extracto hexánico de las flores exhibe un
amplio espectro de actividad contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Salmonella typhimurium y Escherichia coli, a una concentración de 50 mg/ml
(Rojas et al, 2001; Villagómez-Ibarra et al, 2001).
32 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
4. JUSTIFICACIÓN
En los últimos años el cultivo de tejidos vegetales ha tomado un auge importante
en el desarrollo de nuevas tecnologías de preservación y conservación de
especímenes vegetales en peligro de extinción, dada la viabilidad de este método
se han podido determinar propiedades químicas relevantes para la industria en
general sin alterar el débil equilibrio ambiental, la demanda de dicha materia
vegetal y la rápida obtención de esta. Dadas las propiedades medicinales de la
árnica y el gordolobo resulta muy importante enfocar una investigación cuyo
objetivo sea la preservación de dos especies vegetales de importancia en la
medicina tradicional mexicana y a su vez la comparación de los metabolitos
secundarios entre el cultivo in-vitro y la in-vivo.
33 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
5. OBJETIVOS
5.4. OBJETIVO GENERAL:
Aplicar la técnica de cultivo in-vitro a plantas de interés medicinal, en este caso
Árnica (Heterotheca Inuloides) y Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum).
5.5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Inducir la callogenesis en explantes de Árnica (Heterotheca Inuloides) y
Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum).
Comparar los extractos de gordolobo y árnica con los extractos obtenidos
de los callos mediante un análisis de HPLC.
34 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
6. MATERIALES Y METODOS
6.4. OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL
Los explantes fueron obtenidos de hojas jóvenes de Gordolobo (Gnaphalium
oxyphyllum) y Árnica Mexicana (Heterotheca inuloides) respectivamente,
completamente sanas, que no presentaron lesiones de patógenos externos.
El material vegetal seleccionado se obtuvo de dos fuentes, la primera el Jardín
Etnobotánico “Francisco Peláez R.” se encuentra ubicado en la 2 sur #1700, en
San Andrés Cholula, Puebla, México. La segunda en el mercado de flores y
plantas de Tenango de las Flores, Huauchinango Puebla.
6.5. FORMACION DE CALLOS
En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación
de raíces en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes
adventicios y la combinación de auxinas y citocininas en una misma concentración
para la formación y proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los
tejidos de las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad
de respuesta por la edad, la etapa fenológica, el tipo de explante, así como por la
cantidad de hormonas endógenas y proteínas receptoras. Por lo que es necesario
realizar estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la
inducción callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.
Con el método de desinfestación utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un
85% de explantes de hoja libre de contaminación, el cual consistió en lavar los
explantes dos veces en agua de grifo para después ser sumergidos en una
solución de tween 20 al 5 % durante 5 minutos finalizando con un enjuague de
agua de grifo para la desinfección superficial.
35 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Para la desinfección microbiológica los explantes fueron tratados con una solución
de ampicilina al 5% durante 30 minutos para después ser aclarados tres veces en
agua bidestilada estéril. Además se llevo acabo una segunda desinfección
superficial la cual fue realizada con Ca (ClO)2 finalizando con 3 aclarados de agua
bidestilada doblemente estéril. Inicialmente, se contempló también el uso de
entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de este material fue del
100%, por lo que se descartaron.
El medio de cultivo basal utilizado fue el medio MS (Murashige y Skoog, 1962)
para el caso de los micronutrientes y para los macronutrientes se utilizo la
metodología propuesta por (Villegas et. Al. 1992), además con una concentración
de 30 g/l de sacarosa como fuente de carbono y solidificado con agar con una
concentración de 8 g/l, esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 120°C y 15
psi. El medio fue complementado con una combinación de hormonas de acuerdo
con el diseño experimental propuesto por (Villegas et. Al. 1992).
Después de haber obtenido los explantes se procedió a sembrarlos en frascos de
100 ml conteniendo cada uno 20 ml de medio. Una vez sembrados los explantes,
los frascos se taparon con papel aluminio y parafilm, se rotularon con la fecha de
siembra y el medio de cultivo usado. Los frascos fueron expuestos a temperatura
ambiente (18-20°C) en cuartos oscuros y sometidos a revisión visual periódica
para establecer la formación de callos friables y posibles contaminaciones.
6.6. OBTENCIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS
6.6.3. Obtención de los extractos
De ambas plantas se pesaron 50 gr y una vez pesado, se licuaron en seco para
lograr una mayor área de contacto, se saturo la materia vegetal con etanol de 96°
y se dejo macerar por 48 horas, una vez transcurrido el tiempo se filtro el
36 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
macerado y se evaporo el solvente en un rota vapor marca BÜCHI® modelo B-480
a una temperatura de 52°C.
Posteriormente se pesaron 100µgr y se aforo con 10 ml de MeOH.
6.7. DETERMINACIÓN DE LOS MEABOLITOS SECUNDARIOS
Para determinar la eventual presencia de los metabolitos secundarios de H.
inuloides y G. oxyphyllum se realizo un análisis HPLC de los dos extractos cuyos
solventes de la fase móvil fueron los mismos variando las proporciones la primera
MeOH 70% y H2O 30% y la segunda MeOH 80% y H2O 20%.
Del extracto anterior se tomaron 10 ml de la solución y se filtro con un microfiltro
de 0.45µm, para después tomar 20µl e introducirlos al análisis de HPLC marca
WATTERS® serie 410.
Los extractos utilizaron una columna XTERRA® Rp 5µm (4.6 * 250 mm).
37 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7.4. RESULTADOS
7.4.3. OBTENCIÓN DE LA MATERIA VEGETAL
Con el objetivo de localizar poblaciones H. inuloides y G. Oxyphyllum se utilizaron
dos estrategias. La primera consistió en revisar la colección de ejemplares de
nuestras dos especies del Jardín Etnobotánico “Francisco Peláez R.” (San Andrés
Cholula, Puebla), cuya revisión fue exitosa ya que ambos ejemplares se
encontraron en existencia, dada la disponibilidad geográfica de dichas especies la
producción de ambas especies (H. inuloides y G. Oxyphyllum) se distribuyen en
toda la republica mexicana excepto en sus penínsulas lo que posibilita hallarlas
en los estados de Puebla, Tlaxcala, Hidalgo, Guerrero, D.F. y Edo de México.
La segunda estrategia consistió en entrevistas con colectores y vendedores de
plantas del mercado de plantas de Tenango de las Flores,( Huauchinango Puebla),
Hermilo Amador(Xicotepec, puebla), Hidalgo(Puebla capital).
Los resultados arrojaron que H. inuloides es comercializada en la mayor parte de
los mercados visitados tanto en su presentación fresca como en la seca, a
diferencia de G. Oxyphyllum que solo fue conseguido en Jardín Etnobotánico
“Francisco Peláez R.” (San Andrés Cholula, Puebla).
Fig. 8. H. inuloides (izquierda) y G. Oxyphyllum.(derecha) Fuente. Propia
38 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
7.1.2. FORMACIÓN DE CALLOS
En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación
de raíces en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes
adventicios y la de auxinas y citocininas en una misma concentración para la
formación y proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de
las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de
respuesta por la edad, la etapa fenológica, el tipo de explante, así como por la
cantidad de hormonas endógenas y proteínas receptoras. Por lo que es necesario
estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la inducción
callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.
Con el método de desinfestación utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un
85% de explantes de hoja libre de contaminación. Inicialmente, se contempló
también el uso de entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de
este material fue del 100%, por lo que se descartaron.
Los primeros cambios en los explantes de hoja se observaron a partir de las 4
semanas de sembrarlos. Estos consistieron en la formación de callos, (Figura 9 A)
con un alto rendimiento a la inducción, sin embargo estas estructuras al ser
resembradas en medio fresco no crecieron. Para un segundo intento de siembra
se utilizo una combinación (ANA en compañía con KIN o BAP) donde se formaron
callos con un rendimiento medio de inducción, éstos aparentemente presentaron
crecimiento al resembrarse, sin embargo se oxidaron.
En el intento 3 (ANA) se desarrollaron callos (Figuras 9 B y9 C ). En este medio
se formaron brotes con un alto rendimiento de inducción (Figura 9D y9 E). En otro
intento, los explantes se necrosaron (Figura 9F).
39 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Fig.9 Obtención de callos. Fuente: Propia.
7.1.3. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS
De ambas plantas se obtuvo un extracto etanolico cuyo peso final después de
pasar por el arrastre de vapor fue de 3.46 gr en las siguientes figuras se
observaran las fases, desde el inicio de la maceración hasta el producto final.
Fig. 10 A. maceración de los extractos por 48 horas.
40 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Fig. 10 B. filtración de los extractos. (Izquierda), C) evaporación por arrastre de
vapor (derecha).
Fig. 10 D. extracto final cuyo peso final fue de 3.46 g.
41 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
7.1.4. DETERMINACIÓN DE LOS METABOLITOS
SECUNDARIOS
Para la determinación de los metabolitos secundarios, se realizo un análisis de
HPLC cuyas muestras de la planta se muestran en las siguientes figuras
Fig.11 Muestra lista para el análisis de HPLC
Fig. 12. Analisis de HPLC respectivo para H. inuloides .
42 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Fig. 13 analisis de HPLC respectivo para G. Oxyphyllum
Las figuras 12 y 13 muestran graficas de HPLC, donde los picos mas altos
muestran un alto contenido de solvente, y los picos diferenciados muestran la
presencia de metabolitos, cabe destacar que se necesita hacer un análisis mas
extenso en cuanto a HPLC se refiere ya que se debe de cuantificar la cantidad de
metabolitos contenidos en cada pico.
7.2. DISCUSIÓN
Para la realización de la presente investigación, la búsqueda de las especies
vegetales jugo un papel importante, ya que su disponibilidad fue escaza,
comenzando desde la identificación de las especies cuyas presentaciones no eran
las adecuadas para nuestro estudio, por lo cual se recurrió a mercados y jardines
botánicos.
Para la inducción a la callogenesis se tomo de primera mano aportes realizados
por skoog, 1974 tomando en cuenta que se utilizaría como primera metodología lo
descrito para el medio MS, a falta de resultados se profundizo en la utilización de
cada micro y macro nutrientes hasta llegar a la parte de los RCV donde las
combinaciones de la hormonas de crecimiento dieron lograron aclarar las dudas
sobre las cuales los explantes no desarrollaban tejidos, una vez obtenida la
43 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Combinación necesaria se procedió a seguir averiguando el por que una vez
iniciado el proceso de callogenesis los callos de ambas especies vegetales no se
desarrollaban y/o el tejido necrosaba. El problema radico quizá en la edad del
explante y en la agresividad de los agentes desinfectantes. En el caso del análisis
de HPLC la comparación entre los cultivos in-vitro y la planta silvestre no se
pudieron llevar acabo ya que el volumen total de los callos obtenidos era menor de
50gr cantidad mínima requerida para empezar la extracción de los metabolitos y
su posterior análisis , otro factor importante fue la juventud de estos, dado que aun
no tenían un tamaño y masa apropiada para una mejor obtención de los
metabolitos, ya que de haber sido posible se hubiera hecho aparte de un a HPLC
comparativo para ambas plantas resonancias magnéticas que especificarían la
relación que existe entre la planta in.vitro y la in-vivo.
44 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.4. CONCLUSIONES
La auxina ácido α-naftalenacético induce callogenesis en explantes de hojas de
plantas silvestres adultas de H. inuloides. Esta auxina en combinación con las
citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum
esta conclusión esta basada en los cambios de la combinación de los RCV a lo
largo de la investigación.
Se estableció el cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a partir
de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.
8.5. PERSPECTIVAS
El presente trabajo tuvo por objetivos particulares la comparación de metabolitos
secundarios entre las especies H. inuloides y G. oxyphyllum, este objetivo no fue
cumplido ya que como se discutió en apartados anteriores los callos no alcanzaron
la madurez necesaria además de que los callos no reunieron el peso mínimo para
ser analizados y comparados.
Se recomienda que una vez alcanzada tanto la madurez necesaria como el peso
se realice una maceración en hexano en un lapso de 24-48 horas.
Una vez transcurrido este tiempo se propone realizar una destilación por reflujo,
que consiste en calentar el solvente por medio de un nido a una temperatura de
entre 55-60°c con un refrigerante colocado de manera vertical, de tal manera que
el solvente evaporado por acción de la condensación regrese al matraz, todo esto
durante 4 horas para su posterior evaporación por arrastre de vapor, repitiendo
este proceso 3 veces, una vez concluidos los tres reflujos y evaporaciones se
prepare la muestra para su análisis en HPLC y su posterior comparación.
45 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
9. FUENTES CITADAS
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50 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
10. ANEXOS
Reactivos
Stocks o soluciones madre para los micronutrientes del medio de cultivo MS y
según el protocolo de Villegas et-al, 1992 para los macronutrientes.
Micronutrientes
-Solución de fosfato de potasio (K3PO4)
Para 100 ml
0.17 gr de K3PO4
Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.
Almacenar en refrigeración.
-Solución de Nitrato de Amonio (NH4NO3 )
Para 100 ml
0.165 gr de NH4NO3
Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.
Almacenar en refrigeración.
- Solución de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)
Para 100 ml
0.37 gr de MgSO4.7H2O
Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.
Almacenar en refrigeración.
51 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
-Solución de cloruro de calcio di hidratado CaCl.2H2O
Para 100 ml
0.14 gr de CaCl.2H2O
Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.
Almacenar en refrigeración.
- Solución de nitrato de potasio (KNO3)
Para 100 ml
0.190 gr de KNO3
Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.
Almacenar en refrigeración.
-Micronutrientes según Villegas et-al,1992
Para 100 ml
0.083 gr de Yoduro de Potasio (KI)
0.223 gr de Sulfato de Manganeso Monohidratado (MnSO4)
0.63 gr de Acido Bórico (B2O3)
0.86 gr de sulfato de Zinc Heptahidratado (ZnSO4.7H2O)
0.25 gr de Molibdato de Sodio (Na2MoO4)
0.25 gr de Sulfato de cobre Pentahidratado (CuSO4.5H2O)
0.025 gr de Cloruro de Cobalto (CoCl2)
52 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Se disuelven todos los solidos en 50 ml de agua y se afora a 100 ml con agua
destilada.
Almacenar en refrigeración.
-Vitaminas MS
Para 100 ml
0.1 mg de Acido Nicotínico
0.1 mg de Tiamina
0.1 mg de Piridoxina
Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-Quelatos
Para 100 ml
0.372 gr sal de Sodio dihidratado( C10H14N2Na2O8.2H2O).
0.278 gr Sulfato de hierro II (FeSO4).
Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-Mionositol
Para 100 ml
1 gr de Mionositol (C6H12O6 )
Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-Hormonas
-B.A (benzyl amino purina)
53 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
Para 100ml
10 mg de BA
Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml
-A.N.A. acido naftalenacetico
Para 100 ml
10 mg de ANA
Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-stocks de desinfección
-Cloruro de calcio (CaCl2)
Para 100 ml
2.5 gr de CaCl2
Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.
-Tween 20
5 ml de tween 20
Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100ml
-Stock de Ampicilina
0.5 gr de ampicilina
Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml
54 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
11. GLOSARIO
ANA: Acido α-naftalenacetico.
Asepsia: término médico que define al conjunto de métodos aplicados para la
conservación de la esterilidad.
BA: 6-bencilaminopurina.
Callo: masa de tejido parenquimático indiferenciada en crecimiento activo.
CCTV: Cultivo de células y tejidos vegetales.
GD: Medio de cultivo Gresshof & Doy.
Genotipo: totalidad de la información genética que posee un organismo en
particular, en forma de ADN. Junto con la variación ambiental que influye sobre el
individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el
conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de
un organismo.
Germoplasma: conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la
descendencia por medio de gametos o células reproductoras. El concepto de
germoplasma se utiliza comúnmente para designar a la diversidad genética de las
especies vegetales silvestres y cultivadas de interés para la agricultura y, en ese
caso, se asimila al concepto de recurso genético.
HPLC: High Pression Liquid Cromatography
Metabolitos secundarios: compuestos químicos sintetizados por las plantas que
cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es fatal
para la planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de las plantas.
Los metabolitos secundarios de las plantas intervienen en las interacciones
55 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas
ecológicas entre la planta y su ambiente.También se diferencian de los
metabolitos primarios en que cada uno de ellos tiene una distribución restringida
en el Reino de las plantas, a veces a sólo una especie o un grupo de ellas, por lo
que muchos de ellos son útiles en Botánica Sistemática.
Micropropagación: conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados
para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes
cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas
nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o
mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener
plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades
de plantas que no se propagan eficientemente.
MS: Medio de cultivo Murashige & Skoog.
MSNM: Metros Sobre el Nivel del Mar.
RCV: reguladores de crecimiento Vegetal.
SH: Medio de cultivo Schenk &Hilderbrandt.
Totipotencialidad: Término utilizado en biología para referirse a células que
poseen la capacidad de dar origen a varios tipos celulares, incluso pudiendo una
sola de estas células dar origen a millones de células, tejidos, órganos, hasta
incluso embriones.
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