caracterizaciÓn de metabolitos secundarios apartir de tejidos vegetales

UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS

SECUNDARIOS APARTIR DE TEJIDOS

VEGETALES

TESINA

QUE PARA OBTENER EL TITULO DE

T.S.U en Química Área Biotecnología

Presenta

Jairo Arturo Vargas Villegas

Asesor interno

M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez

Asesor Externo

Dr. en C. Eugenio Sánchez Arreola

Xicotepec de Juárez, Puebla. Septiembre 2012

I UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

ÍNDICE

ÍNDICE ........................................................................................................ I

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................... IV

AGRADECIMIENTOS ................................................................................ V

DEDICATORIAS ....................................................................................... VI

RESUMEN ............................................................................................... VII

SUMMARY .............................................................................................. VIII

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1

2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS AMÉRICAS

PUEBLA.................................................................................................... 4

2.1 Misión ................................................................................................ 5

2.2 Visión ................................................................................................. 5

2.3 Organigrama de la Institución ......................................................... 6

2.4 Ubicación .......................................................................................... 7

3. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................ 9

3.1 Cultivo de Células y tejidos vegetales............................................ 9

3.1.1 Reguladores de Crecimiento Vegetal ........................................ 11

3.1.2 Obtención de Callos ................................................................... 12

3.1.3 Medios de Cultivo ........................................................................ 13

3.1.3.1 Macronutrientes ....................................................................... 14

3.1.3.2 Micronutrientes ........................................................................ 15

3.1.3.3 Vitaminas .................................................................................. 15

3.2 Cinética de Crecimiento Celular ................................................... 16

II UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

3.3 Metabolitos secundarios ............................................................... 17

3.3.1 Inducción a los Metabolitos Secundarios ................................. 17

3.4 Cromatografía ................................................................................. 18

3.4.1 Tipos de Cromatografía .............................................................. 19

3.4.2 Cromatografía Líquido-Sólido (CLS) ......................................... 20

3.4.3 Cromatografía Líquida de Alta Presión ..................................... 22

3.4.3.1 Proceso de Derivatización ....................................................... 24

3.5 Antecedentes .................................................................................. 26

4. JUSTIFICACIÓN .................................................................................. 32

5. OBJETIVOS ........................................................................................ 33

2.1 Objetivo General ............................................................................. 33

2.2 Objetivos particulares .................................................................... 33

6. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................ 34

6.1 Obtención de la materia Vegetal ................................................... 34

6.2 Formación de Callos ...................................................................... 34

6.3 Obtención de los Metabolitos Secundarios ................................. 35

6.3.1 Obtención de los Extractos ........................................................ 35

6.4 Determinación de los Metabolitos Secundarios .......................... 36

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................ 37

7.1 Resultados ...................................................................................... 37

7.1.1 Obtención de la Materia Vegetal ................................................ 37

7.1.2 Formación de Callos ................................................................... 38

7.1.3 Obtención de Extractos .............................................................. 39

7.1.4 Determinación de Metabolitos Secundarios ............................. 40

III UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

7.2 Discusión ........................................................................................ 42

8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS................................................. 44

8.1 Conclusiones .................................................................................. 44

8.2 Perspectivas ................................................................................... 44

9. FUENTES CITADAS ............................................................................ 45

10. ANEXOS ............................................................................................ 50

11. GLOSARIO ........................................................................................ 54

IV UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Organigrama de la universidad de las Américas Puebla. ................... 6

Figura 2. Mapa de Ubicación de la Universidad de las Américas Puebla. ......... 7

Figura 3. Función de los RCV en cultivos de células y tejidos vegetales. ...... 11

Figura 4. Fases del crecimiento Vegetal. ........................................................ 17

Figura 5. Propiedades de los disolventes más comunes. ................................ 21

Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. ................ 23

Figura 7. Representación Cromatografíca dela fase inversa. .......................... 24

Figura 8. Heterotheca inuloides y Gnaphalium Oxyphyllum. .......................... 37

Figura 9. Formación de Callos. ........................................................................ 39

Figura 10. Maceración. .................................................................................... 40

Figura 11. Muestra lista para HPLC. ............................................................... 41

Figura 12. Análisis de HPLC para H. inuloides. ............................................... 41

Figura 13. Análisis de HPLC para G. Oxyphyllum. .......................................... 42

V UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

AGRADECIMIENTOS

Al creador por haberme guiado en cada uno de los pasos que di, algunos buenos

y algunos malos pero al final de todo el objetivo se cumplió.

A mis padres por ser pilares fundamentales durante toda mi vida, por haberme

llevado por el camino del bien y estar conmigo siempre.

A mis amigos por esas voces de conciencia en todo momento por todos aquellos

momentos de diversión y mas…

A mis pachis Cesar, José, Oscar y Tonys por que mas que ser amigos son como

mis hermanos más a ya de las voces de conciencia fueron los que estuvieron en

las buenas en las malas…

A mi alma mater la universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez, en especial a

la M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez por ser pieza clave en la realización

de este trabajo, asesorándome, aconsejándome y dándome ánimos para seguir…

A la Fundación Universidad de las Américas Puebla por brindarme esta magnifica

oportunidad de realizar este trabajo, también al Dr. en C. Eugenio Sánchez

Arreola por el asesoramiento y los conocimientos obtenidos.

Cabe destacar mi más sincero agradecimiento a mis compañeros del laboratorio

de investigación fitoquimica, Adriana, Priscilla Osnat, Ana y Fanny por el apoyo y

la entrañable amistad creada durante mis 4 meses de estancia en UDLAP.

VI UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

DEDICATORIAS

A mis padres y Hermana mi gratitud eterna…

A mi Familia por el apoyo incondicional…

A mis profesoras, Alma, Zaira y Marcela mi admiración y gratitud…

A mis amigos Coco, Mariela, Lupita, Cesar, Oscar y José Antonio por el apoyo

incondicional y por estar siempre a mi lado…

A Carmen Animas Hernández por enseñarme que: “los Caminos de Dios son

Misteriosos pero Siempre a Nuestro Favor.”

VII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A

PARTIR DE CELULAS VEGETALES

Vargas Villegas Jairo-Arturo1, Vázquez Sánchez Alma-Yolanda

2, Sánchez Arreola Eugenio

3

I. RESUMEN

Actualmente el cultivo in-vitro es una de las herramientas biotecnológicas más

importantes ya que gracias a él se han podido rescatar especies vegetales en

peligro de extinción. Gracias a estos métodos de propagación la medicina

tradicional mexicana ha retomado un importante papel en la ciencia actual ya que

resulta ser más viable la sustracción e identificación de principios biológicamente

activos. Si bien el gordolobo (G. Oxyphyllum) y árnica (H. Inuloides) no están en

peligro de extinción, resulta interesante el estudio de sus partes activas ya que

ambas plantas poseen una gama de beneficios extraordinaria ya sea como

desinflamatorio y cicatrizante (H. inuloides), y para afecciones respiratorias para

(G. oxyphyllum). Por lo cual el presente trabajo tuvo como objetivos inducir la

callogenesis de ambas especies vegetales utilizando técnicas de desinfección

como la asepsia superficial y microbiológica, así como la utilización de

reguladores de crecimiento (auxinas, citocininas) vegetal, puntos clave para la

inducción a callo. Los resultados obtenidos indican que la auxina ácido -

naftalenacético induce callogenesis en explantes de hojas de plantas silvestres

adultas de H. inuloides y esta auxina en combinación con las citocininas cinetina y

6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum. Obteniendo así, el

establecimiento del cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a

partir de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.

Palabras clave: Cultivo in-vitro, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, Reguladores de

Crecimiento Vegetal, HPLC

1Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Química Área en Biotecnología, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilió conocido col. Tierra Negra C.P.

73080. Xicotepec de Juárez Puebla. E-mail: [email protected] 2Asesor Interno de Estadía. M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Química Área Biotecnología, T.S.U.

Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Juárez Puebla. 3Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Sánchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigación fitoquimica del dapartamento de

ciencias químico Biológicas, Universidad de las Américas Puebla. Santa Catarina Mártir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrés Cholula Puebla.

VIII UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

CARACTERIZACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS A

PARTIR DE CELULAS VEGETALES

Vargas Villegas Jairo-Arturo1, Vázquez Sánchez Alma-Yolanda

2, Sánchez Arreola Eugenio

3

II. ABSTRACT

At present the culture tissue is one of the most important biotechnological tools and

because of this, plant species in danger of extinction have been rescued. As a result of

these extended methods, Mexican traditional medicine has regained an important role in

current research since the subtraction and identification of biologically active principles

turns out to be more feasible. Although Gordolobo (G. Oxyphyllum) and Árnica (H.

Inuloides) plants are not in danger of extinction, the study of their active parts turns out to

be interesting since according to the traditional Mexican medicine both plants possess a

great amount of extraordinary benefits such as anti-inflammatory, cauterizer (H. inuloides),

and against respiratory affections (G. oxyphyllum). That is the reason that the present

work had the purpose to induce the callogenesis of both vegetable species using

disinfection techniques such as superficial and microbiological asepsis, as well as the

utilization of plant growth regulators like auxins and citocininas, which they are key points

to callosity induction. The obtained results indicated that the auxin acid α-naftalenacetic

induces callogenesis in wild adult plant leave implants of H. inuloides and this auxin in

combination with the citocininas cinetina and 6-bencilaminopurine induces callogenesis in

G. oxyphyllum. Concluding this way the establishment of in vitro callosity cultivation of H.

inuloides and G. oxyphyllum from wild adult plant leave implants.

Keywords: culture tissue, G. Oxyphyllum, H. Inuloides, plant growth regulators,

HPLC

1Jairo Arturo Vargas Villegas. T.S.U. en Química Área en Biotecnología, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilió conocido col. Tierra Negra C.P.

73080. Xicotepec de Juárez Puebla. E-mail: [email protected] 2Asesor Interno de Estadía. M. en C. Alma Yolanda Vázquez Sánchez. Profesor de Asignatura de la carrera de T.S.U. en Química Área Biotecnología, T.S.U.

Procesos Agroindustriales, Universidad Tecnológica de Xicotepec de Juárez. Domicilio conocido col. Tierra Negra CP. 73080. Xicotepec de Juárez Puebla. 3Asesor Externo Doctor en Ciencias Eugenio Sánchez Arreola, profesor investigador y jefe del departamento de investigación fitoquimica del dapartamento de

ciencias químico Biológicas, Universidad de las Américas Puebla. Santa Catarina Mártir, Cholula Puebla C.P. 72810,San Andrés Cholula Puebla.

1 UTXJ-QAB-2010-2012 Jairo Arturo Vargas Villegas

1. INTRODUCCIÓN

El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido

moderadamente para abarcar tanto el cultivo aséptico de tejidos como el de

células y órganos, dentro de un grupo de técnicas que se fundamentan en varios

principios. Entre estos principios, los mas importantes sin duda son la

totipotencialidad celular propuesta por Haberlandt (1902) y la hipótesis del balance

hormonal sugerida por Skoog et al. (1957). Aun cuando estos principios han sido

cuestionados por diferentes autores como Trewavas (1981,1982) y Firn (1980)

todos ellos parecen encontrar cierto grado de fundamentación en la mayoría de los

modelos biológicos empleados en el estudio de la morfogénesis in-vitro.

Las técnicas de cultivos asépticos han contribuido no solo a un mejor

entendimiento de los eventos de diferenciación celular sino al aprovechamiento de

tales eventos en la explotación más eficiente de las plantas. En este ultimo

aspecto vale la pena mencionar los siguientes usos de las técnicas de cultivo in-

vitro: A) Mejoramiento genético; B) obtención de plantas libres de virus y de otros

patógenos; C) conservación de germoplasma; D) micropropagación. (Murashige,

1974).

En la actualidad el cultivo in-vitro se practica con éxito en especies hortícolas

(Murashige, 1978), ornamentales (Hughes, 1981), y más recientemente en

especies leñosas (Thorpe, 1983). En algunas especies esta metodología ha

mostrado importantes ventajas en comparación con los sistemas convencionales

de propagación; los más importantes son:

Incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo.

Reducción del tiempo de multiplicación.

Posibilidad de reproducir grandes cantidades de plantas en una superficie

reducida, a bajos costos y tiempo económicamente costeables.

Mayor control de la sanidad del material que se propaga.


Facilidad de transporte del material in vitro de un país a otro, con menos

restricciones aduanales.

Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual solo existen

pocos individuos. (Murashige, 1974).

La reciente re-valoración del conocimiento tradicional abrió una puerta para el

rescate y promoción de la medicina tradicional, incluyendo modelos tradicionales

de dichas practicas con nuevos modelos que incluyen estudios fotoquímicos

avanzados para la sustracción e identificación de los principios biológicamente

activos y así finalmente de ponerla al día, mantenerla como una práctica

socialmente viva, darle reconocimiento oficial pleno, imprimirle una actualidad

técnica eficiente, y de integrarla como un método pleno de posibilidades

salutíferas en la práctica de la medicina contemporánea.

Árnica Mexicana (Heterotheca inuloides)

Heterotheca inuloides es la planta medicinal con nombre popular de Árnica más

conocida y utilizada en México; en México por lo menos se les conoce con el

nombre de Árnica a 15 plantas diferentes. El género Heterotheca contiene

alrededor de siete especies nativas de Norteamérica, incluyendo México.

Pertenece a la familia de las Compuestas (Asteraceae). Es una de las plantas

medicinales más utilizadas en México. Su uso medicinal es muy similar a la

especie europea (Arnica Montana), se preparan numerosas pomadas y ungüentos

para aplicarse externamente en caso de golpes e inflamaciones. Los antiguos

mexicanos la utilizaban frecuentemente para aplicaciones en forma de cataplasma

en hemorroides, rozaduras en bebes, ronchas y llagas de cualquier origen.

(Martínez, 1969).


Gordolobo (Gnaphalium Oxyphyllum)

Planta mexicana de amplia distribución, existen más de cuarenta especies y

crecen naturalmente en las montañas elevadas (Baytelman B. 1980).

El gordolobo es conocido también con el nombre náhuatl de tzonpotónic. Esta

especie es utilizada en varias regiones de América por ser de mucha utilidad en la

medicina tradicional. Existen otras plantas del mismo nombre, poco diferentes en

forma, con casi las mismas propiedades. Es una planta que mide entre 35-75 cm.

De altura su tallo es velludo, sus hojas son angostas, largas, verdes por la parte

de arriba, el envés es velludo y blanquizco, sus flores son de color blanco en

forma de estrella localizadas en la punta del tallo y no es espinosa (Argueta et al,

1994).

Es utilizada en las afecciones de las vías respiratorias como expectorante,

generalmente en tos seca infecciones de garganta, gripa, asma, bronquitis, en los

trastornos gástricos (ulceras, dolor de estomago, parásitos), en heridas,

quemaduras, cólicos, dolores generalizados en la terapéutica del cáncer,

hidropesía, ciática y lumbago siendo utilizada toda la planta incluidas las flores. Su

distribución es amplia, comprendiendo los estados de Baja California, Durango,

Hidalgo, Michoacán, Morelos, Puebla, Sonora y Tlaxcala ya que la situación

climatológica de estos estados es favorable creciendo en los climas cálidos,

semicálido y templados entre los 20 y 1875 Metros Sobre el Nivel del Mar

(MSNM). Su crecimiento se desarrolla en suelos de cultivo, riego y temporal así

como en cualquier suelo (Argueta et al, 1994; Martínez, 1979).


2. GENERALIDADES DE LA UNIVERSIDAD DE LAS

AMÉRICAS PUEBLA

La Universidad de las Américas Puebla ofrece programas de estudio en una gran

variedad de áreas del conocimiento a través de cinco escuelas: Artes y

Humanidades (EDAH), Ciencias (EDEC), Ciencias Sociales (EDCS), Ingeniería

(EDEI) y la de Negocios y Economía (EDNE). En total, se ofrecen 48 programas

de licenciatura, 30 programas de maestría (incluidas 10 maestrías por Internet) y 4

programas de doctorado. Asimismo, cuenta con 300 convenios de cooperación

internacional, que incluyen programas de doble diploma con universidades de alto

prestigio tanto de Europa como de Estados Unidos, en donde los alumnos reciben

el diploma de la UDLAP así como el de la universidad anfitriona.

Actualmente, la UDLAP se encuentra clasificada como Institución de Nivel VI, el

máximo reconocimiento que otorga la Southern Association of Colleges and

Schools (SACS). Esta clasificación acredita que los estudios realizados en la

UDLAP cumplen a plenitud con los más altos estándares de calidad internacional.

La UDLAP participa activamente en diversas asociaciones universitarias

nacionales e internacionales y mantiene con ellas una comunicación permanente.

De estas asociaciones recibe información y asesoría para todo tipo de procesos

de la institución.

La Universidad busca la excelencia académica de sus egresados y una alta

calidad en las investigaciones que realizan sus profesores e investigadores. En tal

sentido, orienta sus esfuerzos a brindar un servicio educativo de alto nivel, lograr

la formación integral de sus estudiantes, mantener un ambiente multicultural

basado en el respeto y promover la comprensión internacional.

Dado su carácter, se organiza legalmente como una fundación. Todos sus

programas académicos guardan la debida acreditación ante la Secretaría de


Educación Pública y tienen plena validez oficial por parte de las autoridades

educativas del Estado de Puebla. Asimismo, sus programas están reconocidos por

diversas universidades de América Latina, Europa y el sistema educativo de los

Estados Unidos de Norte América.

El estudiante puede realizar parte de sus estudios fuera del país y ampliar sus

horizontes o acceder a la práctica profesional en el extranjero. De esta manera, el

ámbito de formación y desarrollo profesional ofrecido por la universidad es más

extenso y variado que el de otros centros educativos de nivel superior en la

República.

2.1. MISIÓN

“Formar profesionistas bien informados, críticos, creativos, innovadores y

altamente capaces en lo técnico, pero sobre todo, conscientes de la alta

responsabilidad social que les exige lograr una distribución equitativa de los

beneficios que la globalización produce”.

2.2. VISIÓN

“Ser reconocida mundialmente como la institución líder en programas académicos,

científicos, culturales y de propuesta de política pública que respondan a los retos

presentados por la globalización”


2.3. ORGANIGRAMA DE LA INSTITUCIÓN

Fig.1 Organigrama institucional UDALP . Tomado de

http://www.udlap.mx/internas/html/esp/organigrama2.aspx#

http://www.udlap.mx/internas/html/esp/organigrama2.aspx


2.4. UBICACIÓN

La universidad de las americas puebla se encientra ubicada en la ex hacienda

Santa Catarina Martir,San Andrés Cholula,Puebla C.P 728010.

Fig 2. Ubicación . tomado de : http://www.udlap.mx/internas/mapaudlap.aspx


El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de investigacion fitoquimica del

departamento de ciencias quimico biologicas de la Universidad de las Américas

Puebla, bajo la direccion del Dr Eugenio Sanchez Arreola profesor investigador

titular.


3. REVISION DE LITERATURA

3.1. CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS VEGETALES

Las plantas son fuente de diversas sustancias de interés para el hombre, en las

que se incluyen compuestos llamados metabolitos secundarios que son utilizados

en la industria como colorantes, saborizantes, fragancias y fármacos, entre otros.

De manera general, en las plantas, la acumulación de estos compuestos ocurre

sólo en ciertas épocas del año y en algunos órganos, lo que puede limitar su

abastecimiento. Por ello, el cultivo de células y tejidos vegetales (CCTV) ha sido

considerado como una alternativa biotecnológica para la producción de

metabolitos secundarios (Verpoorte et. al., 2002). Después del desarrollo

comercial para la producción de la chiconina con cultivos de células de

Lithospermum erytrorhizon, varios son los trabajos sobre el establecimiento de

cultivos de células y tejidos vegetales y la identificación de compuestos con

potencial para su producción industrial (Zhao et al., 2005).

El CCTV es un conjunto de técnicas que presenta en común el hecho de que un

explante (semilla, órgano, tejido o célula viva) se inocula asépticamente en un

medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones

controladas. Lo anterior se basa en el principio de totipotencia celular, el cual

establece que a partir de una célula vegetal, es posible regenerar un individuo fértil

con las mismas características del individuo original, manteniendo su información

genética para realizar todas las funciones de una planta completa (Kieran et al.,

1997). Inicialmente las técnicas de cultivo de células y tejidos vegetales fueron

concebidas y empleadas como herramienta de investigación básica, para estudiar

la bioquímica y fisiología vegetal. Sin embargo, estas técnicas evolucionaron a

tecnologías comerciales para la micropropagación, el mejoramiento genético de


Especies y la producción de metabolitos secundarios de interés industrial

(Rodríguez-Monroy et al., 1999).

El CCTV ofrece varias ventajas sobre la recolección de plantas silvestres y el

desarrollo de cultivos en campo, entre las cuales se pueden mencionar: 1) La

independencia de las condiciones ambientales; 2) Establecer condiciones para la

obtención de productos homogéneos; 3) Establecer un sistema de producción

definido, en el lugar donde se requiere del producto; 4) Obtención de productos en

menor tiempo (Doran, 1999; Sajc et al., 2000).

Para establecer un cultivo vegetal in vitro, se parte de la selección de la planta de

interés y de la colecta de material biológico (ejemplares completos y semillas). La

elección del explante apropiado para el establecimiento de cultivos de células y

tejidos vegetales está basada en el objetivo del cultivo. Si lo que se quiere es

obtener plántulas asépticas (libres de virus), el explante ideal es el meristemo

(dependiendo de la especie de 0.2 – 0.5 mm de longitud) o la germinación de

semillas en condiciones asépticas. Para inducir respuesta de callogénesis y/o

morfogénesis, las células meristemáticas de los tejidos obtenidas de plántulas en

condiciones asépticas, se hacen crecer de forma desdiferenciada (masa amorfa

denominada callo) o diferenciada (organogénesis o embriogénesis), mediante la

aplicación de reguladores de crecimiento vegetal (CIAT, 1991).


3.1.1. REGULADORES DE CRECIMIENTO VEGETAL

Los reguladores de crecimiento vegetal (RCV) son sustancias orgánicas que a

bajas concentraciones influyen en los procesos fisiológicos de las plantas (Fig. 1)

Fig. 3: Función de los reguladores de crecimiento vegetal en los cultivos de células

y tejidos vegetales. (Frankenberger y Arshadm, 1995).

Los RCV cuando son producidos por las plantas (endógena) se les denominan

fitohormonas, las cuales actúan como mensajeros químicos que regulan el

crecimiento y desarrollo de la planta. También regulan las respuestas a las

señales ambientales (Morgan, 1990). El término regulador de crecimiento vegetal

se refiere a un compuesto sintético o natural que se aplica (exógena) para alterar

el crecimiento y desarrollo de las plantas o cultivos de células y tejidos vegetales.

El término fitohormona y regulador de crecimiento vegetal se utiliza

alternativamente, particularmente cuando se refiere a auxinas, citocininas,

giberelinas y ácido abscísico (Frankenberger y Arshadm, 1995).


3.1.2. OBTENCIÓN DE CALLOS

Las células vegetales poseen dos características que las hacen especiales: la

totipotencia, capacidad inherente de una célula para generar una planta completa

y la desdiferenciación, capacidad para volver al estado meristemático de una

célula diferenciada, situación que no ocurre en células animales. Para que una

célula vegetal exprese su totipotencia debe experimentar una desdiferenciación y

luego una nueva diferenciación de acuerdo a las condiciones ambientales del

cultivo. Esto puede lograrse si se colocan partes pequeñas de un tejido u órgano

de la planta (explante) en un medio de cultivo apropiado con los nutrientes y

reguladores de crecimiento, los cuales manipulados convenientemente pueden

generar callos o desarrollar yemas o embriones (Skoog y Miller, 1957).

Los callos se pueden definir como masas de tejido parenquimático indiferenciado

en crecimiento activo. Son agregados celulares amorfos que surgen del

crecimiento desorganizado de explantes sobre un medio de cultivo específico en

condiciones asépticas. Estos agregados celulares no se corresponden con ningún

tejido particular de la planta completa. El término cultivo de callos fue escogido

debido a que la proliferación celular se pensaba era inducida por la herida del

explante durante la escisión. Sin embargo se ha encontrado que es inducido por

reguladores de crecimiento de la planta en el medio de cultivo sólido. Las

hormonas y los reguladores de crecimiento en general son los responsables de la

distribución de los compuestos que la planta biosintetiza y que determinan el

crecimiento activo de todos los órganos (Whahby, 2007); su manera de actuar es

debida a una respuesta compleja sobre factores como la mitosis, polarización,

formación de los primordios y desarrollo de los meristemos. Una vez formados los

callos, puede presentarse una variación somaclonal, normalmente durante los

repetidos subcultivos de mantenimiento de los callos. Este es un período crítico

porque debido a esta variación somaclonal la producción de metabolitos puede

variar de subcultivo en subcultivo (Bourgaud et al., 2001). Después de cierto


Tiempo se alcanza una estabilidad genética y cada callo puede ser considerado

un agregado celular homogéneo.

Uno de los usos principales del cultivo de callos es la obtención de suspensiones

celulares. En muchos casos, para obtener suspensiones celulares finas, es

adecuado aumentar la friabilidad (callo disgregado y esponjoso) del tejido calloso

por incremento de la concentración de la auxina o disminución de la citoquinina en

el medio de crecimiento. Dependiendo de la especie utilizada el ciclo de subcultivo

a partir de callo es de 4 semanas de acuerdo con la especie. Callos con

crecimientos más rápidos deberán subcultivarse cada dos semanas para

renovación de las células. Para crecimientos muy lentos no es conveniente

demorar los subcultivos por más de seis semanas.

3.1.3. MEDIOS DE CULTIVO

Son muchos los medios de cultivo utilizados en suspensiones celulares vegetales

que suministran los elementos esenciales para el desarrollo y mantenimiento

celular. El medio de cultivo más utilizado es el medio MS; éste tiene altos niveles

de nitrógeno inorgánico y de sales minerales, mientras que otras formulaciones,

como NN (Nietsch et al., 1967) tienen niveles muy bajos de nitrógeno inorgánico y

el medio White (1943) tiene bajo contenido de sal. En general, hay una tendencia

a usar niveles más bajos de NH4+ que de NO3

- en medios para cultivos de tejidos

vegetales. La cantidad de NH4+ en el medio MS es casi la mitad que de NO3

-,

mientras otras formulaciones, tales como SH (Schenk y Hildebrandt, 1972), B5

(Gamborg et al., 1968) y GD (Gresshoff y Doy, 1974), contienen niveles aún más

bajos de NH4+. La fuente de carbono comúnmente utilizada es la sacarosa en

concentraciones de 3%, este azúcar es fosforilado y luego forma un compuesto

complejo con una molécula transportadora que facilita su ingreso a la célula a


través de la membrana plasmática (Vásquez y Torres, 1995). La adición de

vitaminas mejora ostensiblemente el crecimiento de los cultivos vegetales y las

hormonas son necesarias para el alargamiento, crecimiento y división celular.

3.1.3.1. MACRONUTRIENTES

Los macronutrientes proveen los seis principales elementos, nitrógeno (N), fósforo

(P), potasio (K), calcio (Ca), magnesio (Mg) y azufre (S), requeridos para el

crecimiento de las plantas. La concentración óptima de cada nutriente para

alcanzar las máximas ratas de crecimiento varía considerablemente entre

especies.

Los medios de cultivo deben contener suficiente nitrógeno inorgánico para un

adecuado crecimiento de la célula vegetal. Las células vegetales pueden crecer

solo en nitratos, pero resultados considerablemente mejores son obtenidos

cuando el medio contiene tanto nitrato como amonio (Roca y Mrogiski, 1991).

Los nitratos son normalmente suministrados en el intervalo de 25-40 mM, mientras

que concentraciones típicas de amonio varían entre 2 y 20 mM. Concentraciones

superiores a 8 mM pueden ser letales para el crecimiento celular de algunas

especies. Las células pueden crecer en un medio de cultivo conteniendo amonio

como única fuente de nitrógeno, si uno o más de los ácidos del ciclo del ácido

tricarboxílico, como citrato, succinato o malato, están presentes en

concentraciones de aproximadamente 10 mM. Cuando las fuentes de nitrógeno,

nitrato y amonio, están presentes en el medio de cultivo, los iones amonio serán

utilizados más rápidamente que los iones nitrato. El potasio es requerido para el

crecimiento celular de muchas especies vegetales. La mayoría de los medios de

cultivo contienen potasio en forma de nitrato o cloruro, a concentraciones de 20-30

mM. Las concentraciones óptimas de P, Mg, S y Ca varían entre 1-3 mM cuando

son satisfechos todos los otros requerimientos para el crecimiento celular; en

ocasiones son necesarias concentraciones más altas si existen deficiencias en

otros nutrientes.


3.1.3.2. MICRONUTRIENTES

Los minerales esenciales para el crecimiento de tejidos y células vegetales

incluyen hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y molibdeno

(Mo). El hierro puede ser el más crítico de todos los minerales. Pueden ser usados

citrato y tartrato de hierro en medios de cultivo, pero estos compuestos son

difíciles de disolver y frecuentemente precipitan luego de que los medios son

preparados. El empleo del complejo EDTA-hierro puede superar este problema;

sin embargo estos complejos no son completamente estables, particularmente en

cultivo líquido, y pueden precipitar luego de unos pocos días. Cobalto (Co) y yodo

(I) también pueden ser adicionados a ciertos medios, pero no se han establecido

los requerimientos estrictos de estos elementos para el crecimiento celular. Sodio

(Na) y cloro (Cl) también son utilizados en algunos medios de cultivo pero no son

esenciales para el crecimiento celular. Cobre (Cu) y Co son adicionados

normalmente a medios de cultivo en concentraciones de 0.1 μM, Fe y Mo a 1 μM, I

a 5 μM, Zn a 5-30 μM, Mn a 20-90 μM, y B a 25-100 μM. Sin embargo, el

crecimiento está más limitado por las otras variables, especialmente por las

hormonas, que por los microelementos (Roca y Mrogiski, 1991).

3.1.3.3. VITAMINAS

Las vitaminas son requeridas por las plantas como catalizadores en varios

procesos metabólicos. Las células y tejidos vegetales cultivados in vitro, requieren

algunas vitaminas y se consideran factores muy importantes en el crecimiento

celular. Las vitaminas más frecuentemente utilizadas en medios de cultivo de

células y tejidos vegetales incluyen tiamina (B1), ácido nicotínico, piridoxina (B6), y

myo-inositol. La tiamina es indispensable para los cultivos celulares en

concentraciones de 0.1 a 10.0 mg/L. El ácido nicotínico es utilizado normalmente

en concentraciones de 0.1-5.0 mg/L; la piridoxina es utilizada entre 0.1-10.0 mg/L.

La vitamina que es básicamente requerida por todas las células vegetales para el

crecimiento es la tiamina. El ácido nicotínico y la piridoxina son con


frecuencia adicionados a los medios de cultivo, pero no son esenciales para el

crecimiento celular en muchas especies. El myo-inositol es comúnmente incluido

en muchas soluciones de vitaminas ya que ha mostrado estimular el crecimiento

en ciertos cultivos de células. Su presencia en el medio de cultivo no es esencial,

pero en pequeñas cantidades estimula el crecimiento celular en muchas especies.

Otras vitaminas como biotina, ácido fólico, ácido ascórbico, ácido pantoténico,

vitamina E (tocoferol), riboflavina, y ácido p-aminobenzoico han sido incluidas en

algunos medios de cultivo. El requerimiento de estas vitaminas por cultivos de

células vegetales es generalmente despreciable, y no son consideradas factores

limitantes del crecimiento. Son generalmente adicionadas al medio de cultivo solo

cuando la concentración de la tiamina está por debajo del nivel deseado o cuando

es deseable crecer células a muy bajas densidades de población. (Villegas et. Al.

1992).

3.2. CINÉTICA DE CRECIMIENTO CELULAR

Para mantener una suspensión celular en crecimiento continuo, es necesario

identificar el momento apropiado en que los componentes del medio de cultivo se

agotan y deben ser renovados, así como remover las sustancias tóxicas

excretadas por las células durante su metabolismo. Por tanto se hace necesario,

bien sea, un subcultivo en medio fresco o un cambio de determinado volumen del

medio de cultivo para continuar los procesos fisiológicos normales. La etapa

apropiada puede ser determinada a partir de una curva de crecimiento celular con

respecto al tiempo, que depende a su vez de la cantidad de inóculo utilizado para

iniciar las suspensiones y de la composición del medio de cultivo. (Hurtado 1988).

La curva de crecimiento típica de células en suspensión presenta las siguientes

fases, (Figura 4):


Figura 4. Fases del crecimiento celular. I Latente, II Aceleración, III Exponencial,

IV Desaceleración, V Estacionaria, VI Muerte. (Hurtado 1988).

Dependiendo de la especie, la mayoría de los cultivos de células vegetales en

suspensión alcanzan su máxima densidad celular entre 18 y 25 días, aunque

puede haber cultivos bastante activos, que la alcanzan entre los 6 y 25 días

(Hurtado 1988).

3.3. METABOLITOS SECUNDARIOS

Los productos naturales, llamados metabolitos secundarios, son compuestos

generalmente de bajo peso molecular, restringidos con frecuencia a familias o a

géneros especiales de plantas. No son importantes para el metabolismo primario

de la planta, pero en muchos casos son de gran importancia para la supervivencia

de la planta en su ambiente; generalmente se forman después de que el

crecimiento ha cesado (fase estacionaria) de allí que una de las estrategias

utilizadas es el cultivo en dos fases, una para el crecimiento y otra para la

producción. (Ibrahim et al., 2007).

3.3.1. INDUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Para que las técnicas de cultivo de células vegetales lleguen a ser

económicamente viables, es importante desarrollar métodos que permitan la

obtención de cantidades apreciables de los compuestos útiles de las células

cultivadas en suspensión. Hasta este momento, varias estrategias se han


desarrollado para mejorar la producción de metabolitos secundarios con el empleo

de células vegetales. Las células del cultivo de tejidos acumulan normalmente

grandes cantidades de compuestos secundarios solamente bajo condiciones

específicas. Eso significa que la maximización de la producción y de la

acumulación de metabolitos secundarios por las células cultivadas de tejidos

vegetales requiere la manipulación de los parámetros del ambiente y el medio de

cultivo, seleccionar líneas celulares de alta producción, el medio precursor

alimenticio y la elicitación. Numerosas investigaciones han sido realizadas para

estudiar el efecto de algunos factores físicos y químicos tales como el pH,

concentración de los nutrientes en el medio de cultivo, empleo de fitohormonas,

temperatura, aireación, luz y agitación, sobre el crecimiento de células en

suspensión y la producción de metabolitos secundarios (Bourgaud et al., 2001) en

diferentes especies vegetales; específicamente se ha estudiado el efecto de

algunos de los factores mencionados anteriormente (Ibrahim et al., 2009).

Aunque la mayoría de los factores mencionados han sido exitosos para mejorar y

aumentar la producción de metabolitos secundarios en diferentes especies

vegetales, los mejores resultados obtenidos para la transformación de plantas

superiores, especialmente de Nerium oleander, es el derivado del mecanismo

inductor de tumores de la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens y

Agrobacterium rhizogenes (Ibrahim et al., 2007). Los cultivos de células u órganos

transformados tienen el potencial de incrementar la producción de metabolitos

secundarios.

3.4. CROMATOGRAFIA

La cromatografía es una técnica que permite la separación de los componentes de

una mezcla debido a la influencia de dos efectos contrapuestos.

a) Retención. Efecto producido sobre los componentes de la mezcla por una fase

estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido anclado a un soporte sólido.


b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la mezcla por una

fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.

El fenómeno de migración de los componentes de una mezcla a lo largo de la fase

estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre de elución. La mezcla

a separar se deposita sobre la fase estacionaría, mientras que la móvil atraviesa el

sistema desplazando a los componentes de la mezcla a distinta velocidad,

dependiendo de la magnitud de sus interacciones relativas con ambas fases. Las

dos fases se eligen de forma que los componentes de la muestra se distribuyan de

modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que

son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el

flujo de la fase móvil; por el contrario los componentes que se unen débilmente a

la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta

movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas

discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. (Koh, 2006).

3.4.1. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil se pueden

distinguir distintos tipos de cromatografía:

a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un

líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido anclado a un

soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no volátil

impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la móvil un gas.


Según el tipo de interacción que se establece entre los componentes de la mezcla

y la fase móvil y estacionaria podemos distinguir entre:

a) Cromatografía de adsorción. La fase estacionaria es un sólido polar capaz de

adsorber a los componentes de la mezcla mediante interacciones de tipo polar.

b) Cromatografía de partición. La separación se basa en las diferencias de

solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil, que

son ambas líquidas.

c) Cromatografía de intercambio iónico. La fase estacionaria es un sólido que lleva

anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede intercambiar por

aquellos iones presentes en la fase móvil. (ASTM, 1979)

3.4.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDO-SÓLIDO (CLS).

La fase estacionaria está constituida por un sólido polar poroso y que esta

finamente granulado. La superficie específica contiene centros polares aptos para

la adsorción de las moléculas polares presentes en la fase móvil. Al disminuir el

tamaño de las partículas, el número de centros activos por unida es mayor, y la

capacidad de adsorción se incrementa. El adsorbente más utilizado es gel de

sílice aunque también se emplea alúmina activada. En el caso del gel de sílice la

interacción se establece entre los grupos Si-OH y Si-O-Si, y los grupos funcionales

polares de los compuestos orgánicos. (ASTM, 1979).

La fase móvil está constituida por un disolvente en el que los componentes de la

mezcla deben ser al menos parcialmente solubles. La velocidad de elución de un

compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase móvil y se puede

utilizar un gradiente de polaridad aumentando con el tiempo la proporción del

disolvente más polar. La retención se realiza en base a la competencia que se

establece entre el soluto a separar (S) y las moléculas de la fase móvil (M) por


adsorberse a los centros activos polares (X) de la fase estacionaria. Así las

moléculas de soluto se adsorben a los centros activos de la fase estacionaria y

van siendo desplazados por las moléculas polares presentes en la fase móvil.

(ASTM, 1979)

Fig. 5. Propiedades de los disolventes más comunes. (ASTM, 1989)


3.4.3. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN (HPLC)

La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas de análisis basadas en la

separación de componentes de una mezcla y su posterior detección. Las técnicas

cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que

consiste en un fluido (gas, líquido, o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra

con un flujo constante de presión proporcionado por una bomba, hasta llegar al

punto donde es introducida la muestra. Siguiendo el flujo de presión la lleva a una

columna donde se encuentra la fase estacionaria que se trata de un sólido o un

líquido fijado en un sólido. (Koh, 2006).

Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase

estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la

fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después de haber

pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado, pasan por

un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del

tipo del compuesto, sus partes lo describe la figura 6.

El papel esencial de las bombas es impulsar a la fase móvil con presión y flujo

constante, el proceso de inyección de la muestra en la actualidad es automática,

las columnas que se utilizan normalmente son de acero inoxidable y los detectores

su papel fundamentalmente es de indicar el momento de aparición de los

diferentes componentes que constituyen la muestra, calificarlo cuantitativamente

como cualitativamente. (Koh, 2006).


Figura 6. Partes fundamentales en las que se compone un HPLC. Tomado de:

Skoog, Leary. 2000.

El uso de la cromatografía ha demostrado ser muy significativo para el estudio del

ácido lipóico, un tipo de cromatografía utilizado fue el HPLC-fase inversa (figura 4),

porque trabaja con las polaridades de los compuestos que se van analizar en el

futuro, ya que la fase móvil es mas polar que la fase estacionaria. La fase móvil es

agua con un componente menos polar como puede ser: agua/metanol,


agua/ACN. El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza

apolar, tal es el caso del ácido lipóico que es un compuesto apolar, mientras que

las moléculas de carácter polar eluyen más rápidamente. (Koh, 2006).

En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se

desgasifique todo componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC,

esto con el propósito de evitar daños futuros. En el análisis de ácido lipóico todos

los solventes, el agua de HPLC, junto con la fase móvil deben ser pasados a

través de un filtro de 4μ y desgasificados al bajo vacío, antes de su uso. (Koh,

2006).

Se basa en el principio de las interacciones hidrofóbicas que resultan de las

fuerzas de repulsión entre un disolvente relativamente polar, un compuesto

relativamente apolar y una fase estacionaria apolar. El efecto hidrofobico

disminuye con la adición de disolvente apolar a la fase móvil.

Fig. 7 Representación de cromatografía de fase inversa. Tomado de: Skoog,

Leary. 2000.


3.4.3.1. PROCESO DE DERIVATIZACIÓN

Derivatización pre-columna. Esta acoplada con cromatografía de fase reversa en

lugar de cromatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida

como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor

velocidad de análisis, las ventajas de la metodología de la derivatización pre-

columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere

máxima sensibilidad de detección, un reactivo fluorescente combinado con la

derivatizacion pre-columna es el método más indicado, Cómo desventaja está la

necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la

posibilidad de interferencia con la separación por exceso del reactivo, el medio de

reacción o la producción de diferentes derivados de un componente. Además la

estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatización

pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser

fundamental para los resultados obtenidos. La muestra a analizar es introducida

en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente

dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a

medida que adelantan por la columna. (Snyder, 1997).


3.5. ANTECEDENTES

El Árnica mexicana (Heterotheca inuloides) es una planta de 1 m de altura con

pelos en el tallo. Las hojas a veces son mas largas y anchas. Las flores están

agrupadas en una cabezuela con cerca de 150 flores todas colocadas en un

disco, parecidas a las margaritas; las brácteas que rodean la cabezuela están

ordenadas de mayor a menor y son velludas como el tallo. Es originaria de

México. Presente en climas cálido, semicálido semiseco y templado desde el nivel

del mar hasta los 2400 m y desde los 2000 a los 3100 MSNM. Cultivada en los

huertos familiares, asociada a bosques de encino, de pino y bosques tropicales

caducifolio y perennifolio, matorral xerófilo, pradera semiárida y bosque de

juníperos. (Barquin Zamora, 1991).

El complejo de plantas medicinales mexicanas conocidas como "Árnica" se

compone de varias especies de plantas: Heterotheca inuloides, conzattii

Mentezlia, pringlei Zexmenia, y especies de Haplopappus. entre otros. La planta

de este complejo, Heterotheca inuloides (Asteraceae), comúnmente denominado

como árnica mexicana, acahual, cuauteteco y xochihuepal, es ampliamente

utilizado en medicina popular para el tratamiento tópico de las contusiones y

magulladuras y para el tratamiento de las heridas de la piel y lesiones.(Camacho

R. 1985).

Esta especie es muy valorada y utilizada con frecuencia en diferentes partes de

México, (Nicholson M. 1993, Lozoya, et-al 1987).algunos de sus usos son

similares a las de Árnica montana. (Willuhn, Röttger 1980). Su principal cualidad

medicinal es que actúa como cicatrizante, desinfectante, desinflamante, y/o

analgésico. Abundan las referencias de su uso en el tratamiento de heridas, lo

cual implica colocar las hojas como emplasto o cataplasma, o con el cocimiento de


las hojas y/o ramas, lavar y aplicar fomentos sobre éstas. En ocasiones, el

cocimiento se hace junto con ramas de gordolobo (sp. n/r), en este caso, además

de realizar el lavado se ponen por un rato las plantas cocidas sobre las heridas y

se da un mejoral al paciente; esta curación se hace durante tres días. O

simplemente se esparcen las hojas tostadas y pulverizadas. (Barquin Zamora,

1991).

En caso de golpes internos o externos y contusiones, en los que hay dolor, se le

usa a manera de té, aunque para éstos dos últimos, también se aplica en

maceración o en forma de pomada, que se hace con la planta molida revuelta con

manteca. Asimismo, en diversas lesiones cutáneas, infectadas o no, como granos,

llagas, moretones, ronchas, infecciones y rozaduras de bebé, se lavan o se

aplican compresas con su cocimiento. Como analgésico en casos de el dolor de

Úlcera, de estómago o de la boca del estómago, de pulmón, (por pulmonía), de

pecho, muscular, renal (V. dolor de riñón) o de reumas, se bebe la infusión de la

planta como agua de tiempo, o se emplea en fomentos calientes si se padece

dolor de muelas. (Chino, Jacques, 1986).

Para problemas gastrointestinales como ardores de estómago, gastritis o úlceras,

se bebe el cocimiento, ya sea en ayunas o después de cada alimento. Para tratar

úlceras del hígado se toma la infusión de las flores y hojas durante un mes, o más

tiempo si continúan las molestias; asimismo se usa cuando se tiene sensación de

boca amarga, disentería, piorrea, falta de apetito, para el hígado, limpiar el

estómago y descongestionar la vesícula. En afecciones respiratorias, como

bronquitis, tos, pulmonía o dolor de pulmón, se toma la infusión de la planta junto

con cuachalalate, durante nueve días. En la atención del postparto se administra,

por vía oral, el té elaborado con árnica y raíz de capitaneja, mismo que se ocupa

cuando se padece hemorragia vaginal, michicahues de mujer (V. cachán) y para

propiciar la fertilidad femenina, así como en padecimientos cardiovasculares como

almorranas, úlceras en las várices, afecciones del corazón y como tónico cardíaco.

Se menciona que también es útil para darlo a los niños que se orinan en la cama,


en padecimientos de los riñones, e irritación de la vejiga, contra el cáncer, para los

nervios y lavar los ojos. (Gómez, Chong 1985).

Químicamente, el órgano más estudiado de Heterotheca inuloides, y casi el único,

es la flor. Contiene un aceite esencial en el que se han identificado los

sesquiterpenos cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-iso-cadapeno, calacoreno y

epóxido de cariofileno.(Bohlman, Zdero 1976).

La parte mas estudiada es la flor, para la que se reporta:

Aceite esencial:

Sesquiterpentenos (cadaleno, trihidro-cadaleno, 4-metoxi-isocadapeno,

calacoreno, epóxido de cariófileno, 2-3-epoxi-7-hidroxi-beta-calacoreno, 4 hidroxi-

2-iso-propil-4-7-dimetil-nafa-talenona, 7-hidroxi-3,4dihydrocadeleno, 7-

hidroxicadeleno, beta-cariofileno, beta-catiofileno 4,5-alfa-oxido). Flavonoides

(astragalin, cariatín, eterdimetilico de eriodictiol, lutein, tetrametil-eter de

quercetagenin dimetil-eter, tetrametil-eter, alfa-arabinosido, beta-glucoronido, beta-

gluconido-dimetil-éster de quercitín, iso-quercitín, rutin, trifolin). Componente

fenólicos (ácido cefeico, clorogénico , protocatéquico). Cumarinas (umbeliferona,

cariolan-1,9 beta-diol). Triterpenos (alfa-y beta-amirina, cicloartenol, lanosterol).

Esteroides (avenastenolo,campesterol, beta-sitosterol, alfa-espinasterol,

estigmastenol, estigmasterol). Partes aéreas: Sesquiterpenos (cadaleno, 4-hidroxi-

2-isp-propil-4-7-dimetil-naftalenona). Flovonoides (quercetína). Flavonas

(apigenina, kaempferol,luteolina). (Jerga, 1987).

En un estudio de fines del siglo pasado se describe que de las flores de esta

planta se han obtenido, una resina, aceite esencial, grasa, una sustancia colorante

amarilla, tanino, ácidos gálico, oxálicom, goma, almidón, un principio amargo y un

alcaloide.(Jerga,1990).

Dentro de los estudios que se le han hecho, en el área microbiológica se sabe

que ejercen fuerte actividad antimicrobiana sobre (Argueta et al, 1994):


• Bacillus subtilis

• Escherichia coli

• Pseudomonas aeruginosa

• Candida albicans

• Staphylococcus aureus

De los cuales de destacan los siguientes compuestos: Sesquiterpenos: 7-hidroxi-

3,4-dihidrocadalina y 7-hidroxicadalina muestrando una potente activada contra G

(+), siendo el primero el más notable contra cepas de Staphylococcus aureus

resistente a meticilina (MRSA), a una concentración mínima bactericida (MBC) de

12.5 microgramos/ml. (Kubo, 1994).

Además de poseer actividad anti-inflamatoria in vivo e in vitro, actúa como

inhibidora de la actividad de la Tirosinasa, como analgésica, antioxidante y

tiene actividad citotóxica contra varios líneas tumorales sólidas (Delgado et al,

2001; Gene et al, 1998; Haraguchi et al, 1996; Haraguchi et al, 1997; Kubo et al,

1994; Kubo et al,1996; Kubo et al, 2000; Segura et al, 2000).

GORDOLOBO

Planta erecta bianual o perenne de vida corta con uno o varios tallos ascendentes,

ramificadas desde la base, de 30 a 75 cm de altura, cubiertos con pequeñas

cerdas lanosas largas y entrecruzadas; hojas numerosas, lanosas, apiñadas,

oblongo-lineares, espatuladas de la base, hojas de 1 a 2 cm de ancho por de 5 a

12 cm de largo, pecioladas con la base prolongada sobre el tallo extendida hacia

abajo, submembranosa con lana fina en la parte de abajo, glabros y verde


opacos en la parte de arriba, aguda a acuminada-apiculada en el ápice

marchitándose pronto de la base. Cabezuelas pocas a muchas, pequeñas, de 3

a 4.5 mm, al momento de abrirse la flor, más o menos globosas muy agrupadas,

Arregladas en panículas en la punta de las ramas, los frutos son aquenios

(Shreve y Wiggins, 1964). Florece de marzo a diciembre.

Es la tos, el padecimiento para el cual se emplea con mayor frecuencia a esta

especie en algunos estados del centro de la República Mexicana (Hidalgo;

Morelos, Puebla, Tlaxcala, Michoacán y Sonora). Asimismo, es muy útil en

problemas pectorales, infecciones en la garganta, bronquitis, asma, y para

descongestionar los bronquios. En trastornos gástricos interviene en el tratamiento

de las úlceras, dolor de estómago y parásitos intestinales (V. lombrices). (Barquin

Zamora, 1991).

Se emplea toda la planta con flores, por ejemplo, para la tos, que es debida al

catarro frío muy intenso, se ingiere el cocimiento de la planta o se prepara un

cocimiento en leche junto con otras plantas del mismo género y se toma en

ayunas durante nueve días; si la tos es crónica sólo se hierven las flores en leche

para tomarse tres veces al día; en ocasiones se hierven las ramas con las hojas

junto con ”ocote” (sp. n/r).También se ocupa en la terapéutica del cáncer, heridas,

fiebre, hidropesía, ciática y lumbago.(Cedillo,1990).

Historia.

En el siglo XVI, Francisco Hernández comenta: “la raíz es calorífica y secante,

triturada y tomada purga los humores flemáticos con seguridad y sin molestia por

el conducto superior”. Para el siglo XX, Maximino Martínez la reporta como:

antirreumático, antitusígeno; contra bronquitis, y dolor de garganta; es emoliente.

La Sociedad Farmacéutica de México la describe como antirreumático y

emoliente. (Martinez, 1944).


Para esta especie se reportan: diterpenos, flavonoides, compuestos

acetilenicos, carotenoides. En estudios recientes se reporta ácido ent-Kaur-16-en-

19-oico, zoapatlin, beta-sitosterol, y estigmasterol (Villagómez-Ibarra et al, 2001).

En un estudio realizado a tres especies mexicanas de Gnaphalium, para la

especie oxyphyllum se reporta que el extracto hexánico de las flores exhibe un

amplio espectro de actividad contra Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,

Salmonella typhimurium y Escherichia coli, a una concentración de 50 mg/ml

(Rojas et al, 2001; Villagómez-Ibarra et al, 2001).


4. JUSTIFICACIÓN

En los últimos años el cultivo de tejidos vegetales ha tomado un auge importante

en el desarrollo de nuevas tecnologías de preservación y conservación de

especímenes vegetales en peligro de extinción, dada la viabilidad de este método

se han podido determinar propiedades químicas relevantes para la industria en

general sin alterar el débil equilibrio ambiental, la demanda de dicha materia

vegetal y la rápida obtención de esta. Dadas las propiedades medicinales de la

árnica y el gordolobo resulta muy importante enfocar una investigación cuyo

objetivo sea la preservación de dos especies vegetales de importancia en la

medicina tradicional mexicana y a su vez la comparación de los metabolitos

secundarios entre el cultivo in-vitro y la in-vivo.


5. OBJETIVOS

5.4. OBJETIVO GENERAL:

Aplicar la técnica de cultivo in-vitro a plantas de interés medicinal, en este caso

Árnica (Heterotheca Inuloides) y Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum).

5.5. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Inducir la callogenesis en explantes de Árnica (Heterotheca Inuloides) y

Gordolobo (Gnaphalium oxyphyllum).

Comparar los extractos de gordolobo y árnica con los extractos obtenidos

de los callos mediante un análisis de HPLC.


6. MATERIALES Y METODOS

6.4. OBTENCION DEL MATERIAL VEGETAL

Los explantes fueron obtenidos de hojas jóvenes de Gordolobo (Gnaphalium

oxyphyllum) y Árnica Mexicana (Heterotheca inuloides) respectivamente,

completamente sanas, que no presentaron lesiones de patógenos externos.

El material vegetal seleccionado se obtuvo de dos fuentes, la primera el Jardín

Etnobotánico “Francisco Peláez R.” se encuentra ubicado en la 2 sur #1700, en

San Andrés Cholula, Puebla, México. La segunda en el mercado de flores y

plantas de Tenango de las Flores, Huauchinango Puebla.

6.5. FORMACION DE CALLOS

En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación

de raíces en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes

adventicios y la combinación de auxinas y citocininas en una misma concentración

para la formación y proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los

tejidos de las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad

de respuesta por la edad, la etapa fenológica, el tipo de explante, así como por la

cantidad de hormonas endógenas y proteínas receptoras. Por lo que es necesario

realizar estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la

inducción callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.

Con el método de desinfestación utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un

85% de explantes de hoja libre de contaminación, el cual consistió en lavar los

explantes dos veces en agua de grifo para después ser sumergidos en una

solución de tween 20 al 5 % durante 5 minutos finalizando con un enjuague de

agua de grifo para la desinfección superficial.


Para la desinfección microbiológica los explantes fueron tratados con una solución

de ampicilina al 5% durante 30 minutos para después ser aclarados tres veces en

agua bidestilada estéril. Además se llevo acabo una segunda desinfección

superficial la cual fue realizada con Ca (ClO)2 finalizando con 3 aclarados de agua

bidestilada doblemente estéril. Inicialmente, se contempló también el uso de

entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de este material fue del

100%, por lo que se descartaron.

El medio de cultivo basal utilizado fue el medio MS (Murashige y Skoog, 1962)

para el caso de los micronutrientes y para los macronutrientes se utilizo la

metodología propuesta por (Villegas et. Al. 1992), además con una concentración

de 30 g/l de sacarosa como fuente de carbono y solidificado con agar con una

concentración de 8 g/l, esterilizado en autoclave durante 20 minutos a 120°C y 15

psi. El medio fue complementado con una combinación de hormonas de acuerdo

con el diseño experimental propuesto por (Villegas et. Al. 1992).

Después de haber obtenido los explantes se procedió a sembrarlos en frascos de

100 ml conteniendo cada uno 20 ml de medio. Una vez sembrados los explantes,

los frascos se taparon con papel aluminio y parafilm, se rotularon con la fecha de

siembra y el medio de cultivo usado. Los frascos fueron expuestos a temperatura

ambiente (18-20°C) en cuartos oscuros y sometidos a revisión visual periódica

para establecer la formación de callos friables y posibles contaminaciones.

6.6. OBTENCIÓN DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS

6.6.3. Obtención de los extractos

De ambas plantas se pesaron 50 gr y una vez pesado, se licuaron en seco para

lograr una mayor área de contacto, se saturo la materia vegetal con etanol de 96°

y se dejo macerar por 48 horas, una vez transcurrido el tiempo se filtro el


macerado y se evaporo el solvente en un rota vapor marca BÜCHI® modelo B-480

a una temperatura de 52°C.

Posteriormente se pesaron 100µgr y se aforo con 10 ml de MeOH.

6.7. DETERMINACIÓN DE LOS MEABOLITOS SECUNDARIOS

Para determinar la eventual presencia de los metabolitos secundarios de H.

inuloides y G. oxyphyllum se realizo un análisis HPLC de los dos extractos cuyos

solventes de la fase móvil fueron los mismos variando las proporciones la primera

MeOH 70% y H2O 30% y la segunda MeOH 80% y H2O 20%.

Del extracto anterior se tomaron 10 ml de la solución y se filtro con un microfiltro

de 0.45µm, para después tomar 20µl e introducirlos al análisis de HPLC marca

WATTERS® serie 410.

Los extractos utilizaron una columna XTERRA® Rp 5µm (4.6 * 250 mm).


7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.4. RESULTADOS

7.4.3. OBTENCIÓN DE LA MATERIA VEGETAL

Con el objetivo de localizar poblaciones H. inuloides y G. Oxyphyllum se utilizaron

dos estrategias. La primera consistió en revisar la colección de ejemplares de

nuestras dos especies del Jardín Etnobotánico “Francisco Peláez R.” (San Andrés

Cholula, Puebla), cuya revisión fue exitosa ya que ambos ejemplares se

encontraron en existencia, dada la disponibilidad geográfica de dichas especies la

producción de ambas especies (H. inuloides y G. Oxyphyllum) se distribuyen en

toda la republica mexicana excepto en sus penínsulas lo que posibilita hallarlas

en los estados de Puebla, Tlaxcala, Hidalgo, Guerrero, D.F. y Edo de México.

La segunda estrategia consistió en entrevistas con colectores y vendedores de

plantas del mercado de plantas de Tenango de las Flores,( Huauchinango Puebla),

Hermilo Amador(Xicotepec, puebla), Hidalgo(Puebla capital).

Los resultados arrojaron que H. inuloides es comercializada en la mayor parte de

los mercados visitados tanto en su presentación fresca como en la seca, a

diferencia de G. Oxyphyllum que solo fue conseguido en Jardín Etnobotánico

“Francisco Peláez R.” (San Andrés Cholula, Puebla).

Fig. 8. H. inuloides (izquierda) y G. Oxyphyllum.(derecha) Fuente. Propia


7.1.2. FORMACIÓN DE CALLOS

En los cultivos in vitro se ha generalizado el uso de las auxinas para la formación

de raíces en tejidos no diferenciados, las citocininas para la formación de brotes

adventicios y la de auxinas y citocininas en una misma concentración para la

formación y proliferación de callos (Rayen et al., 1999). Sin embargo, los tejidos de

las distintas especies vegetales presentan diferencias en su capacidad de

respuesta por la edad, la etapa fenológica, el tipo de explante, así como por la

cantidad de hormonas endógenas y proteínas receptoras. Por lo que es necesario

estudios que conlleven a conocer el tipo y la dosis de RCV para la inducción

callos, brotes y raíces para cada tipo de especie.

Con el método de desinfestación utilizado en el presente trabajo, se obtuvo un

85% de explantes de hoja libre de contaminación. Inicialmente, se contempló

también el uso de entrenudos como explantes, sin embargo la contaminación de

este material fue del 100%, por lo que se descartaron.

Los primeros cambios en los explantes de hoja se observaron a partir de las 4

semanas de sembrarlos. Estos consistieron en la formación de callos, (Figura 9 A)

con un alto rendimiento a la inducción, sin embargo estas estructuras al ser

resembradas en medio fresco no crecieron. Para un segundo intento de siembra

se utilizo una combinación (ANA en compañía con KIN o BAP) donde se formaron

callos con un rendimiento medio de inducción, éstos aparentemente presentaron

crecimiento al resembrarse, sin embargo se oxidaron.

En el intento 3 (ANA) se desarrollaron callos (Figuras 9 B y9 C ). En este medio

se formaron brotes con un alto rendimiento de inducción (Figura 9D y9 E). En otro

intento, los explantes se necrosaron (Figura 9F).


Fig.9 Obtención de callos. Fuente: Propia.

7.1.3. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS

De ambas plantas se obtuvo un extracto etanolico cuyo peso final después de

pasar por el arrastre de vapor fue de 3.46 gr en las siguientes figuras se

observaran las fases, desde el inicio de la maceración hasta el producto final.

Fig. 10 A. maceración de los extractos por 48 horas.


Fig. 10 B. filtración de los extractos. (Izquierda), C) evaporación por arrastre de

vapor (derecha).

Fig. 10 D. extracto final cuyo peso final fue de 3.46 g.


7.1.4. DETERMINACIÓN DE LOS METABOLITOS

SECUNDARIOS

Para la determinación de los metabolitos secundarios, se realizo un análisis de

HPLC cuyas muestras de la planta se muestran en las siguientes figuras

Fig.11 Muestra lista para el análisis de HPLC

Fig. 12. Analisis de HPLC respectivo para H. inuloides .


Fig. 13 analisis de HPLC respectivo para G. Oxyphyllum

Las figuras 12 y 13 muestran graficas de HPLC, donde los picos mas altos

muestran un alto contenido de solvente, y los picos diferenciados muestran la

presencia de metabolitos, cabe destacar que se necesita hacer un análisis mas

extenso en cuanto a HPLC se refiere ya que se debe de cuantificar la cantidad de

metabolitos contenidos en cada pico.

7.2. DISCUSIÓN

Para la realización de la presente investigación, la búsqueda de las especies

vegetales jugo un papel importante, ya que su disponibilidad fue escaza,

comenzando desde la identificación de las especies cuyas presentaciones no eran

las adecuadas para nuestro estudio, por lo cual se recurrió a mercados y jardines

botánicos.

Para la inducción a la callogenesis se tomo de primera mano aportes realizados

por skoog, 1974 tomando en cuenta que se utilizaría como primera metodología lo

descrito para el medio MS, a falta de resultados se profundizo en la utilización de

cada micro y macro nutrientes hasta llegar a la parte de los RCV donde las

combinaciones de la hormonas de crecimiento dieron lograron aclarar las dudas

sobre las cuales los explantes no desarrollaban tejidos, una vez obtenida la


Combinación necesaria se procedió a seguir averiguando el por que una vez

iniciado el proceso de callogenesis los callos de ambas especies vegetales no se

desarrollaban y/o el tejido necrosaba. El problema radico quizá en la edad del

explante y en la agresividad de los agentes desinfectantes. En el caso del análisis

de HPLC la comparación entre los cultivos in-vitro y la planta silvestre no se

pudieron llevar acabo ya que el volumen total de los callos obtenidos era menor de

50gr cantidad mínima requerida para empezar la extracción de los metabolitos y

su posterior análisis , otro factor importante fue la juventud de estos, dado que aun

no tenían un tamaño y masa apropiada para una mejor obtención de los

metabolitos, ya que de haber sido posible se hubiera hecho aparte de un a HPLC

comparativo para ambas plantas resonancias magnéticas que especificarían la

relación que existe entre la planta in.vitro y la in-vivo.


8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

8.4. CONCLUSIONES

La auxina ácido α-naftalenacético induce callogenesis en explantes de hojas de

plantas silvestres adultas de H. inuloides. Esta auxina en combinación con las

citocininas cinetina y 6-bencilaminopurina induce callogenesis en G. oxyphyllum

esta conclusión esta basada en los cambios de la combinación de los RCV a lo

largo de la investigación.

Se estableció el cultivo in vitro de callos de H. inuloides y G. oxyphyllum a partir

de explantes de hojas de plantas silvestres adultas.

8.5. PERSPECTIVAS

El presente trabajo tuvo por objetivos particulares la comparación de metabolitos

secundarios entre las especies H. inuloides y G. oxyphyllum, este objetivo no fue

cumplido ya que como se discutió en apartados anteriores los callos no alcanzaron

la madurez necesaria además de que los callos no reunieron el peso mínimo para

ser analizados y comparados.

Se recomienda que una vez alcanzada tanto la madurez necesaria como el peso

se realice una maceración en hexano en un lapso de 24-48 horas.

Una vez transcurrido este tiempo se propone realizar una destilación por reflujo,

que consiste en calentar el solvente por medio de un nido a una temperatura de

entre 55-60°c con un refrigerante colocado de manera vertical, de tal manera que

el solvente evaporado por acción de la condensación regrese al matraz, todo esto

durante 4 horas para su posterior evaporación por arrastre de vapor, repitiendo

este proceso 3 veces, una vez concluidos los tres reflujos y evaporaciones se

prepare la muestra para su análisis en HPLC y su posterior comparación.


9. FUENTES CITADAS

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10. ANEXOS

Reactivos

Stocks o soluciones madre para los micronutrientes del medio de cultivo MS y

según el protocolo de Villegas et-al, 1992 para los macronutrientes.

Micronutrientes

-Solución de fosfato de potasio (K3PO4)

Para 100 ml

0.17 gr de K3PO4

Disolver en 50 ml de agua destilada y después aforar con agua destilada.

Almacenar en refrigeración.

-Solución de Nitrato de Amonio (NH4NO3 )

Para 100 ml

0.165 gr de NH4NO3



- Solución de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)

Para 100 ml

0.37 gr de MgSO4.7H2O




-Solución de cloruro de calcio di hidratado CaCl.2H2O

Para 100 ml

0.14 gr de CaCl.2H2O



- Solución de nitrato de potasio (KNO3)

Para 100 ml

0.190 gr de KNO3



-Micronutrientes según Villegas et-al,1992

Para 100 ml

0.083 gr de Yoduro de Potasio (KI)

0.223 gr de Sulfato de Manganeso Monohidratado (MnSO4)

0.63 gr de Acido Bórico (B2O3)

0.86 gr de sulfato de Zinc Heptahidratado (ZnSO4.7H2O)

0.25 gr de Molibdato de Sodio (Na2MoO4)

0.25 gr de Sulfato de cobre Pentahidratado (CuSO4.5H2O)

0.025 gr de Cloruro de Cobalto (CoCl2)


Se disuelven todos los solidos en 50 ml de agua y se afora a 100 ml con agua

destilada.


-Vitaminas MS

Para 100 ml

0.1 mg de Acido Nicotínico

0.1 mg de Tiamina

0.1 mg de Piridoxina

Los solidos se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.

-Quelatos

Para 100 ml

0.372 gr sal de Sodio dihidratado( C10H14N2Na2O8.2H2O).

0.278 gr Sulfato de hierro II (FeSO4).


-Mionositol

Para 100 ml

1 gr de Mionositol (C6H12O6 )


-Hormonas

-B.A (benzyl amino purina)


Para 100ml

10 mg de BA

Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml

-A.N.A. acido naftalenacetico

Para 100 ml

10 mg de ANA

Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.

-stocks de desinfección

-Cloruro de calcio (CaCl2)

Para 100 ml

2.5 gr de CaCl2

Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml.

-Tween 20

5 ml de tween 20

Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100ml

-Stock de Ampicilina

0.5 gr de ampicilina

Se disuelven en 50 ml de agua destilada y se afora a 100 ml


11. GLOSARIO

ANA: Acido α-naftalenacetico.

Asepsia: término médico que define al conjunto de métodos aplicados para la

conservación de la esterilidad.

BA: 6-bencilaminopurina.

Callo: masa de tejido parenquimático indiferenciada en crecimiento activo.

CCTV: Cultivo de células y tejidos vegetales.

GD: Medio de cultivo Gresshof & Doy.

Genotipo: totalidad de la información genética que posee un organismo en

particular, en forma de ADN. Junto con la variación ambiental que influye sobre el

individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el

conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de

un organismo.

Germoplasma: conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la

descendencia por medio de gametos o células reproductoras. El concepto de

germoplasma se utiliza comúnmente para designar a la diversidad genética de las

especies vegetales silvestres y cultivadas de interés para la agricultura y, en ese

caso, se asimila al concepto de recurso genético.

HPLC: High Pression Liquid Cromatography

Metabolitos secundarios: compuestos químicos sintetizados por las plantas que

cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es fatal

para la planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de las plantas.

Los metabolitos secundarios de las plantas intervienen en las interacciones


ecológicas entre la planta y su ambiente.También se diferencian de los

metabolitos primarios en que cada uno de ellos tiene una distribución restringida

en el Reino de las plantas, a veces a sólo una especie o un grupo de ellas, por lo

que muchos de ellos son útiles en Botánica Sistemática.

Micropropagación: conjunto de técnicas y métodos de cultivo de tejidos utilizados

para multiplicar plantas asexualmente en forma rápida, eficiente y en grandes

cantidades. La micropropagación se utiliza para multiplicar o propagar plantas

nuevas, tales como aquellas creadas por ingeniería genética, mutagénesis o

mejoramiento genético. Se utiliza también la micropropagacion para obtener

plantas libres de enfermedades (tales como virosis) u obtener grandes cantidades

de plantas que no se propagan eficientemente.

MS: Medio de cultivo Murashige & Skoog.

MSNM: Metros Sobre el Nivel del Mar.

RCV: reguladores de crecimiento Vegetal.

SH: Medio de cultivo Schenk &Hilderbrandt.

Totipotencialidad: Término utilizado en biología para referirse a células que

poseen la capacidad de dar origen a varios tipos celulares, incluso pudiendo una

sola de estas células dar origen a millones de células, tejidos, órganos, hasta

incluso embriones.

caracterizaciÓn de metabolitos secundarios apartir de tejidos vegetales

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