aféresis de progenitores hematopoyéticos

AFÉRESIS DE PROGENITORES HEMATOPOYÉTICOS

Versión 003

Ubaldo Bedoya M.- BacteriólogoM. Sc. Biotecnología

www.imatoncomedica.com

AFERESIS

Técnica mediante la cual se separan los componentes de la sangre, siendo seleccionados los necesarios para su aplicación en medicina y devueltos al torrente sanguíneo el resto de componentes.

Versión 003

El objetivo de este proceso es recolectar los PH y conservarlos hasta el momento de la reinfusión con el fin de hacer un rescate de la función hematopoyética.

La recolección de PH requiere la administración de citocinas debido a que su concentración en sangre periférica es muy baja además de un equipo separador de células.

Carreras, E. et al. Man Trasp Hemop 3ª ed. 2004

www.imatoncomedica.com

AFERESIS

• Controles previos de Hb > 11g/dL , plq > 150.000/mLresultados negativos de HCV, HBsAg y VIH 10 días anteriores.• Si no se consigue la celularidad necesaria con un solo

proceso de aféresis y es necesario repetir el procedimiento, el recuento de plaquetas debe ser mayor a 100.000/mL

• La edad no debe suele ser un factor limitante.

Criterios para la aceptación de donantes sanos de PH

Momento del comienzo

Por calendario:• G-CSF por lo general al 4° o 5° día de movilización.• Con QT: depende del esquema, entre 9 y 14 días post QTSegún recuento periférico de CD34+ > Mayor a 15 cel/uL

www.imatoncomedica.com

AFERESIS

Versión 003

El equipo separa las células por centrifugación en sus distintos componentes por gradientes de densidad.

VST = Peso * Cte. VP = 3 - 4 # ciclos = VST * VP/ 1000

El anticoagulante de preferencia es ACD-A.

Se hacen 3 volemias máximo 4. Depende de la tolerancia del paciente. Depende del CD34+

La tasa de mortalidad es bastante baja, tres muertesestimadas por 10.000 procedimientos*

J Clin Apher. 1990;5(2):70-73

www.imatoncomedica.com

Separación de componentes

www.imatoncomedica.com

Conexión del paciente al citoseparador

Para iniciar el proceso de recolección de PH es necesario que el paciente haya sido catalogado como buen movilizador. CD34+ > 10 cel/μL 5° o 9° día de movilización Catéter y recogida

Actualmente, se considera mínima una concentración de 2 x 106

células CD34+/kg de peso corporal la cual se obtiene en el 94% de los casos con un recuento de CD34+ preaféresis >20 x 106 cel/uL Concentraciones menores a esta se relacionan con retraso en recuperación de plaquetas. Correlación positiva con el arraigo o prendimiento del injerto*

Criterios de recolección de PH

Eur J Haem. 2008. 80(9): 287-295.

Criterios de recolección de PH

Pierelli et al. TRANSFUSION. 2012.

La ultima dosis de filgrastin o lenograstim debe ser administrada 2 o 3 horas antes del conteo en sangre periférica y 3 o 4 horas antes de la aféresis programada.

VOLEMIAS PROCESAD

AS      

  0 1 2 3 4 5 6Predicción

  5 0 0,3 0,5 0,7 1 1,2  C 10 0,2 0,5 0,8 1,1 1,4 1,7 CD 15 0,4 0,8 1,1 1,5 1,8 2,2 D34 20 0,6 1 1,4 1,8 2,3 2,7 34  25 0,8 1,3 1,7 2,2 2,7 3,2  P 30 1 1,5 2 2,6 3,1 3,6 PR 38 1,3 1,9 2,5 3,2 3,8 4,4 OE 50 1,7 2,5 3,3 4 4,8 5,6 S  70 2,4 3,5 4,5 5,5 6,5 7,6  A 80 2,8 3,9 5,1 6,2 7,4 8,5 AF 90 3,2 4,4 5,7 7 8,3 9,5 FE 110 3,9 5,4 6,9 8,4 10 11,5 ER 130 4,5 6,4 8,2 9,8 11,7 13,4 RE 160 5,7 7,9 10 12,1 14,3 16,4 ES 200 7,2 9,8 12,4 15,1 17,7 20,3 SI 250 9 12,3 15,5 18,7 22 25,2 IS 300 10,9 14,7 18,6 22,4 26,3 30,1 S

  VOLUMEN SANGUINEO(mL/Kg de peso)Sexo Obeso Delgado Normal Muscularmasculino 60 65 70 75Femenino 55 60 65 70

Criterios de recolección de PH

Constantes según sexo y peso

Predicción de CD34+Pos aféresis basado en el recuento previo en sangre periférica

www.imatoncomedica.com

Ejemplo

Versión 003

Paciente varón con 67 kgCD34+ en aféresis = 1640/μL Vol. de la aféresis = 200 mL Viabilidad = 0,998

# cel/kg peso = cel/μL * Viab * Vol * 1000

Peso pte = 1640*0,998*200*1000 67 = 4.885.731 cel/kg peso

> 4 x 106 cel/Kg peso IDEALES

Ventajas y desventajas

Sangre periférica Médula ósea

Sin anestesia Extracción única

Arraigo más rápido Sin catéteres

Menos células tumorales Sin citocinas

Requiere más de una aféresis

Requiere anestesia gral.

Se requiere catéter Arraigo mas lento

Hemorragias, embolias e infecciones

Mayores tasas de morbi/mort

Efectos adversos

Toxicidad del citrato: hipocalcemia

Trombocitopenia

Hipovolemia

Mal funcionamiento del catéter.

Infección

Se realiza hemograma post-aféresis:

Plaquetas – Hemoglobina – Leucocitos.

Realizar hemocultivo a las unidades de PH para descartar contaminación.

La mezcla del citrato + heparina disminuye los efectos colaterales del

ACD que cuando se emplea solo.

No emplear en caso de historial de reacciones anafilácticas, antecedente

de enfermedad autoinmune o inflamatoria.

Recomendaciones

Unidad de progenitores hematopoyéticos

El objetivo principal de la criopreservación de los progenitores

hematopoyéticos es mantener la viabilidad y funcionabilidad de las

células a bajas temperaturas durante cortos períodos de tiempo o

incluso décadas.

CRIOPRESERVACIÓN

4º C: Empleo a corto plazo ↓ viabilidad 5% en 24H 50 -70% en 7 días -80º C: Empleo antes de 6 meses-196 º: >6 meses

4°C - 30°C - 80°C : mejor viabilidad

Temperatura de conservación

Nevera a -84° C.

Daño mecánico por formación de hielo intra y extracelular

Daño mecánico por expansión térmica Hiperosmolaridad extracelular y deshidratación Desnaturalización de proteínas

Lesión por congelación

Daño osmótico (deshidratación)

Lesión por congelación

Célula sanguíneanormosmolar.

Célula sanguíneanormosmolar. Centros de nucleación

de hielo.

Centros de nucleaciónde hielo.

Espacio extracelularhiperosmolal.

Espacio extracelularhiperosmolal.

Célula sanguíneadeshidratada.

Célula sanguíneadeshidratada.

Espacio extracelularnormosmótico.

Espacio extracelularnormosmótico.

Daño mecánico

Centros de nucleaciónde hielo.

Centros de nucleaciónde hielo.

Célulasanguínea.

Célulasanguínea.

Célula sanguíneadestruida.

Célula sanguíneadestruida.

Lesión por congelación

Características: Sustancias muy hidrosolubles Baja toxicidad Disminuyen punto eutéctico de una solución T° mínima a la que una solución esta en estado liquido Pueden ser penetrantes y no penetrantes

CRIOPROTECTORES

Las substancias crioprotectoras más utilizadas son:

DMSO (dimetilsulfóxido). Proteínas. Soluciones salino/glucosadas. HES (hidroxietilalmidón). Glicerol.

CRIOPROTECTORES

Transfus Med Hemother 2011;38:107–123

CRIOPROTECTORES

Espacio extracelularnormosmótico.

Espacio extracelularnormosmótico.

Molécula de DMSO.

Molécula de DMSO.

Célula sanguíneacon poco estrés osmótico.

Célula sanguíneacon poco estrés osmótico.

Célulasanguínea.

Célulasanguínea.

Centros de nucleaciónde hielo.

Centros de nucleaciónde hielo.

Espacio extracelularligeramente hiperosmolal.

Espacio extracelularligeramente hiperosmolal.

0ºC 0ºC

0ºC 0ºC

Solución eutéctica(con menor punto decongelación).

Solución eutéctica(con menor punto decongelación).

Centros de nucleaciónde hielo.

Centros de nucleaciónde hielo.

Solución eutéctica conmás solutos segregados(aún con menor puntode congelación).

Solución eutéctica conmás solutos segregados(aún con menor puntode congelación).

Propiedad coligativa de los solutos.

..Solución superenfrianda

CRIOPRESERVACIÓN DE PHSP

• DMSO utilizado a una concentración final del 5-10% en solución proteica ( plasma autólogo o albumina humana)

• DMSO tóxico celular > 4°C: mezcla de las soluciones celular y criopreservante se hace a 4°C

• Mezcla de DMSO y fracción proteica: 30 minutos antes.

CRIOPROTECTORES

PROTEINAS

• Aumentan la supervivencia de las células ya que modifican la viscosidad y la temperatura de la transición hialina de la solución crioprotectora.

• La fuente puede ser autóloga: plasma • Albumina humana al 4%

ALMACENAMIENTO

• Congeladores mecánicos de-120 a -86°C

• Almacenamiento de células criopreservadas es en bolsas de plástico

de PVC/poliolefin y en frascos de polietileno.

De la bolsa de recolección a la de criopreservación

DESCONGELAMIENTO

Descongelamiento rápido

Se tiene mejor viabilidad celular con descongelamiento rápido

Se colocan las bolsas en baño de maría entre 37 y 42°C. Agua

destilada.

Cerciorarse de que toda la bolsa quede sin grumos.

Se realiza en la habitación del paciente.

El orden de descongelación/infusión de las bolsas (en caso de ser +

de una) será de mayor a menor celularidad CD 34+.

CONTROL DE CALIDAD

Prueba de viabilidad por exclusión con tinción azul de trípano o citometría de flujo: CD34+ y 7AAD

La viabilidad post aféresis permite compararla con la pre-aféresis

Ideal superior al 90%

BIBLIOGRAFIA

1. Smith DM, Ness MJ, Landmark JD, Haire WW, Kessinger A. Recurrent neurologic symptoms during peripheral stem cell apheresis in two patients with intracranial metastases. J Clin Apher. 1990;5(2):70-73.

2. Movilización y aféresis de las células madre hematopoyéticas: Guía práctica para el personal de enfermería y otros profesionales de la atención sanitaria relacionados. EBMT. 2009. 3. Carreras, E. et al. Manual de Trasplante Hemopoyético. 3° Ed. Pag 259-263. 2004.

4. Conference report: Best practice for peripheral blood progenitor cell mobilization and collection in adults and children: results of a Società Italiana Di Emaferesi e Manipolazione Cellulare (SIDEM) and Gruppo Italiano Trapianto Midollo Osseo (GITMO) consensus process_3385. 2011

5. Esa Jantunen, Taru Kuittinen. Blood stem cell mobilization and collection in patients with lymphoproliferative diseases: practical issues. Eur J Haem. 2008

6. Armitage, S. et al. CD34 counts to predict the adequate collection of peripheral blood progenitor cells. Bone Marrow Transplant 1997;20:587–91.

7. Cryopreservation of Human Stem Cells for Clinical Application: A Review Transfus Med Hemother 2011;38:107–123.

8. Pierelli et al. Best practice for peripheral blood progenitor cell mobilization and collection in adults and children: results of a Società Italiana Di Emaferesi e Manipolazione Cellulare (SIDEM) and GruppoItaliano Trapianto Midollo Osseo (GITMO) consensus process_3385 1..13. TRANSFUSION. 2012

Gracias

Versión 003

#aferesisTAMO