7 fluorescencia

a.- Estándar externo y curva de calibración

Análisis Cuantitativo en Absorción UV - Visible

(aplicable a otras técnicas analíticas)

Ejemplo:

Se preparan 6 soluciones de conc. conocida de Cu+2

Se mide la absorbancia a max

Concentración

(mg/L )

Absorbancia Abs. Corregida

0 0,003 0

1,00 0,078 0,075

2,00 0,163 0,160

4,00 0,297 0,294

6,00 0,464 0,461

8,00 0,600 0,597

Nota:

Absorb. corregida = p.ej 0,003

(absorb. de la muestra) – (absorb. del solvente)

Curva de calibración:

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Conc / mg/L

Ab

s

Se ajusta a una recta:

y = 0.075x

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Conc / mg/L

Ab

s

Luego se toma la medición de la muestra

Absorbancia = 0,418

y = 0,0750x

Se interpola en la curva de calibración →

Concentración = 5,57 mg/L

y = 0.075x

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Conc / mg/L

Ab

s

b.- Adición de Standard

La MATRIZ es todo lo que está en la muestra exceptuando al analito.

Algunas veces ciertos componentes interfieren en el análisis Efecto de matriz

Preparación de estándares

La concentración y el volumen de la solución patrón agregada debe aumentar aprox.

en 30% de matraz en matraz.

Solución Patrón

Muestrade conc.

desconocida

Sol. patrón

Muestra

e

CxCs

Cx

Cs

Vx

Abs

orba

ncia

V (mL) de standard

(Vs)o

La concentración se determina gráficamente a partir de la ecuación de la recta o aplicando la relación:

Cx = -(Vs)oCs/Vx

(Vs)o = volumen de solución standard

Cs = conc. conocida del analito en el patrón

Vx = volumen (conocido) de la muestra

Ej: Determinación de hierro en alimentos por UV - VIS

Fe+3 (ac) + SCN-(ac) Fe(SCN)+2

(ac)

( max = 458 nm)

Uvas pasasCerealesGranos

Patrón 0,001 M Fe(NO3)3

(mL)

HCl 0,1 M (mL) Concentración Fe+3 (mM)

1 0 20 0,00

2 5 15 0,25

3 10 10 0,50

4 15 5 0,75

5 20 0 1,00

Curva de calibración (Absorbancia vs concentración)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 0,25 0,50 0,75 1,00

Conc (mM)

Ab

s

Interpolar los datos de las muestras

Luminiscencia

Fluorescencia* - Fosforescencia -

Quimioluminiscencia Fluorescencia* - Fosforescencia -

Quimioluminiscencia

Espectroscopía de Fluorescencia

Fluorita (CaF2)

Breve repaso:¿Qué le sucede a las

moléculas luego de la excitación? Breve repaso:¿Qué le sucede a las

moléculas luego de la excitación?

en colisiones se emite la energía (calor - NO RADIANTE)

RADIANTE

Fluorescencia Fosforescencia

Procesos de relajación

En un tiempo muy corto, el átomo o molécula (excitado) vuelve a su estado fundamental

Energía incidente Energía emergente

Calor Luz EMISIÓN

Luz Calor ABSORCIÓN

Luz Luz LUMINISCENCIA

Fluorescencia y Fosforescencia

Fluorescencia Fosforescencia

tiempo aprox 10-5 s tiempo > 10-5 sde minutos a horas

ocurre en ciertas moléculas (hidrocarburos poliaromáticos o heterociclos), llamados fluoróforos o colorantes fluorescentes.

Fluorescencia que implica el Desplazamiento de Stokes

Espines apareadosNo hay campo magnético neto

Espines desapareadosSí hay campo magnético

t de vida medio =10-5 a 10-8 s 10-4 o más

Fluorescencia Fosforescencia

Diamagnetismo Paramagnetismo

Estado singlete: espines apareados Estado triplete: espines desapareados

Fluorescencia

ConversiónInterna y

relajaciónvibracional

Absorción (excitación)

Diagrama de energía de Jablonski

Estado fundamental

Fosforescencia

Cruce entre sistemas

Conversióninterna

Estados vibracionalesde energía

Estados excitados singletes

Estadoexcitadotriplete

12

Procesos de Desactivación:

a) Relajación vibracional: colisiones con otras moleculas

- emisión > excitación (Stokes)- es eficiente, y el paso entre niveles vibracionales dura 10-12 s o menos.- la fluorescencia ocurre del nivel de menor energía vibracional del nivel electrónico excitado, pero puede llegar a cualquier nivel vibracional del estado fundamental.

b) Conversión interna : no entendido del todo- paso no radiante, a un estado electrónico de menor energía.- eficiente: ya que la mayoría de los compuestos NO fluoresce- más probables si hay solapamiento en los niveles de energía vibracional de 2 estados electrónicos.

Fluorescencia

ConversiónInterna y

relajaciónvibracional

Absorción (excitación)

Diagrama de energía de Jablonski

Estado fundamental

Fosforescencia

Cruce entre sistemas

Conversióninterna

Estados vibracionalesde energía

Estados excitados singletes

Estadoexcitadotriplete

12

c) Conversión externa: no entendido del todo

• desactivación via colisiones con el solvente• baja temperatura y/o elevada viscosidad genera menos

colisiones incrementa la fluorescencia o fosforescencia

d) Cruce entre sistemas: • se invierte el espín del electrón

- Cambio de multiplicidad en la molécula (singlete a triplete)- Es más probable si los niveles vibracionales se solapan- Mas común si la molécula tiene átomos pesados (I, Br), y es

más común en presencia de especies paramagnéticas (O2)

e) Fosforescencia:Desactivación desde un nivel electrónico ‘triplete” al estado fundamental produciendo un fotón

Procesos de Desactivación

Absorción 10-14 ~ 10-15 s Relajación Vibracional y Conversión

Interna 10-12 s ó menos Fluorescencia 10-9 ~ 10-7 s Fosforescencia 10-3 ~ 10 s

Variables que afectan la Variables que afectan la fluorescenciafluorescencia

Rendimiento cuántico

kf : fluorescencia kces: cruce entre sistemas kce: conversión externa kci: conversión interna kpd: predisociación kd: disociación

ces ce ci

Relación entre el número de moléculas que fluoresce y el total de moléculas excitadas eficiencia

0 ≤ < 1

Rupturas de enlace ( dependede la estructura del compuesto)

Tipos de Transiciones en Fluorescencia:

- Rara vez ocurre como consecuencia de absorbancia a menor a 250 nm

200 nm => 140 kJ/mol ruptura de enlaces

- No se observa fluorescencia * - Sí en * ó * n

Fluorescencia & Estructura:

.-usualmente compuestos aromáticos policondensados

.-baja energía de transición *

.-rendimiento cuántico aumenta con el número de anillos y grado de condensación.

.-la fluorescencia se favorece especialmente en estructuras rígidas

N HN

H2C

N

O

Zn

2

Ejemplos de compuestos fluorescentes:Ejemplos de compuestos fluorescentes:

Quinolina Indol Fluoreno 8-Hidroxiquinolina

H3C CH3

CH3

CH2OH

CH3 CH3 CH3

La Vitamina A experimenta fluorescencia en la región azul con una max de 500 nm.

Sistema altamente conjugado

Favorececruce entresistemas

Efectos de la Temperatura, Solvente & Efectos de la Temperatura, Solvente & pH pH ::

- disminuye temperatura aumenta fluorescencia (< conv. externa)- aumenta viscosidad aumenta fluorescencia (menos colisiones)- la fluorescencia depende del pH para compuestos con sustituyentes ácidos o

básicosSi hay más formas de resonancia se estabiliza el estado excitado

NH H

NH H

NH H

Formas de resonancia de la anilina

Efecto del O2 disuelto :

- si aumenta [O2] disminuye la fluorescencia oxidación de las especies fluorescentes las propiedades paramagnéticas favorecen el cruce entre sistemas

Aplicaciones de la FluorescenciaAplicaciones de la Fluorescencia- detectando especies inorgánicas al agregar un fluoróforo

IonIon ReactivoReactivoAbsorción Absorción

(nm)(nm)Fluorescencia Fluorescencia

(nm)(nm)Sensibilidad Sensibilidad

(ppm)(ppm)InterferenciInterferenci

aa

AlAl3+3+ ““Alizarin garnet Alizarin garnet R”R” 470470 500500 0,0070,007

Be, Co, Cr, Be, Co, Cr, Cu, FCu, F--,NO,NO3-3-, , Ni, PONi, PO44

-3-3, Th, , Th, ZrZr

FF--

Complejo de Al Complejo de Al con “Alizarin con “Alizarin garnet R”garnet R”

470470 500500 0,0010,001

Be, Co, Cr, Be, Co, Cr, Cu, FCu, F--,Fe, ,Fe, Ni,PO4-3, Ni,PO4-3, Th, ZrTh, Zr

BB44OO772-2-

BenzoínaBenzoína 370370 450450 0,040,04Be, SbBe, Sb

CdCd2+2+

2-(2-(oo--Hidroxifenil)-Hidroxifenil)-benzoxazolbenzoxazol

365365 AzulAzul 22NHNH33

LiLi++

8-8-HidroxiquinolinHidroxiquinolinaa

370370 580580 0,20,2MgMg

SnSn4+4+ FlavanolFlavanol 400400 470470 0,10,1 FF--, PO, PO443-3-, Zr, Zr

ZnZn2+2+ BenzoínaBenzoína -- VerdeVerde 1010B, Be, Sb, B, Be, Sb, iones iones coloreadoscoloreados

N

OH

O

O

OH

OH

HO N N

HO

SO3Na

C

O

C

H

OH

8-Hidroxiquinolina Flavanol “Alizarin garnet R” Benzoína

Ph

Límites de detección en Fluorescencia y Absorción LD en

fluorescencia son tres órdenes de magnitud mejores que en espectroscopía de absorción.

Método Lim. Det. (moles)

Lim. Det. Conc. molar

Ventajas

Absorc.UV-Vis

10-13 a 10-16 10-5 a 10-8 Menos restringid

a

Fluoresc 10-15 a 10-17 10-7 a 10-9 Más sensible