INSTITUTO TECNOLÓGICO DE

LOS MOCHIS

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Microbiología

Anteproyecto:

“Aislamiento y cultivo de microorganismos amilolíticos”

Integrantes:

Soto Luque Carlos ManuelValdez Fonseca Dalia ZuzetMendoza Grajeda Jesús O.

Rivera Jesús RosarioLópez Dimas Carlos

M.C. Ochoa Hernández María

Los Mochis, Sinaloa a 20 de marzo de 2015.

Introducción

Los microorganismos amilolíticos tienen un gran impacto en el ambiente donde se encuentren, ya que son capaces de degradar grandes cantidades de almidón. El almidón es un polisacárido de alto peso molecular ramificado, es una fuente energética pura de vegetales, principalmente, los tubérculos. Generalmente se sabe que los microorganismos con capacidad degradante amilolítica son las bacterias, hongos y levaduras. El microorganismo huésped se selecciona de un grupo formado por las levaduras de los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces o Kluyveromyces o las bacterias del género Zymomonas o los mohos del género Aspergillus (Zoraya, et. al. 2006).

En el presente trabajo se realiza el estudio de cepas microbianas de un nicho ecológico muy presente en nuestra región, siendo el suelo agrícola, productoras de enzimas amilolíticas. Los criterios utilizados para el aislamiento y cultivo de las cepas, son el crecimiento sobre los medios preparados manualmente con almidón y la positividad frente al test de lugol.

Objetivos

Aislar y cultivar microorganismos amilolíticos de suelo agrícola. Identificar microorganismos aislados.

Justificación

En la industria alimentaria, la utilización en enzimas en la producción de alimentos es, hoy en día, un recurso indispensable. Las enzimas son las encargadas de transformar moléculas grandes en compuestos de menor tamaño o viceversa pero con la finalidad de apresurar procesos químicos. El uso de enzimas amilolíticas se aplica mayormente en la producción de jarabes o productos de alto contenido de azúcar, incluso en edulcorantes.

El aislamiento de microorganismos amilolíticos permitirá dar el paso para la producción y obtención masiva de enzimas degradadoras de almidón a partir de cepas puras, con la confiabilidad de que la extracción de estas es segura para su consumo. Dicho eso, la misma producción de enzimas con organismos biosintésicos es un método de ahorro en costos para las industrias o usos domésticos. También aplica la investigación de estos microorganismos si resultan ser patógenos para el suelo en donde se encuentren, aprovechándose de especies ricas en almidón.

Antecedentes

En 2006, investigadores del Instituto de Ciencia Animal, Cuba, realizaron un proyecto de aislación y selección de microorganismos con capacidad degradante de almidón. Se utilizó como medio de cultivo, boniato fresco rallado. Este es conocido como batata o papa dulce, en nuestra región se conoce como camote. Se ajustó el medio a distintas variaciones de pH colocándose en cuatro ambientes distintos por un periodo de 5 días. Se realizaron extracciones de los microorganismos aerobios y se sembraron en un medio, cuya única fuente energética era el almidón. Posteriormente se incubaron a 30°C por siete días.

Se seleccionaron las cepas con mayor crecimiento y se determinó su capacidad amilolítica por la formación de halos de digestión, después de una tinción de lugol en el medio.

Los microorganismos se compararon con cepas de referencia, Aspergillus oryzae y Aspergillus niger. De proyecto se obtuvieron 32 cepas puras, de ellas 31.2% con mayor capacidad amilolítica que las de referencia. Los hongos fueron los que presentaron mayores índices de potencia, en segundo lugar, estuvieron las bacterias y las levaduras mostraron potencia como las cepas de referencia.

En 2004, el departamento de Biotecnología de la Universidad de Antioquia realizó un aislamiento de 13 cepas amilolíticas de tres fuentes, de almidón de maíz, almidón de papa y almidón de yuca. La preparación de los medios constó de utilizar 100 g de una de las 3 muestras y se mezcló en 900 ml de solución salina hasta homogeneizar realizando diluciones seriadas en tubos que contenían 9 ml de agua peptonada.

Con base en el crecimiento sobre los medios modificados con almidón, la positividad frente al test de Lugol, y los aspectos morfológicos de los microorganismos, se hizo el aislamiento de las cepas. Se sembraron por agotamiento en el medio sólido en el que anteriormente se había dejado y se incubaron por 24 horas a 30°C. Las cepas positivas fueron sembradas en 5 ml de respectivo medio líquido e incubadas a 30°C por 24 hr. Y posteriormente se crioconservaron en glicerol al 30% a -20°C.

Material y método

Se tomará una muestra de aprox. 50 gr de suelo agrícola en donde se siembre papa. Con una balanza granataria se pesará 10 gr del suelo y se colocará en un matraz Erlenmeyer con 90 ml de agua estéril. Esto se agitará 40 veces o hasta que tenga una apariencia homogénea.

Se preparará una serie de diluciones desde 10-1 hasta 10-5, para esto, se dispondrá de 10 cajas de Petri estériles y 4 tubos de ensayo (etiquetados de 10 -2 a

10-5 respectivamente). Del matraz (marcado como 10-1), con una pipeta de 5 ml se tomará 3 ml de la solución, de los cuales 2 ml se utilizarán para dos cajas de Petri (1 ml c/u) y el mililitro restante se añadirá a un tubo de ensayo con 9 ml de agua estéril tapado con tapón de algodón (etiquetado: 10-2), este se agitará 40 veces y de él se tomará 3 ml con una pipeta, repitiendo los pasos anteriores para todos los tubos y cajas de Petri.

Las cajas de Petri serán destinadas para los medios de cultivo. Una de las dos cajas de cada tubo o del matraz, se utilizará para un medio de cultivo a base almidón-agar para bacterias, y la segunda caja, para el mismo tipo de medio de cultivo pero este se acidificará con ácido tartárico para el aislamiento de hongos.

Para la elaboración de los medios de cultivo agar-almidón, se preparará manualmente con extracto de carne (3 gr.) o triptona (10 gr.), almidón soluble (10 g.), NaCl (5 gr.) y agar (12 gr.) en 1 000 ml de agua destilada. Se disolverán los componentes en un matraz con los 1 000 ml de agua añadiendo al final el agar, agitando ligera y constantemente. Al hervir durante 1 minuto, el medio se autoclavará a 121°C durante 15 minutos y al retirar de la autoclave se dispondrá de las cajas Petri con la muestra del suelo disuelto en ellas para su rápida preparación evitando por mucho tiempo el contacto con el ambiente. Los medios de cultivo ya preparados se incubaran a 37°C durante 5 días.

Para la determinación de si una colonia es amilolítica, se colocará una gota de lugol directamente para observar el vire de color. Si la zona de la colonia es incolora resulta positivo ante acción amilolítica y si la zona vira a azul-púrpura, es negativo a dicha acción.

Se aislará una cepa pura de una colonia de cada medio de cultivo en un tubo de agar-almidón inclinado para observar directamente la morfología colonial y microscópica individual de cada colonia.

Para la morfología microscópica se tomará una pequeña muestra con un asa bacteriológica y en un portaobjetos con una gota de agua se mezclará la muestra y se hará un frotis en este. Se secará al aire e inmediatamente se fijará a la flama hasta una temperatura soportable en el dorso de la mano. Se aplicará la tinción de Gram para la observación. Para esto, al fijar a la flama, se le colocará una gota de cristal-violeta a la muestra y se dejará reposar durante 1 minuto. Se lavará indirectamente y se le aplicará 1 gota de Lugol, dejando reposar un minuto y se enjuagará. A continuación, se le aplicará 1 gota de alcohol-cetona para desecar la muestra durante 1 minuto y se enjuagará. Por último, se le aplicará 1 gota de Safranina a la muestra dejando actuar durante 1 minuto, se enjuagará y se observará al microscopio con el objetivo 100X utilizando aceite de inmersión.

Se evidenciará lo observado y se describirá la morfología microscópica de cada colonia destacable en los medios de cultivo.

Se determinará e identificará, mediante bibliografía y comparación, las especies aisladas en los medios, las que sean amilolíticas.

Bibliografía

Quintero, R., (1998). Aplicaciones de la Biotecnología en la industria alimentaria. Medellín, Universidad de Antoquia. 210 pp.

Sánchez, C., y C., Figueroa. (2004). Producción de maltodextrinas a partir de almidón de yuca, utilizando la enzima alfa amilasa. Ingeniería Química. Pp 416.

Sánchez, C., Mejía, C., Figueroa, M., Esquivia, M., Agudelo, L., Zapata, N. y M., Gómez. (2004). Estudio de cepas nativas amilolíticas [en línea]. Recuperado el 20 de marzo de 2015 de http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03

Zoraya-Rodríguez, R., Boucourt, J., Rodríguez, N., Albelo, O., Nuñez, F., y R., Herrera (2006). Aislamiento y selección de microorganismos con capacidad de degradar el almidón. Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 40, núm. 3, pp. 349-354. Instituto de Ciencia Animal. Cuba.