RECONOCIMIENTO DE PROTEINASAutores: NatalyYisel Meza Ortega Manuela Coral Ruiz Anny Bravo.

RESUMENAl presentar el laboratorio seguimos el procedimiento paso a paso para llegar a los resultados obtenidos en el siguiente informe. La persona que dono la saliva hace un procedimiento de limpieza bucal para despus tener en su boca 20 ml aproximadamente de agua destilada, por un tiempo de 2 minutos hasta que exista una cantidad considerable de amilasa salival para realizar la prueba, despus este es depositado en un beaker. Tomamos 3 tubos de ensayo los cuales marcamos con los siguientes nmeros: 0-40-100 y procedimos a agregar a cada uno 1 ml de almidn. A dos de ellos los sometimos a bao mara y despus colocamos en ellos 0.5 ml de amilasa salival despus se agita cada uno de ellos. Tomamos la placa colorimtrica y a esta le aadimos 3 gotas de lugol en tres cavidades diferentes y colocamos en cada uno de las cavidades 5 gotas de la sustancia de cada uno de los tubos utilizados anteriormente.A continuacin rotulamos tres tubos mas con los nmeros 3-7-10, al tubo tres le agregamos 1 ml de almidn y 2 ml de amortiguador de pH 3, al tubo 7se le agrego 1 ml de almidn y 2 ml de amortiguados pH 7 y al tubo 10 1 ml de almidn y 2 ml de amortiguador de pH 10. Despus estos tubos los dejamos en bao mara durante un tiempo de 5 minutos, despus agregamos a cada uno de los tubos 0.5 ml de amilasa salival posteriormente tomamos el tubo 3 y agregamos 5 gotas de esta solucin en la placa de porcelana que contiene dos gotas de lugol y as sucesivamente repetimos este mismo procedimiento con los tubos restantes.Procedimos con la rotulacin de tres tubos de ensayo los cuales marcamos con los nombres de amilasa, pepsina y ureasa. A cada uno de ellos agregamos 1 ml de almidn y 2 ml de amortiguador de pH. Depositamos los tubos en el agua a la temperatura requerida y despus de 5 minutos al tubo que se marco como amilasa agregamos 0.5 ml de amilasa salival, al tubo marcado como pepsina, 0.54 ml de pepsina y al tubo marcado como ureasa 0.5 ml de ureasa y despus procedimos a ensayar con lugol, como lo hicimos con las sustancias de los anteriores tubos.Finalmente rotulamos 3 tubos de ensayo como amilasa, mercurio y plomo, y a cada uno agregamos 1 ml de almidn, 2 ml de amortiguador de pH al tubo rotulado como mercurio le agregamos 1 ml de HgCl (cloruro de mercurio) y al tubo rotulado como pb agregamos 1 ml de nitrato de plomo, depositamos los tubos en el agua a temperatura optima. Esperamos 5 minutos y agregamos a cada tubo 0.5 ml de y se evalan los resultados como se hizo anteriormente.

Palabras clave: enzimas, amilasa, actividad enzimtica, factores enzimticos.

INTRODUCCIONSALIVALasaliva(tambin conocida comobaba) es un fluido orgnico complejo producido por lasglndulas salivalesen lacavidad bucal, y directamente involucrada en la primera fase de ladigestin.La saliva puede ser vehculo de contagio de enfermedades en humanos, como elherpes labialo lamononucleosis.

PRODUCCIONSe estima que labocaest humedecida por la produccin de entre 1 y 1.5 litros de saliva al da, durante la vida de una persona se generan unos 34.000 litros. Esta cantidad de saliva es variable ya que va disminuyendo conforme avanzan los aos y debido a diferentes tratamientos.1La produccin de saliva est relacionada con elciclo circadiano, de tal manera que por la noche se segrega una mnima cantidad de saliva.La saliva es segregada por lasglndulas salivaresmayorespartidaysubmaxilar(80%- 90%)) en condiciones estimuladas, mientras que lasglndulas sublingualesproducen solo el 5% del total. Las glndulas menores son responsables basicamente de la secrecin en reposo y contribuyen al 5% al 10% del total de saliva secretada.2La disminucin patolgica de saliva recibe el nombre de hiposalivacin o hiposialia, mientras que la sensacin de sequedad bucal se denominaxerostoma, y la produccin excesiva,sialorrea.La medicin de la produccin de la saliva se llamasialometra.

CARACTERISTICAS Y FUNCIONLa saliva es un lquido transparente y deviscosidadvariable, lo cual se atribuye alcido silico. Es inodora como el agua.La composicin ypHde la saliva varan en funcin de los estmulos (como el olor o la visin de la comida). El pH salival normal oscila entre 6,5 y 7.3La composicin de la saliva es similar a la delplasmay se caracteriza por los siguientes componentes: Agua:Representa un 99,5%.45Permite que los alimentos se disuelvan y se pueda percibir su sabor a travs delsentido del gusto. Iones cloruro:Activan laamilasasalival optialina. Bicarbonato y fosfato:Neutralizan elpHde los alimentos cidos y de la corrosin bacteriana. Moco:: El contenido demucina, glicoproteina fundamental de la saliva, produce la viscosidad necesaria para funciones lubricantes y de formacin del bolo alimenticio que facilita ladeglucina lo largo deltubo digestivo, sin daarlo.6 Lisozima:Es una sustancia antimicrobiana que destruye las bacterias contenidas en los alimentos, protegiendo en parte losdientesde lacariesy de las infecciones. Enzimas:Como la ptialina, que es unaamilasaque hidroliza elalmidnparcialmente en la boca, comenzando la digestin de loshidratos de carbono. La lipasa lingual inicia tambin la digestin de grasas.6 Estaterina:Con un extremo amino terminal muy cido, que inhibe la precipitacin de fosfato clcico al unirse a los cristales de hidroxiapatita. Adems, tambin tiene funcin antibacteriana y antifngica. Otras sustancias:La saliva contiene tambininmunoglobulinasespecficas,transferrinaylactoferrina. En el 2006 investigadores franceses del Instituto pasteur identificaron una sustancia en la saliva humana que llamaronOpiorfina, similar a la encontrada enb ratas y vacas, que es hasta seis veces ms potente que la morfina para calmar el dolor.72 Calcio:: La saliva est saturada de Ca++, con lo que se evita que los dientes lo pierdan y ayuda a digerir el alimento.

LA AMILASAdenominada tambinsacarasaoptialina, es unenzimahidrolasaque tiene la funcin de catalizar la reaccin de hidrlisis de los enlaces 1-4 del componente -Amilosa al digerir elglucgenoy elalmidnpara formarazcaressimples, se produce principalmente en lasglndulas salivares(sobre todo en lasglndulas partidas) y en elpncreas. Tiene actividad enzimtica a unpHde 7. Cuando una de estas glndulas se inflama, como en lapancreatitis, aumenta la produccin de amilasa y aparece elevado su nivel ensangre(amilasemia). Fue la primera enzima en ser identificada y aislada porAnselme Payenen1833, quien la bautiz en un principio con el nombre de "diastasa".El trabajo de una enzima puede verse afectado por diversos factores, desde el pH, la temperatura, iones metlicos, y la concentracin del sustrato. En el laboratorio se estudiaron todos estos diversos factores comprobando que una enzima se comporta de una manera extraordinaria frente a los procesos de hidrlisis del almidn.La a-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a- C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacaridos) como productos.

MATERIALES Y METODOSMateriales y reactivos: 2 Beaker de 100 mL Gradilla con 12 tubos de ensayo Cinta de enmascarar Hielo Termmetro Pipeta de 2 mL Agitador de vidrio Placa colorimtrica Gotero Mechero y placa 150 mL de suspensin de almidn 50 mL de reactivo de lugol 50 mL de solucin amortiguadora de pH 3 100 mL de solucin amortiguadora pH 7 50 mL de solucin amortiguadora pH 10 10 mL de pepsina al 0,1% 10 mL de ureasa al 0,1% 10 mL de cloruro de Mercurio al 1% 10 mL de nitrato de plomo al 1%Mtodos: Preparacin de amilasa salival Influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival Influencia del pH en la actividad enzimtica Especificad de la enzima Efecto de los iones metlicos pesados sobre la accin de la amilasa

RESULTADOS1INFLUENCIADE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

RotuloTipo de bao (10 min)Color resultanteT

Ideal

0Bao de HieloAzul oscuro

40Bao mara T entre (35 y 40 C) Amarillo ocreX

100Bao mara a ebullicin Azul oscuro

2INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA AMILASA SALIVAL

RotuloAmortiguador de pHColor resultantepH

optimo

33Azul oscuro

77Amarillo ocre X

1010Caf oscuro

3 ESPECIFICIDAD DE LA ENZIMA

rotuloColor resultanteRx (positiva)

amilasaAmarillo ocreX

Pepsinanegro

ureasanegro

4EFECTO DE LOS IONES METALICOS PESADOS SOBRE LA ACCIN AMILASA

rotuloReactivo adicionalColor resultanteRx

Amilasa_________amarilloX

Hg1 mL de HgClAzul oscuro

Pb1 mL de nitrato de plomo (Pb(NO3)2)negro

EVICENCIA DE LOS RESULTADOS Influencia de pH en la actividad enzimtica

3 Efecto de los iones metlicos pesados sobre la accin de la amilasa.

PbHg

Amilasa

Especificidad de la enzima

PepsinaUreasaAmilasa

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

La -amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces - C1-C4,

10 7mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando extrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos. Para medir la actividad enzimtica de la -amilasa, se utilizar un test colorimtrico que detecta el almidn. Para ello se contar con una solucin de lugol, ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene unaexplicacin fsica: el lugol se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa (en las regiones hidrofbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la -amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de lugol ya no dar una coloracin azul, sino un color amarillo ocre. 1.En este laboratorio mediremos la desaparicin de sustrato (evidenciada por el test colorimtrico) para determinar la actividad de la enzima. Adems, analizaremos cmo afectan las distintas condiciones en que acta la enzima. En la primera parte del laboratorio se estudi la influencia de la temperatura sobre la actividad de la amilasa salival en el cual se rotulo 3 tubos de ensayo como 0, 40 y 100 que corresponden a la temperatura a la que se someti 1 mL de almidn al 0.5%, que despus de 10 minutos se adiciono 0.5 mL de amilasa salival, como se puede observar el factor que afecta la actividad es la temperatura, la velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica aproximadamente por cada 10C que aumenta la temperatura. Como la funcin enzimtica depende de la estructura terciaria (o cuaternaria) la actividad de la enzima puede llegar a desaparecer si se producen cambios notables de temperatura. La mayora de las enzimas se inactivan a T comprendidas entre 50 y 60C2. Por lo tanto en nuestro caso la temperatura ptima es de 40 C.Enseguida se estudio la influencia del pH en la actividad enzimtica con almidn aadiendo 2 mL de amortiguador de pH 3, 7,10. La mayora de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar drsticamente su actividad.El pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin3.El pH Tambin afecta la forma y por lo tanto la tasa de reaccin, cada enzima tiene un pH ptimo. ste est entre pH 6 - 8 para la mayora de las enzimas4, como en este caso que es de 7 donde se desarrolla la intensidad mxima de la actividad de la enzima y en el prueba se obtuvo un color amarillo ocre que confirma que es optimo.En la prueba de especificidad enzimtica se rotulo tres tubos como amilasa, pepsina y ureasa y a cada uno se le agrego 1 mL de almidn, despus de someter a un bao de temperatura optima (40C)y esperar 5 minutos se agreg 0,5 mL de la enzima correspondiente a cada tubo al que se les realizo la prueba colorimtrica donde la amilasa sali positivo con color amarillo y la pepsina y la ureasa negativo con color negro.Las enzimas son muy especficas, discriminando fcilmente entre sustratos con estructuras muy similares como en el caso de la pepsina y la ureasa donde la coloracin indica que no hay actividad enzimtica porque la pepsina es una enzima que interviene en la digestin de protenas, por lo tanto no acta cuando el sustrato es almidn el cual es un polisacrido de reserva tpico de las plantas; en cuanto a la ureasa es una enzima que degrada la urea en amoniaco y no dara el caso con el almidn. Y se comprueba que la -amilasa ( (1-4)-glucan-4-glucanohidrolasa) acta sobre la -amilosa en donde hidroliza al azar los enlaces (1-4) formando una mescla de de glucosa y maltosa libresdndonos una coloracin amarilla en la placa colorimtrica.Y en el efecto de los metales pesados sobre la amilasa salival Los iones metlicos inhiben la actividad enzimtica esto se debe a que cambian la naturaleza del centro activo impidiendo la formacin del complejo enzima sustrato. Adems los metales, pueden participar como catalizadoras para reacciones no deseadas como por ejemplo facilitar reacciones de oxido reduccin del ion metlico.

CONCLUSIONES

La mejor actividad enzimtica que se obtuvo es a una temperatura de 40C, debido a que se encuentra establecida en la literatura como optima. Por esta razn se concluye que la enzima estuvo en su mxima actividad y funcionamiento. Con el desarrollo experimental de la presente practica nos pudimos percatar de que la variacin de una enzima en su metabolismo depende directamente de los factores de factores fisicoqumicos. Se puede mencionar que hay sustancias encargadas de inhibir las reacciones de sustrato con enzima, como los metales pesados, un ejemplo de ello son la plata y el mercurio. Con esta investigacin se puede concluir que la accin de la amilasa salival es bastante buena y, sobre todo, rpida en ayuda de una temperatura similar a la temperatura corporal, ya que sin ella la actividad enzimtica se desfavorece y la protena se puede desnaturalizar o perder su actividad.

RECOMENDACIONES No pipetear los reactivos con la boca ya que estos pueden ser txicos y causar dao en el organismo. Mantener los reactivos en la cmara de aire ya que estos expulsan unos gases que pueden ser perjudiciales para la salud. Lavar muy bien la boca antes y no haber comido ningn alimento si se es voluntario para donar la saliva. Hacer buches con agua de grifo para eliminar cualquier residuo de comida que pueda quedar localizado en la boca y de esta manera obtener mejores resultados. Lavar muy bien la placa colorimtrica antes de usarla para que los resultados sean exactos y no aparezcan falsos positiva.

CIBERGRAFIA

1. Actividad enzimtica de la amilasa, tomado el 26 de octubre a las 3:31 pm de, http://www.monografias.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf2. FACTORES QUE REGULAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA tomado el 26 de octubre a las 4:10 pm de,http://www.slideshare.net/cipresdecartagena/factores-que-regulan-la-actividad-enzimtica-58528003. libro botanica online, enzimas, tomado el 26 de octubre a las 4:12 pm de, http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/index.html4. Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de BiotecnologaEfecto del pH en la actividad enzimtica tomado el 26 de octubre a las 4:23 pm de,http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/files/users/uami/sho/Tema_5b_pH.pdf