Alumno: Tomás Martínez Hernández 4

Matrícula: 953 3 3492

Licenciatura : Biología Experimental

División: CBS, Unidad, ZTAPALAPA

Título del Proyecto de Investigación

RESPUESTA CÉLULAR A POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES DE LA PROTEíNA DE CHOQUE TÉRMICO DE 60 KDA 5TREPTOCOCCU5 PYOCENH(HSP6OSP) EN PACIENTES CON SORlASlS.

Título del trabajo de Servicio Social

RESPUESTA CELULAR HACIA PROTEíNAS DE CHOQUE TÉRMICO RECOMBINANTES EN PACIENTES PSORASICOS

Fecha de elaboración del trabajo

1 /j u I i 0/2 002 - 1 /ene ro/2 O 0 3

A. Definición de la psoriasis

La psoriasis se define como una dermatosis inflamatoria crónica, asintomatica,

caracterizada por placas eritematoescamosas, bien definidas que se localizan

principalmente en codos, rodillas, región sacra y piel cabelluda, pero puede afectar toda la

superficie cutánea, y las uñas. Hay hiperplasia epidérmica y queratopoyesis acelerada. Se

desconoce la causa, pero parecen influir factores inmunitario, genéticos, psicosomaticos,

ambientales y bacteriológicos (Arenas, 2000).

B. Datos epiderniológicos

La psoriasis afecta al 1-2% de la población mundial. Anualmente, 1.5 millones de

pacientes psoriásicos en los Estados Unidos son vistos por médicos. De acuerdo a la

National Psoriasis Foundation (NPF), existen 150,000 - 260,000 casos nuevos reportados

cada año con edad promedio de 28 años. Entre el 5-10% de los pacientes podrían

desarrollar psoriasis artrítica, con inflamación e hinchazón en la manos, pies y

articulaciones (DiSepio et al, 1999).

Cla5ificación de la psoriasis.

Según la edad de presentación, la evolución clínica y los antecedentes genéticos, la psoriasis se clasifica en dos tipos ( formas juvenil y del adulto). La psoriasis tipo I (juvenil)

aparecen en la gente aproximadamente a los 20 años. Presenta antecedentes familiares,

y su asociación con el HLA es de 85% con Cw6 y en menos proporción con los antígenos

613 y B17. Este tipo de psoriasis es mas generalizada, resistente a tratamiento, y mas

grave. La psoriasis tipo I1 (del adulto) es de aparición tardía, alrededor de los 60 años,

rara vez hay antecedentes familiares, no hay relación con HLA, la evolución clínica es

benigna (Arenas,2000).

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CUADRO CLíNICO

La dermatosis es bilateral, con tendencia a la simetría; predomina en piel cabelluda,

salientes Óseas como codos y rodillas, región sacra, caras de extensión de extremidades;

en ocasiones afecta ombligo, palmas, plantas, genitales y pliegues de flexión (psoriasis

invertida). Las lesiones a veces son Únicas, pero también pueden ser generalizadas

(Arenas,2000).

La dermatosis esta constituida por eritema y escamas que se agrupan en placas de

bordes netos, de forma y tamaño muy variables; la descamación es blanca, nacarada, de

aspecto yesoso, o micácea; puede cubrir toda la placa o parte de la misma. Las lesiones

pequeñas predominan durante la niñez. En un alto porcentaje de los enfermos puede

afectar las uñas; se observan erosiones puntiformes (signo del dedal), hiperqueratosis

subungueal, onicólisis y leuconiquia (Arenas,2000).

Existen cinco formas reconocidas de psoriasis: placa (también llamada psoriasis

vulgaris), guttata, inversa, eritrodérmica y pustular. Un paciente puede exhibir una o mas

formas al mismo tiempo y la enfermedad puede cambiar de una a otra forma

predominantemente (Arenas,2000; DiSepio et al, 1999). Mientras que la apariencia puede

variar, cada forma está caracterizada por hiperproliferación epidermal de queratinocitos,

diferenciación anormal de queratinocitos e infiltración de células inmunes. La forma mas

común y mas estudiada de psoriasis es la psoriasis en placa (PP) (también llamada

psoriasis vulgaris), alrededor del 80% de las personas con psoriasis tienen este tipo. La PP

aparece en cualquier parte de la piel, principalmente en rodillas, codos, cuero cabelludo,

tronco y uñas . Este tipo de psoriasis tiende a ser crónica, aunque la remisión espontánea

puede ocurrir. Las lesiones psoriasicas de la piel también están presentes en forma de

gotas individuales, rojas y pequeñas en la piel y es las que se le denomina psoriasis

guttata (PG). La PG comienza como una pequeña lesión (1 mm) en el tronco,

frecuentemente asociada con una historia precedente de una infección del tracto superior

por estreptococo. En la PG las lesiones se limpian aproximadamente en 12 semanas,

aunque el 70% de los pacientes dentro de un año desarrollan la forma en placa (PP) que

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es . forma crónica de la enfermedad, lo cual sugiere que los dos tipo clínicos están

ligados por factores comunes. La erupción de la psoriasis guttata es algunas veces

observada en pacientes que ya habían presentado placas crónicas Los otros tipos de

psoriasis se presentan en menor frecuencia que la PP y la PG (Valdimarsson et al, 1995; NPF, 2001; Baker y Fry, 1992).

INMUNOLOGíA DE LA PSORIASIS

Existe una amplia evidencia que la psoriasis es causada por un defecto en el sistema

inmune y se ha demostrado que la activación de los iinfocitos es un paso importante en el

proceso de la enfermedad (Asadullah et al, 2002). Hay presencia de linfocitos T CD4' y

linfocitos T CD8' en las lesiones psoriásicas. Los linfocitos T CD4' aislados de lesiones son

preferencialmente linfocitos TH1 los cuales liberan sus citocinas y factores de crecimiento

que causan la hiperproliferación de queratinocitos (Brown et al, 2000; Prinz 1999). Además, existe evidencia que sugiere el papel de los superantígenos bacterianos en la

patogenesis de la enfermedad. De suma importancia es el hecho de que la intención de

las terapias es suprimir el sistema inmune o agentes anti-inflamatorios cuyo blanco son los

linfocitoc T o sus derivados los cuales han sido efectivos en el tratamiento temporal de la

enfermedad (DiSepio et al, 1999; Ortonne 1999). La ciclosporina es un medicamento que

se ha utilizado en tratamiento de la psoriasis. La ciclosporina actúa inhibiendo la acción de

los factores de trascripción NF-AT (factor nuclear de linfocitos T activados), AP-3 y NF-KB

en el promotor del gen que codifica IL-2. Estos son factores de trascripción claves

necesarios para los eventos tempranos en la activación de linfocitos T mediados por

antigenos y la producción de IL-2 (DiSepio et al, 1999; Asadullah et al, 2002). El FK506

(Tacrolimus, Prograf), es otro inmusupresivo con mecanismo de acción similar a la

ciclosporina. Este bloquea la producción de IL-2 y la activación de linfocitos T inhibiendo la

acción del factor de transcripción NF-AT (DiSepio et al, 1999; Asaduliah et al, 2002).

En un estudio se evaluó la habilidad de linfocitos T de la lesión y de sangre periférica de

producir IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 e IL-10 intracelularmente y fueron detectadas por

citometría de flujo. La síntesis de citocinas fue inducida por activación con PMA/ionomicina

(en presencia de Brefeldina A, la cual inhibe la exocitosis de éstas citocinas). Después de

i

la estimulación, se encontraron altos porcentajes de linfocitos T CD8 y CD4 epidérmicos

capaces de producir IFN-y, TNF-a e IL-2; mientras que pocos linfocitos T < 11%

expresaron IL-4 e IL-10. Tanto linfocitos T CD8' como T CD4' fueron capaces de

desempeñar funciones efectoras tipo 1 (TJ y THl, respectivamente). Este estudio revela

una diferenciación tipo 1 tanto en areas lesionadas como en sangre periférica, lo cual

podría indicar un desequilibrio dentro de la población de linfocitos T, lo cual contribuye a

sostener la activación inrnunológica de linfocitos T encontrada en esta enfermedad (Austin

etal, 1999).

Para determinar el perfil de citocinas que exhiben los linfocitos T en un placa psoriasica,

se obtuvieron clonas de linfocitos T de biopsias epidérmicas, del los cuales el 74% eran

CD4+, mientras que un 25% era CD8' y 1% fueron CD4-/CD8-. El IFN-)I fue la citocina

mayormente liberada. Para corroborar estos datos con la situación in vivo, se investigaron

biopsias de piel lesionada de cinco pacientes para detectar la expresión por RT-PCR del

mRNA de la IL-4, IL-IO e IFN-y. Solamente el mRNA de las citocina tipo T H l (IFN-y), y no

la de los linfocitos TH2 (IL-4 e IL-10) se detectaron (Schlaak et al, 1994). También se han

encontrado en las placas psoriasicas la expresión de IL-2, IL-12 (Yawalkar et al, 1998) e

. IFN-5, (Szabo et al, 1998) asociado con niveles incrementadoc de TNF-a (Asadullah et ai,

2002). Se ha postulado que el switch del perfil de citocinas predominante de THl a TH2 en

la psoriasis puede ser benéfico. La terapia con IL-10, una citocina TH2, resulta en una

restauración relativa del balance de citocinas y un mejoramiento clínico en la psoriasis

(Kirby y Griffiths, 2001; Yawalkar et al, 1998). La IL-10 promueve el desarrollo de un

patrón de citocinas tipo 2, por que inhibe en linfocitos T y NK la producción de IFN-y,

mediante la supresión de la síntesis de IL-2 en células accesorias (Asadullah et al, 1998;

Fickenscher et af, 2002). La participación de otras citocinas proinflamatorias como IL-1, IL- 6, IL-8 y TNF-a han sido demostrados en la psoriasis.

Resultados recientes han demostrado el papel que tiene la IL-20 en la función

epidérmica y en la psoriasis. La IL-20 es una reciente citocina identificada por análisis

bioinformatico. La primera evidencia del papel de la IL-20 en la psoriasis es la

hiperqueratosis y la proliferación de la capa- suprabasal que presentan los ratones

transgénicos para gen de la IL-20. Estas anormalidades de los ratones transgénicos son

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I.

semejantes a las anormalidades psoriásicas humanas. Los cambids detectados en la

expresión de proteínas epidérmica en ratones transgénicos IL-20, que son similares a la

psoriasis humana incluyen: la presencia de K5 y K14 tanto en la capa basal como en la

su'prabasal e hiperproliferación asociada a K6. Sin embargo en la piel afectada de estos

ratones no se encontró infiltrado de linfocitos los cual es caracterktico de la psoriasis

humana (Blumberg et al, 2001; Fickenscher et al, 2002; Gniadecki, 1998).

Nickoloff propone a las citocinas y a varios pares de moléculas ligando-receptor que

promueven el contacto célula-célula y la transducción de señales, como blancos

potenciales para el tratamiento de la psoriasis. Entre estos se incluyen el LFA-1 (antígeno

funcional linfocítico 1, también conocido como CDlla-CD18) e ICAM-1 (molécula de

adhesión intracelular también conocido como CD54) (Nickoloff 1998). Entonces diversos

tipos celulares, incluyendo los linfocitos T, células presentadoras de antígeno (CPAs) y

queratinocitos se cree que están involucradas en la inmunopatogénesis de la psoriasis

(James Krueger, Rockefeller University, New York, NY, USA).

Existen diversas moléculas asociadas a la activación de linfocitos, la molécula empleada

en este trabajo fue CD69. El CD69 humano es un homodímero de superficie formado por

la asociación de dos cadenas de 28 y 32 kDa, las cuales están sostenidas por puente

disulfuro. CD69 es una proteína integral de membrana tipo I1 con un solo dominio

transmembranal. El gen murino muestra un 58% de identidad con su contraparte humana,

con la homologfa extensible en toda la longitud de la secuencia codificante (Testi et al,

1994; PROW 1999). CD69 es uno de los antígenos específicos tempranos adquiridos

durante la activación de linfoide, actúa como un receptor transductor de señales

involucrado en los eventos de activación celular, que incluyen proliferación e inducción de

genes especificos. CD69 pertenece a una familia de receptores que modulan la respuesta

inmune y de genes que están agrupados en el complejo de genes de células natural killer

(NKC). La porción extracelular de estos receptores representan una subfamilia de dominios

tipo lectina tipo-C (CTLDs), los cuales son divergentes de las lectinas tipo-C verdaderas y

son referidos como dominios de células NK (NKDs) (Llera et al, 2001; Weis et al, 1998). La

estructura tridimensional del CD69 revela similitud con los receptores NK CD94 y Ly49A.,

cuyas estructuras han sido recientemente determinadas (Boyington et al, 1999). Al

parecer al CD69 le faltan ocho de nueve sitios conservados

en MBP (proteína de unión a manosa; una lectina tipo-C

2000)

de unión a Ca” encontrados

verdadera) (Natarajan et al,

CD69 se encuentra en la superficie de la mayoría de los linajes hematopoyéticos. Es uno

de los marcadores de activación temprana en linfocitos T y 6, células NK, macrófagos,

neutrófilos y eosinófilos. Además, se expresa constitutivamente en monocitos, plaquetas,

células de Langerhans y un pequeño porcentaje de linfocitos residentes en timo y tejidos

linfoides secundarios. Se ha sugerido que el CD69 esta involucrado en el proceso de

selección y maduración durante la migración de timocitos a la medula (Nakayama et al,

2002). CD69 también esta presente en precursores de linfocitos B en la médula Ósea, y

estudios recientes con ratones deficientes de CD69 revelaron su papel modulador en el

desarrollo de iinfocitos 6 y síntesis de anticuerpos (Llera et al, 2001).

Diversas moléculas asociadas a la activación de linfocitos se han observado por

inmunohistoquímica en piel lesionada con psoriasis vulgaris. En un estudio hecho por

citometría de flujo se encontró que los linfocitos T de la epidermis de pacientes con

psoriasis expresan las moléculas HLA-DR (86%), CD69 (59%), CD25 (55%), CD122 (44%)

y CD28 (91%) . Los linfocitos T de la dermis mostraron porcentajes similares excepto por

el CD69 que se encontró en un 17%. La molécula CD69 se encontró directamente en

biopsias de piel lesionada por inmunohistoquímica. La poblaciones de CD4 como de CD8

de la piel lesionada eran CD25’; con activación de CD8 en la epidermis y activación de

CD4 en la dermis. Los resultados muestran que la mayoría de los linfocitos que se

encuentran en la lesión están activados. Así, la mayoría de linfocitos en la lesión

expresaron los tres marcadores de activación, mientras que los linfocitos T de sangre

psoriásica se distinguió por un incremento en CD25, específicamente dentro de la

población linfocitos T CD8 (Ferenczi et al, 2000).

Brian Nickoloff ha creado un modelo animal quimérico para estudiar la inmunogenética

de la psoriasis. Este modelo consiste en realizar injertos piel humana en la piel de ratones

con inmunodeficiencia severa combinada (SCID). Los estudios hechos en estos ratones ha

revelado que cuando se inyectan líneas de linfocitos T CD4+ altamente purificados de

i

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los injertos tratados con linfocitos, reveló qlie

también tienen antígenos de supeficie

receptores inhibidores killer (KIRs) y receptores

presentes. Estos linfocitos T CD8+-NK

moléculas MHC clase I, los cuales están

Gilhar et al, 1997 empleando este modelo observa que los linfocitos T de

piel lesionada son importantes en el placa psoriasica; atribuye este

fenómeno a la presencia de contrasta con los resultados

obtenidos por el equipo de que superantigenos derivados

de bacterias son que facilitan la conversión de

piel normal en Gilhar et al, 1997

sugiere que pero no permite

de la psoriasis.

tanto exógenos

del MCH y

los linfocitos T-NK [linfocitos T CD8' que

ceular característicos de las NK, tales como

activadores killer (KARs)] también están

pLeden interactuar directamente con varias

expresadas en las células epidermales. Entonces,

interactúen mediante sus KIRs o sus KAKs coil

predisponen a la psoriasis (como HLA-Cw6).

inmunidad innata, simultáneamente podría

(por ejemplo, la posesión del alelo HLA-Cw6)

ningún antigen0 extraño o nativo importarte

activación (Nickoloff 1998; Nickoloff y Wrone-Smith,

varios antígenos del MHC clase I, los cuales

Esta teoría, la cual enfatiza el papel de la

licar la susceptibilidad genética de la psoriasis

con la inmunología de la psoriasis en la cual

es requerido para el paso final de la

1999).

autoantígenos) tienen un papel relevante en la respuesL4 de linfocitos T (Nickoloff y

Wrone-Smith 1998).

Por otro lado se han identificado diversos receptores para los alelos de la clase I del

MHC, los cuales pueden activar o inhibir células NK o T-NK. Uno de ellos es el CD94 el cual

puede reconocer señales de péptidos clase I presentados en el contexto del HLA-E.

Recientemente, Nickoloff reporta la presencia de linfocitos T que expresan CD94, CD158a

y CD158b en las placas psoriásicas. Esto indica que estas células podrían participar como

linfocitos patogénicos o reguladores en la psoriasis (Nickoloff, 1999 a y b).

Existen otras moléculas homologas a las moléculas de clase I del MHC, que no

codificadas en el cromosoma 6, que recientemente se ha asociado con la psoriasis. Una de

estas, es el antígeno CDld (codificada en el cromosoma 1), la cual se expresa

normalmente en los queratinocitos de la piel sana pero se ha encontrado sobreexpresado

en los queratinocitos de las placas psoriasicas. Se ha visto que el IFN-y induce la

expresión de CDld en queratinocitos (Bonish et al, 2000). Nickoloff en 1999 postula, que

los linfocitos T-NK CD161' que se ha visto que están también presentes en las lesiones

psoriásicas podrían reconocer glicolípidos derivados de la epidermis, (incluyendo

ceramidas que contienen estos glicolípidos) presentados en la molécula CDld. En otro

estudio realizado por el grupo investigadores encabezado por Nicokoloff, se trabajaron con

clonas de linfocitos T CD94+/CD161+ obtenidas de pacientes psoriásicos, las cuales se

establecieron con superantigenos e IL-2. Cuando incubaron estos linfocitos T con

queratinocitos CDld', encontraron altos niveles de IFN-y e IL-13. Esta producclón de

citocinas se pudo inhibir con un anticuerpo dirigido a la molécula CDld. A demás cuando

estas clonas se inyectaron en un injerto de piel sana de ratones SCIC" se formo una placa

psoriasica, con queratinocitos epidérmicos que expresaron CDld los cuales estaban

infiltrado por linfocitos T CD161+. Estos hallazgos in vivo demostraron que esta clonas

celulares de T, podrían ser patogénica por la creación de una placa psoriasica. Los resultados in vitro soportan un papel patofisiológico de la interacción entre linfocitos T que

expresan NKRs y queratinocitos CDld+, con la subsiguiente producción de 1FN-y. Después

de la inyección in vivo, el perfil de citocinas producidas, estaba caracterizado por la

respuesta inmunológica polarizada hacia T H ~ mas que T H ~ . (Nickoloff et al, 2000).

Antígenos asociados en la patogénesis de la psoriasis.

I

La naturaleza del antígeno responsable de la producción de los eventos inmunológicos

eh la psoriasis ha dado pie a diversas líneas de investigación. Una de ellas involucra

examinar la distribución de varios receptores de linfocitos T en la sangre y piel de

pacientes psoriásicos. Otras líneas han tratado de identificar el antígeno específico (tanto

exógeno como endógeno) en pacientes con psoriasis que podrían activar el sistema

inmune con la creación de linfocitos T patogénicos. Ambos factores activadores de

linfocitos T infecciosos y no infecciosos han sugerido como candidatos de factores

desencadenantes a: retrovirus (virus de inmunodeficiencia adquirida i)[ superantígenos

derivados de bacterias, proteína M estreptocócica y homólogos de queratinas derivados de

peptidos, neuropéptidos tales como la sustancia P y papiloma virus humano (Nickoloff,

1999).

Se ha propuesto que cierta secuencia de aminoácidos que la queratina tienen en común

con la proteína M es el principal blanco de linfocitos T autoreactivos en la psoriasis. Un

ejemplo de esto, es la K17 que comparte la secuencia ALEEAN con la proteína M

(Gudmundsdottir et al, 1999).

Tres líneas principales de investigación indican que la activación de linfocitos tanto

policlonal como oligoclonal contribuyen en el inicio y persistencia de la psoriasis. Estudias

en pacientes con psoriasis guttata han implicado al superantígeno exotoxina

estreptocócica pirogénica tipo C(SPEC) en el inicio de las lesiones de PG por un

superantígeno policlonal que dirige la expansión de linfocitos VB2. En contraste, los linfocitos T CD8' intraepidérmicos encontrados en placas psoriasicas crónicas muestran

una expansión oligoclonal VB consistente con la estimulación de antígeno clásica. Se ha

visto que la activación de leucocitos de sangre periférica de pacientes psoriásicos por el

superantígeno enterotoxina B estafilocócica (SEB) e IL-2 es suficiente para iniciar las

lesiones psoriásicas en ratones SCID (Norris et al, 1997).

Mas sin embargo, dos líneas de investigación demostraron que linfocitos de sangre

periférica de pacientes psoriásicos hiporespondieron a SAgs estreptocócicos y la presencia

de inhibidores séricos que inhiben específicamente la respuesta celular de T a los SAgs en

los pacientes psoriasicos. Por lo que, en el primer caso, sugieren un papel patológico de la

infección estreptocócica en la patogénesis de la psoriasis y en el segundo caso, que los

SAgs liberados de una infección de S. pyogenesfocal induce una activación transitoria de

linfocitos T relevantes, que lleva al desarrollo de una erupción de la piel y

subsecuentemente, a una anergia temporal de linfocitos T hacia estas toxinas (Horiuchi et

, al, 1998; Tokura eta4 1999).

Las proteínas de choque térmico (HSPs), las cuales están expresadas constitutivamente

en todas las células, son esenciales para diversos procesos celulares, tales como

plegamiento de Proteínas, protección de proteínas de la desnaturalización o agregación, y

facilitación del transporte de a través de los canales de la membrana. Una amplia variedad

de estímulos estresantes tales como el choque térmico, radiación ultravioleta e infecciones

bacterianas o virales, inducen un incremento en la síntesis intracelular de las HSPs (Wallin

et al, 2002). En nuestro equipo de investigación se han llevado a cabo diversos estudios

que indican que las proteínas de choque térmico del Streptococcus pyogenes pueden ser

antígenos iinmunodominantes de la bacteria para los pacientes psoriasicos.

Villeda-Gabriel e t al en 1998 empleando inmunofluorescencia indirecta, reportaron que

la piel de los enfermos con psoriasis es reconocida por un suero de conejo anti- S. pyogenes, mientras que esta reacción es negativa en el caso de la piel de los sujetos

sanos. Por otro lado, Pérez-Lorenzo e t al en 1998 reportaron que en el suero de los pacientes con psoriasis existen autoanticuerpos que reconocen la piel lesionada de los pacientes psoriásicos y no la piel sana de los mismos. Además estos autoanticuerpos

presentes en los sueros de estos pacientes perdieron la reactividad hacia los antígenos de

la piel cuando estos fueron inmunoabsorbidos con un extracto proteico total de S. pyogenes. Recientemente en el 2001, Sánchez-Huerta encontró que estos autoanticuerpos

también pueden ser inmunoabsorbidos con la HSP60 del S. pyogenes. Estos resultados

indican que una posible reacción cruza entre los antígenos de la piel psoriásica y la HSP60

del S. pyogenes.

Por otro lado mediante inmunoelectrotransferencia ( I n ) y ELISA se encontró que en los sueros de los pacientes con psoriasis están presentes altos títulos de anticuerpos que

reconocen las fracciones proteícas de 14, 60 y 70 kDa de S. pyogenes (Ortiz-Quintero,

1997; Villeda-Gabriel et al 1998). Éstas fracciones coincidían en peso molecular con las

proteínas de choque térmico del Streptococcus pyogenes las cuales se indujeron con

ch’oque térmico a 45OC (Ortiz-Quintero, 1997).

Con base a lo anterior, Ruiz-González et al 2000 trabajó con la HSP60 del S. pyogenes

recombinante (rHSP6OSp) y encontró que los pacientes con psoriasis en placa presentan

en sus sueros altos título de anticuerpos de la clase IgG que reconocen a esta proteína.

Ramírez-Reséndiz en el 2001, trabajo con la HSP70 del S. pyogenes recombinante, pero

no encontró ninguna relación.

Con base a los resultados obtenidos por Ruiz-González, Sánchez-Becerra (tesis de

maestría en revisión) trunca por PCR el gen que codifica a la HSPGO de S. pyogenes y

obtiene 4 polipéptidos recombinantes de esta proteína con peso molecular de 25, 29, 38 y

46 KDa respectivamente. En estos polipéptidos se eliminaron sitios antigenicos para

células B y células T los cuales fueron detectados teóricamente por dos diferentes

programas de computación. El programa para epitopos de B se basa en los sitios mas

hidrofílicos de la proteína y el programa para epitopos de T se basa en el afinidad que

tienen los péptidos de la proteína para unirse con la molécula HLA-Cw6 el cual esta mas

asociado con la psoriasis. Cuando se trabajo con los polipéptidos antes mencionados y los

sueros de pacientes psoriásicos con alta respuesta hacia la rHSP60Sp se encontró que la

región carboxilo-terminal 415-543 y la región amino-terminal 1-224 de la HSP60Sp son las

regiones más reconocidas por los anticuerpos de los pacientes psoriásicos.

Por último Perez-Lorenzo et al, 2000 estudió la respuesta celular (mediante el método

de incorporación de timidina tritiada) a las proteínas de choque térmico de 60 y 70 kDa de

Streptococcus pyogenes recombinante en pacientes psoriasicos y en sujetos sanos. En

este trabajo también trabajo con extractos solubles totales de Streptococcus pyogenes

antes y después de la inducción de choque térmico (EST37Sp y ESr42Cp,

respectivamente). Cuando midió la respuesta linfoproliferativa con ambos extractos

obtiene respuesta mayores que a respuesta obtenida con la PHA tanto en el grupo de

pacientes como en el grupo de sujetos sanos. AI emplear ambas proteínas de choque

térmico recombinantes observó que la respuesta linfoproliferativa de los pacientes con

I

1

t -

i

L

psoriasis hacia la rHSP70Sp tiene una tendencia a ser mayor que la respuesta de los

sujetos sanos. No se encontró una diferencia en la respuesta hacia la rHSP60Sp entre los

pacientes y los sujetos sanos.

V. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Estudiar la respuesta inmune celular en pacientes con psoriasis hacia los polipéptidos recornbinantes de la HSPGOSp para determinar las región(es) antigenica(s) de la proteína de choque térmico de 60 kDa de Streptococcus pyogenes recombinante (rHSP6OSp).

OB J ETlVOS PARTICU LARES:

Expresar y purificar los plipéptidos y rHSP6O recombinantes.

Determinar las su bpoblaciones de linfocitos T que responden hacia proteínas recombinantes por citometría de flujo tanto en pacientes psoriásicos como en sujetos sanos.

I VI. MATERIAL Y MÉTODOS

A. MUESTRAS BIOLÓGICAS

Se estudiaron fO pacientes con diagnóstico clínico de psoriasis en placa sin tratamiento

sistémico y 10 sujetos sanos como grupo testigo. Todos los pacientes presentaron en el momento de tomar la muestra actividad clínica con un PAS1 mayor de 5. Estos pacientes

se diagnosticaron en la Clínica de Psoriasis de la consulta externa del Servicio de

Dermatología del Hospital General de México, SSA. Se excluyeron del estudio a pacientes

menores de edad, enfermos con otra variedad de psoriasis, pacientes con psoriasis

controlada (PAS1 menor de 5), pacientes bajo tratamiento con inmunosupresores,

pacientes con presencia de alguna enfermedad de etiología estreptocócica (impétigo,

erisipela, etc.).

Tanto a los pacientes como a los testigos se les tomó una muestra de 10 mL de sangre

heparinizada por punción venosa bajo un consentimiento informado por escrito.

B. GENES Y PLÁ5MIDOS UTILIZADOS:

Las proteínas recombinantes se obtuvieron a partir de los genes respectivos clonados

en el sistema del plásmido pPROEX-HT (Life Technology).

El gen hsp6OSp que codifica para la HSP60Sp fue clonado en el fago lambda M49 a

partir de una biblioteca genómica de S. pyogenes por el Dr. Andreas Podbielski (Inst. Med.

Mikrobiol., FDR). Posteriormente este gen (que se encontraba en un fragmento de DNA de

aproximadamente 1650 pb) se subclonó por PCR, por el mismo autor; en el sistema de

expresión del vector pMALc-2 de 6646 pb de New England t?io/abs. A partir del plasmido

pMALc-Z;;hsp60Sp donado por el Dr. Podbielski, el gen hsp60Sp se subclonó por segunda

vez en el vector pPROEX-Hta por Ruiz-González, 2000. Este nuevo plásmido se le dio el

nombre de pHSP6OSP.

Con el plasmido pHSP6OSp Sanchez-Becerra (tesis de maestría en revisión) obtuvo por

PCR cuatro truncamientos del gen hsp6OSp, los cuales codifican para cuatro polipéptidos

recombinantes de esta proteína. El truncamiento de la proteína se realizo por el lado

carboxilo terminal de la proteína. Las características de los cuatro poiipéptidos se

describen en la figura I .

C. INDUCCIÓN DE LAS PROTEíNA.5 h-COMBINANTES

I

I

i

Los plasmidos con los genes antes mencionados se emplearon para transformar a una

cepa de Escherichia coliXL-1 Blue, las cuales se trataron con cloruro de calcio 0.1 M, para

pasarlas en estado de competencia para adquirir el plásmido. La transformación

bacteriana se realizó a 4OC durante 30 minutos en un baño de hielo. Posteriormente se dio

un choque térmico a 90 s a 42OC. Las bacterias transformadas se sembraron en placas de

agar LB con ampicilina (50 pg/ml), y se incubaron a 37OC durante 24 horas.

Cada una de las colonias que contenían al plásmido recombinante, se paso con la ayuda

de un palillo de madera estéril a un tubo con 5.00 ml de medio líquido LB con ampicilina a

una concentración final de 50 pg/ml y se incubó en agitación a 37OC durante 12 horas.

Este cultivo sirvió para inocular un matraz con 100 ml de medio LB con ampicilina a la

misma concentración. Este cultivo se incubó a 37OC en agitación constante durante el tiempo necesario para alcanzar una absorbencia de 0.4 a 0.6 a 640 nn-i. Con la finalidad

de inducir la expresión de los genes de las proteínas recombinantes, se agregó IPTG

(Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside, Research Organics Inc.), a una concentración final

de 0.6 mM y se incubó en agitación durante 4 h más a 37'C.

Las bacterias se cosecharon por centrifugación a 5000 rpm por 10 minutos y se desechó

el sobrenadante, obteniéndoce así el paquete celular. Una alícuota de 1.00 ml de cultivo

se analizó en PAGE-SDS-ME al 12.5% para corroborar la inducción de la proteína

recombinante.

D. PURIFICACIÓN DE LAS PROTEíNAS RECOMBINANTES

La purificación de las proteínas y polipéptidos recombinantes se realizó de acuerdo a las

recomendaciones del proveedor de la resina Ni-NTA (QIAGEN). El sistema de expresión

procariótico pPROEX-HT de Life Technology utilizado en este estudio, presenta la

característica de expresar la proteína recombinante fusionada a una secuencia de 6

histidinas las cuales presentan una fuerte afinidad a una resina matriz de níquel, por lo

I

que se utilizó este sistema para la purificación de las proteínas y polipéptidos

recombinantes.

Una vez que se comprobó la inducción de las proteínas y de los polipéptidos

recombinantes, el paquete bacteriano se resuspendió en 4.00 ml de regulador de lisis

(NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, PMSF lmM,

pH 8.0 - 8.5) y se sonicó a 180 W en un baño de hielo, durante 30 minutos a intervalos

de 5 minutos de reposo y un minuto de sonicado con pulsos. Los restos celulares se

eliminaron por centrifugación a 5000 rpm a 4OC durante 20 minutos. El sobrenadante rico

en proteínas recombinantes se mezcló con la resina (Ni-NTA agarose, QIAGEJV), la cual se

lavo previamente con regulador de lisis.

La mezcla se incubo en un baño de hielo durante 1 h en agitación constante. La mezcla

se empleó para cargar una jeringa de 3 mL, que funciono como una columna. Las

proteínas que no interaccionaron con la resina se eliminaron en el efluente al vaciar la

mezcla en la columna. Posteriormente se llevaron a cabo los lavados con 8.00 - 10.00 ml

de regulador de lavado (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, 2-

mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol, pH 8.0 - 8.5), para la eliminación de las proteínas

que no se unieron a la resina. Para eluir la proteína recombinante correspondiente se

utilizaron fracciones de 500 pL de regulador de elución (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM,

Imidazol 250 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol, pH 8.0 - 8.5). La presencia

de proteínas en las fracciones recuperadas durante la lisis, el lavado y la elusión se

analizaron en PAGE-CDS-ME al 12.5% y se cuantificó la concentración de las mismas por

el método de Bradford (1976).

E. ENSAYO DE ACTIVACIÓN CELULAR DETERMINADO POR LA WPRESIÓN TEMPRANA DEL MARCADOR CD69 DETECTADA POR CITOMETRíA DE FLUJO.

Los ensayos de activación celular, se realizaron en tubos estériles de 5.00 mL con

tapón, marca Falcon - Becton-Dickinson. Para esto, 500 pL de sangre heparinizada de

cada pacientes se incubo con el antígeno correspondiente. Para la rHSP60Sp se utilizo 1

I

119. Para todos los polipeptidos recombinantes de la HSPGOSp (46, 38, 29 y 25 kDa), se

utilizo 1.57xlO-" mol. Un tubo que contenía solamente 500 pL de sangre, se utilizo como

testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó un tubo con 500 pL de sangre

heparinizada y 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Todos los tubos se incubaron durante 8

horas a 37OC en atmósfera de COZ al 5%. Para determinar la población de Iinfocitos T

CD4' y CD8' activadas, de cada tubo se tomaron una alícuota de 60 pL, para teñir las

células con 5 pL de cada uno de los reactivos que a continuación se describen. Estos

reactivos eran una mezcla comercial de anticuerpos monoclonales, los cuales tenían

acoplado diferentes fluorocromos (Becton-Dickinson). El reactivo 1 (Rl) estaba formado

por IgGl de ratón - FITC / IgGl de ratón - PE / anti - CD3 - PerCP (testigos de isotipo).

El reactivo 2 (R2) presentaba las mezcla de anti - CD4 - FlTC / anti - CD69 - PE / anti - CD3 PerCP, el reactivo 3 (R3) consistía en anti - CD8- FITC / anti - CD69 - PE / anti - CD3 PerCP.

Estas mezclas se agitaron en vórtex 5 segundos y se incubaron durante 20 - 30 minutos

a temperatura ambiente y en la oscuridad. Transcurrido este tiempo a cada tubo se le

adicionó 1.5 ml de solución de lisis (FACS Lysing solution, Becton-Dickinson) y se agitaron

en vórtex 5 segundos y se incubaron 20 - 30 minutos a temperatura ambiente y en la

oscuridad. Después se centrífugo a 2000 rpm durante 5 minutos a 4OC, se decantó en un

tiempo y a cada tubo se le agregó 2.00 mL de solución salina FACS-Flow (Becton-

Dickinson), se agitaron los tubos en vórtex 5 segundos y se centrifugaron a 2000 rpm

durante 5 minutos a 4OC, se decanta en un solo tiempo y las células se fijaron con una

solución de pformaldehído al 0.5%. Todas las muestras se adquirieron con 5000 eventos

en la ventana de células T CD3' en el canal F U y se analizaron en el programa Celiquest

para tres colores del citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson), Los resultados se

expresan como porcentaje de células TCD4' y TCD8' que expresan el marcador temprano

de activación CD69.

F. ANAL1515 ESTADfSTlCO

Se determinaron las medianas de los datos obtenidos en las diferentes determinaciones

utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.

La prueba U de Mann-Whitney se empleó para determinar sí existía diferencia estadística entre los dos grupos de sujetos que se manejaron: sujetos sanos y pacientes .

psoriacicos utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.

La prueba de Friedman se empleó para analizar la diferencia estadística entre sujetos

del mismo grupo, ya sea el grupo de sujetos canos o el grupo de pacientes pcoriásicos

utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.

Para la realización de las gráficas se empleó el programa Sigma Plot versión 5.0.

I

t

t

1. >

I.

Actividades realizadas

Expresar y purificar las proteínas recombuinantes (rHSP).

Cuantificación de las r”SP purificadas.

Extracción muestras de sangre de pacientes psoriacicos y sujetos sanos.

Uso del citometro de flujo para medir las poblaciones de linfocitos CD4+ y CD8+

Objetivos y metas alcanzados

Los resultados obtenidos en base a los experimentos realizados sirvieron para analizar la

relación que existe entre las proteínas (rHSP) relacionadas con la enfermedad, los cuales

fueron muy favorables para acercarnos un poco mas y poder descifrar si hay alguna

relación fuerte que nos indique si es la posible causa o un factor desencadenante

involucrdo en la psoriasis. Por ello se puede decir que las metas y objetivos fueron

satisfactorios.

. ..

I. ! I .

;21

I. I

Polipéptido de 25 kDa V S 1 ; I Q 21 I L ? L L E S V L I C

T ?: F P L L Z I H D I? V D G E A L P T L

t

IV. RESULTADOS

F. INDUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEíNe RECOMBINANTES DE LAS

PROTEíNE RECOMBINANTES .

Como el objetivo general de este trabajo fue el de estudiar la activación de los linfocitos

T de los pacientes con psoriasis frente a los polipéptidos y HSP60Sp recombinantes,

entonces fue necesario la obtención de estas proteínas. Para esto se realizo la inducción

de la síntesis (con IPTG) de estas proteínas en las cepas de E. colidonde se encontraban

los genes clonados en los plásmidos correspondientes. Una vez comprobada la inducción

de las proteínas y polipéptidos recombinantes, se procedió a su purificación mediante la

columna Ni-NTA (QIAGEN). En la figura 2 se muestra el análisis de pureza de las proteínas

recombinantes en una PAGE-SDS al 12.5%.

G. ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO DE ACTIVACIÓN CELULAR DETERMINADO

POR LA WPRESIÓN TEMPRANA DEL MARCADOR CD69 DETECTADA POR

CITOMETRíA DE FLUJO

Para determinar la activación de los linfocitos T por los polipéptidos y la HSP6OSp

recombinantes obtenidas en este trabajo, primero se realizó una curva dosis respuesta con

sangre heparinizada de tres sujetos sanos, para encontrar la concentración Óptima de HSP

a utilizar. Para esto se emplearon 6 concentraciones de la rHSP60Sp (2.0, 1.0, 0.50,

0.250, 0.125 y 0.060 pg) y 8 horas de activación. No se observo ninguna diferencia

significativa en los porcentajes de linfocitos T activados, a las concentraciones de 2, 1, 0.5

y 0.250 pg de la proteína (p>0.05) pero este porcentaje bajo a las concentraciones de

0.125 y 0.060pg. Con base a lo anterior, se tomó la decisión de emplear la concentración

de 1 pg de proteína, ya que esta es la concentración que se ha utilizado en otros estudios

hechos en nuestro laboratorio. Posteriormente se procedió a determinar el tiempo Óptimo

de incubación con la sangre de otros 3 sujetos sanos. Se probaron dos tiempos, 8 y 12

horas de incubación (con l p g de antígeno). El tiempo Óptimo resulto ser el de 8 horas,

60 kDa 40 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 f T

25 kDa

figura 2. Análisis de pureza de las proteinas recombinantes en PAGE-SDS al 12.5%. Carril

I y 10 marcadores de peso molecular; carril 2 rHSP70Sp; carril 3 rHSP60Sp; carril 4

polipéptido 414 (46 kDa); carril 5 polipéptido 349 (38 kDa), carril 6 polipéptido 262 (29

kDa); carril 7 polipéptido 224 (25 kDa); carril 8 rHSP60Ec y carril 9 CAT (Cloranfenicol

acetil transferasa, proteína testigo 0 del equipo de reactivos de purificación de QDiGEN).

I

I

Activacibn de Iinfocitos T CD4' de pacientes con psoriasis y sujetos sano5 frente a las

HSP obtenidas.

I Los resultados de activación de los linfocitos T CD4' de los pacientes con psoriasis y

sujetos sanos frente a las proteínas de HSP obtenidas, se muestran en las tablas 1 y 2

respectivamente. Estos resultados están ordenados en forma descendiente con respecto a

los valores del porcentaje de linfocitoc T CD4' de pacientes y sujetos sanos que se

linfocitos T CD4' activados frente a la fitohemaglutinina (testigo de activación) y la

mayoría de estas células no se activaron cuando se dejaron sin ningún estímulo antigenic0

(testigo negativo). Si consideramos como una activación positiva a los porcentajes de

linfocitos T CD4+CD69' arriba del 1%, entonces se puede decir que todas las muestras de

pacientes y sujetos sanos estudiadas presentaron linfocitos T CD4' que se activaron frente

a todas las proteínas completas estudiadas, pero en diferentes proporciones. Con base a

estos resultados se puede decir que existe un grupo de personas (pacientes o sujetos

sanos) que tiene un mayor número de linfocitos que pueden activarse con la HSP y otro

grupo con un número menor de estas células. Sin embargo el porcentaje promedio de

linfocitos T CD4' de pacientes con psoriasis que se activaron con la rHSP60Sp es

ligeramente mayor que el porcentaje de los sujetos sanos (Tablas 1 y 2, Figura 4), pero

esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p>0.05).

i

I activaron frente a la rHSP60Sp. Todas las muestras presentaron un alto porcentaje de

Cuando se trabajo con los polipéptidos de la HSPGOSp se observó que los porcentajes

de linfocitos T CD4" de los pacientes que se activaron con estos polipéptido disminuyeron

con respecto a los valores obtenidos con la proteína completa (p<0.05) (Tabla 1).

Similares resultados se observaron en los sujetos sanos (p<0.05) (Tabla 2). Si analizamos

la activación de estas células con mayor detalle de cada polipéptido, podemos observar

que el porcentaje promedio de activación de linfocitos T CD4' de pacientes frente al

polipéptido de 46 kDa bajo -50% con respecto a la activación promedio obtenida con la

proteína completa (p>0.05). Con el polipeptido de 38 kDa la activación obtenida fue muy

similar al polipéptido de 46 kDa, pero si hubo diferencia significativa (p<0.05). Con el

polipeptido de 29 kDa la respuesta tje la mayoría de los pacientes disminución

drasticamente -80% y en todos los sujetos sanos el porcentaje de linfocitos T CD4'

activados bajo hasta cero (los linfocitos T CD4' no se activaron). Sorprendentemente con

el polipeptido 25 kDa (el cual era el menor peso molecular), la respuesta en pacientes y

sujetos sanos se recupero hasta alcanzar valores de porcentajes en algunos casos un poco

mas altos a los obtenidos con el polipeptido de 46 kDa (ver P12,P16, P14, P l l , P13 y P06,

Tablas 1 y 2, Figura 3).

PACIENTES PSORIÁSICOS

PO5 P i 2

P16

P15

P11

PO6 P17

Pi3 P I 4

PO7

N

Mediana

Tabla 1. Porcentaje de Linfocitos T CD4+CD69+ de pacientes con psoriasis estimulados con rHSP60Sp y polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activación 8 horas.

PHA rHSP6OSp POLIPEPTIDOS (2.5 pg) (1.0 pg = ( 1 . 6 7 ~ 1 0 - ~ ~ moles)

1.67x10-" 46kDa 38kDa 29kDa 25kDa moles)

30.05 30.10 19.99 18.68 13.17 19.39

18.16 21.19 29.29 11.90 15.37 2.53

22.03 20.56 6.65 14.50 2.29 13.93

10.18 17.53 19.76 14.28 11.90 1 .O6

21.82 17.88 5.15 3.27 1.40 8.43 7.52 13.28 6.38 5.00 1.42 6.10 16.72 12.24 3.78 0.21 0.00 3.40 9.67 7.70 1.31 0.95 0.75 2.13 5.42 4.26 1.82 1.13 0.72 3.45 10.14 4.43 2.17 1.70 1.59 3.06

10 10 10 10 10 10 17.125 15.58 5.765 4.135 1.41 7.265

~~~~

Tabla 2. Porcentaje de Linfocitos T CD4+CD69+ de sujetos sanos estimulados con rHSP60Sp y polipeptidos recombinantes de la HSP6OSp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activacih se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Tempo de activación 8 horas.

i

Mediana I 17.465 I 8.085 2.470 I 0.000 I 3.315

35 I 'g 30 -

2 5 -

o 2 0 - I-

1 5 -

n

B

e 0 1 0 - O

z $ o -

5 - -I

I

+ 30-

n 25-

o 2 0 - I-

15-

B

e z 5 -

0 1 0 - O

i $ o -

I

I

i

PHA

e pco.05

o pco.05 -c l

e

4 .~ _____

rHSP6OSp 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa

A

m

i PHA

I ~- I pcO.05 7- pcO.05 1 7 ~ ~ 0 . 0 5 I B

0 rHSP6OSp

I pcO.05 I

t + o ____ __-

46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa

Figura 3. Porcentaje de linfocitos T CD4+CD69+ de pacientes con psoriasis y sujetos sanos. Panel A: 10 Pacientes psonásicos. Panel B: 10 Sujetos sanos. Los extremos de las cajas definen los Pzs y P75 (percentiles 25 y 75, respectivamente). La línea horizontal dentro de la caja representa la mediana y las líneas verticales los Plo y Pw. Las líneas horizontales corresponden al análisis estadístico y señalan la existencia de diferencia estadísticamente significativa. A los valores representados se les restó el valor de testigo de isotipo y el valor del testigo sin estimulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). La activación se llevó a cabo con 1.67 x 10 -11 moles de rHSP60Sp y de polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp durante 8 horas.

,

Activación de Iinfocitos T CD8' de pacientes con psoriasis y sujetos 5at-105 frente a las

HSP obtenidas.

La subpoblación de linfocitos T CD8' de los pacientes con psoriasis y de los.sujetos

sanos se comportaron muy similar a la subpoblación CD4' frente a las proteínas

estudiadas. Como se puede ver en la tabla 3 y 4 y en la figura 4, el porcentaje promedio

de los linfocitos T CD8' de pacientes con psoriasis que se activaron con la HSP6OSp es

muy similar al porcentaje promedio de los sujetos sanos (p>0.05). AI igual que con las

células CD4', los pacientes y sujetos sanos que presentaron alta activación de CD8' con la HSP60Sp también presentaron alta activación con las otros HSP. La mayoría de los pacientes y sujetos sanos que presentaron altos porcentajes de Iinfocitos T CD4' activados

por las proteínas ensayadas, también presentaron altos porcentajes de linfocitos T CD8'

activados.

El porcentaje de linfocitos T CDS' activados con los polipéptidos de 46, 38 y 29 también

disminuyeron con respecto a la respuesta abtenida can la proteína completa, en ambos

grupos de sujetos estudiados (pc0.05) (Tabla 3 y 4, Figura 4). Sin embargo, en ambos

grupos la caída de la respuesta fue de aproximadamente un 40% con el polipeptido de 46

kDa y solamente la mitad de los sujetos sanos llegaron a cero de activación con el

polipéptido de 29 kDa. El polipéptido de 25 kDa también recupero la activación de los linfocitos T CD8 positivas como se observó con los linfocitos T CD4 (Tabla 3 y 4, figura 4).

Tabla 3. Porcentaje de Linfocitos T CDS'CD69' de pacientes con psoriasis estimulados con rHSP6OSp y polipeptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 mg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activación 8 horas.

rHSP6OSp POLIPEPTIDOS PSORIÁSICOS (2.5 pg) (1.0 pg = (1.67xlO-" moles)

1.67x10-" 46 kDa I 38 kDa I 29 kDa I25 kDz moles)

P15 16.31 27.76 21.40 20.33 2.07 16.75

E .

Tabla 4. Porcentaje de Linfocitos T CD8+CD69+ de sujetos sanos estimulados con rHSP60Sp y polipeptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se lec restó el valor del testigo de icotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 mg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activaciÓn.8 horas.

SUJETOS PHA SANOS (2.5 ILg)

S16 32.09 s12 21.44 S11 14.49

rHSP60Sp POLIPEPTIDOS (1.0cLgl = ( 1 . 6 7 ~ 1 0 - ~ ~ moles) 1.67x10-” 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa moles) 29.91 10.13 11.11 0.00 7.09 18.52 11.79 12.06 5.81 20.04 18.17 6.35 7.23 1.32 8.75

i

n Mediana

i

13 13 10 10 10 10 14.265 13.345 8.330 7.010 0.705 7.475

+ m P +q 8 o I-

$ o -

o O

z s

L

J

35

30

25

20

15

10

5

O

7-

I m

Ka

T

pco.05

a T

A 1

I f

I pcO.05

II

i f *

-~ ___ __- I PHA rHSP6OSp 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa

i

peO.05 I __ B ~ peo.05

I 1 pco.05 I

o 20 T

PHA rHSP6OSp ~~

46 kDa 38 kDa

I pco.05 I

29 kDa 25 kDa

Figura 4. Porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ de pacientes con psoriasis y sujetos sanos. Panel A: 10 Pacientes psonásicos. Panel 8: 10 Sujetos sanos. Los extremos de las cajas definen los P25 y P75 (percentiles 25 y 75, respectivamente). La línea horizontal dentro de la caja representa la mediana y las líneas verticales los Plo y Pso. Las líneas horizontales corresponden al análisis estadístico y señalan la existencia de diferencia estadísticamente significativa. A los valores representados se les restó el valor de testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina(PHA). La activación se llevó a cabo con 1.67 x 10 -11 moles de rHSP60Sp y de polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp durante 8 horas.

4 Continua

3 4 1 A N R I A L I K Q Q L E T T T S D F D R Polipéptido de 38 koa

361 L Q E R L A K L A G G V A V I K V G

381 A P T E T A L Y E M K L F . 1 E D A L N A Bolipéptido de

4 0 1 T R A A V E E 1; I V A G G G T A L I T

441 L R A L E E P ‘J R Q I A L N A G Y E G S

401 V I I D K L K I ú S P A G T G F N A A T G

4 3 i E W V D M I K T G I I C I P V K V T R C A

5ül L Q N A A S V ~ S L I Z T T E A V V A N

52 1 K P E P A A P A P A M P A G M D P G M M

5 4 1 G G F * A

Figura 1. Secuencia aminoácidas de la HSP66Sp. .Las fiechas indican el sitio del truncamiento de la HSP60Sp. En cuadros de color negro se muestran las secuencias que presentan Blta afinidad para la molécula MLA-Cw06 (Parker et&, 1994). En letras de cdor verde se muestran las dos regiones (204-211 y 419-426) que presentan una secuencia similar (THüiKXXA).

1

6 1

81

101

if 1

14 1

ií A F G S P L I T N ti G V T 1 A K E I E

L E D H F E Id M G A I.: L V C E V k S K T

E G L K N \- T A G A )I F I G I K R G I E

T A T A T $. 'u' E A L K A. i 0, Q P V S G K

E A 1 A Q V .a. A V S S R S E K V G E Y I

S E A PI E R V G N D G ' i : I T I E E S R G

M E T E L E V V E rJ PI Q F D R G Y L 3 Q

2 Q i Y p.? V T I D N E K M V A

T D K K V S ¢13

D L I Z EJ F F I L I

Polipéptido de 25 kDa 221 N I Q D I L P L L E E V L K

241 T N R P L L I I A I3 D V D G E A L P T L

Polipéptido de 29 kDa 291 V N K I R G T F !ú 1 7 V A 1.7 K A P G F G

781 D R R y\ A M L E D I A I L T G G T V I T

3 0 1 E D L G L E L K D A T M T A L G Q -4 A K

32 1 I T V D K D S T V I V E G S G S S E A I

+ Continua I

i

VII. CONCLUSIONES

i

Los Iinfocitos T CD4' y CD8' de pacientes psoriasicos y sujetos sanos se activaron en

igual proporción cuando se enfrentan con la rHSP60Sp (p>0.05).

Los linfocitos T CD4' de los pacientes psoriasicos presentaron una tendencia de mayor

activación hacia la rHSP60Sp; en los linfocitos T CD8' ,se observó una tendencia de

mayor activación de los sujetos sanos hacia la rHSP60Sp.

Se encontró que en las regiones de aminoacidos 415-543 y 262-349 de la HSP60Sp

posiblemente se localizan los epítopos para los linfocitos T; porque cuando se

eliminaron estas regiones la activación de los linfocitos T disminuyó.

En la región de aminoácidos 1-224 de la HSP6OSp se encuentra otro epítopo para los

linfocitos T, ya que la respuesta de los linfocitos T se recuperó cuando se eliminó la

región 225-543 de la proteína.

VIII. Criterios de evaluación

ConJorme al manejo de las técnicas aprendidas en la investigación aplicadas en la realización de cada experimento, así mismo en la investigación bibliográfica relacionada con la enfermedad (psoriasis).

IX. Bibliográfia

I . Arenas R. 2000. Psoriasis. En: Dermatología. Atlas, diagnóstico y tratamiento,

McGraw-Hill: Interamericana. 415-422.

2. Asadullah K., Sterry W., Stephanek K., Jasulaitis D., Leupold M., Audring H., Volk

H.D., Docke W.D. 1998. IL-10 is a key cytokine in psoriasis. J Clln Invest 101 (4):

783-791.

3. Asadullah K., Volk H-D., Sterry W. 2002. Novel immunotherapies for psoriasis.

TRENDS immunol23 (1): 47-53.

4. Austin L-M-, Ozawa M., Kikuchi T., Walters I.B., Krueger J.G. 1999. The majority of

epidermal T cells in psoriasis vulgaris lesions can produce type 1 cytokines, interferon

gamma, interleukin-2, and tumor necrosis factor-alpha, defining T c l (cytotoxic T

lymphocyte) and TH1 effector populations: a type 1 differentiation bias is also

measured in circulating blood T cells in psoriatic patients. J Invest Dermato l l l3 (5):

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FORMATO PARA SER LLENADO POR EXTERNO PARA EL PROYECTO SOCIAL.

ASESOR(ES) INTERNO Y

1. Nombre y adscripción del asesor.

M. en C. Edith Cortés Barberenci

2. La naturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es:

a) Proyecto de Servicio Social asociado a la investigación que se realiza en las áreas departamentales.

0 interno.

Externo.

n Por convenio.

b) Proyecto de Servicio Social asociado a actividades disciplinarias realizadas por el asesor.

3. Nombre del Proyecto del que deriva el Servicio Social e institución u organismo que lo avala.

Respuesta celular a polipéptidos recombinantes de la proteína de choque térmico de 60 kDa streptococcus pyogenes (hsp6Osp) en pacientes con psoriasis.

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I,

4.Justificar la vinculación del asesor con el Proyecto de Servicio Social.

El asesor dirige la línea de investigación , así como las técnicas en el proyecto de investigación para el Servicio Social.

5. Desglosar las actividades que desarrollara el asesor para dirigir el Servicio Social.

Explicación de cada técnica aplicada en el proyecto. Revisión de cada etapa del trabajo experimental Aclaración de dudas con respecto a la línea de investigación. Revisión del trabajo escrito a entregar.

6. Nombre y Firma del Asesor.

Ed it h Corté s$3 a r b e re n a

I

FORMATO PARA SER EXTERNO PARA EL PROYECTO SOCIAL.

ASESOR(ES) INTERNO Y

- 1. Nombre y adscripción del asesor.

Dra. Maria Lilia Domínguez López

2. La naturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es:

a) Proyecto de Servicio Social asociado a la investigación que se realiza en las áreas departamentales.

0 interno.

Externo.

0 Por convenio.

b) Proyecto de Servicio Social asociado a actividades disciplinarias realizadas por el asesor.

3. Nombre del Proyecto del que deriva el Servicio Social e institución u organismo que lo avala.

Respuesta célular a polipéptidos recombinantes de la proteína de choque térmico de 60 kDa sfrepfococcus pyogenes (hsp60sp) en pacientes con soriasis.

4.Justificar la vinculación del asesor con el Proyecto de Servicio Social.

El asesor dirige la línea de iiivestigación , así como las técnicas en el proyecto de investigación para el Servicio Social.

5. Desglosar las actividades que desarrollará el asesor para dirigir el Servicio Social.

Explicación de cada técnica aplicada en el proyecto. Revisión de cada etapa del trabajo experimental Aclaración de dudas con respecto a la línea de investigación. Revisión del trabajo escrito a entregar.

6. Nombre y Firma del Asesor.

Maria Lilia Dotydnguez Lgpez