Alumno: Tomás Martínez Hernández 4
Matrícula: 953 3 3492
Licenciatura : Biología Experimental
División: CBS, Unidad, ZTAPALAPA
Título del Proyecto de Investigación
RESPUESTA CÉLULAR A POLIPÉPTIDOS RECOMBINANTES DE LA PROTEíNA DE CHOQUE TÉRMICO DE 60 KDA 5TREPTOCOCCU5 PYOCENH(HSP6OSP) EN PACIENTES CON SORlASlS.
Título del trabajo de Servicio Social
RESPUESTA CELULAR HACIA PROTEíNAS DE CHOQUE TÉRMICO RECOMBINANTES EN PACIENTES PSORASICOS
Fecha de elaboración del trabajo
1 /j u I i 0/2 002 - 1 /ene ro/2 O 0 3
A. Definición de la psoriasis
La psoriasis se define como una dermatosis inflamatoria crónica, asintomatica,
caracterizada por placas eritematoescamosas, bien definidas que se localizan
principalmente en codos, rodillas, región sacra y piel cabelluda, pero puede afectar toda la
superficie cutánea, y las uñas. Hay hiperplasia epidérmica y queratopoyesis acelerada. Se
desconoce la causa, pero parecen influir factores inmunitario, genéticos, psicosomaticos,
ambientales y bacteriológicos (Arenas, 2000).
B. Datos epiderniológicos
La psoriasis afecta al 1-2% de la población mundial. Anualmente, 1.5 millones de
pacientes psoriásicos en los Estados Unidos son vistos por médicos. De acuerdo a la
National Psoriasis Foundation (NPF), existen 150,000 - 260,000 casos nuevos reportados
cada año con edad promedio de 28 años. Entre el 5-10% de los pacientes podrían
desarrollar psoriasis artrítica, con inflamación e hinchazón en la manos, pies y
articulaciones (DiSepio et al, 1999).
Cla5ificación de la psoriasis.
Según la edad de presentación, la evolución clínica y los antecedentes genéticos, la psoriasis se clasifica en dos tipos ( formas juvenil y del adulto). La psoriasis tipo I (juvenil)
aparecen en la gente aproximadamente a los 20 años. Presenta antecedentes familiares,
y su asociación con el HLA es de 85% con Cw6 y en menos proporción con los antígenos
613 y B17. Este tipo de psoriasis es mas generalizada, resistente a tratamiento, y mas
grave. La psoriasis tipo I1 (del adulto) es de aparición tardía, alrededor de los 60 años,
rara vez hay antecedentes familiares, no hay relación con HLA, la evolución clínica es
benigna (Arenas,2000).
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CUADRO CLíNICO
La dermatosis es bilateral, con tendencia a la simetría; predomina en piel cabelluda,
salientes Óseas como codos y rodillas, región sacra, caras de extensión de extremidades;
en ocasiones afecta ombligo, palmas, plantas, genitales y pliegues de flexión (psoriasis
invertida). Las lesiones a veces son Únicas, pero también pueden ser generalizadas
(Arenas,2000).
La dermatosis esta constituida por eritema y escamas que se agrupan en placas de
bordes netos, de forma y tamaño muy variables; la descamación es blanca, nacarada, de
aspecto yesoso, o micácea; puede cubrir toda la placa o parte de la misma. Las lesiones
pequeñas predominan durante la niñez. En un alto porcentaje de los enfermos puede
afectar las uñas; se observan erosiones puntiformes (signo del dedal), hiperqueratosis
subungueal, onicólisis y leuconiquia (Arenas,2000).
Existen cinco formas reconocidas de psoriasis: placa (también llamada psoriasis
vulgaris), guttata, inversa, eritrodérmica y pustular. Un paciente puede exhibir una o mas
formas al mismo tiempo y la enfermedad puede cambiar de una a otra forma
predominantemente (Arenas,2000; DiSepio et al, 1999). Mientras que la apariencia puede
variar, cada forma está caracterizada por hiperproliferación epidermal de queratinocitos,
diferenciación anormal de queratinocitos e infiltración de células inmunes. La forma mas
común y mas estudiada de psoriasis es la psoriasis en placa (PP) (también llamada
psoriasis vulgaris), alrededor del 80% de las personas con psoriasis tienen este tipo. La PP
aparece en cualquier parte de la piel, principalmente en rodillas, codos, cuero cabelludo,
tronco y uñas . Este tipo de psoriasis tiende a ser crónica, aunque la remisión espontánea
puede ocurrir. Las lesiones psoriasicas de la piel también están presentes en forma de
gotas individuales, rojas y pequeñas en la piel y es las que se le denomina psoriasis
guttata (PG). La PG comienza como una pequeña lesión (1 mm) en el tronco,
frecuentemente asociada con una historia precedente de una infección del tracto superior
por estreptococo. En la PG las lesiones se limpian aproximadamente en 12 semanas,
aunque el 70% de los pacientes dentro de un año desarrollan la forma en placa (PP) que
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es . forma crónica de la enfermedad, lo cual sugiere que los dos tipo clínicos están
ligados por factores comunes. La erupción de la psoriasis guttata es algunas veces
observada en pacientes que ya habían presentado placas crónicas Los otros tipos de
psoriasis se presentan en menor frecuencia que la PP y la PG (Valdimarsson et al, 1995; NPF, 2001; Baker y Fry, 1992).
INMUNOLOGíA DE LA PSORIASIS
Existe una amplia evidencia que la psoriasis es causada por un defecto en el sistema
inmune y se ha demostrado que la activación de los iinfocitos es un paso importante en el
proceso de la enfermedad (Asadullah et al, 2002). Hay presencia de linfocitos T CD4' y
linfocitos T CD8' en las lesiones psoriásicas. Los linfocitos T CD4' aislados de lesiones son
preferencialmente linfocitos TH1 los cuales liberan sus citocinas y factores de crecimiento
que causan la hiperproliferación de queratinocitos (Brown et al, 2000; Prinz 1999). Además, existe evidencia que sugiere el papel de los superantígenos bacterianos en la
patogenesis de la enfermedad. De suma importancia es el hecho de que la intención de
las terapias es suprimir el sistema inmune o agentes anti-inflamatorios cuyo blanco son los
linfocitoc T o sus derivados los cuales han sido efectivos en el tratamiento temporal de la
enfermedad (DiSepio et al, 1999; Ortonne 1999). La ciclosporina es un medicamento que
se ha utilizado en tratamiento de la psoriasis. La ciclosporina actúa inhibiendo la acción de
los factores de trascripción NF-AT (factor nuclear de linfocitos T activados), AP-3 y NF-KB
en el promotor del gen que codifica IL-2. Estos son factores de trascripción claves
necesarios para los eventos tempranos en la activación de linfocitos T mediados por
antigenos y la producción de IL-2 (DiSepio et al, 1999; Asadullah et al, 2002). El FK506
(Tacrolimus, Prograf), es otro inmusupresivo con mecanismo de acción similar a la
ciclosporina. Este bloquea la producción de IL-2 y la activación de linfocitos T inhibiendo la
acción del factor de transcripción NF-AT (DiSepio et al, 1999; Asaduliah et al, 2002).
En un estudio se evaluó la habilidad de linfocitos T de la lesión y de sangre periférica de
producir IFN-y, TNF-a, IL-2, IL-4 e IL-10 intracelularmente y fueron detectadas por
citometría de flujo. La síntesis de citocinas fue inducida por activación con PMA/ionomicina
(en presencia de Brefeldina A, la cual inhibe la exocitosis de éstas citocinas). Después de
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la estimulación, se encontraron altos porcentajes de linfocitos T CD8 y CD4 epidérmicos
capaces de producir IFN-y, TNF-a e IL-2; mientras que pocos linfocitos T < 11%
expresaron IL-4 e IL-10. Tanto linfocitos T CD8' como T CD4' fueron capaces de
desempeñar funciones efectoras tipo 1 (TJ y THl, respectivamente). Este estudio revela
una diferenciación tipo 1 tanto en areas lesionadas como en sangre periférica, lo cual
podría indicar un desequilibrio dentro de la población de linfocitos T, lo cual contribuye a
sostener la activación inrnunológica de linfocitos T encontrada en esta enfermedad (Austin
etal, 1999).
Para determinar el perfil de citocinas que exhiben los linfocitos T en un placa psoriasica,
se obtuvieron clonas de linfocitos T de biopsias epidérmicas, del los cuales el 74% eran
CD4+, mientras que un 25% era CD8' y 1% fueron CD4-/CD8-. El IFN-)I fue la citocina
mayormente liberada. Para corroborar estos datos con la situación in vivo, se investigaron
biopsias de piel lesionada de cinco pacientes para detectar la expresión por RT-PCR del
mRNA de la IL-4, IL-IO e IFN-y. Solamente el mRNA de las citocina tipo T H l (IFN-y), y no
la de los linfocitos TH2 (IL-4 e IL-10) se detectaron (Schlaak et al, 1994). También se han
encontrado en las placas psoriasicas la expresión de IL-2, IL-12 (Yawalkar et al, 1998) e
. IFN-5, (Szabo et al, 1998) asociado con niveles incrementadoc de TNF-a (Asadullah et ai,
2002). Se ha postulado que el switch del perfil de citocinas predominante de THl a TH2 en
la psoriasis puede ser benéfico. La terapia con IL-10, una citocina TH2, resulta en una
restauración relativa del balance de citocinas y un mejoramiento clínico en la psoriasis
(Kirby y Griffiths, 2001; Yawalkar et al, 1998). La IL-10 promueve el desarrollo de un
patrón de citocinas tipo 2, por que inhibe en linfocitos T y NK la producción de IFN-y,
mediante la supresión de la síntesis de IL-2 en células accesorias (Asadullah et al, 1998;
Fickenscher et af, 2002). La participación de otras citocinas proinflamatorias como IL-1, IL- 6, IL-8 y TNF-a han sido demostrados en la psoriasis.
Resultados recientes han demostrado el papel que tiene la IL-20 en la función
epidérmica y en la psoriasis. La IL-20 es una reciente citocina identificada por análisis
bioinformatico. La primera evidencia del papel de la IL-20 en la psoriasis es la
hiperqueratosis y la proliferación de la capa- suprabasal que presentan los ratones
transgénicos para gen de la IL-20. Estas anormalidades de los ratones transgénicos son
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semejantes a las anormalidades psoriásicas humanas. Los cambids detectados en la
expresión de proteínas epidérmica en ratones transgénicos IL-20, que son similares a la
psoriasis humana incluyen: la presencia de K5 y K14 tanto en la capa basal como en la
su'prabasal e hiperproliferación asociada a K6. Sin embargo en la piel afectada de estos
ratones no se encontró infiltrado de linfocitos los cual es caracterktico de la psoriasis
humana (Blumberg et al, 2001; Fickenscher et al, 2002; Gniadecki, 1998).
Nickoloff propone a las citocinas y a varios pares de moléculas ligando-receptor que
promueven el contacto célula-célula y la transducción de señales, como blancos
potenciales para el tratamiento de la psoriasis. Entre estos se incluyen el LFA-1 (antígeno
funcional linfocítico 1, también conocido como CDlla-CD18) e ICAM-1 (molécula de
adhesión intracelular también conocido como CD54) (Nickoloff 1998). Entonces diversos
tipos celulares, incluyendo los linfocitos T, células presentadoras de antígeno (CPAs) y
queratinocitos se cree que están involucradas en la inmunopatogénesis de la psoriasis
(James Krueger, Rockefeller University, New York, NY, USA).
Existen diversas moléculas asociadas a la activación de linfocitos, la molécula empleada
en este trabajo fue CD69. El CD69 humano es un homodímero de superficie formado por
la asociación de dos cadenas de 28 y 32 kDa, las cuales están sostenidas por puente
disulfuro. CD69 es una proteína integral de membrana tipo I1 con un solo dominio
transmembranal. El gen murino muestra un 58% de identidad con su contraparte humana,
con la homologfa extensible en toda la longitud de la secuencia codificante (Testi et al,
1994; PROW 1999). CD69 es uno de los antígenos específicos tempranos adquiridos
durante la activación de linfoide, actúa como un receptor transductor de señales
involucrado en los eventos de activación celular, que incluyen proliferación e inducción de
genes especificos. CD69 pertenece a una familia de receptores que modulan la respuesta
inmune y de genes que están agrupados en el complejo de genes de células natural killer
(NKC). La porción extracelular de estos receptores representan una subfamilia de dominios
tipo lectina tipo-C (CTLDs), los cuales son divergentes de las lectinas tipo-C verdaderas y
son referidos como dominios de células NK (NKDs) (Llera et al, 2001; Weis et al, 1998). La
estructura tridimensional del CD69 revela similitud con los receptores NK CD94 y Ly49A.,
cuyas estructuras han sido recientemente determinadas (Boyington et al, 1999). Al
parecer al CD69 le faltan ocho de nueve sitios conservados
en MBP (proteína de unión a manosa; una lectina tipo-C
2000)
de unión a Ca” encontrados
verdadera) (Natarajan et al,
CD69 se encuentra en la superficie de la mayoría de los linajes hematopoyéticos. Es uno
de los marcadores de activación temprana en linfocitos T y 6, células NK, macrófagos,
neutrófilos y eosinófilos. Además, se expresa constitutivamente en monocitos, plaquetas,
células de Langerhans y un pequeño porcentaje de linfocitos residentes en timo y tejidos
linfoides secundarios. Se ha sugerido que el CD69 esta involucrado en el proceso de
selección y maduración durante la migración de timocitos a la medula (Nakayama et al,
2002). CD69 también esta presente en precursores de linfocitos B en la médula Ósea, y
estudios recientes con ratones deficientes de CD69 revelaron su papel modulador en el
desarrollo de iinfocitos 6 y síntesis de anticuerpos (Llera et al, 2001).
Diversas moléculas asociadas a la activación de linfocitos se han observado por
inmunohistoquímica en piel lesionada con psoriasis vulgaris. En un estudio hecho por
citometría de flujo se encontró que los linfocitos T de la epidermis de pacientes con
psoriasis expresan las moléculas HLA-DR (86%), CD69 (59%), CD25 (55%), CD122 (44%)
y CD28 (91%) . Los linfocitos T de la dermis mostraron porcentajes similares excepto por
el CD69 que se encontró en un 17%. La molécula CD69 se encontró directamente en
biopsias de piel lesionada por inmunohistoquímica. La poblaciones de CD4 como de CD8
de la piel lesionada eran CD25’; con activación de CD8 en la epidermis y activación de
CD4 en la dermis. Los resultados muestran que la mayoría de los linfocitos que se
encuentran en la lesión están activados. Así, la mayoría de linfocitos en la lesión
expresaron los tres marcadores de activación, mientras que los linfocitos T de sangre
psoriásica se distinguió por un incremento en CD25, específicamente dentro de la
población linfocitos T CD8 (Ferenczi et al, 2000).
Brian Nickoloff ha creado un modelo animal quimérico para estudiar la inmunogenética
de la psoriasis. Este modelo consiste en realizar injertos piel humana en la piel de ratones
con inmunodeficiencia severa combinada (SCID). Los estudios hechos en estos ratones ha
revelado que cuando se inyectan líneas de linfocitos T CD4+ altamente purificados de
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los injertos tratados con linfocitos, reveló qlie
también tienen antígenos de supeficie
receptores inhibidores killer (KIRs) y receptores
presentes. Estos linfocitos T CD8+-NK
moléculas MHC clase I, los cuales están
Gilhar et al, 1997 empleando este modelo observa que los linfocitos T de
piel lesionada son importantes en el placa psoriasica; atribuye este
fenómeno a la presencia de contrasta con los resultados
obtenidos por el equipo de que superantigenos derivados
de bacterias son que facilitan la conversión de
piel normal en Gilhar et al, 1997
sugiere que pero no permite
de la psoriasis.
tanto exógenos
del MCH y
los linfocitos T-NK [linfocitos T CD8' que
ceular característicos de las NK, tales como
activadores killer (KARs)] también están
pLeden interactuar directamente con varias
expresadas en las células epidermales. Entonces,
interactúen mediante sus KIRs o sus KAKs coil
predisponen a la psoriasis (como HLA-Cw6).
inmunidad innata, simultáneamente podría
(por ejemplo, la posesión del alelo HLA-Cw6)
ningún antigen0 extraño o nativo importarte
activación (Nickoloff 1998; Nickoloff y Wrone-Smith,
varios antígenos del MHC clase I, los cuales
Esta teoría, la cual enfatiza el papel de la
licar la susceptibilidad genética de la psoriasis
con la inmunología de la psoriasis en la cual
es requerido para el paso final de la
1999).
autoantígenos) tienen un papel relevante en la respuesL4 de linfocitos T (Nickoloff y
Wrone-Smith 1998).
Por otro lado se han identificado diversos receptores para los alelos de la clase I del
MHC, los cuales pueden activar o inhibir células NK o T-NK. Uno de ellos es el CD94 el cual
puede reconocer señales de péptidos clase I presentados en el contexto del HLA-E.
Recientemente, Nickoloff reporta la presencia de linfocitos T que expresan CD94, CD158a
y CD158b en las placas psoriásicas. Esto indica que estas células podrían participar como
linfocitos patogénicos o reguladores en la psoriasis (Nickoloff, 1999 a y b).
Existen otras moléculas homologas a las moléculas de clase I del MHC, que no
codificadas en el cromosoma 6, que recientemente se ha asociado con la psoriasis. Una de
estas, es el antígeno CDld (codificada en el cromosoma 1), la cual se expresa
normalmente en los queratinocitos de la piel sana pero se ha encontrado sobreexpresado
en los queratinocitos de las placas psoriasicas. Se ha visto que el IFN-y induce la
expresión de CDld en queratinocitos (Bonish et al, 2000). Nickoloff en 1999 postula, que
los linfocitos T-NK CD161' que se ha visto que están también presentes en las lesiones
psoriásicas podrían reconocer glicolípidos derivados de la epidermis, (incluyendo
ceramidas que contienen estos glicolípidos) presentados en la molécula CDld. En otro
estudio realizado por el grupo investigadores encabezado por Nicokoloff, se trabajaron con
clonas de linfocitos T CD94+/CD161+ obtenidas de pacientes psoriásicos, las cuales se
establecieron con superantigenos e IL-2. Cuando incubaron estos linfocitos T con
queratinocitos CDld', encontraron altos niveles de IFN-y e IL-13. Esta producclón de
citocinas se pudo inhibir con un anticuerpo dirigido a la molécula CDld. A demás cuando
estas clonas se inyectaron en un injerto de piel sana de ratones SCIC" se formo una placa
psoriasica, con queratinocitos epidérmicos que expresaron CDld los cuales estaban
infiltrado por linfocitos T CD161+. Estos hallazgos in vivo demostraron que esta clonas
celulares de T, podrían ser patogénica por la creación de una placa psoriasica. Los resultados in vitro soportan un papel patofisiológico de la interacción entre linfocitos T que
expresan NKRs y queratinocitos CDld+, con la subsiguiente producción de 1FN-y. Después
de la inyección in vivo, el perfil de citocinas producidas, estaba caracterizado por la
respuesta inmunológica polarizada hacia T H ~ mas que T H ~ . (Nickoloff et al, 2000).
Antígenos asociados en la patogénesis de la psoriasis.
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La naturaleza del antígeno responsable de la producción de los eventos inmunológicos
eh la psoriasis ha dado pie a diversas líneas de investigación. Una de ellas involucra
examinar la distribución de varios receptores de linfocitos T en la sangre y piel de
pacientes psoriásicos. Otras líneas han tratado de identificar el antígeno específico (tanto
exógeno como endógeno) en pacientes con psoriasis que podrían activar el sistema
inmune con la creación de linfocitos T patogénicos. Ambos factores activadores de
linfocitos T infecciosos y no infecciosos han sugerido como candidatos de factores
desencadenantes a: retrovirus (virus de inmunodeficiencia adquirida i)[ superantígenos
derivados de bacterias, proteína M estreptocócica y homólogos de queratinas derivados de
peptidos, neuropéptidos tales como la sustancia P y papiloma virus humano (Nickoloff,
1999).
Se ha propuesto que cierta secuencia de aminoácidos que la queratina tienen en común
con la proteína M es el principal blanco de linfocitos T autoreactivos en la psoriasis. Un
ejemplo de esto, es la K17 que comparte la secuencia ALEEAN con la proteína M
(Gudmundsdottir et al, 1999).
Tres líneas principales de investigación indican que la activación de linfocitos tanto
policlonal como oligoclonal contribuyen en el inicio y persistencia de la psoriasis. Estudias
en pacientes con psoriasis guttata han implicado al superantígeno exotoxina
estreptocócica pirogénica tipo C(SPEC) en el inicio de las lesiones de PG por un
superantígeno policlonal que dirige la expansión de linfocitos VB2. En contraste, los linfocitos T CD8' intraepidérmicos encontrados en placas psoriasicas crónicas muestran
una expansión oligoclonal VB consistente con la estimulación de antígeno clásica. Se ha
visto que la activación de leucocitos de sangre periférica de pacientes psoriásicos por el
superantígeno enterotoxina B estafilocócica (SEB) e IL-2 es suficiente para iniciar las
lesiones psoriásicas en ratones SCID (Norris et al, 1997).
Mas sin embargo, dos líneas de investigación demostraron que linfocitos de sangre
periférica de pacientes psoriásicos hiporespondieron a SAgs estreptocócicos y la presencia
de inhibidores séricos que inhiben específicamente la respuesta celular de T a los SAgs en
los pacientes psoriasicos. Por lo que, en el primer caso, sugieren un papel patológico de la
infección estreptocócica en la patogénesis de la psoriasis y en el segundo caso, que los
SAgs liberados de una infección de S. pyogenesfocal induce una activación transitoria de
linfocitos T relevantes, que lleva al desarrollo de una erupción de la piel y
subsecuentemente, a una anergia temporal de linfocitos T hacia estas toxinas (Horiuchi et
, al, 1998; Tokura eta4 1999).
Las proteínas de choque térmico (HSPs), las cuales están expresadas constitutivamente
en todas las células, son esenciales para diversos procesos celulares, tales como
plegamiento de Proteínas, protección de proteínas de la desnaturalización o agregación, y
facilitación del transporte de a través de los canales de la membrana. Una amplia variedad
de estímulos estresantes tales como el choque térmico, radiación ultravioleta e infecciones
bacterianas o virales, inducen un incremento en la síntesis intracelular de las HSPs (Wallin
et al, 2002). En nuestro equipo de investigación se han llevado a cabo diversos estudios
que indican que las proteínas de choque térmico del Streptococcus pyogenes pueden ser
antígenos iinmunodominantes de la bacteria para los pacientes psoriasicos.
Villeda-Gabriel e t al en 1998 empleando inmunofluorescencia indirecta, reportaron que
la piel de los enfermos con psoriasis es reconocida por un suero de conejo anti- S. pyogenes, mientras que esta reacción es negativa en el caso de la piel de los sujetos
sanos. Por otro lado, Pérez-Lorenzo e t al en 1998 reportaron que en el suero de los pacientes con psoriasis existen autoanticuerpos que reconocen la piel lesionada de los pacientes psoriásicos y no la piel sana de los mismos. Además estos autoanticuerpos
presentes en los sueros de estos pacientes perdieron la reactividad hacia los antígenos de
la piel cuando estos fueron inmunoabsorbidos con un extracto proteico total de S. pyogenes. Recientemente en el 2001, Sánchez-Huerta encontró que estos autoanticuerpos
también pueden ser inmunoabsorbidos con la HSP60 del S. pyogenes. Estos resultados
indican que una posible reacción cruza entre los antígenos de la piel psoriásica y la HSP60
del S. pyogenes.
Por otro lado mediante inmunoelectrotransferencia ( I n ) y ELISA se encontró que en los sueros de los pacientes con psoriasis están presentes altos títulos de anticuerpos que
reconocen las fracciones proteícas de 14, 60 y 70 kDa de S. pyogenes (Ortiz-Quintero,
1997; Villeda-Gabriel et al 1998). Éstas fracciones coincidían en peso molecular con las
proteínas de choque térmico del Streptococcus pyogenes las cuales se indujeron con
ch’oque térmico a 45OC (Ortiz-Quintero, 1997).
Con base a lo anterior, Ruiz-González et al 2000 trabajó con la HSP60 del S. pyogenes
recombinante (rHSP6OSp) y encontró que los pacientes con psoriasis en placa presentan
en sus sueros altos título de anticuerpos de la clase IgG que reconocen a esta proteína.
Ramírez-Reséndiz en el 2001, trabajo con la HSP70 del S. pyogenes recombinante, pero
no encontró ninguna relación.
Con base a los resultados obtenidos por Ruiz-González, Sánchez-Becerra (tesis de
maestría en revisión) trunca por PCR el gen que codifica a la HSPGO de S. pyogenes y
obtiene 4 polipéptidos recombinantes de esta proteína con peso molecular de 25, 29, 38 y
46 KDa respectivamente. En estos polipéptidos se eliminaron sitios antigenicos para
células B y células T los cuales fueron detectados teóricamente por dos diferentes
programas de computación. El programa para epitopos de B se basa en los sitios mas
hidrofílicos de la proteína y el programa para epitopos de T se basa en el afinidad que
tienen los péptidos de la proteína para unirse con la molécula HLA-Cw6 el cual esta mas
asociado con la psoriasis. Cuando se trabajo con los polipéptidos antes mencionados y los
sueros de pacientes psoriásicos con alta respuesta hacia la rHSP60Sp se encontró que la
región carboxilo-terminal 415-543 y la región amino-terminal 1-224 de la HSP60Sp son las
regiones más reconocidas por los anticuerpos de los pacientes psoriásicos.
Por último Perez-Lorenzo et al, 2000 estudió la respuesta celular (mediante el método
de incorporación de timidina tritiada) a las proteínas de choque térmico de 60 y 70 kDa de
Streptococcus pyogenes recombinante en pacientes psoriasicos y en sujetos sanos. En
este trabajo también trabajo con extractos solubles totales de Streptococcus pyogenes
antes y después de la inducción de choque térmico (EST37Sp y ESr42Cp,
respectivamente). Cuando midió la respuesta linfoproliferativa con ambos extractos
obtiene respuesta mayores que a respuesta obtenida con la PHA tanto en el grupo de
pacientes como en el grupo de sujetos sanos. AI emplear ambas proteínas de choque
térmico recombinantes observó que la respuesta linfoproliferativa de los pacientes con
I
1
t -
i
L
psoriasis hacia la rHSP70Sp tiene una tendencia a ser mayor que la respuesta de los
sujetos sanos. No se encontró una diferencia en la respuesta hacia la rHSP60Sp entre los
pacientes y los sujetos sanos.
V. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Estudiar la respuesta inmune celular en pacientes con psoriasis hacia los polipéptidos recornbinantes de la HSPGOSp para determinar las región(es) antigenica(s) de la proteína de choque térmico de 60 kDa de Streptococcus pyogenes recombinante (rHSP6OSp).
OB J ETlVOS PARTICU LARES:
Expresar y purificar los plipéptidos y rHSP6O recombinantes.
Determinar las su bpoblaciones de linfocitos T que responden hacia proteínas recombinantes por citometría de flujo tanto en pacientes psoriásicos como en sujetos sanos.
I VI. MATERIAL Y MÉTODOS
A. MUESTRAS BIOLÓGICAS
Se estudiaron fO pacientes con diagnóstico clínico de psoriasis en placa sin tratamiento
sistémico y 10 sujetos sanos como grupo testigo. Todos los pacientes presentaron en el momento de tomar la muestra actividad clínica con un PAS1 mayor de 5. Estos pacientes
se diagnosticaron en la Clínica de Psoriasis de la consulta externa del Servicio de
Dermatología del Hospital General de México, SSA. Se excluyeron del estudio a pacientes
menores de edad, enfermos con otra variedad de psoriasis, pacientes con psoriasis
controlada (PAS1 menor de 5), pacientes bajo tratamiento con inmunosupresores,
pacientes con presencia de alguna enfermedad de etiología estreptocócica (impétigo,
erisipela, etc.).
Tanto a los pacientes como a los testigos se les tomó una muestra de 10 mL de sangre
heparinizada por punción venosa bajo un consentimiento informado por escrito.
B. GENES Y PLÁ5MIDOS UTILIZADOS:
Las proteínas recombinantes se obtuvieron a partir de los genes respectivos clonados
en el sistema del plásmido pPROEX-HT (Life Technology).
El gen hsp6OSp que codifica para la HSP60Sp fue clonado en el fago lambda M49 a
partir de una biblioteca genómica de S. pyogenes por el Dr. Andreas Podbielski (Inst. Med.
Mikrobiol., FDR). Posteriormente este gen (que se encontraba en un fragmento de DNA de
aproximadamente 1650 pb) se subclonó por PCR, por el mismo autor; en el sistema de
expresión del vector pMALc-2 de 6646 pb de New England t?io/abs. A partir del plasmido
pMALc-Z;;hsp60Sp donado por el Dr. Podbielski, el gen hsp60Sp se subclonó por segunda
vez en el vector pPROEX-Hta por Ruiz-González, 2000. Este nuevo plásmido se le dio el
nombre de pHSP6OSP.
Con el plasmido pHSP6OSp Sanchez-Becerra (tesis de maestría en revisión) obtuvo por
PCR cuatro truncamientos del gen hsp6OSp, los cuales codifican para cuatro polipéptidos
recombinantes de esta proteína. El truncamiento de la proteína se realizo por el lado
carboxilo terminal de la proteína. Las características de los cuatro poiipéptidos se
describen en la figura I .
C. INDUCCIÓN DE LAS PROTEíNA.5 h-COMBINANTES
I
I
i
Los plasmidos con los genes antes mencionados se emplearon para transformar a una
cepa de Escherichia coliXL-1 Blue, las cuales se trataron con cloruro de calcio 0.1 M, para
pasarlas en estado de competencia para adquirir el plásmido. La transformación
bacteriana se realizó a 4OC durante 30 minutos en un baño de hielo. Posteriormente se dio
un choque térmico a 90 s a 42OC. Las bacterias transformadas se sembraron en placas de
agar LB con ampicilina (50 pg/ml), y se incubaron a 37OC durante 24 horas.
Cada una de las colonias que contenían al plásmido recombinante, se paso con la ayuda
de un palillo de madera estéril a un tubo con 5.00 ml de medio líquido LB con ampicilina a
una concentración final de 50 pg/ml y se incubó en agitación a 37OC durante 12 horas.
Este cultivo sirvió para inocular un matraz con 100 ml de medio LB con ampicilina a la
misma concentración. Este cultivo se incubó a 37OC en agitación constante durante el tiempo necesario para alcanzar una absorbencia de 0.4 a 0.6 a 640 nn-i. Con la finalidad
de inducir la expresión de los genes de las proteínas recombinantes, se agregó IPTG
(Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside, Research Organics Inc.), a una concentración final
de 0.6 mM y se incubó en agitación durante 4 h más a 37'C.
Las bacterias se cosecharon por centrifugación a 5000 rpm por 10 minutos y se desechó
el sobrenadante, obteniéndoce así el paquete celular. Una alícuota de 1.00 ml de cultivo
se analizó en PAGE-SDS-ME al 12.5% para corroborar la inducción de la proteína
recombinante.
D. PURIFICACIÓN DE LAS PROTEíNAS RECOMBINANTES
La purificación de las proteínas y polipéptidos recombinantes se realizó de acuerdo a las
recomendaciones del proveedor de la resina Ni-NTA (QIAGEN). El sistema de expresión
procariótico pPROEX-HT de Life Technology utilizado en este estudio, presenta la
característica de expresar la proteína recombinante fusionada a una secuencia de 6
histidinas las cuales presentan una fuerte afinidad a una resina matriz de níquel, por lo
I
que se utilizó este sistema para la purificación de las proteínas y polipéptidos
recombinantes.
Una vez que se comprobó la inducción de las proteínas y de los polipéptidos
recombinantes, el paquete bacteriano se resuspendió en 4.00 ml de regulador de lisis
(NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, PMSF lmM,
pH 8.0 - 8.5) y se sonicó a 180 W en un baño de hielo, durante 30 minutos a intervalos
de 5 minutos de reposo y un minuto de sonicado con pulsos. Los restos celulares se
eliminaron por centrifugación a 5000 rpm a 4OC durante 20 minutos. El sobrenadante rico
en proteínas recombinantes se mezcló con la resina (Ni-NTA agarose, QIAGEJV), la cual se
lavo previamente con regulador de lisis.
La mezcla se incubo en un baño de hielo durante 1 h en agitación constante. La mezcla
se empleó para cargar una jeringa de 3 mL, que funciono como una columna. Las
proteínas que no interaccionaron con la resina se eliminaron en el efluente al vaciar la
mezcla en la columna. Posteriormente se llevaron a cabo los lavados con 8.00 - 10.00 ml
de regulador de lavado (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, 2-
mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol, pH 8.0 - 8.5), para la eliminación de las proteínas
que no se unieron a la resina. Para eluir la proteína recombinante correspondiente se
utilizaron fracciones de 500 pL de regulador de elución (NaH2P04 50 mM, NaCl 300 mM,
Imidazol 250 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, 10% de glicerol, pH 8.0 - 8.5). La presencia
de proteínas en las fracciones recuperadas durante la lisis, el lavado y la elusión se
analizaron en PAGE-CDS-ME al 12.5% y se cuantificó la concentración de las mismas por
el método de Bradford (1976).
E. ENSAYO DE ACTIVACIÓN CELULAR DETERMINADO POR LA WPRESIÓN TEMPRANA DEL MARCADOR CD69 DETECTADA POR CITOMETRíA DE FLUJO.
Los ensayos de activación celular, se realizaron en tubos estériles de 5.00 mL con
tapón, marca Falcon - Becton-Dickinson. Para esto, 500 pL de sangre heparinizada de
cada pacientes se incubo con el antígeno correspondiente. Para la rHSP60Sp se utilizo 1
I
119. Para todos los polipeptidos recombinantes de la HSPGOSp (46, 38, 29 y 25 kDa), se
utilizo 1.57xlO-" mol. Un tubo que contenía solamente 500 pL de sangre, se utilizo como
testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó un tubo con 500 pL de sangre
heparinizada y 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Todos los tubos se incubaron durante 8
horas a 37OC en atmósfera de COZ al 5%. Para determinar la población de Iinfocitos T
CD4' y CD8' activadas, de cada tubo se tomaron una alícuota de 60 pL, para teñir las
células con 5 pL de cada uno de los reactivos que a continuación se describen. Estos
reactivos eran una mezcla comercial de anticuerpos monoclonales, los cuales tenían
acoplado diferentes fluorocromos (Becton-Dickinson). El reactivo 1 (Rl) estaba formado
por IgGl de ratón - FITC / IgGl de ratón - PE / anti - CD3 - PerCP (testigos de isotipo).
El reactivo 2 (R2) presentaba las mezcla de anti - CD4 - FlTC / anti - CD69 - PE / anti - CD3 PerCP, el reactivo 3 (R3) consistía en anti - CD8- FITC / anti - CD69 - PE / anti - CD3 PerCP.
Estas mezclas se agitaron en vórtex 5 segundos y se incubaron durante 20 - 30 minutos
a temperatura ambiente y en la oscuridad. Transcurrido este tiempo a cada tubo se le
adicionó 1.5 ml de solución de lisis (FACS Lysing solution, Becton-Dickinson) y se agitaron
en vórtex 5 segundos y se incubaron 20 - 30 minutos a temperatura ambiente y en la
oscuridad. Después se centrífugo a 2000 rpm durante 5 minutos a 4OC, se decantó en un
tiempo y a cada tubo se le agregó 2.00 mL de solución salina FACS-Flow (Becton-
Dickinson), se agitaron los tubos en vórtex 5 segundos y se centrifugaron a 2000 rpm
durante 5 minutos a 4OC, se decanta en un solo tiempo y las células se fijaron con una
solución de pformaldehído al 0.5%. Todas las muestras se adquirieron con 5000 eventos
en la ventana de células T CD3' en el canal F U y se analizaron en el programa Celiquest
para tres colores del citómetro FACSCalibur (Becton-Dickinson), Los resultados se
expresan como porcentaje de células TCD4' y TCD8' que expresan el marcador temprano
de activación CD69.
F. ANAL1515 ESTADfSTlCO
Se determinaron las medianas de los datos obtenidos en las diferentes determinaciones
utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.
La prueba U de Mann-Whitney se empleó para determinar sí existía diferencia estadística entre los dos grupos de sujetos que se manejaron: sujetos sanos y pacientes .
psoriacicos utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.
La prueba de Friedman se empleó para analizar la diferencia estadística entre sujetos
del mismo grupo, ya sea el grupo de sujetos canos o el grupo de pacientes pcoriásicos
utilizando el programa Sigma Stat versión 2.03.
Para la realización de las gráficas se empleó el programa Sigma Plot versión 5.0.
I
t
t
1. >
I.
Actividades realizadas
Expresar y purificar las proteínas recombuinantes (rHSP).
Cuantificación de las r”SP purificadas.
Extracción muestras de sangre de pacientes psoriacicos y sujetos sanos.
Uso del citometro de flujo para medir las poblaciones de linfocitos CD4+ y CD8+
Objetivos y metas alcanzados
Los resultados obtenidos en base a los experimentos realizados sirvieron para analizar la
relación que existe entre las proteínas (rHSP) relacionadas con la enfermedad, los cuales
fueron muy favorables para acercarnos un poco mas y poder descifrar si hay alguna
relación fuerte que nos indique si es la posible causa o un factor desencadenante
involucrdo en la psoriasis. Por ello se puede decir que las metas y objetivos fueron
satisfactorios.
. ..
I. ! I .
;21
I. I
Polipéptido de 25 kDa V S 1 ; I Q 21 I L ? L L E S V L I C
T ?: F P L L Z I H D I? V D G E A L P T L
t
IV. RESULTADOS
F. INDUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEíNe RECOMBINANTES DE LAS
PROTEíNE RECOMBINANTES .
Como el objetivo general de este trabajo fue el de estudiar la activación de los linfocitos
T de los pacientes con psoriasis frente a los polipéptidos y HSP60Sp recombinantes,
entonces fue necesario la obtención de estas proteínas. Para esto se realizo la inducción
de la síntesis (con IPTG) de estas proteínas en las cepas de E. colidonde se encontraban
los genes clonados en los plásmidos correspondientes. Una vez comprobada la inducción
de las proteínas y polipéptidos recombinantes, se procedió a su purificación mediante la
columna Ni-NTA (QIAGEN). En la figura 2 se muestra el análisis de pureza de las proteínas
recombinantes en una PAGE-SDS al 12.5%.
G. ESTANDARIZACIÓN DEL ENSAYO DE ACTIVACIÓN CELULAR DETERMINADO
POR LA WPRESIÓN TEMPRANA DEL MARCADOR CD69 DETECTADA POR
CITOMETRíA DE FLUJO
Para determinar la activación de los linfocitos T por los polipéptidos y la HSP6OSp
recombinantes obtenidas en este trabajo, primero se realizó una curva dosis respuesta con
sangre heparinizada de tres sujetos sanos, para encontrar la concentración Óptima de HSP
a utilizar. Para esto se emplearon 6 concentraciones de la rHSP60Sp (2.0, 1.0, 0.50,
0.250, 0.125 y 0.060 pg) y 8 horas de activación. No se observo ninguna diferencia
significativa en los porcentajes de linfocitos T activados, a las concentraciones de 2, 1, 0.5
y 0.250 pg de la proteína (p>0.05) pero este porcentaje bajo a las concentraciones de
0.125 y 0.060pg. Con base a lo anterior, se tomó la decisión de emplear la concentración
de 1 pg de proteína, ya que esta es la concentración que se ha utilizado en otros estudios
hechos en nuestro laboratorio. Posteriormente se procedió a determinar el tiempo Óptimo
de incubación con la sangre de otros 3 sujetos sanos. Se probaron dos tiempos, 8 y 12
horas de incubación (con l p g de antígeno). El tiempo Óptimo resulto ser el de 8 horas,
60 kDa 40 kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 f T
25 kDa
figura 2. Análisis de pureza de las proteinas recombinantes en PAGE-SDS al 12.5%. Carril
I y 10 marcadores de peso molecular; carril 2 rHSP70Sp; carril 3 rHSP60Sp; carril 4
polipéptido 414 (46 kDa); carril 5 polipéptido 349 (38 kDa), carril 6 polipéptido 262 (29
kDa); carril 7 polipéptido 224 (25 kDa); carril 8 rHSP60Ec y carril 9 CAT (Cloranfenicol
acetil transferasa, proteína testigo 0 del equipo de reactivos de purificación de QDiGEN).
I
I
Activacibn de Iinfocitos T CD4' de pacientes con psoriasis y sujetos sano5 frente a las
HSP obtenidas.
I Los resultados de activación de los linfocitos T CD4' de los pacientes con psoriasis y
sujetos sanos frente a las proteínas de HSP obtenidas, se muestran en las tablas 1 y 2
respectivamente. Estos resultados están ordenados en forma descendiente con respecto a
los valores del porcentaje de linfocitoc T CD4' de pacientes y sujetos sanos que se
linfocitos T CD4' activados frente a la fitohemaglutinina (testigo de activación) y la
mayoría de estas células no se activaron cuando se dejaron sin ningún estímulo antigenic0
(testigo negativo). Si consideramos como una activación positiva a los porcentajes de
linfocitos T CD4+CD69' arriba del 1%, entonces se puede decir que todas las muestras de
pacientes y sujetos sanos estudiadas presentaron linfocitos T CD4' que se activaron frente
a todas las proteínas completas estudiadas, pero en diferentes proporciones. Con base a
estos resultados se puede decir que existe un grupo de personas (pacientes o sujetos
sanos) que tiene un mayor número de linfocitos que pueden activarse con la HSP y otro
grupo con un número menor de estas células. Sin embargo el porcentaje promedio de
linfocitos T CD4' de pacientes con psoriasis que se activaron con la rHSP60Sp es
ligeramente mayor que el porcentaje de los sujetos sanos (Tablas 1 y 2, Figura 4), pero
esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p>0.05).
i
I activaron frente a la rHSP60Sp. Todas las muestras presentaron un alto porcentaje de
Cuando se trabajo con los polipéptidos de la HSPGOSp se observó que los porcentajes
de linfocitos T CD4" de los pacientes que se activaron con estos polipéptido disminuyeron
con respecto a los valores obtenidos con la proteína completa (p<0.05) (Tabla 1).
Similares resultados se observaron en los sujetos sanos (p<0.05) (Tabla 2). Si analizamos
la activación de estas células con mayor detalle de cada polipéptido, podemos observar
que el porcentaje promedio de activación de linfocitos T CD4' de pacientes frente al
polipéptido de 46 kDa bajo -50% con respecto a la activación promedio obtenida con la
proteína completa (p>0.05). Con el polipeptido de 38 kDa la activación obtenida fue muy
similar al polipéptido de 46 kDa, pero si hubo diferencia significativa (p<0.05). Con el
polipeptido de 29 kDa la respuesta tje la mayoría de los pacientes disminución
drasticamente -80% y en todos los sujetos sanos el porcentaje de linfocitos T CD4'
activados bajo hasta cero (los linfocitos T CD4' no se activaron). Sorprendentemente con
el polipeptido 25 kDa (el cual era el menor peso molecular), la respuesta en pacientes y
sujetos sanos se recupero hasta alcanzar valores de porcentajes en algunos casos un poco
mas altos a los obtenidos con el polipeptido de 46 kDa (ver P12,P16, P14, P l l , P13 y P06,
Tablas 1 y 2, Figura 3).
PACIENTES PSORIÁSICOS
PO5 P i 2
P16
P15
P11
PO6 P17
Pi3 P I 4
PO7
N
Mediana
Tabla 1. Porcentaje de Linfocitos T CD4+CD69+ de pacientes con psoriasis estimulados con rHSP60Sp y polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activación 8 horas.
PHA rHSP6OSp POLIPEPTIDOS (2.5 pg) (1.0 pg = ( 1 . 6 7 ~ 1 0 - ~ ~ moles)
1.67x10-" 46kDa 38kDa 29kDa 25kDa moles)
30.05 30.10 19.99 18.68 13.17 19.39
18.16 21.19 29.29 11.90 15.37 2.53
22.03 20.56 6.65 14.50 2.29 13.93
10.18 17.53 19.76 14.28 11.90 1 .O6
21.82 17.88 5.15 3.27 1.40 8.43 7.52 13.28 6.38 5.00 1.42 6.10 16.72 12.24 3.78 0.21 0.00 3.40 9.67 7.70 1.31 0.95 0.75 2.13 5.42 4.26 1.82 1.13 0.72 3.45 10.14 4.43 2.17 1.70 1.59 3.06
10 10 10 10 10 10 17.125 15.58 5.765 4.135 1.41 7.265
~~~~
Tabla 2. Porcentaje de Linfocitos T CD4+CD69+ de sujetos sanos estimulados con rHSP60Sp y polipeptidos recombinantes de la HSP6OSp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activacih se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). Tempo de activación 8 horas.
i
Mediana I 17.465 I 8.085 2.470 I 0.000 I 3.315
35 I 'g 30 -
2 5 -
o 2 0 - I-
1 5 -
n
B
e 0 1 0 - O
z $ o -
5 - -I
I
+ 30-
n 25-
o 2 0 - I-
15-
B
e z 5 -
0 1 0 - O
i $ o -
I
I
i
PHA
e pco.05
o pco.05 -c l
e
4 .~ _____
rHSP6OSp 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa
A
m
i PHA
I ~- I pcO.05 7- pcO.05 1 7 ~ ~ 0 . 0 5 I B
0 rHSP6OSp
I pcO.05 I
t + o ____ __-
46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa
Figura 3. Porcentaje de linfocitos T CD4+CD69+ de pacientes con psoriasis y sujetos sanos. Panel A: 10 Pacientes psonásicos. Panel B: 10 Sujetos sanos. Los extremos de las cajas definen los Pzs y P75 (percentiles 25 y 75, respectivamente). La línea horizontal dentro de la caja representa la mediana y las líneas verticales los Plo y Pw. Las líneas horizontales corresponden al análisis estadístico y señalan la existencia de diferencia estadísticamente significativa. A los valores representados se les restó el valor de testigo de isotipo y el valor del testigo sin estimulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina (PHA). La activación se llevó a cabo con 1.67 x 10 -11 moles de rHSP60Sp y de polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp durante 8 horas.
,
Activación de Iinfocitos T CD8' de pacientes con psoriasis y sujetos 5at-105 frente a las
HSP obtenidas.
La subpoblación de linfocitos T CD8' de los pacientes con psoriasis y de los.sujetos
sanos se comportaron muy similar a la subpoblación CD4' frente a las proteínas
estudiadas. Como se puede ver en la tabla 3 y 4 y en la figura 4, el porcentaje promedio
de los linfocitos T CD8' de pacientes con psoriasis que se activaron con la HSP6OSp es
muy similar al porcentaje promedio de los sujetos sanos (p>0.05). AI igual que con las
células CD4', los pacientes y sujetos sanos que presentaron alta activación de CD8' con la HSP60Sp también presentaron alta activación con las otros HSP. La mayoría de los pacientes y sujetos sanos que presentaron altos porcentajes de Iinfocitos T CD4' activados
por las proteínas ensayadas, también presentaron altos porcentajes de linfocitos T CD8'
activados.
El porcentaje de linfocitos T CDS' activados con los polipéptidos de 46, 38 y 29 también
disminuyeron con respecto a la respuesta abtenida can la proteína completa, en ambos
grupos de sujetos estudiados (pc0.05) (Tabla 3 y 4, Figura 4). Sin embargo, en ambos
grupos la caída de la respuesta fue de aproximadamente un 40% con el polipeptido de 46
kDa y solamente la mitad de los sujetos sanos llegaron a cero de activación con el
polipéptido de 29 kDa. El polipéptido de 25 kDa también recupero la activación de los linfocitos T CD8 positivas como se observó con los linfocitos T CD4 (Tabla 3 y 4, figura 4).
Tabla 3. Porcentaje de Linfocitos T CDS'CD69' de pacientes con psoriasis estimulados con rHSP6OSp y polipeptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se les restó el valor del testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 mg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activación 8 horas.
rHSP6OSp POLIPEPTIDOS PSORIÁSICOS (2.5 pg) (1.0 pg = (1.67xlO-" moles)
1.67x10-" 46 kDa I 38 kDa I 29 kDa I25 kDz moles)
P15 16.31 27.76 21.40 20.33 2.07 16.75
E .
Tabla 4. Porcentaje de Linfocitos T CD8+CD69+ de sujetos sanos estimulados con rHSP60Sp y polipeptidos recombinantes de la HSP60Sp. ND= No determinado. A los valores representados se lec restó el valor del testigo de icotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 mg de fitohemaglutinina (PHA). Tiempo de activaciÓn.8 horas.
SUJETOS PHA SANOS (2.5 ILg)
S16 32.09 s12 21.44 S11 14.49
rHSP60Sp POLIPEPTIDOS (1.0cLgl = ( 1 . 6 7 ~ 1 0 - ~ ~ moles) 1.67x10-” 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa moles) 29.91 10.13 11.11 0.00 7.09 18.52 11.79 12.06 5.81 20.04 18.17 6.35 7.23 1.32 8.75
i
n Mediana
i
13 13 10 10 10 10 14.265 13.345 8.330 7.010 0.705 7.475
+ m P +q 8 o I-
$ o -
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L
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35
30
25
20
15
10
5
O
7-
I m
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T
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a T
A 1
I f
I pcO.05
II
i f *
-~ ___ __- I PHA rHSP6OSp 46 kDa 38 kDa 29 kDa 25 kDa
i
peO.05 I __ B ~ peo.05
I 1 pco.05 I
o 20 T
PHA rHSP6OSp ~~
46 kDa 38 kDa
I pco.05 I
29 kDa 25 kDa
Figura 4. Porcentaje de linfocitos T CD8+CD69+ de pacientes con psoriasis y sujetos sanos. Panel A: 10 Pacientes psonásicos. Panel 8: 10 Sujetos sanos. Los extremos de las cajas definen los P25 y P75 (percentiles 25 y 75, respectivamente). La línea horizontal dentro de la caja representa la mediana y las líneas verticales los Plo y Pso. Las líneas horizontales corresponden al análisis estadístico y señalan la existencia de diferencia estadísticamente significativa. A los valores representados se les restó el valor de testigo de isotipo y el valor del testigo sin estímulo. Como testigo de activación se utilizó 2.5 pg de fitohemaglutinina(PHA). La activación se llevó a cabo con 1.67 x 10 -11 moles de rHSP60Sp y de polipéptidos recombinantes de la HSP60Sp durante 8 horas.
4 Continua
3 4 1 A N R I A L I K Q Q L E T T T S D F D R Polipéptido de 38 koa
361 L Q E R L A K L A G G V A V I K V G
381 A P T E T A L Y E M K L F . 1 E D A L N A Bolipéptido de
4 0 1 T R A A V E E 1; I V A G G G T A L I T
441 L R A L E E P ‘J R Q I A L N A G Y E G S
401 V I I D K L K I ú S P A G T G F N A A T G
4 3 i E W V D M I K T G I I C I P V K V T R C A
5ül L Q N A A S V ~ S L I Z T T E A V V A N
52 1 K P E P A A P A P A M P A G M D P G M M
5 4 1 G G F * A
Figura 1. Secuencia aminoácidas de la HSP66Sp. .Las fiechas indican el sitio del truncamiento de la HSP60Sp. En cuadros de color negro se muestran las secuencias que presentan Blta afinidad para la molécula MLA-Cw06 (Parker et&, 1994). En letras de cdor verde se muestran las dos regiones (204-211 y 419-426) que presentan una secuencia similar (THüiKXXA).
1
6 1
81
101
if 1
14 1
ií A F G S P L I T N ti G V T 1 A K E I E
L E D H F E Id M G A I.: L V C E V k S K T
E G L K N \- T A G A )I F I G I K R G I E
T A T A T $. 'u' E A L K A. i 0, Q P V S G K
E A 1 A Q V .a. A V S S R S E K V G E Y I
S E A PI E R V G N D G ' i : I T I E E S R G
M E T E L E V V E rJ PI Q F D R G Y L 3 Q
2 Q i Y p.? V T I D N E K M V A
T D K K V S ¢13
D L I Z EJ F F I L I
Polipéptido de 25 kDa 221 N I Q D I L P L L E E V L K
241 T N R P L L I I A I3 D V D G E A L P T L
Polipéptido de 29 kDa 291 V N K I R G T F !ú 1 7 V A 1.7 K A P G F G
781 D R R y\ A M L E D I A I L T G G T V I T
3 0 1 E D L G L E L K D A T M T A L G Q -4 A K
32 1 I T V D K D S T V I V E G S G S S E A I
+ Continua I
i
VII. CONCLUSIONES
i
Los Iinfocitos T CD4' y CD8' de pacientes psoriasicos y sujetos sanos se activaron en
igual proporción cuando se enfrentan con la rHSP60Sp (p>0.05).
Los linfocitos T CD4' de los pacientes psoriasicos presentaron una tendencia de mayor
activación hacia la rHSP60Sp; en los linfocitos T CD8' ,se observó una tendencia de
mayor activación de los sujetos sanos hacia la rHSP60Sp.
Se encontró que en las regiones de aminoacidos 415-543 y 262-349 de la HSP60Sp
posiblemente se localizan los epítopos para los linfocitos T; porque cuando se
eliminaron estas regiones la activación de los linfocitos T disminuyó.
En la región de aminoácidos 1-224 de la HSP6OSp se encuentra otro epítopo para los
linfocitos T, ya que la respuesta de los linfocitos T se recuperó cuando se eliminó la
región 225-543 de la proteína.
VIII. Criterios de evaluación
ConJorme al manejo de las técnicas aprendidas en la investigación aplicadas en la realización de cada experimento, así mismo en la investigación bibliográfica relacionada con la enfermedad (psoriasis).
IX. Bibliográfia
I . Arenas R. 2000. Psoriasis. En: Dermatología. Atlas, diagnóstico y tratamiento,
McGraw-Hill: Interamericana. 415-422.
2. Asadullah K., Sterry W., Stephanek K., Jasulaitis D., Leupold M., Audring H., Volk
H.D., Docke W.D. 1998. IL-10 is a key cytokine in psoriasis. J Clln Invest 101 (4):
783-791.
3. Asadullah K., Volk H-D., Sterry W. 2002. Novel immunotherapies for psoriasis.
TRENDS immunol23 (1): 47-53.
4. Austin L-M-, Ozawa M., Kikuchi T., Walters I.B., Krueger J.G. 1999. The majority of
epidermal T cells in psoriasis vulgaris lesions can produce type 1 cytokines, interferon
gamma, interleukin-2, and tumor necrosis factor-alpha, defining T c l (cytotoxic T
lymphocyte) and TH1 effector populations: a type 1 differentiation bias is also
measured in circulating blood T cells in psoriatic patients. J Invest Dermato l l l3 (5):
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FORMATO PARA SER LLENADO POR EXTERNO PARA EL PROYECTO SOCIAL.
ASESOR(ES) INTERNO Y
1. Nombre y adscripción del asesor.
M. en C. Edith Cortés Barberenci
2. La naturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es:
a) Proyecto de Servicio Social asociado a la investigación que se realiza en las áreas departamentales.
0 interno.
Externo.
n Por convenio.
b) Proyecto de Servicio Social asociado a actividades disciplinarias realizadas por el asesor.
3. Nombre del Proyecto del que deriva el Servicio Social e institución u organismo que lo avala.
Respuesta celular a polipéptidos recombinantes de la proteína de choque térmico de 60 kDa streptococcus pyogenes (hsp6Osp) en pacientes con psoriasis.
I
I
I
I
t.
t
L
L
I,
4.Justificar la vinculación del asesor con el Proyecto de Servicio Social.
El asesor dirige la línea de investigación , así como las técnicas en el proyecto de investigación para el Servicio Social.
5. Desglosar las actividades que desarrollara el asesor para dirigir el Servicio Social.
Explicación de cada técnica aplicada en el proyecto. Revisión de cada etapa del trabajo experimental Aclaración de dudas con respecto a la línea de investigación. Revisión del trabajo escrito a entregar.
6. Nombre y Firma del Asesor.
Ed it h Corté s$3 a r b e re n a
I
FORMATO PARA SER EXTERNO PARA EL PROYECTO SOCIAL.
ASESOR(ES) INTERNO Y
- 1. Nombre y adscripción del asesor.
Dra. Maria Lilia Domínguez López
2. La naturaleza del Proyecto del que procede el Servicio Social es:
a) Proyecto de Servicio Social asociado a la investigación que se realiza en las áreas departamentales.
0 interno.
Externo.
0 Por convenio.
b) Proyecto de Servicio Social asociado a actividades disciplinarias realizadas por el asesor.
3. Nombre del Proyecto del que deriva el Servicio Social e institución u organismo que lo avala.
Respuesta célular a polipéptidos recombinantes de la proteína de choque térmico de 60 kDa sfrepfococcus pyogenes (hsp60sp) en pacientes con soriasis.
4.Justificar la vinculación del asesor con el Proyecto de Servicio Social.
El asesor dirige la línea de iiivestigación , así como las técnicas en el proyecto de investigación para el Servicio Social.
5. Desglosar las actividades que desarrollará el asesor para dirigir el Servicio Social.
Explicación de cada técnica aplicada en el proyecto. Revisión de cada etapa del trabajo experimental Aclaración de dudas con respecto a la línea de investigación. Revisión del trabajo escrito a entregar.
6. Nombre y Firma del Asesor.
Maria Lilia Dotydnguez Lgpez