UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE MEDICINA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MED 300

Informe de Laboratorio Nº 8

AISLAMIENTO DEL GLUCÓGENO

Presentado por:

Cubilla, Lourdes 4-747-2468

Chacón, Katiuska 4-747-2336

Miranda, Karen 4-747-2372

A consideración del profesor:

ROBERTO GUEVARA

III Año de Licenciatura en Medicina

I semestre

2009

Experimento Nº 8

Objetivos:

1. Extraer el glucógeno presente en una muestra de hígado de pollo.

2. Caracterizar mediante pruebas químicas el glucógeno extraído.

Introducción:

El glucógeno es el principal polisacárido de reserva de las células animales y al igual que la amilopectina es un polisacárido ramificado de la D-glucosa con enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6 en los puntos de ramificación, pero es mucho más ramificado y compacto que ésta.

El glucógeno es abundante en el hígado, donde puede alcanzar hasta el 7% del peso hú-medo, pero también se le halla en músculo esquelético.

En las células hepáticas el glucógeno se encuentra almacenado en gránulos grandes que contienen además las enzimas responsables de su síntesis y degradación.

El glucógeno puede hidrolizarse por la acción de alfa-amilasa que se encuentra en la sali-va y jugo pancreático, las cuales rompen los enlaces alfa-1,4 en las ramas exteriores del glucógeno para dar glucosa, una pequeña cantidad de maltosa y un núcleo resistente lla-mado dextrina limite.

GLUCOGÉNESIS:

El glucógeno es la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en los animales y corresponde al almidón de las plantas. Se encuentra en proporción mayor en el hígado (hasta 6%) y en el músculo, donde rara vez excede de 1%. Al igual que el almidón, es un polímero ramificado de la D-glucosa.

La función del glucógeno muscular es actuar como una fuente de fácil disponibilidad de unidades de hexosa para la glucólisis dentro del propio músculo. El glucógeno hepático sirve en gran parte para exportar unidades de hexosa para la conservación de la glucosa

AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO

sanguínea, particular entre comidas. Después de 12 a 18 horas de ayuno, el hígado casi agota su reserva de glucógeno.

El glucógeno muscular sólo disminuye de manera significativa después de ejercicio vigo-roso prolongado. Puede inducirse en almacenaje mayor de glucógeno muscular con die-tas ricas en carbohidratos después de la depleción por el ejercicio. Las enfermedades por almacenamiento de glucógeno son un grupo de trastornos hereditarios que se caracteri-zan por movilización deficiente del glucógeno y depósito de formas anormales del mismo.

Materiales:

50 hígados de pollo Cuchillo 1 matraz Erlenmeyer de 250 Ml y 500 Ml Probetas de 25 Ml, 50 Ml, 100 ml Baño maría Plancha Centrifugadora Vasos Químicos Tubos de ensayo

Reactivos:

Hidróxido de Potasio

Etanol

Reactivo de Molish

Propiedades Físicas y Químicas

Hidróxido de Potasio

◦ ESTADO FÍSICO: Líquido◦ APARIENCIA: Clara◦ COLOR: Incoloro◦ OLOR: Inodoro◦ PUNTO DE EBULLICIÓN: 102-143°C (216-289 °F)◦ PUNTO DE CONGELACIÓN: -89 a 4°C (-128 a 39°F)◦ PRESIÓN DE VAPOR: No disponible◦ DENSIDAD DEL VAPOR: No disponible◦ GRAVEDAD ESPECÍFICA (agua=1): 1,09-1,52 @ 15,6°C◦ DENSIDAD: 9,09-12,67 lbs/gal @ 15,6°C◦ SOLUBILIDAD EN AGUA: 100%◦ PH: 12-14◦ VOLATILIDAD: No disponible◦ UMBRAL DE OLOR: No disponible◦ VELOCIDAD DE EVAPORACIÓN: No disponible◦ COEFICIENTE DE DISTRIBUCIÓN EN AGUA/ACEITE: No disponible

Etanol

◦ Físicas

▪ Punto de ebullición: 78.3 °C. Punto de fusión: -130 °C.▪ Índice de refracción (a 20 °C):1.361 Densidad: 0.7893 a 20 °C.▪ Presión de vapor: 59 mm de Hg a 20 °C. Densidad de vapor: 1.59 g /mL▪ Temperatura de ignición: 363 °C ▪ Punto de inflamación (Flash Point): 12 °C ( al 100 %), 17 °C (al 96 %), 20 °C

(al 80%), 21 oC (al 70 %), 22 °C (al 60 %), 24 °C (al 50 %), 26 °C (al 40 %), 29 oC (al 30 %), 36 oC (al 20 %), 49 oC (al 10 %) y 62 oC (al 5 %).

▪ Límites de explosividad: 3.3- 19 %▪ Temperatura de autoignición: 793 oC.▪ Punto de congelación: -114.1 oC▪ Calor específico:(J/g oC): 2.42 (a 20 oC).▪ Conductividad térmica (W/m K): 0.17 (a 20 oC).▪ Momento dipolar: 1.699 debyes.▪ Constante dielétrica: 25.7 (a 20 oC).▪ Solubilidad: Miscible con agua en todas proporciones, éter, metanol, cloro-

formo y acetona.▪ Temperatura crítica: 243.1 oC.▪ Presión crítica: 63.116 atm.▪ Volumen crítico: 0.167 l/mol.▪ Tensión superficial (din/cm): 231 (a 25 oC).▪ Viscosidad (cP): 1.17 (a 20oC).▪ Calor de vaporización en el punto normal de ebullición (J/g): 839.31.▪ Calor de combustión (J/g): 29677.69 (a 25 oC)▪ Calor de fusión (J/g): 104.6▪ El etanol es un líquido inflamable cuyos vapores pueden generar mezclas

explosivas e▪ Inflamables con el aire a temperatura ambiente.

◦ Químicas: Se ha informado de reacciones vigorosas de este producto con una gran variedad de reactivos como: difluoruro de disulfurilo, nitrato de plata, pen-tafluoruro de bromo, perclorato de potasio, perclorato de nitrosilo, cloruro de cromilo, percloruro de clorilo, perclorato de uranilo, trióxido de cromo, nitrato de fluor, difluoruro de dioxígeno, hexafluoruro de uranio, heptafluoruro de yodo, te-traclorosilano, ácido permangánico, ácido nítrico, peróxido de hidrógeno, ácido peroxodisulfúrico, dióxido de potasio, peróxido de sodio, permanganato de pota-sio, óxido de rutenio (VIII), platino, potasio, t-butóxido de potasio, óxido de plata y sodio. En general, es incompatible con ácidos, cloruros de ácido, agentes oxi-dantes y reductores y metales alcalinos.

Reactivo de Molish

Prueba de Molish: es una prueba general para carbohidratos. En presencia de ácidos no

oxidantes, los carbohidratos experimentan deshidratación y forman furfural y sus

derivados. Estos productos se combinan luego con alfa naftol sulfonato originando un

color púrpura.

Toxicidad

Hidróxido de Potasio

◦ DATOS DE TOXICIDAD: Hidróxido de potasio: DL50 365 mg/kg en rata. La gravedad del daño al tejido depende de la concentración del producto, la prolon-gación del contacto con el tejido y el estado del tejido local. Después de la ex-posición puede pasar un tiempo antes de que aparezca la irritación u otros efec-tos. Este material es un fuerte, irritante y es corrosivo para la piel, ojos y mem-branas mucosas. Este material puede provocar quemaduras graves y daño per-manente al tejido con el cual entre en contacto. Su inhalación puede producir irritación grave y posibles quemaduras junto con edema pulmonar que puede producir neumonitis. El contacto de los ojos con este material puede producir irritación grave, corrosión con posible daño a la córnea y ceguera. Su ingestión puede producir irritación, corrosión/ulceración, náuseas y vómitos. En general, los efectos crónicos se deben a irritación a largo plazo. Este material puede pro-ducir dermatitis en la piel o ulceración recurrente de la córnea y alteraciones de la visión. En informes de casos extraordinarios, se ha observado que la inhala-ción a largo plazo produce una reacción inflamatoria de los bronquios y disfun-ción obstructiva de las vías respiratorias.

Etanol

◦ LD50 (oral en ratas): 13 ml/Kg◦ México:◦ CPT: 1900 mg/m3 (1000 ppm)◦ Estados Unidos:◦ TLV (TWA): 1900 mg/m3 (1000 ppm)◦ Reino Unido:◦ VLE: 9500 mg/m3 (5000 ppm)◦ Francia:◦ VME: 1900 mg/m3 ( 1000 ppm)◦ Alemania:◦ MAK: 1900 mg/m3 (1000 ppm)◦ Periodos largos: 1900 mg/m3 (1000 ppm)◦ Suecia:◦ Periodos largos: 1900 mg/m3 (1000 ppm)◦ Alcohol desnaturalizado:◦ LDLo (oral en humanos): 1400 mg/Kg.◦ LD50 (oral en ratas): 7060 mg/Kg.◦ LC 50 (inhalado en ratas): 20000 ppm /10 h◦ Niveles de irritación a piel de conejos: 500 mg/ 24h, severa.◦ Niveles de irritación a ojos de conejos: 79 mg, 100 mg/24h, moderada.

Procedimiento:

1. Cortamos en trozos pequeños 50 g de hígado de pollo.

2. Calentamos en el Erlenmeyer de 250 mL con mucha precaución y usando lentes de

seguridad 20.0 mL de KOH al 50%.

3. Después adicionamos inmediatamente los trozos de hígado en el Erlenmeyer que

contiene el KOH.

4. Calentamos en baño maría durante 45 minutos. Agitamos el matraz de ser

necesario.

5. Después del calentamiento adicionamos 30 mL de agua.

6. Adicionamos 70 mL de etanol. Agitamos.

7. El floculado es principalmente glucógeno, tapamos y dejamos reposar por 10

minutos.

8. Luego adicionamos la mezcla en los tubos de centrifugación.

9. Centrifugamos por 5 minutos a velocidad máxima.

10.Recogimos el precipitado y ensayamos la prueba de Molish.

Resultados:

EN EL PRECIPITADO DE GLUCÓGENO SE FORMO UN ANILLO PURPURA MEDIANTE LA PRUEBA DE MOLISH INDICÁNDONOS LA PRESENCIA DE GLUCÓGENO EN EL HÍGADO DE POLLO.

Discusión:

El método de aislamiento utilizado en este laboratorio se basa en las propiedades químicas del glucógeno no compartidas por otras sustancias presentes en el hígado. La separación del glucógeno del tejido se consigue mediante la adición de KOH y posteriormente con etanol precipita polisacáridos y elimina los monosacáridos soluble y. Así, se produce un precipitado que contiene una mezcla de glucógeno, proteínas y ácidos nucleicos, que han resistido el calentamiento anterior. Luego el tratamiento con el reactivo de molish que contiene H2SO4 es un método rápido para la determinación de hexosas y alopentosas constituyentes de un polisacárido. Mediante este método, el glucógeno es hidrolizado por un ácido (H2SO4) hasta sus unidades elementales (monosacáridos) dando asi la formación de un anillo purpura demostrando positiva la presencia del glucógeno en el tejido.La prueba de Molish es realizada para la identificación de carbohidratos, la cual da positiva cambiando a color morado violeta . La coloración producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón. No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta

¿Cómo se purifica el glucógeno?R= El glucógeno se libera de los tejidos que lo contienen por calentamiento con una base fuerte (KOH) hasta la destrucción total del tejido. La separación del glucógeno del tejido se consigue mediante la adición de etanol (precipita polisacáridos y elimina los monosacáridos solubles) y sulfato de sodio (coprecipitante). Así, se produce un precipitado que contiene una mezcla de glucógeno, proteínas y ácidos nucleicos, que han resistido el calentamiento anterior.El tratamiento posterior con ácido tricloroacético (TCA) hace que precipiten las proteínas y ácidos nucleicos de la mezcla. El glucógeno aislado se vuelve a precipitar con etanol, obteniéndose una preparación con un alto grado de pureza.

Bibliografía:

Bioquímica Básica de Marks: Un enfoque clínico. Smith, Colleen; Marks, Alan &

Lieberman, Michael. Segunda edición. Editorial: Mc Graw Hill. http://www.monografias.com/trabajos11/glucog/glucog.shtml http://www.vivirsalud.com/2007/07/10/%C2%BFque-es-el-glucogeno/

Harrison Principios de Medicina Interna, 15 edición, Dennis L. Kasper, Eugene Braunwald, Anthony S. Fauci , Stephen L. Hauser, Danl Longo.