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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE ODONTOLOGIA
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO DE SOLUCIONES DE PROPOLEO ETANOLICO SOBRE DOS BACTERIAS PERIODONTOPATOGENAS FRECUENTES
EN LA ENFERMEDAD GINGIVOPERIODONTAL. HOSPITAL MILITAR CENTRAL, LIMA 2010.
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE CIRUJANO DENTISTA
PRESENTADO POR:
BACH. ALAN DANNY CALDERON PUENTE DE LA VEGA
PUNO – PERU
2010
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE ODONTOLOGIA
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN VITRO DE SOLUCIONES DE PROPOLEO ETANOLICO SOBRE DOS BACTERIAS
PERIODONTOPATOGENAS FRECUENTES EN LA ENFERMEDAD GINGIVOPERIODONTAL. HOSPITAL MILITAR CENTRAL, LIMA 2010.
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE CIRUJANO DENTISTA
PRESENTADO POR:
BACH. ALAN DANNY CALDERON PUENTE DE LA VEGA
APROBADA POR EL JURADO REVISOR CONFORMADO POR:
PRESIDENTE:…………………………………………………………….
C.D. ERICK CASTAÑEDA PONZE
PRIMER MIEMBRO:……………………………………………………..
Mg. AGUSTO ATAYUPANQUI NINA
SEGUNDO MIEMBRO:…………………………………………………
Mg. ALBERTO PACHECO VILLAGRA
DIRECTOR DE TESIS:……………………………………………………
C.D. JORGE MERCADO PORTAL
ASESOR DE TESIS:………………………………………………………
Blgo. ELFER VALDIVIA PAZ-SOLDAN
……………………………………………………….
C.D. NELSON MERCADO PORTAL
DEDICATORIA A mis amados padres Arcadio y Felicia por su amor, apoyo y cariño incondicionales durante toda mi vida y muy en especial durante los años de formación de mi Carrera Universitaria. Mis triunfos son sus triunfos. A mi hermano Alexander por su ayuda y apoyo.
AGRADECIMIENTO
A mi asesor Tte Crl. Odont. Nelson Mercado Portal por su constante exigencia en la realización del presente trabajo de investigación, así como por brindarme su amistad y apoyo incondicional durante mi permanencia en las instalaciones del hospital, de igual forma a el personal Militar y Civil que conforman la familia del H.M.C A mis asesores Biólogo Microbiólogo Elfer Valdivia Paz-Soldán quien en la sección de Microbiología del Servicio de Patología y Laboratorio Clínico me condujo y me apoyó en todo, aun en los peores momentos en que las cosas parecían no salir bien, dándome fuerzas para seguir adelante; también a mi asesor My. Odont. Helbert Alfaro Segovia quien me dio las facilidades para recolectar las muestras así como me dio la confianza durante mi permanencia en el Servicio de Periodoncia. A mi Director de Tesis Mg. Jorge Mercado Portal por su orientación y consejo profesional durante la realización del presente trabajo de investigación. A mi compañera Betsy con quien pasé todos estos años de mi vida académica en la Universidad, por su cariño y motivación constante. A los docentes de la Escuela Profesional de Odontología de la Universidad Nacional del Altiplano- Puno, quienes me acompañaron aun en los peores momentos de mi salud personal, siempre los recordaré con mucho cariño.
INDICE
RESUMEN…………………………………………………………………………………1
INTRODUCCION:………………………………………………………………………...3
CAPITULO I
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, ANTECEDENTES Y OBJETIVOS DE LA
INVESTIGACION
1.1 Planteamiento del Problema.…………………………………………………………….5
1.2 Enunciado del Problema……..…………………………………………………………..6
1.3 Justificación de la Investigació..n………………………………………………………..6
1.4 Formulación de la Investigación..………………………………………………………..8
1.5 Antecedentes de la Investigación..……………………………………………………….8
CAPITULO II
MARCO TEORICO
2.1 Biocidas naturales……………………………………………………………………...14
2.2 Propóleo………………………………………………………………………………..14
2.3 Cavidad oral……………………………………………………………………………19
2.4 Placa dental…………………………………………………………………………….21
2.5 Infecciones mixtas de la cavidad oral………………………………………………….24
2.6 Enfermedad Periodontal…………………………………………………………….....25
2.7 Bacterias Periodontopatógenas………………………………………………………...35
2.8 Índices Epidemiológicos Periodontales………………………………………………..39
2.9 Medios de transporte y cultivo…………………………………………………………40
2.10 Hipótesis………………………………………………………………………………41
2.11 Objetivo General……………………………………………………………………...41
2.12 Objetivos Específicos…………………………………………………………………41
CAPITULO III
MATERIALES Y METODOS
3.1 Diseño del estudio…………………………………………………………………....43
3.2 Tipo de estudio………………………………………………………………………..43
3.3 Población y muestra de la Investigación………………………………………………43
3.4 Operacionalizacion de las variables……………………………………………………44
3.5 Instrumentos……………………………………………………………………………45
3.6 Recolección de datos…………………………………………………………………..45
3.7 Obtención y preparación de la Solución Etanólica de Propóleo……………………….46
3.8 Cepas bacterianas para el estudio (Proyecto piloto)…………………………………...47
3.9 Pacientes………………………………………………………………………………..49
3.10 Consideraciones éticas………………………………………………………………..53
3.11 Diseño y análisis estadístico………………………………………………….............56
3.12 Recursos………………………………………………………………………………56
CAPITULO IV
CARACTERISTICAS DEL AREA DE INVESTIGACION………………………….60
CAPITULO V
RESULTADOS……………………………………………………………………………61
Discusión…………………………………………………………………………………...66
Conclusiones……………………………………………………………………………….69
Recomendaciones………………………………………………………………………….70
Referencias Bibliográficas…………………………………………………………………71
Anexos……………………………………………………………………………………..78
INDICE DE ESQUEMAS
ESQUEMA N° 1 : COMPOSICION PROMEDIO DE PROPOLIS……………………..17
ESQUEMA N° 2 : CRITERIOS DE ESPECIFICIDAD EN LA PERIODONTITIS……26
ESQUEMA N° 3: CLASIFICACION DE LA PERIODONTITIS……………………….27
ESQUEMA N°4: ETIOLOGIA DE LA PERIODONTITIS……………………………...29
INDICE DE TABLAS
TABLA N° 1: PROMEDIO DEL HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES
EXPERIMENTALES SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS……………………...61
TABLA N° 2: DIAMETROS PROMEDIOS DE HALOS DE INHIBICION SOBRE
FUSOBACTERIUM NUCLEATUM……………………………………………………...63
INDICE DE GRAFICOS
GRAFICO N°1: HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES EXPERIMENTALES
SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS……………………………………………...62
GRAFICO 2: DIAMETRO EN PROMEDIO DE LOS HALOS DE INHIBICION DE LAS
SOLUCIONES EXPERIMENTALES SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS…….62
GRAFICO N° 3: HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES EXPERIMENTALES
SOBRE FUSOBACTERIUM NUCLEATUM…………………………………………….64
GRAFICO N° 4: PROMEDIO DEL HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES
EXPERIMENTALES SOBRE FUSOBACTERIUM NUCLEATUM…………………….64
GRAFICO N° 5: COMPARACION DE LA MAYOR ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
PRODUCIDA POR LAS DIFERENTES CONCENTRACIONES DE PROPOLEO
ETANOLICO………………………………………………………………………………65
GRAFICO N° 6: COMPARACION DE LAS SOLUCIONES DE EEP CON LA
AMOXICILINA……………………………………………………………………………65
INDICE DE ANEXOS
ANEXO N° 1………………………………………………………………………………78
ANEXO N° 2………………………………………………………………………………79
ANEXO N° 3………………………………………………………………………………80
ANEXO N° 4………………………………………………………………………………82
ANEXO N° 5………………………………………………………………………………83
RESUMEN
El presente trabajo de investigación se realizó con el objetivo de determinar la actividad
antibacteriana in vitro de soluciones de Propóleo Etanólico a diferentes concentraciones
sobre dos bacterias periodontopatógenas frecuentes en la enfermedad
Gingivoperiodontal teniendo un diseño de estudio experimental, de tipo prospectivo,
longitudinal y comparativo, realizado en los servicios de Periodoncia y Patología
Clínica del Hospital Militar Central de la ciudad de Lima, cuya población muestral
estubo conformada por 20 pacientes con Enfermedad Gingivoperiodontal atendidos en
el Servicio de Periodoncia de dicho hospital, empleando un tipo de muestreo no
probabilístico por conveniencia.
Se realizó una prueba piloto con Cepas ATCC Porphyromona gingivalis y
Fusobacterium nucleatum para comprobar la actividad antibacteriana del Propóleo a sus
diferentes concentraciones del 5% -15% - 30%, luego se procedió a la toma de muestras
extraídas directamente de la placa subgingival del paciente con enfermedad
Gingivoperiodontal.
Previamente las placas fueron preparados con Agar Brucella y Agar Schedler
suplementados, para garantizar un crecimiento bacteriano optimo. En condiciones de
anaerobiosis las muestras fueron sembradas en cada placa utilizando el método de
difusión de disco, una vez reactivadas las bacterias se procedió a preparar los pozos de
sensibilidad para posteriormente realizar las lecturas de los diferentes halos de
inhibición mediante un vernier, de las concentraciones de Propóleo Etanólico al 5%-
15%- 30%, así como de los Grupos control positivo y negativo.
Los resultados mostraron que todas las concentraciones de Propóleo Etanólico
presentaron actividad antibacteriana; con promedios para el Propóleo Etanólico al 5%
de 17.15 mm, para el Propóleo Etanólico al 15% de 22 mm y en menor diámetro para el
Propóleo Etanólico al 30% de 15.9 mm. Se concluye que el Propóleo Etanólico al 15%
presentó una mayor actividad antibacteriana, mientras que al 30% se observó una
disminución en esta, debido que a mayores concentraciones de Propóleo este tiende a
saturarse y por lo tanto disminuir su actividad antibacteriana
PALABRAS CLAVE: Actividad antibacteriana, Propóleo etanólico,
Periodontopatógenas, ATCC
INTRODUCCION
En la actualidad en el Perú, según el Ministerio de Salud, de entre las enfermedades de
la cavidad oral de más alta incidencia, preponderan: la Caries Dental y las
Enfermedades Gingivoperiodontales, observándose un incremento sustancial en cuanto
a la incidencia de estas.
Las enfermedades Gingivoperiodontales son procesos infecciosos cuyo factor etiológico
esencial es la Biopelícula de placa dental, muy común entre los seres humanos,
considerada como un problema de salud publica en muchas partes del mundo,
observándose en el paciente una pérdida de calidad de vida de una manera notoria con
el agravante de la enfermedad.
A la fecha son más de 500 especies microbianas las que se han podido identificarse en
la cavidad oral, dentro de estas destacan un grupo de complejos bacterianos que se
encuentran relacionados a la etiopatogenia de las diversas entidades de la Enfermedad
Gingivoperiodontal; en la Gingivitis se ha observado que aproximadamente el 45% de
las bacterias aisladas corresponde a biota anaerobia, conformada fundamentalmente por
Actinomyces spp , Fusobacterium spp, Prevotella intermedia y cocos anaerobios; en
pacientes con Periodontitis del Adulto se ha observado que el 75% corresponde a
especies gran negativas de las cuales el 90% son anaerobias entre las cuales destacan
Porphyromona gingivalis, Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum,
Bacteroides forshytus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Peptostreptococcus spp
.
Con el advenimiento de nuevas técnicas bacteriológicas, en la década de los 90, que
permitían el aislamiento e identificación de muchas especies que se sabía residían en
las lesiones periodontales, surgió la necesidad de crear nuevos y más confiables
métodos de recolección de muestras de bolsas y fue así como se relacionó a ciertas
bacterias con patologías específicas, renaciendo así la teoría específica de la
Enfermedad Periodontal.
El establecimiento de los Postulados de Socransky, así como el esclarecimiento de los
factores de virulencia o determinantes de patogenicidad bacterianos, llevaron a concluir
que existen verdaderos Periodontopatógenos anaerobios prevaleciendo la
Porphyromona gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium
nucleatum, algunas Prevotellas y Bacteroides, pertenecientes a la familia
Bacteroidaceae, según Bergey´s Manual of Systemic Bacteriology (1994).
Puesto que la periodontitis es una enfermedad infecciosa y teniendo en cuenta que
algunos pacientes no responden a la terapia mecánica convencional, los antibióticos se
han prescrito como coadyuvantes al tratamiento periodontal; sin embargo surgieron
bacterias patógenas resistentes a dicha antibioterapia, debido a su inapropiado uso
sistémico, convirtiéndose estos en un problema clínico grave.
Es por ello que recientemente se ha prestado especial atención a la medicina natural. La
Organización Mundial de la Salud (O.M.S.) proyecta que cerca del 80% de la
población mundial emplea la medicina tradicional para fines terapéuticos en atención
primaria de Salud. Investigaciones ampliamente realizadas durante la última década,
prestan especial atención a la medicina y en el campo de la Estomatología proponen
alternativas en el uso de productos naturales entre ellos el Propóleo, como solución a
diversos problemas de salud oral. De ahí que existe una gama de estudios sobre
Propóleos de origen extranjero que comprueban su acción antimicrobiana, atribuyendo
dicho efecto a la presencia de principios activos como los flavonoides, flavonas.
Bajo este concepto el propósito de esta investigación es demostrar científicamente la
actividad antimicrobiana in Vitro del extracto de Propóleo etanólico a diferentes
concentraciones, sobre cepas Periodontopatógenas de mayor incidencia, estudio que
servirá para disminuir el potencial patógeno de estas especies, especialmente de la
Porphyromona gingivalis, Actinobacillus actinomicetemcomitans, Fusobacterium
nucleatum, algunas Prevotellas, constituyendo de esta manera una alternativa en la
prevención de la proliferación de las enfermedades Gingivoperiodontales, así como
establecer una base en la futura elaboración de un producto aplicable en la práctica
odontológica, empleando como en este caso un recurso muy abundante en nuestro
medio.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA,
ANTECEDENTES Y OBJETIVOS DE
LA INVESTIGACION
I. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, ANTECEDENTES Y OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION.
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:
La Organización Mundial de la Salud ( O.M.S.) ha venido actualmente promoviendo la
utilización de los sistemas tradicionales de medicina, estimulando el uso potencial de
estas ; en este contexto en nuestro país además del difícil acceso a los medicamentos,
impulsa al mayor uso de recursos como la fitoterapia, apiterapia entre otros, agentes
naturales que son económicamente viables y constituyen alternativas eficaces para las
afecciones bucales. La medicina alternativa presenta a la Estomatología, entre otros al
Propóleos que viene a ser un bálsamo, compuesto natural producido por las abejas
melíferas (Apis mellifera) de la goma de varias plantas, al que se le han atribuido
múltiples propiedades, destacando su acción antimicrobiana.
En el área de la salud las enfermedades adquieren trascendencia por dos motivos, ya sea
por los daños que producen y/o por la prevalecía en la población en general. La placa
dental representa un agente etiológico tanto para el desarrollo de la Enfermedad
Periodontal y Caries dental, enfermedades altamente prevalentes que se presentan en el
98% de la población peruana.
Por otra parte la enfermedad periodontal se caracteriza por ser crónica cuya evolución
se sabe actualmente que es progresiva y continua. El modelo más aceptado de evolución
es por brotes al azar que afectan cada vez a distintos sitios, pero que ineludiblemente
con el paso del tiempo producen la pérdida de la dentición. Existen fases de actividad y
otras de inactividad en las que no se produce pérdida de soporte óseo. El conocer en que
fase nos encontramos es importante para estar seguros de que el tratamiento es el
responsable de la mejoría y no el paso a la inactividad. El objetivo del tratamiento tiene
que ser el control de la enfermedad en el tiempo y no en un momento dado.
Entre los múltiples fármacos indicados destacan: metronidazol, tetraciclinas, ácido
clavulánico, sin embargo cada vez son más numerosas las bacterias de los Géneros
Bacteroides, Prevotella u otros que, al producir betalactamasa, presentan resistencia a
ciertos fármacos como a la penicilina, así como su incumplimiento ocasiona fracasos en
la resolución de los procesos y prolongarlo innecesariamente provocaría la aparición
de efectos secundarios no deseables, limitando estos su uso en estomatología, razones
que nos incentiva a estudiar nuevas sustancias con principios activos potentes, así como
a plantear alternativas en la obtención de nuevos agentes antimicrobianos.
1.2 ENUNCIADO DEL PROBLEMA:
Actividad antibacteriana in vitro de soluciones de Propóleo Etanólico sobre bacterias
Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad Gingivoperiodontal. Hospital Militar
Central, Lima 2010.
1.3 JUSTIFICACION DE LA INVESTIGACION:
Enfermedades gingivales como periodontales están catalogadas entre las afecciones más
comunes del género humano por incluirse entre las enfermedades que mayor relación
tienen con un desequilibrio del ecosistema oral, y conllevan un predominio de flora
bacteriana patógena (aerobia y anaerobia); en íntima relación con este desequilibrio,
algunas bacterias comensales pueden llegar a convertirse en patógenas oportunistas. Las
condiciones anatómicas del espacio gingivodental, así como otros factores físicos como
la temperatura, humedad, pH, y el bajo potencial de oxidorreducción del espacio
gingivodental (especialmente cuando se asocia con placa bacteriana subgingival)
explican el predominio de bacterias anaerobias y su implicación en los procesos
periodontopatógenos. Así, se han podido identificar diversos factores de virulencia en
las bacterias periodontopatógenas (Porphyromona gingivalis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia y otras).
Lo referido nos obliga a optar de forma habitual por un tratamiento antimicrobiano con
espectro suficiente como para actuar contra las múltiples bacterias causales. No
obstante, es útil realizar, cuando sea posible, el estudio microbiológico del proceso y el
conocimiento de la sensibilidad antibiótica de las bacterias aisladas. Los datos así
obtenidos nos suministran la información y la experiencia necesarias para aplicar con
éxito el tratamiento.
Existen soluciones naturales que son utilizadas en otras áreas de la medicina como
tratamiento y en otras áreas odontológicas como: cirugía maxilofacial, endodoncia, etc.
Y actualmente existen nuevos estudios sobre el extracto de propóleo etanólico que se
están utilizando en muchos países como medicamento coadyuvante a la terapia
periodontal. Estas soluciones, según los investigadores, poseen propiedades
antimicrobianas, antiinflamatorias, y regenerativas entre otras.
Se realizará el presente trabajo de investigación por las siguientes razones:
Originalidad: porque no se encontró antecedentes de investigación similares a nivel
local, que hayan pretendido obtener y procesar el propóleo etanólico a diferentes
concentraciones y comprobar su actividad antibacteriana in Vitro en patógenos
específicos de la cavidad oral.
Factibilidad: ya que se dispone de unidades de estudio, recursos humanos, recursos
financieros, tiempo, asesoría y disponibilidad de un diseño para realizar la
investigación.
Relevancia Científica: al pretender conocer e investigar la actividad antibacteriana del
propóleo etanólico se aportan bases científicas para el uso de este como terapia
alternativa en el control de la enfermedad gingivoperiodontal.
Relevancia Social: debido a que la región andina posee una diversidad de climas y una
naturaleza libre de industrias y de tratamientos con pesticidas, que permite una
abundante cosecha de miel y de esa manera impulsar el aprovechamiento del uso de
apifármacos como métodos alternativos en la práctica estomatológica.
Interés personal: como investigadores, es importante realizar una monografía con
información actual sobre la actividad de extractos de propóleos así como su potencial
antibacteriano sobre microorganismos patógenos, que sirva como base a los
profesionales en odontología para aplicar en la práctica profesional e investigativa.
1.4 FORMULACION DE LA INVESTIGACION:
¿Qué actividad antibacteriana tienen las soluciones de Propóleo Etanólico al 5% - 15% -
30% sobre las dos bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad
Gingivoperiodontal?
1.5 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACION:
ANTECEDENTES INTERNACIONALES.-
Shub, et al (URSS 1978). “Effect of propolis on strains of staphylococcus aureus
resistant to antibiotics”. Preparó extractos de muestras de própolis recolectados en 18
regiones de la URSS. Estos extractos estaban diluidos en agar, en placas petri. Los
placas fueron entonces inoculados con la bacteria Bacillus, Staphylococcus aureus,
Escherichia coli , Pseudomonas aeraginosa, y la Candida albicans, e incubados en 37
oC o 20-25 oC por 48h. Propolis en 125-500 ug/ml inhibió el crecimiento de S. auneus
y B.Cereus, pero a las otras 2 bacterias las inhibió a concentraciones superiores de 1000
ug/ml. (1)
Kedzia, A (Polonia 1986), “Effect of ethauol extract of propolis (EEP) on anaerobic
Bacteria”. Determinó las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de extracto del
etanol de própolis para 112 cepas de bacterias anaerobias. EEP demostró la efectividad
máxima en contra de las cepas de Bacteroides y Peptostreptococcus. De 37 cepas
examinadas, 18 estaban inhibidos en 0.01-0.50 mg/ml . EEP fue ligeramente menos
efectivo en contra de las cepas grampositivas de Propionibacterium, Arachinia y
Eubacterium (MIC 0.50-1.00 mg/ml). (2)
Gutierez S, et al (Camaguey 1999), “Acción antibacteriana de la tintura
hidroalcohólica de propóleos al 4% en gérmenes de origen endodòncico”. Determinaron
el efecto "in vitro" de la solución hidroalcohólica de propóleos al 4% como
antiséptico. El universo consistió en 200 controles bacteriológicos radiculares, los
cuales arrojaron 77 cepas de diferentes microorganismos, éstos se enfrentaron "in vitro"
para medir su eficacia a diferentes soluciones por la técnica de doble capa de agar.
Además se determinó probar el alcohol al 70%, cloranfenicol sódico al 10% y agua
como controles positivos y negativos, los estudios revelaron la sensibilidad a la solución
hidroalcohólica de propóleos al 4% en un 62% de los Estreptococos viridan, un 85% de
los Estreptococos aureos y un 85% de los Lactobacilos s/p. (3)
Sforcin, et al (Brasil 2000), “Efecto del Propòleo brasileño en la actividad
antibacteriana”. Estudió el comportamiento de los microorganismos hacia la acción
antibiótica del propóleo observando la actividad in vitro de cepas bacterianas aisladas
provenientes de infecciones humanas. Llevó a cabo la dilución de extracto etanólico de
propóleos (EEP) en agar, con concentraciones de serie que van desde 0,4 hasta 14,0%
(% v / v). Se verificó que el crecimiento de bacterias Gram-positivas es inhibido por
bajas concentraciones de propóleos (0,4%), mientras que las bacterias Gram-negativas
son menos sensibles a esta sustancia, las concentraciones inhibitorias mínimas variaron
desde 4,5 hasta 8,0%. (4)
Velikova, et al (Turquía 2001), “Chemical composition and biological activity of
propolis from Turkish and Bulgarian origin”. Mediante difusión en agar, evaluaron la
actividad antimicrobiana y la composición química de propóleos proveniente de
Turquía frente a Staphylococcus aureus y Eschericchia coli, obteniendo resultados
positivos para Staphylococcus aureus; para Eschericchia coli obtuvieron una menor
inhibición de crecimiento. (5)
Gebara, et al (Brasil 2002), “Própolis antimicrobial activity against periodontopathic
bacteria”. Demostraron la actividad antimicrobiana de Propòleo contra bacterias
Periodonttopathic, analizando un grupo de bacterias aerobias y anaerobias, entre ellas
algunas bacterias periodontopatógenas como Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia, y
además, levaduras como Cándida albicans. Para Actinobacillus actinomycetemcomitans
ellos obtuvieron una CIM(concentración minima inhibitoria) de 1μg/ml; para
Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia,
obtuvieron valores de CIM(concentración mínima inhibitoria) de 0,25μg/ml, y de
12μg/ml para Cándida albicans. Demostrando que todas las bacterias
Periodontopatogenas probados son susceptibles al Extracto de Propolis, sugiriendo que
en estudios mas a fondo sea probado como coadyuvante a la terapia periodontal. (6)
Santos, et al (Brasil 2002), “Susceptibility of Prevottella inteermedia/Prevotella
nigrescens (and Porphyromona gingivalis) to Propolis (Bee Glue) and other
Antimicrobial Agents”. Evaluaron in vitro la susceptibilidad de Prevotella Intermedia y
Porphyromonas gingivalis frente a seis antimicrobianos prescritos en odontología en el
Brasil, y el propoleo (pegamento de la abeja). Los agentes antimicrobianos probados
eran tetraciclina, penicilina, clindamicina, eritromicina, metronidazol, meropenem y seis
extractos etanólicos de los propolis (EEPs) del Brasil. Todas las cepas eran susceptibles
a la penicilina, al eritromicina, al meropenem, al metronidazol y al 95% de ellos (n=19)
a la tetraciclina. Treinta y seis por ciento (n=7) de los del Prevotella intermedia
probados eran resistentes al clindamicina. En cuanto a actividad de los própolis, todas
las especies eran susceptibles y los valores inhibitorios mínimos de la concentración se
extendieron a partir del 64 a 256 ug/ml. Cuando la concentración del propóleo era de
256 ug/ml, la muerte fue observada dentro de 3 h de incubación para los
Porphyromonas gingivalis y dentro de 6 h para el Prevotella intermedia (7)
Gheldof N, et al (Norteamérica 2002), . El propósito de este estudio fue caracterizar el
contenido antioxidante de la miel de 10 fuentes diferentes de flores y determinar sus
efectos sobre el crecimiento del orales seleccionados agentes patógenos (por ejemplo,
Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum). Estos resultados sugieren que
las mieles de diferentes fuentes florales pueden presentar variadas actividades a los
antimicrobianos.(8)
Stepanovic, et al (Servia 2003), “In vitro antimicrobial activity of propolis and
synergism betwen propolis and antimicrobial drugs”. Investigó las propiedades
antimicrobianas del extracto etanólico de 13 de propóleos (EEP) de muestras de
diferentes regiones de Serbia en contra de 39 microorganismos (14 resistentes o
multirresistentes a los antibióticos), y determinar la actividad sinérgica entre los agentes
antimicrobianos y propóleos. Los resultados indicaron que la EEP, independientemente
de la resistencia microbiana a los antibióticos, mostraron actividades más significativas
antimicrobiana frente a bacterias Gram-positivas (MIC 0,078% -1,25% de la EEP) y
levaduras (0,16% -1,25%), mientras que las bacterias Gram-negativas fueron menos
susceptibles (1,25% & ndash;> 5%). Enterococcus faecalis fue el más resistente de
Gram-positivas, la bacteria más resistentes Gram-negative fue la Candida albicans. (9)
Fajuri, et al (Chile 2004), “Eficacia del Propòleo chileno como Antimicrobiano contra
microorganismos de interés en Odontología”. Estudiaron el efecto del própolis sobre
diferentes microorganismos patógenos orales, entre los cuales incluyó Streptococcus
mutans, Porphyromonas gingivalis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y
Cándida albicans. Sus resultados mostraron inhibición de crecimiento de todos ellos,
excepto de Porphyromonas gingivalis, fueron susceptibles al propóleos. (10)
Del Rio P, et al (Chile 2006) “Actividad biocida de un própolis chileno frente a P.
gingivalis”. Concluyen que el propóleo chileno marca Apiherbal fue capaz de inhibir el
75% de Porphyromonas gingivalis, aisladas a concentraciones de 83,2 mg/ml y que
este posee un origen botánico mixto, es decir, constituido por especies introducidas y
especies nativas. (11)
Alfredo Mauricio Batista de Paula (Brasil 2006), “Susceptibility of oral pathogenic
bacteria and fungi to brazilian green propolis extract”. Mediante su estudio en difusión y
dilución por agar determinaron las Concentraciones Mínimas Inhibitorias de la
Prevotella intermedia (20-50 ug/ml), Porphyromona gingivalis (30-50 ug/ml),
Fusobacterium nucleatum y Actinomyces. actinomicetecomitans (30-60 ug/ml) y para
todas ellas la Concentración Mínima Bactericida fue de 200-400 ug/ml formando halos
de inhibición de 14 a 17 mm de diámetro. (12)
Koru O, et al (Turquía 2007), “Actividad antimicrobiana in vitro de las muestras de
los propolis de diversos orígenes geográficos contra ciertos patógeno orales”.
Realizaron un estudio: la actividad antimicrobiana de cinco muestras de los propolis,
recogida a partir de cuatro diversas regiones en Turquía y del Brasil, contra nueve cepas
anaerobias que fue evaluada. Los extractos del etanol de los propolis (EEP) fueron
preparados como muestras y de los propolis determinaron concentraciones inhibitorias
mínimas (MIC) y las concentraciones bactericidas mínimas (MBC) de EEP en el
crecimiento de los microorganismos de la prueba usando método de la dilusión del agar.
Todas las cepas eran susceptibles y MIC los valores se extendieron a partir del 4 a
512mug/ml para la actividad de los propolis. Propolis de Kazan-Ankara demostró la
mayoría de los valores eficaces MIC a los microorganismos estudiados. Los valores de
MBC de las muestras de Kazan-Ankara EEP fueron extendidos a partir del 8 a
512mug/ml. La muerte fue observada dentro de 4h de la incubación para el anaerobius
de Peptostreptococcus y los micros y lactobacillus acidophilus y naeslundii de los
actinomicetos, mientras que 8h para los oralis de Prevotella , melaninogenica de
Prevotella y los gingivalis de Porphyromonas, 12h para el nucleatum de
Fusobacterium, 16h para el parvula de Veillonella. Fue demostrado que las muestras
de los propolis eran más eficaces contra las bacterias anaerobias grampositivas que
gramnegativas. (13)
ANTECEDENTES NACIONALES.-
Ortiz G. (2000) “Acción in Vitro del propóleo frente a las bacterias Escherichia Coli y
Atafhylococcus aureus”. Este estudio tuvo como objetivo comprobar el efecto
antibacteriano del propoleo in Vitro de la región del Cusco, según el método de Kirby
Bauer modificado y mediante curvas de crecimiento bacteriano, concluyendo que la
cantidad mínima de propóleo con acción antibacteriana es de 32mg/ml o 3.2% para
Staphylococcus aureus ATCC y para Escherichia coli ATCC de 128 mg/ml 0 12.8%. (14)
Eguizabal M. et al (2007). “Actividad antibacteriana in Vitro del extracto etanólico de
propóleo peruano sobre Strptocuccus mutans y Latobacillus casei provenientes del
Valle de Oxapampa (Pasco)”. Demostraron mediante el método de difusión en placa
que soluciones de 0.8%, 20 y 30 % v/v del E.E.P. poseían actividad antibacteriana,
concluyendo que E.E.P en solución al 0.8 % tiene una mayor acción antibacteriana
contra S.mutans y L..casei .(15)
Cruzado et al (2007). “Ensayo químico y efecto de antibiosis in Vitro de la miel de
abeja sobre microorganismos grampositivos y gramnegativos” , trabajo orientado a
determinar los componentes químicos y el efecto de antibiosis “in vitro” de la miel de
abeja, frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, comúnmente causantes de
enfermedades prevalentes en la población. Se empleó el Método de Difusión en Discos,
Método de Kirby&Bauer. Los resultados de antibiosis fueron positivos para Escherichia
coli, Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus y negativo para Klebsiella
pneumoniae. (16)
Lopez J. et al (2004). “Estandarización del Propóleo de la provincia de Oxapampa,
departamento de Pasco (Perú) como materia prima para su utilización a nivel
industria”, observaron que los análisis microbiológicos muestran que el propóleos
presenta actividad antibacteriana y antifúngica, y en base a los resultados obtenidos,
consideran como porcentajes mínimos de actividad los siguientes: Propóleos en
solución al 3%: 0.08% y Propóleos en solución al 5%: 0.05%, entre otros resultados. (17)
Rodríguez Ch. (2007). “Actividad antibacteriana de cuatro soluciones de propóleo en
bacterias anaerobias frecuentes en necrosis pulpar con reacción periapical” demostró
que soluciones de propóleo al 50ug/10uL, 100ug/10uL, 200ug/10uL y 500ug/10uL
frente a cepas ATCCR de Porphyromona gingivalis, Prevotella melanogenica,
Peptostreptococcus anarobius y Actinomyces odontolyticus, también presentaban
actividad antibacteriana en comparación con la actividad antibacteriana del
paramonoclorofenol alcanforado. Se utilizó el medio de agar shadler en placas petri y el
método por discos de papel según la técnica de Kirby Bauer, en condiciones de
anaerobiosis, por 24h y+ 48h de incubación a 37º C (18)
ANTECEDENTES LOCALES.-
Mamani C. (2008). “Comparación in vitro de la actividad antifúngica extracto
etanólico de propóleo peruano y Nistatina en Candida Albicans de la Candidiasis
Seudomenbranosa Aguda”, demostró que tanto la Nistatina como concentraciones de
extracto Etanólico de Propóleo al 20% mostraron efecto antifúngico similar sobre
aislados de Candida Albicans. (19)
MARCO TEORICO, HIPOTESIS,
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
II. MARCO TEORICO.
2.1 BIOCIDAS NATURALES
Existe un gran interés desplegado por parte de los investigadores por estudiar sustancias
naturales que posean algunas propiedades farmacológicas con efecto microbiano, esto
simultáneamente al desarrollo tecnológico de la industria farmacéutica (20).
Los fármacos a base de derivados de productos naturales presentan una inmensa ventaja
respecto a los tratamientos químicos. En las plantas los principios activos siempre están
biológicamente equilibrados por la presencia de sustancias complementarias que van a
potenciarse biológicamente entre sí, de forma tal que en general no se acumulan en el
organismo, y se encuentran limitados sus efectos indeseables (21).
En Estados Unidos se calcula que entre un cuarto y la mitad de todos los productos
farmacéuticos que se venden, tienen un origen natural o han sido obtenido a partir de
sustancias naturales, pero una escasa o nula cantidad son usados como antimicrobianos,
desde la aparición de los antibióticos convencionales en la década de 1950 (22).
Es así que la Fitoterapia, nombre que se aplica al uso medicinal de derivados de
plantas, nunca ha dejado de tener vigencia. En el ámbito odontológico, el importante
crecimiento mundial de la fitoterapia dentro de programas preventivos y curativos ha
estimulado la investigación, con el fin de avalar la actividad antimicrobiana de distintos
derivados de plantas con el objeto de ayudar en el control de la placa bacteriana, y por
consiguiente, en la disminución de la incidencia de caries dental y enfermedad
periodontal (20).
2.2 PROPOLEO
Se da el nombre de própolis, que en griego significa defensor de la ciudad, entendida
ésta como sinónimo de colmena, a una resina cérea, de composición compleja y
consistencia viscosa, que las abejas elaboran y utilizan en la construcción, reparación,
aislamiento y protección de la colmena.
Al ser un compuesto resinoso y pegajoso, es elaborado por la abeja Apis mellífera, a
partir de exudados vegetales y mezclado con sustancias salivales. La palabra pròpolis
deriva del griego pro, para o en defensa, y polis, la ciudad, es decir, “defensa de la
ciudad (o la colmena)” (23).
Las abejas Apis mellífera lo obtienen por adición de cera y secreciones salivales al
material resinoso, gomoso o balsámico que recolectan de yemas, brotes y heridas de
diversas plantas. En la colmena, las abejas utilizan al propóleos con diversos fines tales
como: cerrar grietas, reducir al mínimo las vías de acceso, recubrir y aislar restos de
animales que se hayan introducido en la colmena evitando su descomposición,
consolidar componentes estructurales, barnizar el interior de las celdillas con fines
desinfectantes y evitar vibraciones (24).
En este trabajo se revisan las pruebas disponibles sobre las propiedades del pròpolis en
el posible tratamiento y prevención de las enfermedades Gingivoperiodontales y para
ello se hace un breve repaso del origen y la composición del pròpolis.
1.- ORIGEN BOTANICO Y COMPOSICION
En las zonas templadas la mayor parte del pròpolis procede del exudado de brotes de
chopos o álamos pertenecientes al género Populus spp; en la zona septentrional de
Rusia, de los brotes de abedul (Betula verrucosa) y de P. tremula(25,26); en las regiones
mediterráneas, de las choperas y de las hojas de Cistus spp.; en Brasil de las hojas de
especies de Baccharis dracunculifolia6 ; en Venezuela y Cuba de la resina floral del
género Clusia y en zonas más tropicales se obtiene de otros vegetales (25).
El estándar de calidad vigente para pròpolis es la identificación botánica y las pruebas
cromatográficas que corroboran la procedencia del propóleos (27). Una técnica muy útil e
informativa para determinar el origen botánico del propóleos, consiste en el análisis
microscópico de los granos de polen y de fragmentos de hojas u otros restos dejados por
las abejas durante la recolección del exudado de planta, los cuales son frecuentes
contaminantes (28).
En general, revisiones sobre la composición química de propóleos dan cuenta de los
siguientes grupos químicos: aldehídos, ácidos y ésteres alifáticos, amino ácidos, ácidos
y ésteres aromáticos, chalconas y dihidrochalconas, flavanonas, flavonas, flavonoides,
ácidos grasos, cetonas, terpenoides, esteroides y azúcares (29).
El grupo más importante de compuestos encontrado en propóleos son los denominados
fenoles, los cuales, constituyen más del 50% del peso total. Las propiedades médicas del
pròpolis son atribuidas principalmente a la presencia de estas sustancias. Más aún, la
literatura apunta que algunas de las actividades pueden ser fuertemente relacionadas a
los flavonoides, el principal compuesto fenólico del pròpolis (30).
Los flavonoides son pigmentos vegetales, sintetizados a partir del aminoácido
fenilalanina, que generalmente exhiben brillantes colores como el de los pétalos de las
flores. La mayoría de las veces emiten fluorescencia cuando son excitados por la luz
UV, y se localizan en las células de las plantas verdes. Los flavonoides son usados por
los botánicos para clasificación taxonómica. Ellos regulan el crecimiento de las plantas
e influencian otras células biológicas de diversas maneras. Los flavonoides inhiben o
destruyen muchas especies bacterianas, inhiben importantes enzimas virales, tales como
la transcriptasa reversa y otras diversas proteasas, y además, destruyen algunos
importantes protozoos (31).
Muchos profesionales están incrementando el uso de flavonoides puros para tratar
muchas importantes enfermedades, debido a su comprobada habilidad de inhibir
enzimas específicas, simular algunas hormonas y neurotransmisores, y eliminar
radicales libres (32).
Se ha demostrado químicamente que los exudados de los árboles de tipo Poplar
(Populus alba), son el principal recurso de pròpolis de zonas con clima mediterráneo
como la zona norte de Europa, Sudamérica, y oeste de Asia (China). Menos
comúnmente, en otras partes del mundo, especies como Bétula, Ulmus, Pinus, Quercus,
Sálix, y Acacia son utilizadas como recurso para el pròpolis. Se ha demostrado además,
que la composición química del género Poplar (Populus) incluye principalmente
muchos tipos de flavonoides, flavonas y fenoles.
En países con clima tropical como Brasil los principales componentes del propóleos
son, terpenoides y prenilados, los cuales derivan de ácidos cumarínicos. Esta diferencia
ha sido explicada por el diferente origen vegetal de este pròpolis, el cual, pertenece
principalmente al género Baccharis spp (33).
ESQUEMA 1: COMPOSICION PROMEDIO DE PROPOLIS
COMPONENTE
Pròpolis P. Nigra
(media)
Pròpolis
Suizo
Pròpolis
Italiano
Pinocembrina
Pinobanksina
O-acetato de pinobanksina
Chrysina
Galangina
Pentenil cafeatos
Bencil cafeato
Prenetil cafeato
Glicéridos fenólicos
Ácidos diterpénicos
7.2
3.7
8.0
8.4
7.8
3.3
3.0
2.8
1.1
-
0.3
-
0.5
-
0.3
0.2
-
-
23.1
-
0.2
-
0.4
0.5
0.2
-
0.9
0.2
-
53.2
2.- CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS
El pròpolis es un material fuertemente adhesivo, Chaillou et al (34), al analizar las
propiedades físicas de una muestra de pròpolis de Argentina, determinaron lo siguiente:
a.- Características organolépticas: 100% presentó estructura homogénea, el 45%
presentó un aspecto de trozos irregulares con brillo, el 30 % con poco brillo, y el resto
trozos irregulares opacos. Los ensayos de consistencia mostraron que el 45% de las
muestras eran poco blandas, el 40% duras y solamente un 15% blandas. Con respecto al
color, el 65% de las muestras presentaron color marrón oscuro, un 20% marrón claro
con tintes amarillos, un 10% con tintes castaños. El olor del 75% de las mismas fue
resinoso, y el sabor de la totalidad de los propóleos fue picante.
b.- Punto de fusión: los valores encontrados para las diferentes regiones en estudio
fluctuaron entre los 64°C y 89.5°C , con un promedio de 70°C.
c.- Impurezas mecánicas, ceras y resinas: el valor medio de impurezas mecánicas
analizadas fue de 24,063%, contenido de cera promedio, de 30,048% y el porcentaje de
resinas, 44,770%.
d.- Índices de oxidación, compuestos fenólicos y flavonoides: el rango de valores del
índice de oxidación osciló entre los 4 y 18 segundos, el promedio fue de 9,8 segundos.
3.- ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Las propiedades farmacológicas del pròpolis son bien conocidas y están bien
documentadas.
Por lo tanto, esto se relaciona con las preferencias de las abejas para la elaboración del
pròpolis en una estación específica del año. Apis mellífera puede detectar, seguramente
cuáles son las plantas que se encuentran en un adecuado estado de desarrollo y, de esta
manera, determinar cuál especie usar. Varios componentes encontrados en el propóleos
en otras partes del mundo, con ciertas propiedades protectoras, son volátiles, por lo que
podrían ser detectados por las abejas a través de sus antenas o su sistema olfativo (35,
36,37).
Las actividades biológicas de algunos de los más importantes componentes del
propóleos son:
- Pinocembrina: actividad antibacteriana, fungicida, y utilidad como anestésico local (35)
- Acacetina: propiedades antiinflamatorias (35). Además, recientemente se ha visto que
es un poderoso inhibidor de enzimas presentes en el Citocromo P450 (pertenecientes a
la familia de las enzimas denominadas CYP1), que estarían involucradas en el
metabolismo de los hidrocarburos policíclicos aromáticos y hormonas. Por ello se
especula que estas enzimas tendrían un rol importante en la aparición de algunos tipos
de cáncer, más aún, que han sido detectadas en algunas muestras de tejidos
cancerígenos (37).
- Conferido: promisorio agente anticarcinogénico al inducir directamente quinona
reductasa y otras enzimas protectoras, sin promover la activación de otros carcinógenos (38).
- Galangina: es uno de los flavonoides que con mayor frecuencia se han encontrado en
propóleos, presenta actividad antimutagénica, antioxidante, secuestrador de radicales
libres y modulador de actividad de enzimas metabólicas, pero se le destaca
principalmente por su capacidad antigenotóxica como un potente agente
quimioprotector frente al cáncer. Además posee actividad antibacteriana (38)
Actividad biocida
En general, las propiedades antimicrobianas del propóleos han sido investigadas en los
últimos años, sin embargo, es difícil comparar los resultados de diferentes estudios,
debido tanto a las diferentes composiciones del propolis como a los diferentes métodos
utilizados para su estudio.
En particular, la actividad biocida del propóleos estudiada frente a bacterias de interés
en medicina, ha mostrado resultados alentadores in vitro e in vivo, ya que inhibió el
crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias, tanto Gram positivo como Gram
negativo. Sin embargo, se ha señalado que el efecto del pròpolis en contra de bacterias
Gram positivo y levaduras, es mayor que sobre bacterias Gram negativo (39,40).
En cuanto a la actividad del propóleos sobre patógenos periodontales, Santos et al,
evaluaron in vitro la susceptibilidad de Prevotella Intermedia y Porphyromonas
gingivalis frente al propóleos, obteniendo valores de CIM entre 64μg/ml y 256μg/ml.
Gebara et al, analizaron un grupo de bacterias aerobias y anaerobias, entre ellas algunas
bacterias periodontopatógenas como Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis y Prevotella intermedia, y
además, levaduras como Cándida albicans. Para Actinobacillus actinomycetemcomitans
ellos obtuvieron una CIM de 1μg/ml; para Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas
gingivalis y Prevotella intermedia, obtuvieron valores de CIM de 0,25μg/ml, y de
12μg/ml para Cándida albicans.
4.- MECANISMO DE ACCIÓN
El mecanismo de acción antimicrobiano del pròpolis es complejo y no está
completamente entendido. De acuerdo a Amoros et al y Bonhevi et al , la actividad en
contra de los microorganismos está más relacionada al efecto sinérgico de los
flavonoides (y otros fenoles), que a la acción de cada uno de ellos por separado. Estos
descubrimientos están de acuerdo con lo que estudió Takaisikikuni y Schilcher , quienes
observaron que la acción antibacteriana utilizaba varios mecanismos, tales como la
formación de complejos streptocócicos pseudomulticelulares, desorganización del
citoplasma, de la membrana plasmática, y de la pared celular, bacteriolisis parcial, e
inhibición de la síntesis de proteínas. Además se observó una inhibición de la división
celular en presencia de pròpolis, y este hecho sugirió que el propóleos podría actuar
inhibiendo la replicación del DNA a través de la RNA polimerasa e, indirectamente,
afectando la división celular.
5.- USO DEL PROPOLEO EN ODONTOLOGÍA
Existen estudios (41), que dan cuenta de las propiedades de inhibitorias del ácido cafeico
y el fenil éster de ácido cafeico (derivados del pròpolis) sobre algunos componentes
involucrados en respuestas inflamatorias periodontales, como las MMPs (matrix
metalloproteinase), las que participan además, en procesos tumorales. Aunque no
existen estudios que relacionen directamente la inhibición que ejercería el pròpolis
sobre las MMPs que se liberan en el periodonto, sí existen estudios analizando las
interacciones que se producen entre estos dos elementos (propóleos y MMPs) en otras
patologías del organismo como algunos tipos de cáncer. Tae-Wook Chung et al
determina que uno de los componentes del pròpolis, el ácido cafeico y su fenil éster de
ácido cafeico (derivado del ácido cafeico), es capaz de inhibir tanto la expresión del gen
de la MMP-9 como la actividad catalítica de su enzima.
En un trabajo realizado por Al-Shaher et al para investigar agentes antimicrobianos
alternativos para conductos endodónticos, comparó la tolerancia de pròpolis e hidróxido
de calcio in vitro sobre fibroblastos del ligamento periodontal y de la pulpa dental,
logrando toxicidades diez veces menores para propóleos, con un 75% mas de viabilidad
celular, en comparación con hidróxido de calcio.
En Cuba se utilizó una pasta dental a base de propóleos, con la cual se realizaron
ensayos en un grupo de niños, analizándose la variación en el índice de COPD. Se logró
una disminución significativa en el índice de caries.
Rosalen et al, observaron que la aplicación de extracto de pròpolis en molares de ratas
redujo la severidad de lesiones cariosas. Ikeno et al, demostró que al incluir un extracto
etanólico de propóleos, proveniente de China, en agua, a una concentración de 1mg/ml,
la incidencia de caries disminuyó de 62,2% a 56,2%. En un estudio clínico que se
realizó para investigar el efecto del pròpolis en la reducción de placa bacteriana, el cual
se realizó durante 3 días, el índice de placa se redujo en un 44,7% aproximadamente
después del tratamiento, comparado con el placebo. Además, el colutorio redujo la
concentración de polisacáridos insolubles en la placa en un 61,7% comparado con el
placebo. Se ha determinado además, que el propóleo es capaz de inhibir in vitro la
enzima glucosiltransferasa. Esta enzima es producida por el Streptococcus mutans y
constituye un factor de virulencia asociado con caries dental. Glucosiltransferasa
cataliza la formación de glucanos solubles e insolubles a partir de sacarosa, y contribuye
significativamente a la formación de la matriz de polisacáridos de la placa dental.
6.- REACCIONES ADVERSAS
Las reacciones adversas a la aplicación local de pròpolis son escasas y se refieren
generalmente a reacciones alérgicas de hipersensibilidad de tipo dermatitis de contacto (42). Se han descrito hasta la fecha un total de 250 casos de alergias por dermatitis de
contacto al propóleos. Los reportes generalmente se describen con dermatitis en las
zonas palmares y dedos, correspondiente a la manipulación de partes de la colmena que
contienen pròpolis, o bien, se han visto reacciones alérgicas en la mucosa oral,
mucositis orales agudas con ulceraciones, debido a la ingesta de grageas o gotas de
pròpolis (43). El principal agente sensibilizante descubierto en la composición de pròpolis
corresponde a 3-metil-2-butenil cafeato y feniletil cafeato. Posiblemente existan otros
alergenos no descubierto a la fecha (42).
2.3 CAVIDAD ORAL
La cavidad oral es una de las zonas anatómicas de nuestro organismo con mayor
número y variedad de bacterias aerobias y anaerobias. Estos microorganismos
interaccionan tanto entre sí como con el medio oral estableciendo un complejo
ecosistema dinámico donde se pueden encontrar de forma simultánea bacterias
residentes y transeúntes ocasionales, en el que podemos apreciar especies bacterianas en
proporciones diferentes. Así, por ejemplo, en el dorso de lengua, asociada con otras
bacterias grampositivas anaerobias facultativas, predomina la especie Streptococcus
salivarius y en el surco gingival predominan Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis
y Streptococcus oralis.
2.4 La placa dental: un tipo de biopelícula
La placa dental se define como una comunidad microbiana que se encuentra sobre la
superficie dental, formando una biopelícula embebida en una matriz de polímeros de
origen bacteriano y salival. Se presenta en la boca de individuos sanos y enfermos, y es
el agente etiológico de dos de las enfermedades orales más prevalentes: la caries dental
y la enfermedad periodontal (44).
En 1978, Costerton (45) introdujo el término biofilm. El biofilm, o biopelícula, es una
formación de agregados bacterianos, usualmente existentes como comunidades
cercanamente asociadas, que se adhieren a una variedad de superficies naturales o
artificiales, en un medio acuoso que contiene una concentración suficiente de nutrientes
para sostener las necesidades metabólicas de la microbiota.
Actualmente, Marsh y Martin (2000), definen a la placa dental como una comunidad
microbiana compleja que se encuentra en la superficie de los dientes, embebida en una
matriz de origen bacteriano y salival.
Las biopelículas constituyen una comunidad microbiana protegida de una amplia
variedad de factores antibacterianos y que predominan en cualquier ecosistema que
posea un nivel suficiente de nutrientes. Todas las biopelículas poseen una estructura y
una fisiología complejas, que les permite crear y mantener un ecosistema abierto de
canales de agua (45). Un estudio reciente sobre la estructura de la placa dental, demostró
que ésta presenta una configuración más abierta de lo que antes se pensaba. Se ha
descubierto la presencia de canales que pueden atravesar la profundidad de la
biopelícula (46).
1.- Ecología de la placa dental
La formación de la placa dental comprende un patrón ordenado de colonización
(sucesión microbiana). Los colonizadores primarios pueden retenerse cerca de la
superficie dental mediante interacciones físico-químicas no específicas entre las
moléculas cargadas provenientes de la célula bacteriana y de la superficie del huésped (47). Posteriormente, se establecen una serie de interacciones intermoleculares específicas
bastante fuertes entre las adhesinas bacterianas y los receptores complementarios de la
película adherida (acondicionadora), dando como resultado una adherencia irreversible (48,49). Estos colonizadores primarios luego crecen, modificando las condiciones
medioambientales locales y haciendo del lugar un medio favorable para la colonización
de especies anaerobias. Estos últimos colonizadores se unen a especies bacterianas ya
adheridas a través de la co-adhesión (47,50). De esta manera se formarán biopelículas
estructuralmente complejas compuestas por diversas especies de microorganismos.
La placa dental, con el tiempo, se convierte en una estructura organizada espacialmente
con organismos que ocupan posiciones particulares definidas, debido a las propiedades
biológicas y físicas del sitio en el que se encuentran, dando lugar a lo que algunos
investigadores han denominado "mosaico de microorganismos" (44).
Una característica clave de una comunidad microbiana es el mantenimiento de una
microflora estable en un medio que es variable. Tal estabilidad ha sido denominada
"homeostasis microbiana".
2.- Tipos de placa bacteriana
Se clasifica: Según su localización: en supragingival y subgingival
Según sus propiedades: en adherente y no adherente
Según su potencial patógeno: en cariogénica y periodontopatogénica.
3.- Formación
La formación de la placa dental es el resultado de una serie de procesos complejos que
involucran una variedad de bacterias y componentes de la cavidad bucal del hospedero.
Estos procesos comprenden:
1.-Formación de la película adquirida sobre la superficie del diente.
2.-Colonización por microorganismos específicos.
3.-Formación de la matriz de la placa.
4.- Estudio microbiológico de las placas dentales
- ¿Quién coloniza la cavidad oral?
En conjunto, la boca es un ecosistema complejo y denso (>2,7 microorganismos/gramo)
compuesto fundamentalmente por Streptococcus del grupo viridans y bacterias
anaerobias. Los microorganismos preponderantes son Streptococcus sanguis,
Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius,
Peptostreptococcus sp., Micrococcus sp., Enterococcus sp., Neisseria sp., Veillonella
sp.,Actinomyces sp., Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Corynebacterium sp.,
Prevotella sp., Porphyromonas sp., Fusobacterium sp., Capnocytophaga sp.,
Actinobacillus sp., Selenomonas sp., Eikenella sp., Campylobacter sp., Treponema sp.,
etc. (51-54). Aunque pueden aislarse en toda la cavidad oral, presentan una marcada
predilección por determinados nichos. Así, S. sanguis, S. mutans, S. mitis y Actinomyces
viscosus colonizan fundamentalmente la superficie del diente (53); S. salivarius y
Veillonella sp. la lengua y la mucosa bucal (52), y Fusobacterium sp., Prevotella sp.,
Porphyromonas sp. y espiroquetas anaerobias la cresta gingival .
Actualmente está claro que no hay que erradicar los microorganismos de la flora, hecho
materialmente imposible y que conduciría a la aparición de sobre infecciones, para
lograr una efectividad máxima del control y tratamiento de los procesos odontógenos,
sino actuar específicamente frente a los agentes causales y restaurar el equilibrio
ecológico.
2.5 INFECCIONES MIXTAS DE LA CAVIDAD ORAL
1.- CLASIFICACION
1.1.- Odontógenas: caries, pulpitis, absceso periapical, gingivitis, periodontitis, osteítis
e infección de los espacios aponeuróticos. En muchos de estos procesos intervienen
bacterias aerobias y anaerobias facultativas de los géneros Porphyromonas, Prevotella,
Fusobacterium, Selenomonas, Streptococcus, Actinomyces, Actinobacillus,
Lactobacillus, Veillonella, Peptostreptococcus y Capnocytophaga.
1.2.- No odontógenas: infecciones de la mucosa oral, de las glándulas salivales y otras.
2.- ESPECIFICIDAD DE LAS INFECCIONES ODONTOGENAS
La especificidad o inespecificidad de las infecciones odontógenas ha ido cambiando y
evolucionado a lo largo del tiempo de acuerdo fundamentalmente con los métodos
diagnósticos disponibles.
En 1924 se implicó a S. mutans y posteriormente, en 1960, se demostró que la
inoculación de este microorganismo a animales gnobióticos daba lugar a la aparición de
caries destructiva. Se acuñó el término de "placa dental bacteriana" y se pensó que
cualquier microorganismo de la flora oral podía causar enfermedad, pero en los años
1970 se demostró que la "cantidad" de placa no estaba directamente relacionada con la
aparición y gravedad de la enfermedad, y se aceptó el carácter específico de algunos
cuadros.
De acuerdo con estos criterios, S. mutans, Actinobacillus actinomycetemcomitans y
Porphyromonas gingivalis son los agentes etiológicos de la caries y la periodontitis
juvenil y del adulto, respectivamente, y se confirma la implicación de otras especies en
la enfermedad periodontal (56) (Esquema N° 2).
2.6 ENFERMEDAD PERIODONTAL
1.- Enfermedad periodontal
El término enfermedad periodontal hace referencia a varias enfermedades que afectan a
la mucosa gingival, el tejido conectivo de sujeción (ligamento periodontal) y el alvéolo
dental. Por tanto, incluirá la gingivitis (afecta sólo a la mucosa gingival, con una
respuesta inflamatoria confinada en la encía) y la periodontitis (asociada con
destrucción de las estructuras de sujeción del diente o periodonto, como ligamento
periodontal, hueso alveolar, cemento y encía). Estas afecciones, junto con la caries, se
encuentran entre las infecciones crónicas más frecuentes.
2.- Gingivitis
Es la inflamación de los tejidos blandos que rodean al diente sin afectación del soporte
periodontal. Existen diferentes tipos de gingivitis con características clínicas y
microbiológicas diferentes: crónica (inducida por la placa dental), ulcerativa
necrotizante (más frecuente en adolescentes que en adultos), hormonal (en la pubertad y
el embarazo), farmacológica (producida por difenilhidantoína, nifedipino, ciclosporina,
etc.) y asociada a enfermedades sistémicas (discrasias sanguíneas, enfermedades
autoinmunitarias, diabetes, SIDA) (57,58,59).
La asociada a la placa dental es la más frecuente, afecta prácticamente a toda la
población y evoluciona en brotes de duración e intensidad variables. Etiológicamente es
inespecífica y son muchos los microorganismos que pueden estar implicados en su
génesis y evolución. Es reversible y no necesariamente llega a afectar a los tejidos de
sujeción del diente. Por este motivo se cuestiona su carácter de "enfermedad" e incluso
se ha postulado un posible efecto beneficioso al propiciar una respuesta inmunológica
local y sistémica frente a patógenos periodontales que controlará el sobrecrecimiento de
estos microorganismos (59).
Esquema N°2. Criterios de especificidad en las periodontitis.
Asociación Eliminación
Respuesta del
huésped
Factores de
virulencia
Modelos
experimentales
P. gingivalis +++ +++ +++ +++ +++
A. actinomy
cetemcomitans +++ +++ +++ +++ +++
P. intermedia +++ ++ ++ +++ +++
F. nucleatum +++ + +++ ++ +
B. forsythus +++ + + +
C. rectus +++ ++
E. corrodens +++ + + ++
P. micros +++ + +
Selenomonas sp. +++
Eubacterium sp. ++ ++
Espiroquetas +++ +++ +++ +++ +
Su etiología es similar a la de las periodontitis, aunque hay diferencias que dependen de
la asociación o no de los dos cuadros. En los casos de gingivitis y ausencia de
periodontitis las especies implicadas con mayor frecuencia son Streptococcus
anginosus, Campylobacter concisus, Treponema socranskii, Actinomyces naeslundii y
S. sanguis. Cuando coexisten ambos procesos se aíslan Eubacterium sp., Fusobacterium
sp., Peptostreptococcus sp., Prevotella intermedia, Selenomonas sputigena,
Campylobacter rectus y Treponema sp. (57,58).
La forma más agresiva y dolorosa es la gingivitis ulcerativa necrotizante aguda, que
cursa con destrucción de las papilas interdentales y del borde gingival, siendo P.
intermedia y los treponemas orales los agentes causales habituales (57,58).
3.- Periodontitis
Se produce una pérdida del ligamento periodontal y una reabsorción del alvéolo
dentario que conducen, en último término, a la pérdida del diente. Es la causa más
frecuente de pérdida de piezas dentarias en los adultos (58).
Clasificación:
La periodontitis puede ser activa (progresiva) o inactiva (quiescente) y la clasificación
más aceptada se basa en el grupo de edad afectado y combina criterios de extensión de
las lesiones y curso evolutivo (Esquema N°3).
Esquema N°3. Clasificación de las periodontitis.
1) Periodontitis del adulto
2) Periodontitis precoz
a) Prepuberal (generalizada/localizada)
b) Juvenil (generalizada/localizada)
c) Rápidamente progresiva
3) Periodontitis asociada a enfermedad sistemática
(síndrome de Down, diabetes tipo I, infección por VIH)
4) Periodontitis ulcerativa-necotrizante
5) Periodontitis refractaria
Otra clasificación viene a ser de acuerdo a su naturaleza u origen y en este sentido
tenemos:
a.- Endógenas.- que son afecciones producidas por bacterias de la microbiota bucal, es
decir bacterias comensales que habitan normalmente algunos sitios de esta cavidad, y
generalmente se citan a las afecciones causadas por P. intermedia, P. melaninogenica,
Eikenella corrodens, Fusobacterium sp., Campilobacter sputorum, Treponemas sp., etc.
b.- Exógenas.- que serían las producidas por bacterias no habituales de la boca, pero
que se instalan en ella producen afecciones de tipo inespecíficas. Son las llamadas
infecciones periodontales verdaderas, y son clásicamente producidas por A.
actinomycetemconmitans y P. gingivalis.
c.- Sobreinfecciones periodontales.- donde se aíslan enterobacterias como la
Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoneae, Candida albicans,
Pseudomona aeruginosa, y otras. Estos son también microorganismos exógenos, que no
producen afección típica bucal, pero se supone, en base a la gran cantidad de factores de
virulencia y a que son patógenos en otros sitios orgánicos, dificulten el tratamiento de
estas afecciones.
De manera general y de acuerdo con Haffajee y Socransky (1994), las bacterias más
frecuentes en las afecciones periodontales son: Actinobacillus actinomycetemcomitans
(A.a.) Bacteroides forsythus, Campilobacter rectus, Eubacterium nodatum,
Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Porphyromona gingivalis,
Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Streptococcus intermedius y varias
especies de Treponemas.
La causa primaria es la acumulación de microorganismos en la superficie del diente y
bajo la encía. En los estudios realizados sobre las zonas afectadas y adyacentes (sin
alteraciones) se comprueba que en las primeras existe un predominio de gramnegativos
anaerobios o facultativos y en las zonas sanas la flora predominante es grampositiva
(Actinomyces sp., Streptococcus sp.).
De manera general, se puede afirmar que la periodontitis es una gingivitis que
evolucionó a tejidos profundos, causando destrucción de éstos, aunque no toda
gingivitis progresa a periodontitis, ya que para que esto suceda, debe acumularse mayor
cantidad de irritantes locales (la placa subgingival y su posterior calcificación son claves
para que se dé este proceso), u otro factor local sobreañadido, que permita la instalación
y progresión de bacterias, de escasa presencia en los tejidos sanos, con gran cantidad de
factores de virulencia.
Periodontitis del adulto
Los microorganismos implicados son numerosos (Esquema N°4). Recientemente se han
descrito nuevas especies (Lactobacillus uli, Prevotella nigrescens) y géneros
(Atopobium) en los sacos periodontales, aunque su significación clínica es incierta.
Otras especies como Streptococcus oralis, Actinomyces sp. y Veillonela parvula se han
aislado de zonas inactivas y quizás desempeñan un papel protector. De todas ellas, P.
gingivalis es la implicada de una forma más clara, ya que cumple todos los criterios de
determinación etiológica específica.
Esquema N°4. Etiología de la periodontitis.
1) Periodontitis del adulto:
P. gingivalis
P. intermedia
C. rectus
B. forsythus
A. acinomycetemcomitans
Eubacterium sp.
Capnocitophaga sp.
Mycoplasma sp.
Fusobacterium sp.
Treponema sp.
Peptostreptococcus sp.
S. sputigena
4) Periodontitis rápidamente progresiva:
A. actinomycetemcomitans
P. gingivalis
P. intermedia
5) Periodontitis refractaria:
B. forsythus
P. melaninogenica
S. intermedius
P. intermedia
P. gingivalis
A. actinomycetemcomitans
E. corrodens
2) Periodontitis prepuberal:
A. actinomycetemcomitans
P. gingivalis
P. intermedia
S. sputigena
E. corrodens
6) Periodontitis ulcerativa necrotizante:
P. intermedia
Treponema sp.
Fusobacterium nucleatum
Leptotrichia buccalis
P. melaninogenica
3) Periodontitis juvenil:
A. actinomycetemcomitans
P. gingivalis
Eubacterium sp.
Fusobacterium sp.
Periodontitis precoz
1) Periodontitis prepuberal: Aparece después de la erupción de la primera dentición.
Es una forma agresiva que conduce a la destrucción rápida de las estructuras del
periodonto. El agente etiológico más importante es A. actinomycetemcomitans, aunque
también están implicados P. intermedia, P. gingivalis, S. sputigena y Eikenella
corrodens (Esquema N°4). En su patogenia es importante la aparición de una disfunción
leucocitaria atribuida inicialmente a una alteración genética. Sin embargo, la
eliminación de A. actinomycetemcomitans reduce el defecto leucocitario, hecho que
sugiere que la infección puede ser la desencadenante de dicha disfunción.
Recientemente se ha demostrado que A. actinomycetemcomitans produce una
leucotoxina .
2) Periodontitis juvenil: La periodontitis juvenil, al igual que la prepuberal, es una
forma agresiva y destructiva que conduce rápidamente a la pérdida del hueso alveolar.
La implicación de A. actinomycetemcomitans es clara. Los pacientes presentan tasas
muy elevadas de anticuerpos y se ha demostrado la transmisión familiar. Otras especies
implicadas, pero con mucha menor frecuencia, son P. gingivalis, Eubacterium sp. y
Fusobacterium sp. (Esquema N°4). Aunque se ha descrito un componente genético que
parece incluir un defecto en la función quimiotáctica de los leucocitos
polimorfonucleares, está por determinar la participación de A. actinomycetemcomitans
en la disfunción leucocitaria. La forma más común es la localizada, que afecta
fundamentalmente a los primeros molares y/o incisivos. La forma generalizada afecta a
la mayor parte de los dientes.
3) Periodontitis rápidamente progresiva: La edad de comienzo se extiende desde la
pubertad hasta aproximadamente los 30 años. Se caracteriza por un avance rápido de las
lesiones y un elevado componente de destrucción tisular. Los agentes etiológicos
implicados son A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis y P. intermedia.
Periodontitis refractaria
Se caracteriza por una ausencia de respuesta al tratamiento. Las especies asociadas son
B. forsythus, P. melaninogenica, C. rectus, Streptococcus intermedius, P. intermedia,
P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans y E. corrodens (Esquema N°4).
Periodontitis ulcerativa necrotizante
Se produce como consecuencia de brotes recidivantes de gingivitis ulcerativa
necrotizante. Los agentes etiológicos más destacados son P. intermedia y Treponema
sp. (Esquema N°4).
Periodontitis asociada a enfermedades sistémicas
La etiología de las infecciones de la cavidad oral en pacientes inmunodeprimidos
presenta algunas características específicas, pero en conjunto es similar a la de los
sujetos inmunocompetentes. Sin embargo, frecuentemente se complican por
sobreinfección con enterobacterias (Klebsiella sp.), Enterococcus sp., Clostridium sp.,
Bacteroides fragilis, Fusobacterium sp. y Candida sp. El papel de estos
microorganismos y de Lactobacillus acidophilus, Streptococcus oralis y Fusobacterium
sp. no está totalmente aclarado. En pacientes con SIDA es frecuente aislar C. rectus y
parece ser un importante patógeno o un indicador de enfermedad periodontal.
4.- Etiología de las Enfermedades Periodontales
La etiología de las enfermedades periodontales siempre ha sido un punto de discusión y
hasta ahora, pese a los avances de la ciencia, no está del todo muy claro, y si no se
comprende bien la causa de una afección, mal puede instaurarse una adecuada
prevención así como un efectivo tratamiento, por lo que siempre se ha buscado aclarar
la causa precisa de estas afecciones.
Es lógico entonces que se requieran métodos para dilucidar si alguna especie bacteriana,
o varias de ellas de manera sinérgica, predominantes en un tipo de lesión, son la causa
del problema, o simplemente son comensales que aprovechan las condiciones del medio
ambiente, para multiplicarse con rapidez y aparecer de manera abundante en este tipo de
lesión, y por ello surgieron básicamente dos parámetros fundamentales que son: 1- los
estudios de los determinantes bioquímicos bacterianos (factores de virulencia), y 2- el
cumplimiento de los postulados de Socransky.
5.- Determinantes bioquímicos o Factores de virulencia
Este aspecto es básico en el estudio de cualquier infección, ya que para que una bacteria
sea capaz de generarla, debe poseer factores que le permitan establecerse en los tejidos,
vencer las defensas orgánicas y producir sustancias citolesivas, definiéndose entonces
los determinantes bioquímicos o factores de virulencia, como una serie de propiedades
que le permitan a las bacterias establecerse (colonizar) en un tejido, generar una
afección, y determinar el grado o gravedad de la infección. Estas propiedades pueden
estar presentes en los microorganismos o producirlos metabólicamente.
En resumen, los factores de virulencia son los elementos a tomar en cuenta para decidir
(desde el punto de vista microbiano) si una bacteria es causante de una afección, o si
solamente son coadyuvantes o agravantes (invasores o predadores secundarios), o si
sólo están presentes en las lesiones aprovechando un ambiente rico en nutrientes y con
bajas defensas como lo son las bolsas periodontales.
Es conveniente, por lo tanto, hacer un resumen de los factores de virulencia y los
principales microorganismos que los poseen:
La cápsula, compuesta por polisacáridos, enmascara a las bacterias de los fagocitos,
por lo cual es un factor antifagocitario. La Porphyromona gingivales (P.g.), los
Prevotellas, Bacteroides y otras tantas, la poseen.
Las fimbrias, compuestas por proteína llamada pilina, le permite a la bacteria adherirse
fuertemente a las superficies que más les favorece, bien sea por nutrientes o por falta de
defensa orgánica. Muchos bacilos como el Pg., Actinibacillus actinomycetemcomitans
(A.a.), Prevotellas intermedia (RL), Bacteroides forsythus, Capnocitophaga ochracea,
que pueden ser calificados como periodontopatógenos clásicos, además de muchas otras
que habitan en el surco gingival, poseen estas estructuras
Los flagelos, compuestos por una proteína denominada flagelina, les permite huir de un
sitio o ir hacia uno favorable. Pocas bacterias orales son móviles.
Presencia de receptores, que son aquellas proteínas que poseen las bacterias en su
superficie, de carga negativa, que les permite adherirse a los tejidos orgánicos de cargas
positivas. Esto les permite a las bacterias evitar las fuerzas de desplazamiento a que
éstas pueden estar sometidas. Muchas bacterias bucales tienen ese tipo de mecanismo de
adhesión.
Enzimas líticas, como la colagenasa, la hialuronidasa, la lecitinasa, la
condroitinsulfatasa y otras, destruyen los tejidos vivos, y permiten a las bacterias
introducirse en ellos, por lo que son llamadas factores de invasividad. Muchas bacterias
de la microbiota bucal, producen enzimas líticas, especialmente P. g., P. intermedia, A.
a., Capnocitophaga, y otras tantas como el Peptostreptococcus magnum.
Fosfolipasa A, una enzima que transforma los fosfolípidos tisulares para originar ácido
araquidónico, que por activación de las ciclooxigenasa 2 (COX2), originan
prostaglandinas, ésta tiene un efecto edematógeno que si bien atrae plasma (nutrimentos
para ellas), también atrae células defensivas, pero las bacterias están bien protegidas
contra ellas. P. gíngivalis y P. endodontalis, son productoras de esta enzima.
Leucotoxina, importante toxina que destruye los leucocitos (polimorfonucleares y
mononucleares), limitando así la defensa de la zona afectada. A. a. es el prototipo
productor de esta toxina, por lo cual se le considera importante agente etiológico en las
periodontitis agresivas en las cuales predominan.
Factor de inhibición de fibroblastos, importante porque los fibroblastos son
productores de fibras colágenas y elásticas, que limitan la invasión bacteriana, y este
factor, dificulta la reparación de los tejidos. A. a. y Capnocitophaga son importantes
productores de este factor.
Factor de inhibición quimiotáctica de leucocitos, que inhibe la atracción de leucocitos
hacia la zona afectada, aún en presencia de C5a, proteína del sistema de Complemento
que promueve la quimiotaxis de leucocitos hacia la zona afectada. Este factor lo
producen P, g., A.a., Capnocitophaga y algunos Fusobactedum.
Como se puede observar, son muchas las formas como las bacterias pueden afectar y
hasta engañar al organismo para sobrevivir en un ambiente sumamente hostil, lleno de
múltiples maneras de acabar con cualquier invasión.
6.- Postulados de Socransky
Con relación al segundo punto, Robert Koch, famoso bacteriólogo alemán del siglo
XIX, marcó una serie de pautas para decidir la etiología bacteriana de alguna
enfermedad (postulados de Koch), y Socransky adaptó esos postulados a la etiología de
la enfermedad periodontal (Negroni, Marta, 1999), que en resumen son:
1.- El microorganismo debe estar en grandes cantidades en los sitios activos de la
afección.
2.- La eliminación del microorganismo, deberá producir la remisión de la afección.
3.- Los microorganismos deben poseer suficientes factores de virulencia.
4.- Debe existir respuesta inmune (celular o humoral) en la zona afectada.
5.- La implantación experimental de esas bacterias en un surco gingival, debe inducir la
enfermedad.
Con relación al punto 1, se puede decir que son muchísimos los microorganismos
aislados de lesiones periodontales, pero para implicar al microorganismo como
periodontopatógeno, deben aislarse en gran número y de manera constante en relación
con una patología específica. El punto 2 se explica por si solo, así como el 3. Con
relación al punto 4, la bacteria implicada debe ser capaz de alterar de manera notable al
organismo para que éste reaccione, estimulando la respuesta inmune específica, es decir,
la zona afectada debe ser infiltrada con múltiples células defensivas tipo macrófagos,
con la generación de anticuerpos, así como también la producción de interleuquinas y
además se deben encontrar allí bacterias fagocitadas; y el 5 quizás sea el más
problemático porque se debe reunir más de una condición para que se dé una infección
gingivoperiodontal experimental. Un punto importante a tomar en cuenta es el estado
inmunológico del paciente o el animal de experimentación, ya que parece ser que
algunas formas de enfermedad periodontal están relacionadas con factores hereditarios o
congénitos como lo sería la transmisión ligada al cromosoma X.
2.7 BACTERIAS PERIODONTOPATOGENAS
Casi todas las bacterias implicadas hasta ahora como periodontopatógenas, cumplen con
los Postulados de Socransky, sobre todo (A.a.) y (Pg.), quienes son tomados como
periodontopatógenos típicos. Adicionalmente, podemos mencionar a la Prevotella
intermedia, Fusobacterium nucleatum, P. melaninogenica y P. nigrensis, al
Capnocitophaga ochracea, al Bacteroides forsythus, la Wolinella (Campilobacter)
recta, al Peptostreptococcus micros y P. magnum, Treponema vincentii y otros tantos.
Enumerar y describir las principales bacterias implicadas en la génesis de los diferentes
tipos de periodontitis, no es cosa fácil, ya que la revisión de la extensa bibliografía sobre
el tema, es a veces algo contradictoria, pero si se pueden obtener datos que permiten
afirmar a un microorganismo como periodontopatógeno, aunque muchos autores
prefieren llamarlos "posibles patógenos periodontales".
Aunque hay más de 300 especies que se aíslan en los sacos periodontales, solo un
pequeño porcentaje de ellas se consideran etiológicamente importantes.
El grupo de Bacilos Anaerobios Gram Negativos mayormente relacionados en la
etiología de la enfermedad periodontal comprende los Géneros Porphyromonas,
Prevotella, Bacteroides y Fusobacterium, los cuales están ubicados dentro de la familia
Bacteroidaceae, según Bergey's Manual of Systemic Bacteriology (1994). La
clasificación de estas bacterias ha sido difícil y por ello a lo largo de los años han
emergido numerosas reclasificaciones taxonómicas, que posiblemente continúen en el
futuro.
1.- Género Porphyromonas
Carecen de metabolismo fermentativo, por lo que son llamadas asacarolíticas, utilizan
substratos nitrogenados como fuente de energía, no se desarrollan en presencia de bilis y
son sensibles a la vancomicina.
Actualmente el Género Porphyromonas comprende doce especies, pero solo tres se han
aislado de la cavidad bucal del hombre, P. gingivalis, P. endodontalis y P.
asaccharolytica. Estas especies se caracterizan, además, por producir un pigmento
negro en sus colonias, característica que se observa en medios de cultivo que contienen
sangre lisada, hemina y vitamina K. Dicha pigmentación se debe a la presencia de
hemina y protoporfirina. La hemina, producto de la descomposición de la hemoglobina
es un factor relevante para el crecimiento de estas bacterias tanto in vivo como in vitro.
P. gingivalis, ha sido considerada una bacteria periodontopatógena por excelencia, se
aísla del surco gingival especialmente cuando no existe una buena salud periodontal, y
se ha asociado especialmente con la progresión de la periodontitis crónica en el adulto.
Van Winkelhoff (1988); Marhs (2000); Liebana (2002), refieren que P. gingivalis es el
microorganismo más patógeno dentro del grupo de Bacilos Anaerobios Gram
Negativos. Ellos señalan que el poder patógeno de esta bacteria en la colonización,
destrucción del tejido periodontal y evasión de las defensas del hospedero, tiene
relación con un gran número de factores de virulencia.
Porphyromonas gingivales.
Estos son cocobacilos capsulados, inmóviles, fimbriados, gramnegativos, anaeróbicos
estrictos, asacarolíticos (no fermentan carbohidratos), productores de un pigmento negro
característico en agar-sangre y su crecimiento es favorecido por la protoporfirina. Son
sensibles a las sales biliares al 20 % y se aíslan de la saliva, lengua, amígdalas, placa
dental y otros sitios de la boca, pero se aíslan con frecuencia y en alto número en
pacientes con bolsas periodontales, por lo que se les relaciona con las periodontitis
crónicas (del adulto) y sus formas refractarias. No se han asociado con infecciones
extraorales.
Factores de virulencia
La Pg no posee plásmidos o agentes capaces de formar poros en las membranas
celulares de las células objetivo; pero tiene elementos con potencial de inserción.
Cápsula de polisacárido. Son barreras fisico-químicas de la bacteria, dan protección
contra la desecación y resistencia a la fagocitocis por los PMN neutrófilos.
La Pg tiene una cápsula densa y amorfa de aproximadamente 15 nm de espesor,
alrededor de la membrana exterior. Existe una fuerte relación entre la encapsulación de
Pg y la habilidad para funcionar como un patógeno oral. Esta encapsulación incrementa
su resistencia a la fagocitosis, resistencia al suero e inducción decrecida a los leucocitos
polimorfonucleares. Schiffer et al, postulan que esta barrera física gruesa funciona como
una máscara física para los lipopolisacáridos, impidiendo la activación de la cascada del
complemento. La bacteria invasora se protege de esta manera de la opsonización y
fagocitosis.
Hemaglutina. La Pg posee hemaglutininas que participan del proceso de
hemaglutinación de las células rojas sanguíneas. Ésta es mediada por adhesinas
asociadas a la superficie de la bacteria. Se ha identificado en Pg por electrofóresis una
proteína de adhesión hemaglutinante llamada HA-Ag2, como un antígeno común a
todas las especies, con la capacidad de unión a los eritrocitos. Esta proteína también
participa en la adherencia a las células epiteliales.
Enzimas. La Pg produce una amplia variedad de enzimas las cuales son consideradas
como los principales factores de virulencia. Entre estas tenemos, la colagenasa y la
proteasa parecida a la tripsina, que son muy especificas para Pg. Por estas enzimas este
microorganismo puede ser distinguido de otras cadenas anaeróbicas negras
pigmentadas.
Lipopolisacáridos (LPS). El lipopolisacárido de Pg es significativamente mitogénico.
Sismey-Durrant y Hope reportaron que los LPS producidos por Pg fueron capaces de
estimular la producción de Prostaglandinas E2 de los macrófagpos de las ratas y en
fibroblastos gingivales humanos. Tamura et al y Takada et al han demostrado la
estimulación de IL-1ß e IL-8 por los LPS de Pg en los fibroblastos gingivales humanos.
2.- Género Fusobacterium
Las bacterias que conforman el Género Fusobacterium, se caracterizan por ser bacilos
largos fusiformes, inmóviles, no esporulados y generalmente no fermentativos. La
producción de ácido butírico como principal producto metabólico permite diferenciar
Fusobacterium de Prevotella, Porphyromonas y Bacteroides.
Se han descrito varias especies que habitan en el surco gingival en la cavidad bucal,
entre ellas las más comunes son F. nucleatum, F. naviforme, F. periodonticum, F. alocis
y F. sulci. Estas especies han sido relacionadas con la enfermedad periodontal, sin
embargo, su significación como patógenos es dudosa, a excepción de F. nucleatum,
especie que se ha sido aislado con mayor frecuencia en el surco gingival. Se han
descrito hasta los momentos cinco subespecies de esta especie bacteriana: F. nucleatum
nucleatum, F. nucleatum polymorphum, F. nucleatum fusiforme, F. nucleatum vincentii
y F. nucleatum animalis. De ellas F. nucleatum nucleatum, es significativamente
frecuente en la periodontitis.
Su poder patógeno está asociado a la presencia de fimbrias, lipopolisacáridos, a la
producción de factores solubles inhibidores de la quimiotaxis de los polimorfonucleares
y a la elaboración de metabolitos que se comportan como compuestos tóxicos tisulares.
Fusobacterium nucleatum
La virulencia que posee el Fusobacterium nucleatum se debe a sus componentes
estructurales. Los polisacáridos del Fusobacterium nucleatum son considerados
endotoxinas que poseen actividades biológicas como reacción local de Schwartzman,
mortogenicidad de las células B, actividad policlonal de las células B, inducción de la
reabsorción ósea y la producción de interleuquinas por los macrófagos.
Se agregará que la gran mayoría de las bacterias que se han señalado aquí como
periodontopatógenas son gramnegativas y anaeróbicas estricta, por lo que prefieren
zonas muy pobres en oxígeno, como las que se encuentran en el surco gingival o en las
bolsas periodontales, y eso podría explicar porque son tan abundantes en las lesiones
destructivas periodontales, sin que sean necesariamente causa de ellas, pero si podrían
agravarlas, aunque, como puede observarse, tienen varios factores de virulencia y
muchas cumplen con algunos postulados de Socransky, pero solamente la
Porphyromona gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium
nucleatum y algunas Prevotellas, tienen suficientes razones para considerarse
periodontopatógenos.
2.8 INDICES EPIDEMIOLÓGICOS PERIODONTALES
INDICE GINGIVAL (Loe y Silness, 1963) (Loe 1967)
Determina la severidad y localización de la inflamación gingival mediante la evaluación
de la fragilidad capilar. Se evalúa todas las piezas dentarias existentes, en cada pieza se
toma 04 áreas:
- Por bucal: distal, medio y mesial.
- Por palatino o lingual: porción media.
Procedimiento:
- Seque con un chorro de aire la encia marginal
- Sondee la hendidura gingival con la sonda periodontal.
- Lleve la sonda hasta el fondo de la hendidura o bolsa y recórrala en el sentido
lateral de mesial a distal o viceversa.
- Regístrese los datos en la historia clínica, según los siguientes criterios.
Grado 0 = encía normal
Grado 1 = inflamación leve
- Ligero cambio de color
- Ligero edema del margen
gingival
- No sangrado al sondaje.
Grado 2 = inflamación moderada
- El tejido se aprecia brillante y liso
- Enrojecimiento moderado y edema
- Sangrado al sondaje
Grado 3 = inflamación severa
- Edema y/o ulceración
- Enrojecimiento marcado
- Sangrado espontáneo. Universidad Peruana Cayetano Heredia – Facultad
de Estomatología “Roberto Beltrán Neira”
2.9 MEDIOS DE TRANSPORTE Y DE CULTIVO
Medio Tioglicolato suplementado para el transporte y cultivo de microorganismos
anaerobios.
Preparación: Se alista 100 ml de caldo tioglicolato el cual se hierve hasta alcanzar una
solución homogénea y transparente; se deja reposar por 15 minutos para luego
esterilizarlo en autoclave por 15 minutos a 125 grados. Se deja enfriar a temperatura
ambiente por unos 5 minutos y se le agrega 50 ug de hemina y 50 ug de menadiona.
Luego, el caldo se traslada en tubos estériles de acuerdo a la necesidad, con tapa rosca
de 5ml cada uno, los mismos que serán llenados al ras, cerrados vigorosamente y
almacenados en una estufa a 37 grados por 24 horas para el control de esterilidad
respectivo. Si al cabo de ese tiempo se observara turbidez, crecimiento o cualquier
alteración en el caldo, éste se descartaba por contaminación.
Agar Brucella-sangre suplementado para el cultivo de microorganismos
anaerobios estrictos exigentes
Preparación: Se alista 500 ml de agar Brucella base (Himedia Laboratories SA,India) al
cual se hierve hasta alcanzar una solución homogénea y transparente; se deja reposar
por 15 minutos para luego esterilizarlo en autoclave por 15 minutos a 125 grados. Se
deja enfriar a temperatura ambiente por unos 5 min. y se le agrega 25 ml de sangre
desfibrinada de carnero (procesada en el Instituto Nacional de Salud), 0.5 ml de hemina
(Himedia Laboratories SA. India) 35 y 1ml de menadiona diluidas.
Luego el agar, aún en su estado líquido, se traslada a 25 placas de Petri estériles,
depositando 20 ml en cada una, donde finalmente el agar se gelificará. El porcentaje
final alcanzado por placa de Petri será de 5% sangre, 0.0005 % hemina y 0.00001%
menadiona. Las placas serán incubadas en una estufa a 37 grados por 24 horas para el
control de esterilidad respectivo. Si al cabo de ese tiempo se observaba crecimiento
bacteriano o cualquier alteración en el agar, éste se descartaría por contaminación.
2.10 HIPOTESIS
Dado que a mayor concentración de las soluciones de Propóleo etanólico, estas tienen
mayor actividad antibacteriana In Vitro, entonces se afirma que cuando la concentración
es del 30% será mayor su actividad antibacteriana In Vitro frente al crecimiento de las
dos bacterias Periodontopatógenas: Porphyromona Gingivalis y Fusobacterium
Nucleatum.
2.11 OBJETIVO GENERAL
Determinar in vitro la concentración de Soluciones de Propóleo Etanólico que tengan
mayor actividad antibacteriana sobre las bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la
enfermedad gingivoperiodontal.
2.12 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Demostrar la actividad antibacteriana in Vitro de Propóleo Etanólico al 5% de
concentración, sobre dos Bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad
Gingivoperiodontal.
Demostrar la actividad antibacteriana in Vitro de Propóleo Etanólico al 15% de
concentración, sobre dos Bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad
Gingivoperiodontal.
Demostrar la actividad antibacteriana in Vitro de Propóleo Etanólico al 30% de
concentración, sobre dos Bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad
Gingivoperiodontal.
Comparar las actividades antibacterianas in Vitro de Propóleo Etanólico al 5%, 15%,
30% de concentración frente a la Amoxicilina, sobre dos Bacterias Periodontopatógenas
frecuentes en la Enfermedad Gingivoperiodontal
Comprobar las propiedades antibacterianas del Propóleo Etanólico, determinando la
longitud de halos de inhibición sobre el cultivo de cada uno de las Bacterias aisladas.
MATERIALES Y METODOS
I. MATERIALES Y METODOS
3.1 DISEÑO DEL ESTUDIO:
Experimental: porque se manipuló intencionalmente las condiciones de la
investigación (variable independiente) y se analiza sus efectos sobre la variable
dependiente.
Grupos control: un control positivo representado por los discos con antibiótico
(amoxicilina), un control negativo representado por discos con agua destilada estéril y
un grupo experimental representado por discos con extracto etanólico de Propóleo a
diferentes concentraciones.
3.2 TIPO DE ESTUDIO:
Según el periodo en que se capta la información:
Prospectivo: porque los datos serán registrados conforme a la ocurrencia de los hechos.
Según los objetivos de la investigación:
In Vitro: debido a que el estudio lo realizaremos en medios de cultivo que servirán para
el desarrollo de las bacterias, manejados estos en laboratorio.
Según la evolución del fenómeno estudiado:
Longitudinal: por que las variables de estudio serán observadas a lo largo de un tiempo
determinado.
3.3 POBLACION Y MUESTRA DE LA INVESTIGACION:
1.- Población:
Pacientes con Enfermedad Gingivoperiodontal que acude al Servicio de Periodoncia del
Hospital Militar Central Crl. Luis Arias Schreiber
2.- Muestra:
Muestra dirigida por conveniencia no probabilística, constituida por 20 pacientes
atendidos en el Servicio de Periodoncia del Hospital Militar Central Crl. Luis Arias
Schreiber.
3.- Unidad de estudio:
Paciente con enfermedad Gingivoperiodontal que acude al Servicio de Periodoncia del
Hospital Militar Central Crl. Luis Arias Schreiber.
4.- Unidad de análisis:
Cepas de bacterias anaerobias estrictas y facultativas (cepas ATCC) más frecuentes
identificados por género y especie adquiridos de los Laboratorios GenLab SAC, las
cuales son:
· Porphyromona gingivalis (ATCC 33277) (altamente patogénico)
· Fusobacterium Nucleatum (ATCC 25586) (moderadamente patogénico)
Muestras de la placa subgingival de pacientes que firmen el consentimiento informado
5.- Criterios de inclusión:
- Bacterias anaerobias estrictas y facultativas más frecuentes en la enfermedad
Gingivoperiodontal.
- Bacterias que no tengan contacto con ningún tipo de medicamento o solución
antimicrobiana.
6.- Criterios de exclusión:
- Cepas que no pudieran ser reconstituidas en medio de cultivo.
3.4 OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
VARIABLES DE ESTUDIO
Variable Independiente:
- Extracto de Propóleo etanólico al 5%, 15%, 30%
Bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la enfermedad Gingivoperiodontal.
Variable Dependiente:
- Actividad antibacteriana in Vitro de extracto de Propóleo etanólico sobre bacterias
Periodontopatógenas.
VARIABLES DE CONTROL
- Control positivo: Amoxicilina 500mg.
- Control negativo: Agua destilada estéril.
OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES VARIABLES INDEPENDIENTES
VARIABLE DEFINICIÓN CONCEPTUAL DIMENSIONES
NATURALEZA
DE LA VARIABLE
FORMA DE
MEDICION
ESCALA DE
MEDICION
INDICADOR
Solución de propóleo etanólico
a diferentes concentraciones
Solución resultante del proceso de disolución del propóleo en un
vehiculo etanólico en una unidad de
volumen determinada
Diferentes concentraciones Cuantitativa Directa
Razón (5%-15%-
30%)
Concentración de propóleo
etanólico (peso
Prop/volumen) *alcohol 70%
Bacterias Periodontopatógena
s
Bacterias anaerobias
estrictas que colonizan
frecuentemente los tejidos
subgingivales durante la
enfermedad Gingivoperiodontal
Bacterias anaerobias estrictas:
P.gingivalis, F. nucleatum
Cualitativa Directa -
Identificación de los
microorganismos aislados
VARIABLE DEPENDIENTE:
VARIABLE DEFINICIÓN CONCEPTUAL DIMENSIONES
NATURALEZA
DE LA VARIABLE
FORMA DE
MEDICION
ESCALA DE
MEDICION
INDICADOR
Actividad antibacteriana in
Vitro de la solución de Propóleo
etanólico a diferentes
concentraciones
Capacidad de una sustancia de inhibir el desarrollo y
crecimiento de P.gingivalis, F.
nucleatum
Actividad antibacteriana
de las soluciones de
Propóleo. etanólico al
5%-15%-30% sobre
P.gingivalis, F. nucleatum
Cuantitativa Directa Ordinal
Halos de inhibición del
crec. Bacteriano medido en mm de
diámetro de las soluciones de
Propóleo. etanólico a diferentes
concentraciones
3.5 INSTRUMENTOS:
Se utilizará como instrumento para la recolección de datos:
Ficha N°1: “FICHA DE APLICACIÓN” : Elaborado por el investigador,
donde los datos obtenidos en laboratorio serán registrados, todos estos de manera
codificada. (Anexo 1)
Ficha N°2: “CONSENTIMIENTO INFORMADO”. Importante ya que en este
documento el paciente da su consentimiento y se compromete a cumplir lo indicado en
dicho documento. (Anexo 2)
Ficha N°3: “FICHA CLINICA DE SELECCIÓN”. Donde solo los pacientes ya
seleccionados donantes de la muestra, consignan datos, antecedentes personales y
algunos índices epidemiológicos periodontales. (Anexo 3)
3.6 RECOLECCION DE DATOS:
La recolección de datos estará a cargo del investigador, realizando previamente las
coordinaciones con las autoridades pertinentes del servicio y hospital, para que las
actividades programadas se realizaran sin interrupción.
Las técnicas a emplear estarán bajo la supervisión y control continuo por parte de los
asesores del Proyecto de Investigación.
3.7 OBTENCION Y PREPARACION DE LA SOLUCION ETANOLICA DE
PROPOLEO
Recolección e identificación del Propóleo:
Realizado en las colmenas del Centro de Producción e Investigación apícola de la
región de Chanchamayo, departamento de Junín, ubicada a una altitud de 720 msnm,
cuya foresta está integrada por Eucalipto, Sauce, Pino, Cipres entre otros, los cuales
proporcionan fuente principal de resina a partir de las cuales las abejas elaboran el
Propóleo.
Las abejas que residen en estas colmenas son del genero Apis Mellifera y la recolección
será mediante la “técnica del raspado” (con espátula).
Se almacena el Propóleo en bolsas atóxicas transparentes (usados para conservar
alimentos).
Traslado al laboratorio:
Colocados de manera conjunta en bolsas oscuras alejados de la luz (los principios
activos del Propóleo se oxidan en presencia de la luz), se transportaron hacia el
laboratorio NATURAL BEE HEALTH INDUSTRY S.R.L. dirigido por el Magíster en
Ciencias JULIO CESAR BRACHO PEREZ que labora en la UNIVERSIDAD
NACIONAL AGRARIA DE LA MOLINA Facultad de Ciencias. Es un producto ya
estandarizado y elaborado bajo las normas adecuadas.
Selección y/o eliminación de impurezas:
Con la finalidad, la materia prima debe estar libre de impurezas burdas (astillas,
extremidades, tórax o alas de las abejas, así como de material de desecho).
Congelado:
Se congela la masa de Propóleo a temperatura de -20 A -40 ºC por 48 horas.
Pulverizado y pesado del Propóleo:
Realizado rápidamente en un molino eléctrico y se pesa la cantidad necesaria de
acuerdo a la concentración de extracto final que se desee obtener: 300 gr y 1800 gr para
la elaboración de extractos al 5% y 30 % respectivamente.
Elaboración de extracto etanólico de Propóleos al 5% (EEP 5%) Y 30% (EEP
30%):
La materia prima pesada se trasvasa a dos frascos ámbar de boca ancha, se añaden 600
ml y 2000 ml de solución etanólica al 70% (al 96% consumible), se mantiene en reposo
durante 2h, concluido el tiempo de reposo se coloca en un baño de agua a una
temperatura de 38°C y se calienta suavemente con agitación por durante 15 min.
Se obtiene un extracto de Propóleo al 5% (concentración 50ug/ml) y Propóleo al 30%
(concentración 300ug/ml)
Maceración del Propóleo:
Se colocan en frascos de vidrio color caramelo y bien tapados en un lugar seco y fresco,
alejado de la luz, durante un periodo de 15 días, agitándolos varias veces en el día.
Filtrado:
Terminado el proceso de maceración, las soluciones etanólicas sobrenadantes se
decantan cuidadosamente y se filtran previamente a través de papel de filtración rápida.
Se somete a temperatura de refrigeración durante 24 h y se procede a la filtración final
con papel de filtración rápida, obteniéndose el EEP 5% Y EEP 30%.
Elaboración de los EEP 15%:
A partir del EEP 30% se elaborará el EEP 15 % por dilución, añadiendo solución
etanólica al 70% hasta alcanzar la concentración del 15% ( concentración 150ug/ml ).
3.8 CEPAS BACTERIANAS PARA EL ESTUDIO: (Proyecto Piloto)
Por tratarse de un estudio experimental en el cual se trabajarán con microorganismo
anaerobios estrictos, serán cepas anaerobias estándar ATCC (American Type Culture
Collection), previamente identificadas por género y especie; importadas a través de
laboratorios GenLab S.A.C, financiados por el investigador.
· Porphyromona gingivalis (Anaerobias estrictas, altamente patogénico)- ATCC
(33277)
· Fusobacterium nucleatum.(Anaerobias estrictas, moderadamente patogénico)-
ATCC (25586)
3.8.1 Crecimiento de cepas bacterianas estándares:
- Fusobacterium nucleatum: sembrados en Agar Schedler, adicionado con sangre de
carnero al 5%, hemina y vitamina K, más un sobre de anaerobiosis, a 37°C en cámara
anaerobia.
- Porphyromona gingivalis: sembrados en Agar Brucella, suplementado sangre de
carnero al 5%, hemina y vitamina K, más un sobre de anaerobiosis a 37°C en cámara
anaerobia y 5% de CO2.
3.8.2 Reconstitución de las cepas estándar ATCC:
- Fusobacterium nucleatum ATCC (25586): para viabilizar esta cepa bacteriana se
utilizará un frasco con caldo de Tioglicolato (3ml), donde se introducirá los cristales
liofilizados contenidos en el vial (25586), en condiciones de anaerobiosis. Se llevará a
incubadora a 37° por el lapso de 24 horas.
Al cabo de las 24 horas se realizará un repicaje con este inóculo en placas con agar
sangre Schedler, llevándose nuevamente a incubar por 24 horas más.
- Porphyromona gingivalis ATCC (33277): para viabilizar esta cepa bacteriana se
utilizará un frasco con caldo de Tioglicolato (3ml), donde se introducirá los cristales
liofilizados contenidos en el vial (33277), en condiciones estériles. Se llevará a
incubadora a 37° por el lapso de 72 horas.
Al cabo de las 72 horas se realizará un repicaje con este inóculo en placas con agar
sangre Brucella, llevándose nuevamente a incubar por 48 horas más.
3.8.3 Prueba de sensibilidad antibacteriana:
- Fusobacterium nucleatum ATCC (25586):
Se hará uso de la cámara de anaerobiosis, para lo cual antes de llenarla se introducirán
todos los materiales que serán utilizados.
Se procederá a sembrar con un hisopo el inóculo bacteriano en 4 placas que contengan
agar sangre Schedler con los suplementos antes mencionados.
Con sacabocados estériles se procederá a preparar los pocillos que tendrán un diámetro
de 7mm aproximadamente, a una distancia de 15mm entre sí, en número de cinco por
cada placa, donde se colocaran las tres concentraciones de Propóleo (5%-15%-30%), un
grupo control negativo (agua bidestilada) y un grupo control positivo (Amoxicilina)
Las 4 placas serán colocadas en una jarra y/o campana de anaerobiosis con el indicador
y sobre de anaerobiosis respectivos, llevándose esta a la incubadora a 37° C por un
periodo de 48 a 72 horas.
Se procederá a la lectura de la medida de los halos de inhibición, con la ayuda del pie de
rey o calibrador.
- Porphyromona gingivalis ATCC (33277):
Bajo condiciones estériles se procederá a sembrar con un hisopo el inóculo bacteriano
en 4 placas con agar sangre Brucella.
El procedimiento similar al anterior culmina al colocar las 4 placas en una jarra de
anaerobiosis bajo microaerofilia (se coloca en el interior de la jarra una pequeña vela
encendida que al ser cerrada combustiona el O2).
Se llevará la jarra de anaerobiosis a la incubadora a 37°C por un periodo de 48 a 72
horas, se procederá a la lectura de la medida de los halos de inhibición, con la ayuda del
pie de rey o calibrador.
3.9 PACIENTES
Una vez realizado el Proyecto piloto con cepas ATCC, haber calibrado los posibles
errores y perfeccionado la técnica, procedemos a la recolección de muestras de
pacientes que acudieran al servicio de Periodoncia del Hospital Militar Central.
1.- Técnica de recolección de datos.-
Una vez obtenido el “consentimiento Informado” Ficha Nª2 (Anexo 2), se procederá al
llenado de la Ficha Nº3, donde la técnica a realizar será mediante la entrevista con
preguntas cerradas y el examen clínico (odontograma, periodontograma, profundidad
de la bolsa, índice gingival, índice de retención, índice de movilidad dentaria, índice de
furcación, etc.), de ser posible este ha de realizarse un día previo a la toma de muestras.
2.- Procedimiento de recolección de datos.-
Se seleccionarán pacientes en numero de 20 aproximadamente, con presencia de
signos clínicos de inflamación causada por periodontitis según los INDICES
EPIDEMIOLÓGICOS PERIODONTALES de Loe y Sillness, como sangrado gingival
al sondaje, enrojecimiento de la encía, aumento de volumen, y además, presencia de
saco periodontal con pérdida de inserción y movilidad dentaria, se muestrearán sacos
con profundidades mayor o igual a 4mm, además que se cumplirán con los criterios de
inclusión y exclusión mencionados más abajo.
Criterios de inclusión:
- Pacientes lúcidos orientados en tiempo, espacio y persona (LOTEP).
- El grupo control estará conformado por pacientes cuyas edades oscilen entre 15 y 60
años y de ambos sexos.
- Los sujetos escogidos para el grupo de estudio serán individuos que tengan un mínimo
de 10 dientes permanentes y un diagnóstico de gingivitis o periodontitis.
- Pacientes que acepten voluntariamente y autoricen por escrito formar parte del estudio.
Criterios de exclusión:
- Pacientes con padecimientos sistémicos (contemplados en el Anexo 3).
- Pacientes que se encuentran recibiendo terapia periodontal o farmacológica sistémica en
las últimas semanas previas a la toma de la muestra.
- Pacientes que fumen y/o usen algún tipo de antiséptico bucal.
- Pacientes mujeres embarazadas.
Toma de muestra de placa dental subgingival: Será realizada por el Investigador del
presente estudio, con el apoyo del Odontólogo encargado de la atención en esos
momentos. Una vez seleccionados los dientes para tomar las muestras, realizaremos el
aislamiento de la zona elegida a manera de evitar la contaminación de la muestra
subgingival con la saliva, con una torunda de algodón estéril se secará la zona.
La muestra será obtenida removiendo la placa supragingival con una cureta periodontal
(Hu FriedyÒ), dicho instrumento será aplicado en sentido coronal.
Posteriormente se aplicará una suave corriente de aire de manera de producir el
despegamiento del borde superior de la encía marginal.
Luego se procederá a tomar la muestra con conos de papel de endodoncia y/o puntas de
papel absorbentes estériles número 30 o 35, aproximadamente tres, las cuales serán
insertadas en la profundidad del saco, colocándolos cuidadosamente sin ejercer presión,
procurando no perforar el fondo, durante 15 a 20 segundos.
La primera se aplicará por mesial de la pieza dentaria elegida, la segunda se colocará
por vestibular y la tercera por distal de la misma, después de haber colocado la última
punta de papel absorbente, se retirarán todas juntas y se introducirán rápidamente en
tubos (rotulados con el código del paciente) que contengan aproximadamente 2ml de
medio de transporte estéril sellado de Caldo Tioglicolato, de tal manera que cerca al
flameo de un mechero se conserve su esterilidad y nuevamente se taparan, este medio
de transporte nos permitirá una tolerancia de no más de 24 horas para su
procesamiento en el laboratorio.
Para su posterior identificación bacteriológica respectiva (mediante tinción Gram sobre
la muestra del portaobjeto, para su identificación morfológica en el microscopio).
Procesamiento en el laboratorio (Servicio de Patología-Laboratorio de
Microbiología): llegada la muestra inmediatamente se procederá a colocarla en la
incubadora por un periodo de 24 a 48 horas, al cabo del cual se podrá observar turbidez,
signo que nos demuestra que habrá una conservación bacteriana apropiada.
Preparación de medios: Grupos de cinco placas serán preparadas previamente bajo las
condiciones de esterilidad establecidas, en medios como el Agar Brucella y Agar
Schedler que serán suplementados con sangre de carnero al 5% (proporcionada por el
INC), hemina y vitamina K, para asegurar el mayor crecimiento posible de los
anaerobios.
Sembrado de muestras: Con una asa de Koller, en un tiempo máximo de 10 min
procederemos a la siembra en las placas, para evitar la pérdida de las muestras, estas
serán llevadas inmediatamente a la jarra de anaerobiosis más un sobre de anaerobiosis
de la marca “Anaerocult”, cerrados por un tiempo de 6 a 7 días hasta observar el
crecimiento bacteriano.
Aislamiento: Obtenido el crecimiento de las bacterias, procederemos a su identificación
morfológica celular, mediante las técnicas de tinción Gram, usaremos como batería el
Cristal Violeta más bicarbonato de Na, Lugol, Alcohol Acetona y la Safranina o
Fuccina.
Las bacterias en estudio presentan morfología celular macroscópica y microscópica muy
marcadas y bien diferenciadas:
Prueba de la actividad antibacteriana: una vez reactivada las bacterias estas serán
diluidas en tubos con agua bidestilada de 3 ml hasta obtener una dilución de Mc.Farland
1.
Se procederá a realizar la siembra de las bacterias en las placas las cuales contienen el
Agar respectivo, con un hisopo estéril el cual se pasará de manera uniforme por toda la
placa.
Procedemos a trabajar en los pocillos, aplicando las soluciones y los grupos control con
una micropipeta calibrada de 10ul.
La siembra de las soluciones se realizará por cada género de bacteria y por
quintuplicado, realizando el inmediato transporte de las placas hacia la jarra de
anaerobiosis (se utilizó sobres de anaerobiosis de la marca “Anaerocult”) por un periodo
de 48-72 horas, esperando la formación de halo de inhibición alrededor de los pocillos.
F.nucleatum Mal
olor
Bacilos
largos
Colonias
traslucidas
Formas
irregulares(parecido al
moho del pan)
P.gingivalis Mal
olor
Cocobacilos
pequeños
Café oscuro Convexas, lisas
circulares
zonas
hemolítica
Fluores
cencia
U.V
SESGOS PROBABLES Y FACTORES DE CONFUSION (LIMITACIONES):
- No se encontraron antecedentes locales de actividad antibacteriana del Propóleos
sobre bacterias patógenas específicas presentes en la cavidad oral.
- Tanto los costos y reducida tecnología disponible en el área para llevar a cabo
pruebas más sofisticadas u otros parámetros de laboratorio.
- El elevado costo económico que representa procesar una mayor cantidad de cepas
bacterianas anaerobias estrictas.
3.10 CONSIDERACIONES ETICAS:
- En el presente estudio se investigación se respetará las normas éticas de
investigación biomédica establecidas internacionalmente de a cuerdo a la
declaración de Helsinki, en 1964 para lo cual su realización cuenta con todas las
normas vigentes.
- La información recolectada será manejada de manera confidencial por el
investigador, así como su publicación y presentación de datos se efectuará en forma
anónima, acorde a los artículos Nº 73, 74, 75 y 76 del código de Ética Profesional y
Deontológico del Colegio Odontológico del Perú.
- Al ejecutar la presente investigación se contará con la participación voluntaria,
autorización por escrito de los sujetos a estudio así como su información necesaria
acerca de los fines, métodos, beneficios e incomodidades derivadas de la
investigación. (Ficha N°2: “CONSENTIMIENTO INFORMADO”).
- Se solicitará autorización respectiva del Director Hospital Militar Central “Coronel
Luís Arias Schreiber”, del jefe del servicio de Patología Clínica – laboratorio
clínico, laboratorio de la sección de Microbiología del HMC, del coordinador de
internos de la UNA-Puno en el HMC.
- Informe técnico del Extracto Etanólico del departamento Química de la Universidad
Agraria la Molina, centro de producción e investigación apícola para la obtención
del Propóleo.
- En la investigación se protegerá la vida, salud, intimidad, confidencialidad y la
dignidad del ser humano.
PLAN DE RECOLECCION DE DATOS:
1.-Procedimiento:
- Permiso para acceder a las unidades de estudio: (se solicitará autorización de las
distintas autoridades)
• Director Hospital Militar Central “Coronel Luís Arias Schreiber”.
• Departamento de Estomatología, Servicio de Periodoncia HMC.
• Servicio de Patología Clínica, sección de Microbiología HMC.
• Centro de producción e investigación apícola para la obtención del Propóleo.
• Laboratorio de análisis químico para el procesamiento del Propóleo,
departamento de Química de la Universidad Nacional Agraria la Molina.
- Procedimiento para la obtención y preparación de la solución de Propóleo
Etanólico a sus diferentes concentraciones.
2.-Proyecto piloto:
- Obtención de muestras a partir de cepas bacterianas ATCC importadas de los
laboratorios Gen Lab.
- Utilizando métodos diferenciales de Tinción Gram. aplicados con diferentes
reactivos, podremos identificar la morfología colonial (macroscópica) de las
colonias en estudio.
3.-Preparación de medio de cultivo y siembra:
- Procedimientos para el crecimiento (Medio de cultivo, Agar Sangre Brucella,
Schedler).
- Reconstitución de las cepas bacterianas (Estandarización de la muestra y/o siembra).
4.-Inoculación al medio de cultivo y determinación de sensibilidad:
- Procedimiento para determinar la sensibilidad antibacteriana de las cepas puras de
Periodontopatógenos, observando los halos de inhibición en los pozos de
“sensibilidad” trabajados previamente, se harán las mediciones de los halos con una
regla calibrada, sobre la superficie de la placa Petri y con luz refleja.
- Se llenaran los datos en las “Fichas de Aplicación” (Anexo 1).
5.- Determinación de la C.I.M. (concentración inhibitoria minima)
- Determinación de la concentración de Propóleo etanólico que presente mayor
actividad antibacteriana por el Método de Dilución en Caldo, apreciando la turbidez
en los tubos respetivos.
6.-Procesamiento de datos y/o Plan de análisis
6.1. Manejo de datos:
- Revisaremos los datos recolectados (de cada una de las fichas clínicas verificando
que se encuentren consignados todos los datos programados y que no existan
omisiones o errores en los mismos), elaborando una base de datos ordenada a través
de una plantilla, tabularemos los datos recolectados y los representaremos
gráficamente.
- Se les asignará un código numérico que permitirá su tabulación por computadora,
facilitando así su análisis y obtención de la información y/o resultados
6.2. Interpretación de datos:
- Se realizará por medio de estadística descriptiva
-
3.11 DISEÑO Y ANALISIS ESTADISTICO:
- Se procederá al plan de análisis de datos de acuerdo a la secuencia:
1.- Una vez elaborada la base de datos codificada se harán los análisis, cruces de
variables y pruebas estadísticas.
2.- La información recolectada se procesaría mediante el paquete estadístico SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versión en español de Windows.
Utilizando además una hoja de cálculo de Microsoft Excel 2003 para la representación
grafica correspondiente.
La prueba estadística ANOVA, es el análisis de varianza que nos ayuda a determinar
diferencias significativas de una misma solución a diferentes concentraciones
La representación gráfica podría ser expresada en barras, mientras que el análisis de
datos se presentaría en cuadros en forma numérica y porcentual de acuerdo a las
variables de estudio.
3.12 RECURSOS
RECURSOS MATERIALES:
1.- Equipos de impresión, cómputo, material de escritorio y registro
- Computadora Pentium IV
- Impresora Epson
- Cámara fotográfica digital
- Papel bond A-4
- Etiquetas
- Programas software
- Resaltadores, correctores
- Lápiz marcador, lápices, lapiceros
- Calculadora Fx-3600
- Fotocopias varias de las fichas 1 al 5
2.- Materiales de laboratorio
- Tubos de ensayo 2 y 5 ml con tapa rosca.
- Vasos de precipitados de 150 y 200 ml
- Placas petri Pyrex
- Asa de siembra
- Pipetas de 1.5 y 10 ml (pasteur)
- Matraces Erlenmeyer de 125, 250,500 ml.
- Probetas de 25, 100 y 250 ml.
- Gradillas
- Embudos
- Pinza porta Discos
- Goteros
- Micropipeta calibrada.
- Laminas portobjetos
3.- Medios de cultivo y transporte
- Tubos de ensayo sellados con Caldo de tioglicolato.
- Medios de cultivo de aislamiento: Agar Sangre Brucella y Schedler.
4.- Sistema generador de Anaerobios
- Sobres para anaerobiosis. Anaeerocult
5.- Reactivos
- Agua destilada
- Etanol al 70% y 96%
- Solución Fisiológica al 0.9%.
- Ampollas de agua bidestilada de 5ml
- Amoxicilina 500 mg
- Reactivos de coloración Gram (Cristal Violeta más bicarbonato de Na, Lugol,
Alcohol Acetona y la Safranina o Fuccina).
- Aceite de inmersión
6.- Instrumentos y Equipos
- Estufa de cultivo
- Microscopio.
- Cocina eléctrica.
- Soporte Universal.
7.- Material e instrumental Odontológico
- Campos operatorios y baberos desechables
- Mascarillas, gorros descartables
- Guantes estériles.
- Cureta peridontal
- Sonda peridontal calibrada
- Espejos dentales
- Exploradores
- Bandejas
- Pinzas para algodón.
- Conos de papel estériles.
8.- Materiales del ensayo “in Vitro”
- Sacabocados de 7 mm de diámetro
- Mechero Bunsen
- Sacabocados esteriles
- Jeringas de Tuberculina
- Jeringas de 5 y 10 ml.
RECURSOS HUMANOS:
Investigador : Bach. Estomatología. Alan Danny Calderón Puente de la Vega
Director Tesis: Mgt.C.D Jorge Mercado Portal.
Asesor : Blgo. Microbiólogo Elfer Valdivia Paz-Soldan
Tte. Crl.Odont. Nelson Mercado Portal
: My. Odont. Helbert Alfaro Segovia.
Docentes colaboradores : Ing. Quimico. Julio Cesar Bracho Perez, especialista en
recursos apicolas de la Universidad Agraria La Molina.
Coordinador Internado : Tte. Crl. EP Odont. Nelson Mercado Portal
RECURSOS INSTITUCIONALES:
- Hospital Militar Central “Crl. Luis Arias Schreiber”, Lima
- Servicio de Estomatología, Departamento de Periodoncia del HMC.
- Servicio de Patología Clínica, sección de microbiología del HMC.
- Departamento de Química de la Universidad Agraria la Molina, Lima.
CARACTERIZACION DEL AREA DE
INVESTIGACION
IV. CARACTERIZACION DEL AREA DE INVESTIGACION
Ámbito de Estudio:
Comprende a toda la ciudad de Lima, distrito de Jesús María como ámbito general y la
sección de laboratorio de microbiología del servicio de Patología Clínica –laboratorio
clínico del Hospital Militar Central “Coronel Luís Arias Schreiber”.
Ubicación Geográfica:
Ubicado en el distrito de Jesús María, en la cuadra 28 de la Av. Brasil con la primera
cuadra de la Av. Faustino Sánchez Carrión (Pershing), se encuentra el Hospital Militar
Central de Lima “Crl. Luís Arias Schreiber”.
Factores Climáticos:
Con altos niveles de humedad, ubicada a 12 grados de latitud sur y casi al nivel del mar.
Presenta la costa peruana una serie de microclimas, debido también a fenómenos
naturales como la fría corriente de Humboldt, cercanía de la cordillera y su ubicación
tropical.
Vías de Acceso:
Cuenta el Hospital Militar Central “Crl. Luís Arias Schreiber”, con todas las vías de
acceso y comunicaciones adecuadas, además de estar situada en una zona urbana,
cuenta con todos los servicios así como una infraestructura adecuada para realizar
trabajos de investigación.
RESULTADOS
V. RESULTADOS
TABLA N° 1.
PROMEDIO DEL HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES
EXPERIMENTALES SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS
CONCENTRACIONES PROMEDIO (mm) MINIMO (mm) MAXIMO (mm)
PROPOLEO 5% 19.3 14 23
PROPOLEO 15% 24.4 14 33
PROPOLEO 30% 16.1 12 20
AMOXICILINA 300 mg 38.6 23 50
AGUA BIDESTILADA 0 0 0
TRABAJADAS SOBRE UN NUMERO DE 10 MUESTRAS, EXTRAIDAS DE LA
PLACA SUBGINGIVAL DE PACIENTES CON ENFERMEDAD
GINGIVOPERIODONTAL QUE AL ANALISIS MICROSCOPICO SE OBSERVA
LA PRESENCIA DE LA BACTERIA PORPHYROMONA GINGIVALIS.
SE ANALISA QUE LAS TRES CONCENTRACIONES DE PROPOLEO
ETANOLICO AL 5%- 15% -30%, PRESENTAN HALOS DE INHIBICION TANTO
MINIMAS COMO MAXIMAS, POR LO TANTO TODAS PRESENTAN
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.
EL PROPOLEO AL 15 % PRESENTA UN MAYOR PROMEDIO DE 24.4 mm EN
HALOS DE INHIBICION.
LA AMOXICILINA Y EL AGUA BIDESTILADA SON USADOS COMO GRUPOS
CONTROL PARA LA VALIDACION DE DATOS.
GRAFICO N°1.
HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES EXPERIMENTALES SOBRE
PORPHYROMONA GINGIVALIS.
GRAFICO 2.
DIAMETRO EN PROMEDIO DE LOS HALOS DE INHIBICION DE LAS
SOLUCIONES EXPERIMENTALES SOBRE PORPHYROMONA GINGIVALIS.
TABLA N° 2.
DIAMETROS PROMEDIOS DE HALOS DE INHIBICION SOBRE
FUSOBACTERIUM NUCLEATUM
CONCENTRACIONES PROMEDIO (mm) MINIMO (mm) MAXIMO (mm)
PROPOLEO 5% 15 6 20
PROPOLEO 15% 19.6 8 36
PROPOLEO 30% 15.7 13 19
AMOXICILINA 300 mg 29.9 21 50
AGUA BIDESTILADA 0 0 0
TRABAJADAS SOBRE UN NUMERO DE 10 MUESTRAS, EXTRAIDAS DE LA
PLACA SUBGINGIVAL DE PACIENTES CON ENFERMEDAD
GINGIVOPERIODONTAL QUE AL ANALISIS MICROSCOPICO SE OBSERVA
LA PRESENCIA DE LA BACTERIA FUSOBACTERIUM NUCLEATUM.
SE ANALISA QUE LAS TRES CONCENTRACIONES DE PROPOLEO
ETANOLICO AL 5%- 15% -30%, PRESENTAN HALOS DE INHIBICION TANTO
MINIMAS COMO MAXIMAS, POR LO TANTO TODAS PRESENTAN
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA.
EL PROPOLEO AL 15 % PRESENTA UN MAYOR PROMEDIO DE 19.6 mm EN
HALOS DE INHIBICION.
LA AMOXICILINA Y EL AGUA BIDESTILADA SON USADOS COMO GRUPOS
CONTROL PARA LA VALIDACION DE DATOS.
GRAFICO N° 3.
HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES EXPERIMENTALES SOBRE
FUSOBACTERIUM NUCLEATUM.
GRAFICO N° 4.
PROMEDIO DEL HALO DE INHIBICION DE LAS SOLUCIONES
EXPERIMENTALES SOBRE FUSOBACTERIUM NUCLEATUM.
GRAFICO N° 5.
COMPARACION DE LA MAYOR ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA
PRODUCIDA POR LAS DIFERENTES CONCENTRACIONES DE PROPOLEO
ETANOLICO
GRAFICO N° 6.
COMPARACION DE LAS SOLUCIONES DE EEP CON LA AMOXICILINA
V. DISCUSIÓN
En la presente investigación los resultados nos demostraron que existen diferencias
significativas con respecto al tamaño de los halos de inhibición en las distintas
concentraciones utilizadas del extracto etanólico de Propóleo (5%-15%-30%).
Existen estudios que tratan sobre las propiedades antibacterianas del Extracto etanólico
de Propóleo en bacterias anaerobias como Porphyromona gingivalis y Fusobacterium
Nucleatum, obteniendo también formaciones de halos inhibitorios; esto concuerda con
Kedzia que en 1986 determinó las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) del
extracto de etanol de propolis contra las cepas de Bacteroides y Peptostreptococcus
siendo inhibidos en 0.01-0.50 mg/ml (10ug - 500ug / ml), encontrando que nuestras
soluciones de EEP están dentro del rango estudiado por Kedzia, pues al aplicar
soluciones del EEP al 5% (50ug/mL) sobre Porphyromona gingivalis, se formaron
halos inhibitorios mínimos (6-14mm), demostrando con ello que nuestra solución de
extracto de Propóleo al 5% posee actividad antibacteriana pero mínima.
También coincidimos con el estudio realizado por Alfredo Mauricio Batista de Paula
(2006) que determinó las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (MIC) del extracto de
Propóleo de la Porphyromona gingivalis (30- 50 ug/ml), similar a nuestro estudio que a
concentraciones de 5% (50ug/ml) ya presentaban actividad inhibitorias; Santos et al
(2002), evaluaron la susceptibilidad de Porphyromonas gingivalis frente al própolis,
estableciendo que cuando la concentración del Propóleo era de 256 ug/ml, la muerte fue
observada dentro de 3 h de incubación para los Porphyromonas gingivalis, similar a
nuestro estudio en donde a concentraciones del 30% ( 300ug/ml) los halos de inhibición
promediaban entre los 12 a 20 mm.
En el estudio de Gebara et al (2002), determinaron que la concentración mínima
inhibitoria (MIC) del extracto de Propóleo, para la Porphyromona gingivalis, estaba
entre 0.25ug/ml. Siendo este valor menor a la de nuestra concentración de EEP al 5%
(50ug/ml).
En los estudios realizados por Alfredo Mauricio Batista de Paula (2006), mediante su
estudio en difusión y dilución por agar determinaron que la Concentración Mínima
Bactericida (MBC) del extracto de Propóleo fue de 200-400 ug/ml formando halos de
inhibición de 14 a 17 mm de diámetro. En nuestra investigación el EEP al 30% (300
ug/ml) formó halos inhibitorios entre 12 y 19 mm de diámetro. Determinando así que la
actividad antibacteriana a estas concentraciones es menor, pero que en relación a
concentraciones del 15% registramos en nuestro estudio halos de inhibición mayores de
entre los 11 a 36 mm de diámetro.
Ambas bacterias fueron susceptibles a las concentraciones de 5% - 15% - 30%. Lo que
es comparable con el estudio realizado por Koru O, Toksoy F y col (2007) en cepas
anaerobias de los géneros: Peptostreptococcus, Lactobacillus, Porphyromona,
Fusobacterium, Actinomyces, Prevotella, Veillonella. Todas las cepas eran susceptibles
y los valores se extendieron a partir del 4 a 512mg/ml para la actividad de los propolis.
Tanto la Porphyromona gingivalis como el Fusobacterium nucleatum en nuestro
estudio presentaron halos de inhibición mayores de 33 y 36 mm frente al EEP de 15%;
según los estudios realizados por Alfredo Mauricio Batista de Paula (2006) y Santos et
al (2002) que trabajaron con Fusobacterium nucleatum y Porphyromona gingivalis,
obtuvieron también inhibición de dichas bacterias al ser aplicadas el extracto de
Propóleo a diversas concentraciones incluso en un rango de 20ug/ml a 276 ug/ml. Con
esto Podemos determinar que la Porphyromona gingivalis es una de las bacterias que
presenta mayor sensibilidad a la actividad antibacteriana del extracto de Propóleo.
Siendo la Porphyromona una de las bacterias anaerobias estrictas de mayor prevalencia
en patologías pulpar (como necrosis), patologías periapicales, enfermedad
gingivoperiodontal.
Fajuri et al, en el 2004 estudió el efecto del própolis sobre diferentes microorganismos
patógenos orales, entre los cuales incluyó Streptococcus mutans, Porphyromonas
gingivalis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Cándida albicans. Sus
resultados mostraron inhibición de crecimiento de todos ellos, excepto la
Porphyromonas gingivalis, todos los demás fueron susceptibles al propóleos. Lo cual
es contradictorio con el resultado en nuestra investigación donde la Porphyromona
gingivalis fue la más susceptible al presentar un mayor promedio de halo inhibitorio.
Importante a recalcar en nuestra investigación, donde debemos mencionar que al
estudiar bacterias como Porphyromona gingivalis y Fusobacterium nucleatum se
determinó, que a medida que la concentración es elevada menor es el promedio del halo
inhibitorio: El EEP a 5% (50ug/mL) presenta halos en promedio de 17.15mm, el EEP a
15% ( 150 ug/mL), con halos de inhibición en promedio de los 22 mm, el EEP a 30%
(300 ug/mL) con halos de inhibición ligeramente menores de 15.9 mm; lo que
contradice el estudio realizado por Rodríguez Ch. (2007). “Actividad antibacteriana de
cuatro soluciones de Propóleo en bacterias anaerobias presentes en necrosis pulpar”
donde establece que a mayor concentración de Propóleo mayor será su actividad
antibacteriana, obteniendo resultados del extracto de Propóleo a 50ug/10uL (6 - 8mm),
el extracto de Propóleo a 100 ug/10uL (7.5 y 9.3 mm), el extracto de Propóleo a 200
ug/10uL (9.2 y 11.7 mm) y el extracto de Propóleo a 500ug (15.8 y 19.5 mm); esto
debido que a mayor concentración del extracto llega este a saturarse y así perder su
capacidad antibacteriana.
Cabe resaltar que para la presente investigación utilizamos como control negativo agua
bidestilada, la cual no formó halo inhibitorio en ninguno de los ensayos, manteniéndose
como constante en 0 mm. Lo cual nos sirve a manera de control de calidad garantizando
la siembra bacteriana y que la formación de los halos inhibitorios alrededor de los
pocillos de Amoxicilina y Propóleo fueron formados por estas sustancias.
Finalmente esta investigación nos permite demostrar que el extracto de Propóleo que se
obtiene de las colmenas de la abeja Apis Mellifera en Perú, tiene un rango de inhibición
similar a los extractos de propóleos de otros países como Brasil, Turquía, etc.
CONCLUSIONES
De los ensayos in Vitro realizados concluimos que:
El Propóleo Etanólico en las concentraciones ensayadas al 5% posee actividad
antibacteriana mediana frente a las dos bacterias periodontopatógenas estudiadas, con
un promedio en los halos de inhibición de 17.15 mm.
El Propóleo Etanólico en las concentraciones ensayadas al 15% posee actividad
antibacteriana mayor frente a las dos bacterias periodontopatógenas estudiadas, con un
promedio en los halos de inhibición de 22 mm.
El Propóleo Etanólico en las concentraciones ensayadas al 30% posee actividad
antibacteriana menor frente a las dos bacterias periodontopatógenas estudiadas, con un
promedio en los halos de inhibición de 15.9 mm, lo que refleja que a medida que se
incrementa la concentración se produce una saturación del Propóleo que disminuye su
actividad antibacteriana
Al realizar la comparación entre las concentraciones de Propóleo Etanólico al 5% - 15%
- 30% frente a la Amoxicilina, se encontró que existen diferencias estadísticamente
significativas a favor de este último con 34.25 mm de promedio en sus halos de
inhibición.
De entre las dos bacterias periodontopatógenas estudiadas, la más sensible al Propóleo
etanólico al 15%, fue la Porphyromona gingivalis con un promedio de 24,4 mm de
diámetro en sus halos de inhibición.
Aunque todas concentraciones ensayadas de Propóleo Etanólico presentaron actividad
antibacteriana frente al crecimiento de las bacterias Periodontopatógenas:
Porphyromona Gingivalis y Fusobacterium Nucleatum; no implica que a mayor
concentración de EEP sea mayor su actividad antibacteriana in Vitro, puesto que a
medida que se incrementa la concentración se produce una saturación del Propóleo que
disminuye su actividad antibacteriana.
RECOMENDACIONES
A las autoridades de la UNA:
Implementar los laboratorios de microbiología en la Escuela Profesional de Odontología
a fin de realizar estudios a profundidad acerca del comportamiento del Propóleo así
como de otros productos de origen natural.
Reforzar los métodos de diagnostico más utilizados por el laboratorio de las
enfermedades periodontales y periimplantarias como son el cultivo, inmunodiagnostico,
sonda de ADN, reacción en cadena de polimerasa (PCR), entre otros y de esa manera
impulsar la investigación de la medicina tradicional.
A los investigadores:
Se recomienda que los protocolos de ejecución del presente estudio puedan ser
evaluados en estudios in Vivo.
Se recomienda hacer estudios sobre la posibilidad de una acción sinérgica entre el o los
compuestos antibacterianos del Propóleo y los distintos fármacos antibacterianos, como
terapia coadyuvante periodontal.
Realizar estudios de investigación con otros microorganismos específicos tomados de
pacientes que acudieran a la clínica estomatológica la UNA-Puno y que sean causantes
de afecciones medico estomatológicas.
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ANEXOS
ANEXO N°1
HOSPITAL MILITAL CENTRAL
SECCION DE MICROBIOLOGIA
Ficha de aplicación
Fecha:………………………………………………………….
Cepa ATCC en estudio:…………………………………….
Código de placa:……………………………………………..
Mm. de halos
de inhibición
Concen-
traciones
Porphyromona
gingivalis
X
mm
Fusobacterium
nucleatum
X
mm
Amoxicilina
300 mg
X
mm
Propóleo
5%
Propóleo
15%
Propóleo
30%
Agua Bidestilada
estéril
ANEXO N°2
HOSPITAL MILITAL CENTRAL
SERVICIO DE ESTOMATOLOGIA
Consentimiento Informado
Yo ………………………………………………………………………..identificado
con D.N.I (otros) Nº……………………………
He leído la hoja de información que se me ha entregado, así como he sido informado por el Interno en Odontología Alan Danny Calderón Puente de la Vega acerca del Trabajo de investigación intitulado "Actividad antibacteriana in vitro de soluciones de propóleo etanólico sobre bacterias Periodontopatógenas frecuentes en la Enfermedad Gingivoperiodontal. Hospital Militar Central, Lima 2010”, los mismos que serán realizados en el servicio de laboratorio clínico del Área de microbiología, la cual va a consistir en una revisión clínica de la cavidad bucal y toma de muestras de la placa subgingival, no poniendo en riesgo mi salud, cuyos datos obtenidos serán consignados en la ficha de registro.
Se me ha sido informado de las ventajas y los beneficios que se va a obtener, realizándome preguntas que considere oportunas, todas las cuales han sido absueltas y con respuestas que considero suficiente y aceptables. Tomo el compromiso de cumplir con las indicaciones que me señale el Interno (antes, durante y después) para la toma de muestras. Por lo tanto en forma conciente y voluntaria doy mi consentimiento para formar parte de este estudio. Los datos obtenidos serán totalmente confidenciales.
Lima, Perú Fecha:
……………………………………… ……………………………………
Firma del Interno Firma del Medico Asesor / Coordinador
……………………………………..
Firma de Paciente
ANEXO N°3
Ficha Clínica de Selección
FICHA PERIODONTAL I. FILIACION Nombre:................................................................Edad:......Sexo:... Ocupacion:.................Estado Civil:.........Direccion:......................... II. ANTECEDENTES SISTEMICOS 1. Quirurgicos:................................................................ 2. Medicamentosos:....................................................... 3. Patológicos:................................................................ III. ENFERMEDAD SISTEMICA ACTUAL ........................................................ IV. HISTORIA PERIODONTAL 1. Afecciones: ................................................................ 2. Tratamientos previos: ................................................ 3. Parafuncion: a) Bruxismo ( ) b) Apretamiento ( ) c) Golpeteo ( ) 4. Otros:.......................................................................... 5. Tabaquismo: .............................................................. 6. Higiene Bucal: a) Cepillado...................... b) Frecuencia....................... V. SINTOMAS PERIODONTALES 1) Dolor: .......... 2) Prurito gingival: ............ 3) Sabor metalico: ............... 4) Xerostomía:. ....5) Ptialismo: ...................... 6) Halitosis: ......................... 7) Otros: .............. VI. SIGNOS CLINICOS GINGIVALES DE INTERES 1) Color: ............. 2)Textura: ........................ 3) Consistencia: .................... 4) Contorno: .........5) Tamaño: ........................6) PGA: ................................. 7) PGR: ............... 8) Sangrado: ..................... VII. SIGNOS RADIOGRAFICOS 1) Perdida Osea: a) Localizacion: ................ b) Grado:............... 2) Trabeculado: a) Regular......................... b) Irregular...... c) Denso......... 3) Cemento Radicular: a) Conservado...... b) Reabsorvido.... c) Engrosado.... VIII. DIAGNOSTICO ............................................................................................................................... ............................................................................................................................ .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. IX. PERIODONTOGRAMA
Universidad Peruana Cayetano Heredia – Facultad de Estomatología “Roberto Beltrán Neira”
ANEXO N°4
MATRIZ DE DATOS
Porphyromona
Gingivalis
Propóleo 5
%
Propóleo
15 %
Propóleo
30 %
Amoxicilina
500 mg
Agua
Bidestilada
Muestra 01 14 18 16 50 -
Muestra 02 20 20 20 50 -
Muestra 03 14 14 16 40 -
Muestra 04 20 20 20 50 -
Muestra 05 19 29 14 39 -
Muestra 06 21 25 13 23 -
Muestra 07 20 33 15 36 -
Muestra 08 20 22 12 23 -
Muestra 09 23 31 18 38 -
Muestra 10 22 32 17 37 -
Fusobacterium
nucleatum
Propóleo 5
%
Propóleo
15 %
Propóleo
30 %
Amoxicilina
500 mg
Agua
Bidestilada
Muestra 11 6 11 19 40 -
Muestra 12 8 8 18 50 -
Muestra 13 6 14 16 40 -
Muestra 14 18 17 13 28 -
Muestra 15 19 11 14 21 -
Muestra 16 19 34 15 24 -
Muestra 17 17 19 16 26 -
Muestra 18 18 11 13 23 -
Muestra 19 19 36 16 23 -
Muestra 20 20 35 17 24 -
ANEXO N°5
OBTENCION Y PREPARACION DE LA SOLUCION ETANOLICA DE PROPOLEO
CEPAS BACTERIANAS PARA EL ESTUDIO: (Proyecto Piloto)
· Porphyromona gingivalis ATCC (33277)
· Fusobacterium nucleatum ATCC (25586)
Cristales Liofilizados de Microorganismos Placas con Agar Brucella y Agar Schedler suplementadas
Difusión en la placa Jarra de anaerobiosis
Crecimiento bacteriano Pocillos de sensibilidad
Halos de Inhibición Medición de halos de inhibición
PACIENTES
Consentimiento Informado Medición de la profundidad de la bolsa
Campo de trabajo
Aislamiento relativo y Cono en la bolsa periodontal
Muestras contenidas en Caldo Tioglicolato Sembrado de las muestras
Crecimiento de Colonias de P.gingivalis Crecimiento de Colonias de F.nucleatum
Análisis Microscópico Bacilos largos rosados
PRUEBA DE LA SENSIBILIDAD ANTIBACTERIANA
Campo de trabajo Propoleo a diferentes concentraciones
Difusión en el disco Preparado de pocillos de sensibililidad
Pocillos listos Micro pipeta calibrada para la adición de las concentraciones
Medición del Propóleo al 5%
Halos de inhibición de las tres concentraciones
EQUIPO DE TRABAJO
Asesor: Blgo. Microbiólogo Elfer Valdivia Paz-Soldan
Asesor: Tte. Crl. EP Odont. Nelson Mercado Portal Asesor: My. EP Odont. Helbert Alfaro Segovia.
Hospital Militar Central Lima .Crl. Luis Arias Schreiber