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UNIVERSIDAD A U T ~ N O M A METROPOLITANA
Unidad Iztapalapa
4 v i s i ó n : Ciencias Biológicas y De La Salud. '
Departamento: Biologia
Titulo del trabajo
Tesis que presenta el alumno
/Nombre: GARCIA SAHAGUN MARIA ELENA
Matricula: 89339887
Para la obtención del grado de
d a d o obtenido: LICENCIATURA m ?SOrnG\A
Asesores: M. En C. MARIA DE LOS ANGELES AGUILAR SANTAMARÍA
Dra. 'NATASHA BOHOROVA n
ENERO 2001
DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE GLUFOSINATO
Y MANOSA PARA INHIB.lR AL 90% LA DIVISION CELULAR EN
MAIZ TROPICAL (Zea mays L.)
INTRODUCCI~N Las proteínas son el producto directo de la transcripción y traducción de ADN. Para
lograr que un organismo sintetice una proteína, generalmente se necesita un gen con la
codificación para esa proteína y una secuencia promotora en el ADN para que active dicho
gen.
A principios de la década de los noventa se obtuvieron los primeros cereales
transgénicos y fértiles, arroz y maíz,; se ha logrado integrar en su genoma un fragmento de
ADN exógeno, que incluso se trasmite por vía sexual a su descendencia. Este avance ha
provisto enormes oportunidades para conferir una mayor resistencia a las plantas contra
plagas, enfermedades y efectos no deseados de herbicidas, así como para modificar los
procesos biosintéticos y la calidad de los productos vegetales (Zhou et al., 1995).
Estos genes son usados selectivamente a favor de una regeneración de brotes
transformados. Un sistema tradicional de selección es aquél que utiliza a los genes que
confieren resistencia a los efectos no deseados de herbicidas o a algunos antibióticos (Zhou
et al. , 1996).
La habilidad para transferir genes dentro de líneas recombinantes de importancia
agronómica ofrece el potencial plara mejorar características importantes tal como la
resistencia a plagas de insectos. Estudios recientes en el campo del mejoramiento del maíz
transgénico demostraron que los genes derivados de genes insecticidas de origen bacteriano,
en particular Bacillus thuringiensis (Bt), expresan una proteína insecticida en las células
vegetales. El gen Bt ha sido usado como un insecticida por muchos años y la expresión de
proteinas provenientes de genes c:lonados ha aumentado las posibilidades de usar esas
proteínas insecticidas en plantas transgénicas (Bohorova et al., 1999).
El maíz ha sido uno de los blancos principales de la manipulación genética en granos
monocotiledónicos. La mayoría de los estudios sobre la transformación del maíz han
utilizado genotipos adaptados a zonas templadas y plantas regeneradas; a partir de estas
líneas se ha mostrado que el ADN recombinante (molécula conformada de nuevas
combinaciones de secuencias de ADN) se transmite a la progenie. Sin embargo poca o
ninguna atención se ha prestado al potencial de transformación del germoplasma del maíz y
de las líneas recombinantes adaptadas a regiones tropicales y subtropicales. La producción
de plantas transformadas genéticamente depende de la habilidad para integrar genes
exógenos dentro de las células blanco y de la eficiencia con la cual las plantas son
regeneradas a partir de células transformadas genéticamente (Bohorova et al., 1999).
El maíz es originario de América, es una planta herbácea anual. La importancia del
maíz como planta cultivada dio lugar al desarrollo de nuevas variedades más productivas y
que pudiesen ser cultivadas en regimes de características distintas a las de aquélla en que se
le había cultivado inicialmente. México tiene la mayor diversidad de maíz en el mundo y
también es el centro de origen de esta planta ( Hruska et al., 1997).
La mejora vegetal tradicional se ha venido practicando con éxito, pero tales métodos
resultan ya insuficientes para satisfacer las necesidades de alimentos impuestas por el
crecimiento demográfico. Además, tienen el inconveniente de haber producido variedades
que dependen de abonos agroquímicos que dañan al medio (Nieto-Jacob0 et al., 1999).
Las plantas transgénicas han sido desarrolladas para mejorar la calidad del producto,
para controlar enfermedades, malezas y problemas de insectos. Las ventajas que presentan
estas plantas son: reducir el uso de insecticidas, mejorar el medio ambiente y salud pública,
facilitar la implementación, ya que lo Único que se debe hacer es proveer a los agricultores
de la semilla ya modificada genéticamente.
Entre las desventajas que se encuentran en los cultivos transgénicos se encuentra el
posible surgimiento de nuevas malezas y la erosión de la diversidad genética entre plantas
transgénicas y plantas silvestres nativas, además de que su comercialización tendría que ser
con costos competitivos ( Hruska et al., 1997).
La producción de plantas transgénicas implica el uso de un gen de selección para
favorecer la regeneración de brotes transformados. En sistemas de selección tradicionales
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estos genes se utilizan para conferir resistencia a herbicidas, a antibióticos o a la manosa.
LOS genes que confieren características agronómicas importantes como resistencia a
insectos, enfermedades y a efectos no deseables de herbicidas, pueden ser dos tipos: genes
marcadores (selectivos) y genes reporteros.
Un agente selectivo es un compuesto fitotóxico que interfiere con el metabolismo
celular de la planta. Un gen de selewión puede ser una secuencia de ADN que codifica para
un producto que permite la desintoxicación o evasión del agente selectivo a través de la
modificación enzimática del mismo o de la expresión de un blanco alterado respectivamente
(Altman A., 1998).
Los genes reporteros son aquellos que se expresan en las células de la planta aún sin
la integración de ellos en el genoma vegetal. Los genes reporteros que son más comúnmente
usados incluyen aquellos que codifican enzimas con distinta especificidad de sustrato y
pueden ser monitoreados por ensayos radioquímicos, histoquímicos o fluorométricos o por
luminiscencia; son introducidos frecuentemente dentro de plantas modificadas
genéticamente, alterando las vías metabólicas.
Existen genes selectivos que codifican para proteínas que confieren resistencia a
herbicidas tales como glufosinato, glifosato, sulfonilureas y ácido fenoxicarboxílico (2,4 D).
También se encuentran genes cuyo producto confiere tolerancia a antibióticos como la
kanamicina, higromicina B, metotrexato, gentamicina y bleomicina (Altman A., 1998).
La fosfinotricina (glufosinato) es el ingrediente activo del herbicida comercial
"Basta". Este es un herbicida toxicológica y ambientalmente benigno pues no persiste en el
ambiente. Actúa como un potente inhibidor competitivo de la glutamin sintetasa (Dekker y
Duke, 1995; Droge et al., 1992):, la cual es una enzima central del metabolismo del
nitrógeno en las plantas. La acumulación resultante de amonio y la deficiencia en glutamina
lleva a una rápida muerte a las ctjlulas vegetales (Droge et al. , 1992). Dos genes que
codifican para enzimas que desactivan metabólicamente al glufosinato son el gen bar y el
pat. El gen bar de Streptomyces hygroscopicus y el gen pat de S. viridiochromogenes,
codifican para fosfinotricin acetiltransferasa (PAT) (Dekker y Duke, 1995) la cual confiere
al tejido vegetal la resistencia al compuesto herbicida fosfinotricin (De Blok et al., 1989).
El glifosato: (N-fosfonometil glicina) es el ingrediente activo del herbicida
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“Roundup” (Malik et al., 198!?) que se une y bloquea específicamente a 5-
enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una enzima del patrón biosintético de 10s
aminoácidos aromáticos, causando Ila muerte de la planta. Las ventajas del glifosato son su
relativo bajo costo y que, por sus características, no causa daño significativo al ambiente
pues se une rápidamente al suelo, donde es biodegradado por las bacterias, y presenta una
toxicidad relativamente baja en mamíferos, aves y peces (Atkinson D., 1985).
Existen controversias sobre 110s efectos ambientales del uso de marcadores resistentes
a antibióticos por lo que no se utilizan mucho (Haldrup et al., 1998). Entre los genes
resistentes a antibióticos más usados se encuentra el npt2 o neo, que codifica para neomicin
fosfotransferasa (NPTII) la cual dlesintoxica una gama de antibióticos aminoglicósidos,
kanamicina (Km) y geneticina (G41.8). También se encuentra el gen hpt que codifica para
higromicina fosfotransferasa (HPT) (Droge et al., 1992; Flavell et al., 1992):
A pesar de que los procedimientos de transformación han sido establecidos en
muchas especies vegetales, varios de estos métodos presentan bajas frecuencias de
transformación y muchas fugas no1 transgénicas. Por lo tanto, se requieren métodos de
selección alternos y más eficientes para mantener el progreso en esta área (Joersbo et al.,
1998; Koziel et al., 1993; Vasil y Vasil, 1986).
Un desarrollo reciente basado en el uso de genes selectivos consiste en proporcionar
a las células transformadas una ventaja metabólica mayor, comparada con las células sin
transformar, las cuales presentan un metabolismo lento y una viabilidad reducida. Esta
estrategia de selección difiere de la selección tradicional en que las células transgénicas
adquieren la habilidad para sobrevivir sobre un medio selectivo, mientras que las no
transgénicas son eliminadas activamente. (Joersbo et al., 1998).
El nuevo sistema de selección está basado en el gen para la fosfomanosa isomerasa
(PMI) de E. coli, como gen selectivo, la manosa como agente selectivo.
Las hexosas tienen una gran importancia funcional no sólo por ser las principales
sustancias utilizadas en la respiración, sino también como materia inicial a cuyas expensas la
planta sintetiza toda su dotación de las demás sustancias orgánicas. Entre las hexosas se
encuentran la ghcOSa, fructosa , manosa y galactosa. La manosa, que no es metabolizada
por muchas especies de plantas, se encuentra sólo como un derivado y, principalmente,
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como componente de los polisacáridos de la cápsula de secreción. La manosa es fosforilada
por hexoquinasa a manosa-6-fosfat0, la cual se acumula resultando en una severa inhibición
del crecimiento (Joersbo et al., 1998).
En el Centro Internacional para el Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT)
actualmente se están desarrollando dos líneas de investigación del maíz transgénico, una de
ellas es la investigación con sustancias alternas de selección, como glufosinato y manosa.
Uno de los objetivos del programa de maíz en el CIMMYT es el introducir al
mercado germoplasma nuevo obtenido a partir de líneas desarrolladas por mejoramiento
genético. Estas líneas genéticamente transformadas son resistentes al ataque de insectos que
infestan los cultivares evitando así un decremento en la producción total.
La concentración que se requiere es aquella que inhiba un 90% a las células,
generando una resistencia posterior a dicha sustancia y obteniéndose así genes resistentes.
OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL
Determinar la concentración necesaria de glufosinato y manosa para inhibir al 90% la
división celular del maíz tropical (Zea m q s L) en callos embriogénicos.
OBJETIVOS PARTICULARES
Desarrollar callos embriogénicos de líneas mejoradas de maíz tropical (Zea mays L),
CML2 16x72, CML72X2 16, Cr(vlL323, CML327 a partir de embriones inmaduros.
Determinar las diferentes conc,entraciones de glufosinato y manosa para obtener la
inhibición al 90% de la división celular en los callos embriogénicos.
Utilizar dos diferentes concentraciones de glufosinato y manosa durante el estadio de
regeneración para corroborar el efecto del agente selectivo.
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METODOLOGIA
0 Material biológico
Se emplearon híbridos de las líneas transformadas de maíz tropical del CIMMYT:
CML2 16x72, CML72X216, CM323 y CML327, las cuales heron cultivadas bajo
condiciones de invernadero.
0 Preparación de los medios de cultivo
Los medios de cultivo empleados se prepararon siguiendo las recomendaciones de
Bohorova (1 999).
l. Medio para la-formación de callos embriogénicos.
Se empleó el medio N6C1 y se preparó de acuerdo con la modificación de (Chu et
al. 1975), suplementando el medio basal N6 con 200 mg/l de caseína hidrolizada (Sigma),
2.302 mg/l de L-prolina (Sigma), 3% de sacarosa (Sigma) y 2 mg/l de dicamba (Sigma). Se
le añadió agar para solidificarlo.
2. Medio de regeneración.
El medio de regeneración (Basico murashige and Scoog (MS) (1963)) se suplementó con
2 % de sacarosa (Sigma), 0.5 mg/1 de indol-3-acético (IAA) (Sigma) y 1 mg/ de 6-
bencilaminopurina (6-BAP) (Sigma). Para solidificar el medio se le agregó agar.
Los medios se prepararon un día antes de la siembra, se colocaron en matraces aforados y
se esterilizaron en autoclave. Posteriormente se vaciaron a cajas de petri en una campana de
flujo laminar.
Desinfección de granos de maíz
Los granos de maíz heron esterilizados con cloro comercial al 30% y O. 1 % de
detergente Tween por litro de agua estéril durante 30 minutos; posteriormente, se
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enjuagaron con agua destilada estéril. Todo esto se realizó en condiciones asépticas en una
campana de flujo laminar.
0 Obtención de embriones y siembra
De un total de 3000 semillas de las cuatro líneas de maíz, se extrajeron los embriones
inmaduros y se seleccionaron sólo aquellos que medían de 1-2 mm de longitud, los cuales se
colocaron sobre la superficie del medio de cultivo N6C 1, con el escutelum hacia arriba. Se
pusieron 25 embriones en cada caja de petri.
Esto se llevó a cabo en la cajmpana de flujo laminar.
0 Tratamiento
Con el fin de seleccionar las células con mayor capacidad para la regeneración, se
llevaron a cabo experimentos con dos agentes selectivos, que se describen a continuación.
Tratamiento con glufosinato
Para determinar el efecto del glufosinato sobre la formación de callo a partir de
embriones se emplearon 350 embriones inmaduros distribuidos en siete grupos, es decir, 50
embriones por tratamiento.
Las concentraciones de glufosinato a probar fueron: el control, 1 mg/l, 3 mg/l, 5 mg/l, 7
mg/l, 9 mg/l y 11 mg/l.
ExDerimento I
I . Establecimiento de callos em briogénicos
Los embriones inmaduros obtenidos se colocaron en cajas de petri con medio sólido
N6C1 al que previamente se adicionaron las diferentes concentraciones de glufosinato. Los
cultivos heron incubados en la obscuridad, a 27OC, durante cuatro semanas.
Transcurrido ese tiempo se procedió a seleccionar y cuantificar los callos
embriogénicos que podían pasar al proceso de regeneración.
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El criterio de selección de los callos fue que se registraron formación de colonias
celulares y la presencia de embriones en la superficie del callo.
2. Repeneración de los callos embriogénicos.
Esta parte del experimento tuvo como finalidad determinar si los callos embriogénicos
regenerarian en dos medios de cultivo diferentes y lograr así una segunda selección.
Los callos embriogénicos seleccionados se transfirieron a cajas de petri con medio sólido
MSR sin glufosinato y MSR con 5g/l de glufosinato, se colocaron 8 callos por caja. De
cada medio se formaron 4 lotes y se colocaron: del genotipo 323, 60 callos en medio MSR
normal e igual cantidad en medio MSR adicionado con glufosinato; de la línea 327, se
colocaron 2 1 embriones en cada uno de los medios; mientras que del CML2 16x72 heron
34, y del CML72X216 heron 28 en ambos medios. Se incubaron en la cámara de
crecimiento a 26OC, con un fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 horas de obscuridad,
durante un mes. Posteriormente se cuantificó la regeneración, contando el número de callos
que formaron brotes.
ExDerimento II
El diseño de este experimento h e muy similar al anterior excepto por el
pretratamiento aplicado a los embriones al iniciar la siembra. Se hizo con el objetivo de
determinar si ese pretratamiento favorecería una mayor proporción de células que pudieran
formar callos en presencia de glufosinato.
I . Establecimiento de callos embrio&nicos
Se sembró un total de 350 embriones de cada genotipo en medio N6C1 sin selección y
se incubaron en obscuridad a 27"C, durante siete días. Transcurrido este periodo, los
embriones se transfirieron a cajas de petri con medio N6C1 sólido con: lmg/l, 3 mg/l, 5
mg/l, 7 mg/l, 9 m@ y 1 1 mg/l de glufosinato y se reincubaron en las mismas condiciones, en
obscuridad a 27"C, durante cuatro semanas. Finalmente se seleccionaron y se cuantificaron
los callos embriogénicos aplicando los mismos criterios que en el Experimento I.
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2. Regeneración de los callos embriogénicos.
La finalidad de esta parte del experimento h e determinar si los callos embriogénicos
regenerarían con dos medios diferentes y lograr así una segunda selección.
Los callos embriogénicos seleccionados se transfirieron a cajas de petri con medio sólido
MSR sin glufosinato y MSR con 11 gh de glufosinato. En cada medio se colocaron 84 callos
de la línea CML323; para el genotipo CML327, 19 callos; para CML216XCML72, 59 y
para CML72XCML216 solamente 67. Estos callos heron incubados en la cámara de
crecimiento a 26"C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz, por 8 horas de obscuridad,
durante un mes. Posteriormente se cuantificó la regeneración siguiendo el criterio descrito
en el experimento I.
Tratamiento con manosa
Para determinar el efecto de la manosa sobre la formación de callo a partir de embriones
se emplearon 300 embriones inmaduros distribuidos en seis grupos, es decir 50 embriones
por tratamiento.
Las concentraciones de manosa probadas fueron: control, O.325g/l7 0.75 gh, 1.25, 2 gh y
5 4.
ExDerimento I
1. Establecimiento de callos embriogénicos
Los embriones inmaduros obtenidos se colocaron en cajas de petri con medio sólido
N6C l . Se pusieron 25 embriones por caja. Los cultivos fueron incubados en obscuridad, a
27"C, durante cuatro semanas.
Transcurrido ese tiempo se procedió a seleccionar y cuantificar los callos
embriogénicos de la misma forma que para los tratados con glufosinato.
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2. Reaeneracidn de los callos embriogénicos.
Al igual que en el caso del tratamiento con glufosinato este experimento tuvo como
finalidad determinar si los callos embriogénicos llegarían a regenerar con dos medios
diferentes y lograr así una segunda selección.
Los callos embriogénicos así seleccionados se transfirieron a cajas de petri con medio
sólido MSR sin mmosa y MSR con 1.25gA de manosa. En cada medio se colocaron 79
callos de la línea CML323; de la línea C m 3 2 7 se sembraron 14; en el caso del genotipo
CML216X72, heron 3 1 y del cultivo CML72XCML216, heron 43. Se incubaron en la
cámara de crecimiento a 26"C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 horas de
obscuridad, durante un mes. Posteriormente se cuantificó la regeneración, siguiendo el
criterio que se empleó en el experimento con glufosinato.
ExDerimento I1
Este experimento h e muy similar al anterior excepto por el pretratamiento aplicado a los
embriones al iniciar la siembra. Su finalidad h e determinar si el pretratamiento propiciaría
una mayor proporción de células capaces de formar callos en presencia de manosa.
1. Establecimiento de callos embriogénicos
Se sembró un total de 300 embriones en cada genotipo en medio N6Cl normal y se
incubaron en obscuridad a 27"C, durante siete días. Transcurrido este periodo los embriones
se transfirieron a cajas de petri con medio N6C1 sólido con 0.325 g/l, 0.75 dl, 1.25,2 g/l y
5 g/l de manosa y se reincubaron en las mismas condiciones. Finalmente se seleccionaron y
se cuantificaron los callos embriogénicos aplicando el mismo criterio que en el experimento
con glufosinato.
2. Regeneración de los callos embriogénicos.
Esta parte del experimento tuvo como propósito determinar si los callos embriogénicos
regenerarían en dos medios diferentes y lograr así una segunda selección.
Los callos embriogénicos seleccionados se transfirieron a cajas de petri con medio sólido
MSR normal y MSR con 5 dl de manosa. En cada medio se colocaron 13 1 callos de la línea
CML323; del cultivo CML327, 15 callos; del CML216XCML72, 1 18 y de la línea
CML72XCML216, solamente 9. Estos callos heron incubados en la cámara de crecimiento
a 26"C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz por 8 horas de obscuridad, durante un mes.
Posteriormente se cuantificó la regeneración de igual manera que en el experimento con
glufosinato.
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RESULTADOS Y DISCUSI~N
0 Obtención de embriones y siembra
De las 3000 semillas obtenidas úricamente se utilizaron 1300 embriones ya que fueron
los que presentaban las mejores condiciones para realizar el experimento, esto es, tenían
la talla adecuada de 1-2 mm, no estaban contaminados y se extrajeron fácilmente.
Tratamiento con glufosinato
ExDerimento I
Con respecto a las observaciones y datos registrados se encontró que no hubo
crecimiento en todas las concentraciones probadas. La concentración hasta donde se registró
formación de callos fue la de 5 g/l, y esto sólo en tres líneas de maíz. El porcentaje de callos
en las cuatro variedades fue distinto pues con algunas concentraciones el valor es alto, como
ocurrió en el lote testigo y la concentración 1 g/l en el genotipo 323, mientras que con otras
fue muy bajo, como la de 5 g/l en la línea CML72XCML216 (tabla 1).
En lo que se refiere a los lotes testigo, todos presentan un alto porcentaje de formación
de callos, a excepción de la línea CML327 debido principalmente a la viabilidad que tienen
los embriones para formar callos embriogénicos, a los criterios de selección y, con menor
probabilidad, a la contaminación proveniente del embrión,
La respuesta del genotipo C m 3 2 3 fue positiva en el lote testigo y en la concentración
de 1 g/l, con un 96%, mientras que para la concentración de 3 g/l, la formación disminuyó a
casi a la mitad, 48.9%, diferencia que resultó ser estadísticamente significativa (x’ = 23.10; p
< 0.05); aun así, se puede considerar esta línea como tolerante a esta concentración de
glufosinato.
En el caso de la línea CML327 se formaron callos hasta con 5 g/l de glufosinato; el
porcentaje más alto, 86.6%, se registró con 1 dl, mientras que la concentración con menor
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número de callos h e 5 d l , con 8 %, por lo que se deduce que esta última sí afectó la
formación de callos. Se observa que el lote testigo sólo tuvo un 16.6% de formación de
callos y esto puede deberse a que los embriones que se colocaron en este medio no hubieran
sido viables. Las diferencias entre los resultados del lote testigo y los de embriones
provenientes de las concentraciones 1 y 5 dl son significativas, estadísticamente hablando
(x’ = 300; p < 0.05)
En la variedad CML216X CML72 también hubo formación de callos hasta la
concentración de 5 dl. El porcentaje más alto se presentó en el testigo, 86.3%, mientras que
la menor formación de callos h e en el lote de 5 con 16%. Este último dato sugiere una
baja tolerancia al glufosinato aunque mayor con respecto a la observada en la línea de maíz
CML327 (x’ = 98.7; p < 0.05).
El genotipo CML72X CML2 16 también presentó formación de callos hasta 5 dl; la
mayor proporción se obtuvo en el lote testigo con 86.4% y h e descendiendo, como en los
otros maíces, hasta llegar a la concentración 5 8/1 donde el número de callos h e sólo de
4%; este es el dato más bajo de los cuatro genotipos, las diferencias entre las tres
concentraciones y el testigo resultaron significativas (x’ = 171.28; p < 0.05) (tabla 1).
En la gráfica 1 se puede apreciar el comportamiento de las cuatro líneas de maíz, en
los diferentes lotes y se aprecia que la máxima concentración donde existió crecimiento de
callos embriogénicos h e 5 dl. En virtud de que entre esta concentración y la siguiente hay
una diferencia de 2 gA sería conveniente afinar la curva dosis respuesta en este intervalo para
determinar con precisión la concentración de glufosinato máxima que tolera cada una de las
líneas de maíz.
Como de todas las líneas empleadas, excepto la CML323, se obtuvieron callos
embriogénicos a partir de embriones sembrados en medio con glufosinato hasta la
concentración de 5 dl, se decidió llevar a cabo el experimento de regeneración transfiriendo
10s callos seleccionados a medio MSR sin glufosinato y a MSR adicionado con 5 de
glufosinato.
La tabla 2 nos muestra los resultados del experimento de regeneración. En general hubo
un alto porcentaje de regeneración en ambos medios, siendo el genotipo CML72X c m 2 1 6
el que presentó mayor proporción.
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Comparando los datos de regeneración en medio normal y con glufosinato se observa
que hubo mayor regeneración en el primero, lo cual era de esperarse ya que no existía un
agente que impidiera la regeneración, mientras que para el segundo medio se comprueba el
efecto del agente selectivo (glufosinato).
De los cultivos de la línea CML 323 en MSR, el porcentaje más alto se obtuvo en el lote
testigo, %.S%, y el más bajo, 58.3%, con embriones provenientes de la concentración 3 g/],
siendo esta última diferente de manera significativa (x2 = 14.6; p < 0.05). En el medio con
glufosinato el patrón fue diferente pues con embriones de la concentración 1 gA se presentó
el porcentaje más alto, 57.9%, mientras que el más bajo estuvo en los de la concentración de
3 g/]; ambos lotes difieren significativamente con respecto al lote testigo y entre ellos
mismos (x2 = 35.6; p < 0.05). Nuevamente se observa que esta línea es más sensible que las
otras al glufosinato.
En medio MSR normal, los embriones de la línea CML327 provenientes de los lotes
expuestos a 3 y 5 g/1 regeneraron en un loo%, aunque los provenientes del cultivo de 1 g/l
de glufosinato tuvieron el 84.6%; resultando significativa (x2 = 2.3; p < 0.05), esto puede ser
debido a la viabilidad del embrión o al criterio de selección de los callos embriogénicos es
decir, que de todos los callos formados no todos fueron clasificados como embriogénicos.
En el medio MSR adicionado con glufosinato, los embriones crecidos en presencia de 3 gA
de glufosinato tuvieron un 66.7% de regeneración, siendo esta diferencia significativa con
respecto al testigo (x2 = 1 1.5; p < 0.05), por lo que se deduce que esta línea tolera más al
glufosinato que la CML323. Además el 100% de los embriones provenientes de la
concentración de 5 g/l regeneraron.
La variedad CML2 16X C m 7 2 presentó una regeneración del 100% en MSR normal en
todos los lotes en tanto que en MSR con glufosinato h e menor, siendo el lote testigo el que
tuvo el porcentaje más bajo, 16.7 %, debido a la poca capacidad de regeneración en
presencia del agente selectivo que poseen las células. Las tres concentraciones difieren
significativamente del testigo (x2 = 747.5; p < 0.05).
El genotipo CML72X CML2 16 mostró que el lote testigo tiene un 93.8% de callos
embriogénicos regenerados, mientras que en los tres restantes se obtuvo el loo%, de
regeneración en MSR normal. En el medio con glufosinato los embriones provenientes del
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lote expuesto a 5 g / ] no regeneraron debido a su alta sensibilidad al glufosinato, mientras que
para los lotes expuestos a 1 y 3 gA se obtuvo el loo%, teniendo una diferencia significativa
con el lote testigo (x2 = 91.6; p < 0.05).
En la gráfica 2 se presenta el comportamiento de los cuatro genotipos y se aprecia que
en todas las líneas de maíz, con excepción del genotipo CML323, hubo regeneración en
todos los callos embriogénicos en medio MSR normal lo cual es evidencia de que los callos
embriogénicos conservan su capacidad de regeneración después de la primera fase de
selección con el glufosinato.
La gráfica 3 muestra un comportamiento diferente al de la gráfica anterior; en este caso
sí existió una disminución de regeneración en varios lotes. Por los resultados obtenidos en la
última parte del experimento I, se deduce que puede hacerse una segunda selección con
glufosinato en la fase de regeneración, ya que sólo aquellos callos resistentes o más
tolerantes al agente selectivo puede dar lugar a brotes.
El glufosinato resultó ser un buen agente selectivo para la línea 323 ya que h e la más
sensible seguida por la variedad de maíz CML72X CML216 ya que no presenta
regeneración en el lote proveniente de la concentración 5 g/], Sería conveniente determinar
la concentración de glufosinato máxima que tolera esta última línea para obtener
regeneración aunque sea en baja proporción; de acuerdo con los resultados esta
concentración es menor a 5 g / ] .
Con base en las observaciones anteriores, se abre una nueva línea de investigación sobre
la regeneración de callos embriogénicos seleccionados con glufosinato, es decir, en este
trabajo observamos IO que ocurre al inicio de la regeneración pero falta determinar si se
regeneran las plantas completamente y si éstas serían viables, fértiles, productivas, etc.
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DE GENOTIPO
MAÍZ
L
I 327
72x2 16
[GLUFOSINATO] FORMACI~N DE mg/l CALLOS
EMBRIOGÉNICOS (%) O
3 96 1 96
4* 5 15.3" 3 32* 1 86.4 O 16* 5
29.5* 3 67.4* 1 86.3 O 8* 5 13 3
86.6* 1 96.6 O
48.9*
Tabla l . Porcentaje de formación de callos embriogénicos de los cuatro genotipos de
maíz tratados con diferentes concentraciones de glufosinato.
*Diferencia significativa ( x2; p < 0.05)
GENOTIPO DE LOTE DE MAÍZ ORIGEN DE
LOS CALLOS 323 O
1 3
327 O
3 1
O 2 16x72 5
1 3 1
5 72x2 16 O
1 3 1
# DE MSR-G EMBRIONES
REGENERACI~N (%) MSR + G
c o L o c A D o s I I 24
9 1* 58.3* 11 57.9* 94.7 19 33.3 95.8
3 I 1 O0 I 1 O0
l3 I 100 84.6*
3 92.3 1 66.7*
2 16.7 1 O0 6 1 O0 1 O0
3 3
1 oo* 1 loo O0 1 50* 1 83.3' 1 oo*
1 O0 1 oo* 1 O0 O*
Tabla 2. Porcentaje de regeneración de los callos embriogénicos en medio MSR normal y MSR con 5 g/l de glufosinato. *Diferencia significativa ( x'; p < 0.05)
17
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
Gráfica 1. Porcentaje de formación de callos embriogknicos de cuatro líneas de maíz en medio CIM adicionado con diferentes concentraciones de glufosinato.
L
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
I
Gráfica 2. Porcentaje de regeneración de callos embriogénicos en medio MSR normal a partir de embriones previamente expuestos a diferentes concentracines de glufosinato.
Gráfica 3. Porcentaje de regeneración de callos embriogénicos en medio MSR con 5 gA de glufosinato a partir de embriones previamente expuestos a diferentes concentraciones del agente selectivo.
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
ExDerimento I1
Como ya se mencionó el diseño de este experimento h e similar al del anterior,
siendo la única diferencia la aplicación de un pretratamiento aplicado a los embriones al
iniciar la siembra, con el objetivo de determinar si se favorecía una mayor proporción de
células que pudieran formar callos en presencia de glufosinato.
A diferencia del experimento I, en éste sí hubo crecimiento de células en los callos
embriogénicos de todas las concentraciones, a excepción del genotipo CML327, que sólo
presentó formación de callos en las concentraciones 1 y 3 g/l glufosinato. Esto quiere decir
que el periodo de incubación en ausencia de glufosinato disminuye el efecto selectivo del
agente. En el caso de la línea CML327 se deduce que a pesar de la incubación previa,
conserva la sensibilidad al glufosinato.
En lo que se refiere al lote testigo sólo en la línea CML216X CML72 se observa un
100% de formación de callos, mientras que el cultivo CML323 presenta el porcentaje más
bajo, 52.1%; esto puede deberse a la viabilidad de los embriones, al criterio de selección de
los callos embriogénicos y, con menor probabilidad, a posible contaminación de los
embriones proveniente directamente de las mazorcas de maíz.
La tabla 3 nos muestra que la línea 323 tuvo una alta formación de callos
embriogénicos en las seis concentraciones. En la de 1 g/1 se presentó un 96% y en la de 11
g/1 un 16.6%; todos los lotes difieren significativamente del lote testigo (x2 = 67.9; p <
0.05), excepto los de 3 y 5 dl. En este caso se observa una disminución de formación de
callos conforme se aumentó la cantidad de glufosinato por lo que se deduce que la última
concentración donde hubo crecimiento, que h e de 11 d l , es la que puede aplicarse para
seleccionar células.
Para el genotipo CML327, únicamente en el lote testigo y en los expuestos a 1 y 3
g/1 se aprecia formación de callos embriogénicos, siendo la concentración 1 g/1 la que
presenta el menor porcentaje 32%, diferencia que es significativa con respecto al lote testigo
(X2 = 15.1; p C= 0.05); la concentración de 3 g/l tuvo el porcentaje más alto, 66.6%. En el
lote testigo hubo sólo un 63.6% de formación de callos y esto pudo deberse a que no todos
10s embriones que se colocaron en este lote heron viables.
2 2 5 8 0 3 En la línea de maíz CML216X CML72 hubo formación de callos en todos lotes, aunque
en el de la concentración 11 g/l de glufosinato fue baja, sólo 9 %. Todas las concentraciones
resultaron ser diferentes con respecto al lote testigo (x’ = 210.5; p < 0.05). La disminución
del porcentaje de formación de callos en función de la concentración de glufosinato sugiere
una baja tolerancia al agente y la que más convendría para fines de selección es la de 1 lg l .
De la línea CML72X CML216 existió formación de callos embriogénicos en seis
concentraciones. El porcentaje más bajo se presentó en el lote de 3 g/1 mientras que el lote
con mayor proporción fue el testigo. Al igual que en el genotipo CML216X CML72, las seis
concentraciones difirieron de manera significativa del lote testigo y entre ellos mismos (x2 =
210.5; p < 0.05).
En la gráfica 4 se observa el comportamiento de los cuatro genotipos en los diferentes
lotes comprobándose la disminución de formación de callos en función de la concentración
de glufosinato, la máxima concentración donde existió crecimiento de callos embriogénicos,
11 dl, y el comportamiento distinto de la línea 327. Al igual que en el experimento 1, sería
conveniente afinar la curva dosis respuesta entre la concentración 3 y 5 g/1 para el maíz 327
con el fin de determinar con precisión la concentración de glufosinato máxima que tolera
cada una de las líneas de maíz.
Como casi todos los genotipos empleados tuvieron callos embriogénicos hasta la
concentración 11 g / ] , se decidió realizar el experimento de regeneración transfiriendo los
callos seleccionados a medio MSR sin y a MSR con 11 g/l de glufosinato.
En la tabla 4 se presentan los resultados de la segunda parte del experimento y se
observa que el comportamiento h e similar al del experimento I.
Comparando los datos de regeneración en medio normal y con glufosinato se aprecia en
general, que existió mayor regeneración en el medio normal, esto debido a que no
presentaba ningún agente selectivo que afectara la regeneración; en tanto el medio
adicionado con glufosinato sí la afectó pues su proporción fk menor, comprobándose así el
efecto del agente selectivo.
En medio normal, la línea CML323 presenta formación de brotes en todos 10s
embriones provenientes de los lotes de formación de los callos con diferentes
19
concentraciones de glufosinato. Los embriones de las concentraciones 1, 3, 5, y 9 g/1
presentan diferencias significativas en relación al lote testigo (x’ = 8 1.7; p < 0.05); el lote
testigo presentó la mayor regeneración mientras que la concentración de 5 g/l tuvo menor
cantidad de brotes regenerados.
La línea de maíz CML327 mostró regeneración en los embriones provenientes de las
concentraciones 1 y 3 g/1 con un 50 % el medio normal, ambas difieren significativamente
del testigo (x’ = 12.8; p < 0.05); en el medio con glufosinato, el lote proveniente de la
concentración 3 g/l no presenta ningún indicio de regeneración lo cual confirma su alta
sensibilidad al glufosinato.
En el caso del híbrido CML216X CML72 en medio normal se registraron brotes en todos
los lotes. Los lotes testigo, 3, 9 y 1 1 g/l mantuvieron el 100% de regeneración, el de la
concentracion 5 g/1 tuvo una proporción más baja y más aún el de 7 g/l; estos dos difieren de
manera significativa del lote testigo.
En el medio MSR con glufosinato, el comportamiento de CML216X CML72 es irregular
pues en los embriones de 1 y 3 g/1 la regeneración disminuye notablemente pero a partir de
la concentración de 7 g/l los embriones muestran regeneración que disminuye nuevamente en
el lote proveniente de la concentración 11 g/l. Todos los lotes difieren significativamente del
testigo. Dadas estas variaciones, sería conveniente repetir la experiencia incrementando el
tamaño de la muestra.
La línea CML72X CML2 16 fue la única que mostró un 100% de regeneración en todos
los lotes de embriones, en el medio sin glufosinato; en el caso del medio adicionado con el
agente selectivo, los embriones proveniente de los lotes 1 y 3 g/l conservaron
completamente su capacidad de regeneración. Los embriones de los lotes 7, 9 y 11
regeneraron menos y difieren significativamente del testigo (x’ = 73.5; p < 0.05).
La gráfica 5 nos muestra el comportamiento de las cuatro variedades de maíz pretratadas
durante siete días con medio N6C 1 normal y se observa que los genotipos CML216X
C m 7 2 y 72x216 presentan mayor regeneración en todos los lotes mientras que de las otras
h e a s no todas regeneraron, siendo esto más evidente en la 327.
20
En la gráfica 6 se observa una respuesta similar pues las líneas CML216X72 y
CML72X2 16 presentan la mayor regeneración aunque en menor proporción que en el medio
normal.
Se recomienda utilizar células pretratadas ya que se obtiene un mayor porcentaje en
tasa de sobrevivencia tanto para callos embriogénicas como para regeneración. Bohorova et
al (1999) menciona que las plantas transgénicas solo pueden ser producidas cuando las
células son competentes, tanto para regeneración y transformación integrativa. No todas las
células vegetales son totipotenciales, y las células difieren en su capacidad para responder a
los activadores. Los embriones inrnaduros de precultivo o escutelos aislados con células
competentes para embriogénesis somática han probado ser excelentes blancos para
bombardeo de microproyectiles y para una rápida recuperación de plantas transgénicas.
21
DE MAiz
323
327
2 16x72
72x2 16
[GLUFOSINATO] dl
- O 1 3 5 7 9 11 O 1 3 O 1 3 5 7 9 1 1 O
1 3 5 7 9 1 1
1 FORMACI~N DE CALLOS
EMBRIOGÉNICOS (%) 52.1 96* 51 50
48.9* 33.3* 16.6* 63.6
32.1* 66.6 100
60.4* 80.6* 54.5* 54.5* 18.1"
9* 79.2
50* 1 1 . 1 * 66.7* 39.6* 37.5* 25*
Tabla 3. Efecto del pretratamiento sobre la formación de callo embriogénico de las cuatro líneas de
maíz en presencia de glufosinato.
*Diferencia significativa ( x:; p < 0.05)
22
MAÍZ
323
327
2 16x72
72x2 16
"
"
"
"
-
ORIGEN DE LOS CALLOS
O 1 3 5 7 9 11 O 1 3 O 1 3 5 7 9 11 O 1 3 5 7 9 1 1
EMBRIONES coLocADos
12 24 12 12 12 8 4 7 6 6 10 23 12 6 24 8 6 25 11 3
24 10 6 6
"
"
"
"
-
REGENERA MSR-G
50 70.8* 83.3* loo* 50
42.9* 50
71.4 50* 50* 1 O0 95.7 100
83.3* 79.2*
1 O0 1 O0 100 1 O0 1 O0 100 1 O0 1 O0 1 O0
"
"
"
"
-
CIÓN (%) MSR + G
91.7 37.5* 33.3*
O* 16.7
37.5* 50* 14.3 16.7 o* 60
45.5* 16.7* 33.3* 39.1* 62.5 33.3*
72 loo* loo* 75 90 *
83.3* 50*
Tabla 4. Porcentaje de regeneración de los callos embriogénicos de dtferentes líneas de maíz en medto
MSR normal y MSR adicionado con 11 811 de glufosinato
*Diferencia sigruficativa ( x*; p < 0.05)
23
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
I I
Gráfica 4. Porcentaje de formación de callos embriogénicos de cuatro líneas de maíz pretratados durante siete días con medio C1M normal.
1 O0 90
70 3 60 5 50 O 3 gll 8 40 g 30
O 5 gll
20 10 O
w
m 9 gll
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
Gráfica 5. Porcentaje de regeneración de c a l l o s embrigénicos pretratados; en medio MSR normal a partir de embriones previamente expuestos a diferentes concentraciones de glufosinato.
Exoerimento I
Como se mencionó anteriormente la metodología de este experimento para determinar el efecto de
otro agente selectivo, la manosa, fue similar a la llevada a cabo en el experimento con glufosinato.
Con respecto a la formación de callos embriogénicos, en la tabla 5 se observa que se
presentó en los genotipos CML323, CML327 y CML72X CML216 hasta la concentración
0.752 g/l, mientras que en la línea CML216X CML72 hubo callos hasta la concentración de
1.25 g/l; se registró variación en el porcentaje de formación de callos en las cuatro líneas,
siendo la CML327 la que presentó menor proporción en tanto que la línea CML323 cuenta
con el valor más alto.
Los lotes testigo de las variedades CML323 y CM72X CML216 tuvieron el 100%
de formación de callos, mientras que la variedad 327 presenta sólo 28.5%, siendo éste el
más bajo; en la línea CML216X C m 7 2 se obtuvo el 5 1.8%. Por estos resultados se deduce
que la capacidad de los embriones para formar callos embriogénicos disminuyó; otro factor
h e el criterio de selección utilizado o con menor probabilidad, la contaminación
proveniente directamente de las mazorcas de maíz.
En lo que se refiere al genotipo CML323 éste presentó el mayor porcentaje de callos
embriogénicos de las cuatro variedades, siendo el valor más bajo 90% en la concentración
0.752 g/l por lo que se infiere que esta línea es muy tolerante a la manosa pues no hubo
selección.
En el caso de la variedad CbE327 el lote testigo sólo tuvo 28.5% de formación de
callos y esto pudo deberse a que los embriones no heron viables o los callos formados no
eran embriogénicos. El porcentaje mis alto se presentó en la concentración 0.352 gA con un
40 %, mientras que la concentración con menor número de callos fue 0.752gA; ambos lotes
resultaron diferentes significativamente respecto al testigo (x2 = 16; p < 0.05).
En el caso de la línea CML216X CML72 existió formación de callos hasta la
concentración 1.25 g/l. El porcentaje más alto se presentó en la concentración 0.352 g/1
mientras que la menor formación de callos fue en 1.25 dl. Esto sugiere una mayor tolerancia
a la manosa. Las tres concentraciones presentan diferencias significativas con respecto al
lote testigo (x2 = 54.2; p < 0.05).
24
El genotipo CML72X CML216 presentó formación de callos hasta 0.752 d l ; en el
lote testigo y en 0.352 g/1 h e del 100% mientras que para la concentración 0.752 8/1
descendió drásticamente hasta 24.4% siendo esta diferencia significativa con respecto al lote
testigo (x’ = 57.1; p < 0.05).
La gráfica 7 muestra que la c:oncentración donde ya no existió tolerancia a la manosa
es 1.25 g/]. La líneas más resistentes a la manosa heron: CML323, CML216X CML72 y
CML72X CML216 (aunque esta última h e menos resistente por el porcentaje obtenido en
la concentración de 0.752). La línea menos resistente h e CML327, por lo tanto la manosa
es un buen agente selectivo para este genotipo.
Como en la línea CML2 16X CML72 existió formación de callos hasta la
concentración 1.25 g/1 se decidió llevar a cabo el experimento de regeneración transfiriendo
los callos seleccionados a medio MSR normal y a MSR adicionado con 1.25 g/] de manosa.
La tabla 6 nos muestra los resultados del experimento de regeneración en medio sin
agente selectivo y con el agente selectivo. En general hubo un alto porcentaje de
regeneración en ambos, siendo el genotipo CML327 el Único que presentó el 100% de
regeneración en los dos medios.
Comparando los datos de regeneración en medio normal y con manosa se observa
que la diferencia no es significativa, por lo que se deduce que la concentración del agente
selectivo (manosa) no tuvo influencia directa sobre la fase de regeneración; convendría
también como en el caso del glufosinato afinar la curva dosis respuesta entre 1.25 y 2.5 para
determinar la concentración de manosa que tolera cada una de las líneas de maíz ya
regeneradas.
El genotipo donde existió el menor porcentaje en medio normal h e el CML323,
siendo este mismo el que presentó menor formación de brotes en medio con manosa.
Para el genotipo CML323 en MSR normal, la proporción más alta se obtuvo en el
lote testigo y en los embriones provenientes de la concentración 0.352 g/l; en el caso de 10s
embriones provenientes de la concentración 0.752 g/1 presentó un 30% siendo esta última
diferente de manera significativa del lote testigo (x2 = 8; p < 0.05). En medio con manOSa
existió mayor porcentaje que en medio sin manosa; el lote testigo presentó la proporción
mayor, mientras que en los embriones provenientes de la concentración 0.752 g/l disminuyó
25
prácticamente al 50%. Los embriones provenientes de la concentración 0.752 g/1 difieren
significativamente con respecto al lote testigo (x2 =14.7; p < 0.05).
De los cultivos de la línea (zML327 en MSR normal y adicionado con manosa se
presentó 100% de regeneración en todos los embriones provenientes de las diferentes
concentraciones por lo que se deduce que esta variedad muestra una alta tolerancia a la
manosa. Este comportamiento es muy diferente al observado con glufosinato en el que,
como se observa en la tabla 2, la línea 327 es menos tolerante al agente selectivo.
La variedad CML216X CML72 presentó un alto porcentaje en medio normal en los
embriones provenientes de la concentración 0.752 g/l en tanto que en medio con manosa los
embriones provenientes de las concentraciones 0.352, 0.752 y 1.25 g/l tuvieron diferencias
significativas con respecto al lote testigo (x’ = 57.1; p < 0.05).
El genotipo CML72X CML216 en medio normal mostró que el lote testigo tiene un
91.3 g/1 de callos embriogénicos regenerados, mientras que en los dos restantes se obtuvo el
loo%, de regeneración, patrón similar al que presentó en el experimento con glufosinato,
parte 1. En medio con manosa el lote testigo y los embriones provenientes de la
concentración 0.752 g/l, presentaron los porcentajes más bajos de las cuatro líneas.
En la gráfica 8 se presenta el comportamiento de los cuatro genotipos y se observa
que la línea 323 es la más sensible a la manosa, mientras que la variedad 327 h e la que
presentó el 100% de regeneración sólo en el lote testigo y en las dos primeras
concentraciones; se observa también, que sólo en la línea CM2 16X CML72 se presentó
regeneración en la concentración 11.25. Las demás líneas tuvieron un comportamiento
similar.
La gráfica 9 muestra Prácticamente el mismo comportamiento que el anterior pues es
muy poco lo que varía en el porcentaje de regeneración a excepción del genotipo CML72X
CML216 que presentó mayor formación de brotes en la concentración 0.752 g/l. Por estos
resultados se puede decir que el medio con 1.25 8/1 de manosa no afecta directamente a la
fase de regeneración.
Estos resultados difieren de los resultados obtenidos por Joersbo et al (1 998) el fue
Pionero en utilizar la manosa como agente selectivo y encontró que la estrategia de selección
26
basada en el uso de fosfomanosa isomerasa (PMI) como gen selectivo y rnanosa como
agente selectivo era altamente eficiente. El mecanismo de selección de manosa se cree que
recae sobre la toxicidad de manosa-6-fosfato hacia células transgénicas. La incubación de
células de espinaca en la presencia de manosa se ha mostrado que resulta en desnutrición
con respecto a fosfato y ATP, debido a la acumulación de manosa-6-fosfato no
metabolizable.
27
GENOTIPO DE MAÍZ FORMACI~N DE CALLOS [MANOSA] gA EMBRIOGÉNICOS (%)
323
90 0.752 96 0.325 1 O0 O
327 O 28.5 0.325 40" 0.752 10.4"
2 16x72 O 51.8 0.325 81.8" O. 752 75.6" 1.25 14.8"
72x2 16
24.4" 0.752 1 O0 0.325 1 O0 O
Tabla 5. Porcentaje de formación de callos embriogénicos de los cuatro genotipos de maíz tratados con diferentes concentraciones de manosa. *Diferencia significativa ( x2; p < 0.05)
GENOTIPO DE REGENERACI~N (%) # DE LOTE DE MAÍZ MSA +M MSR-M EMBRIONES ORIGEN DE
LOS CALLOS coLocADos 3 23 60 50 10 O
0.352
1 O0 1 O0 5 0.352 1 O0 1 O0 20 O 327
30.8" 30 13 0.752 54.4 50 22
0.752 92.9 1 O0 13 O 2 16x72 1 O0 1 O0 5
I 0.352 I 7 I 1 O0 i 1 O0 0.752
77.8 1 O0 9 O. 752 1 O0 1 O0 29 0.352 82.6 91.3 23 O 72x2 16 1 O0 1 O0 7 1.25 87.5 95.5 22
Tabla 6. Porcentaje de regeneración de los callos embriogénicos en medio MSR normal y MSR con 1.25 g/1 de manosa. *Diferencia significativa ( x2; p < 0.05)
28
5
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
Grafica 7 Porcentaje de formacion de callos embriogenicos de cuatro lineas de maiz en medio C1 M adicionado con diferentes concentraciones de manosa.
I 323 327 216x72 72x216
I GENOTIPO
I L I
Grafica 8. Porcentaje de regeneracion de callos embriogenicos en medio MSR normal a partir de embriones previamente expuestas a diferentes concentraciones de manosa.
323 327 216x72 72x216
genotipo
Grafica 9. Porcentaje de regeneracion de callos embriogenicos en medio MSR con 1.25 g/l de manosa a partir de embriones
~~
previamente f xpuestos a diferentes concentraciones del agente selectivo.
Experimento II
Este experimento fue simtlar al experimento I1 realizado con glufosinato y consistió en
aplicar un pretratamiento a los embriones al iniciar la siembra, con el objetivo de determinar si se
favorecía una mayor proporción de células de embriones que pudieran formar callos en presencia
de manosa.
LOS resultados muestran la formación de callos embriogénicos hasta la concentración de
5 g / l ; el genotipo CML323 fue el Único que no presentó formación de callos embriogénicos en el
lote testigo mientras que en la línea CML216X CML72 existió el 100 % de callos; en la variedad
de maíz CML72X CML2 16 la proporción bajó drásticamente a 10.7% debido probablemente a
la capacidad que tienen los embriones para formar callos embriogénicos o al criterio de selección.
En la tabla 7 se aprecia que en el genotipo CML323 se presentó la mayor formación de
callos con respecto a las demás líneas; sin embargo el lote testigo no presentó formación de éstos,
debido a la viabilidad del embrión o a contaminación de ellos. En la concentración 5 g/l se
observó la menor proporción de callos, 87.5%, mientras que en 0.752, 1.25, y 2.5 gA se obtuvo
el 100%. Estos resultados indican que no existió una selección como tal, por lo que se necesita
aumentar la concentración para encontrar aquella que sea óptima para seleccionar aquellos callos
resistentes a este azúcar.
En el caso de la variedad 327 la formación de callos se presentó sólo hasta la
concentración de 0.752 gil con el porcentaje más bajo, 9.3%. En este caso se observa una
disminución de formación de callos conforme se aumentó la cantidad de manosa, por lo que se
deduce que la concentración donde hubo crecimiento, que fue de 0.752, es la que puede aplicarse
para seleccionar células. Las únicas concentraciones donde existió formación de callos resultaron
diferentes significativamente con respecto al lote testigo (x’ = 40.8; p < 0.05). Como se vio en el
experimento con glufosinato, esta línea resultó ser sensible a la manosa.
En el genotipo CML216X CML72, se presentó un porcentaje alto de formación de callos
similar al de la linea CML323. En las concentraciones 2.5 y 5 g/l se registró 56.2% para ambas, y
difieren significativamente del lote testigo (x’ = 19.8; p < 0.05). Al igual que el lote testigo, con
las concentraciones de 0.752 y 1.25 gA se obtuvo el 100% de formación de callos. Estos datos
sugieren que es la línea más tolerante a la manosa, por lo que es la menos indicada para fines de
selección.
29
La variedad CML72X CML2 16 h e la que registró la menor proporción de callos de
todas, siendo el lote testigo el de menor porcentaje, 10.7%, mientras que en la concentración de
1.25 g/l, se presentó un 60%, el más alto. Todas las concentraciones, a excepción de 5 gA difieren
significativamente del lote testigo (x’ =347; p < 0.05). El hecho de que todos 10s lotes tengan
mayor proporción de callos que el lote testigo es debido a contaminación en este último.
La gráfica 10 muestra el comportamiento de las cuatro líneas de maíz, comprobándose
así que el genotipo que presenta mayor sensibilidad a la manosa es el CML327; también se
aprecia que la variedad de maíz CML216X C m 7 2 presenta formación de callos en todas las
concentraciones, y es la que tiene el mayor porcentaje. Al igual que en los experimentos
anteriores, convendría afinar la curva dosis-respuesta entre la concentraciones 0.752 y 1.25 gA,
con el fin de determinar con precisión la concentración de manosa máxima que tolera cada una de
las líneas de maíz. Estos resultados difieren de los obtenidos en los embriones no pretratados, la
cual consiste en que los pretratados crecieron hasta la concentración 5 g/l, mientras que los otros
sólo hasta la concentración 1.25g/l, por lo que se deduce que el pretratamiento genera una mayor
proporción de células que forman callos en presencia de manosa, es decir, contrarrestra el efecto
seleccionador del agente.
Tres de los cuatro genotipos empleados tuvieron callos embriogénicos hasta la
concentración de 5 g/l, por lo que se decidió realizar el experimento de regeneración transfiriendo
los callos seleccionados a medio MSR normal y a MSR adicionado con 5 g/l de manosa.
En la tabla 8 se observan los resultados de la segunda parte del experimento, donde
puede apreciarse una diferencia notable entre los brotes formados en medio normal y aquéllos
formados con medio adicionado con manosa, siendo el primero el que presenta una mayor
regeneración, debido a que ningún agente selectivo está presente.
En medio normal, el genotipo CML323 presentó formación de brotes en todos los
embriones provenientes de todos los lotes de formación de callos con diferentes concentraciones
de manosa, a excepción del lote testigo. Todos tuvieron 100% de regeneración, excepto los de la
concentración 5gA en la que se registró el 88.9% de regeneración bajo. Para los callos
embriogénicos transferidos al medio con 5g/l de manosa, se observó en el lote testigo un 40% de
regeneración, mientras que los embriones provenientes de los lotes de fomción de callos de las
concentraciones 1.25, 2.5 y 5 g/l tuvieron un porcentaje mayor, resultando diferentes
30
significativamenten del lote testigo (x2 =136.5; p < 0.05); los de la concentración 0.752g/l
registraron las frecuencias más bajas de formación de brotes, 33.3%.
La variedad de maíz CML327 sólo presentó brotes en los embriones provenientes del
lote testigo y de las concentraciones 0.352 y 0.752 gil, siendo el lote de 0.352 gil el que presenta
el menor porcentaje de formación de brotes en medio normal; las diferencias entre los lotes
experimentales y el lote testigo son sigtllficativas (x2 =34.6; p < 0.05). En el caso del medio con
manosa, el comportamiento que se presentó es similar ya que los embriones provenientes del lote
testigo tienen el mayor porcentaje de regeneración, mientras que el menor porcentaje lo tuvieron
los embriones provenientes de la concentración 0.352 gil, por lo que concluye que esta línea es la
más sensible.
En el caso del genotipo CML2! 16x72 en medio normal, los embriones provenientes de la
concentración 1.25 presentan la menor proporción de regeneración y los embriones provenientes
del lote testigo y de las concentraciones 0.752, 2.5 y 5 g/l tuvieron el 100 % de formación de
brotes. En el medio con agente selectivo, el comportamiento de este genotipo íüe muy variable,
siendo los embriones provenientes de la concentración 0.752 g/l los que tuvieron el mayor
porcentaje de regeneración y 0.352 g/l la que presenta menor proporción de brotes. Los
embriones provenientes del lote testigo tuvieron un 50 % de regeneración. Por estos resultados
convendría repetir el experimento con manosa, aplicando las mismas concentraciones y más
elevadas para determinar si este conviene ser utilizada como agente selectivo en m a í z .
La línea CML72X CML216 tuvo un alto porcentaje de regeneración en medio normal
como era de esperarse, pues el porcentaje más bajo lo tuvieron los embriones provenientes de la
concentración 0.752 gil con 80.8%. Este comportamiento cambió en medio con manosa, ya que
los embriones provenientes de las concentraciones 0.352, 0.752, 1.25 y 2.5 gil descendieron
notablemente, mientras que los embriones provenientes del lote testigo y de la concentración 5 gil tuvieron el 100?40. Los embriones provenientes de las concentraciones 0.352, 0.752 y 1.52
difheron sigmfkativamente del lote testigo (x’ = 60; p < 0.05)
La gráfica 11 muestra el comportamiento de las cuatro líneas pretratadas durante siete
dias con medio C M normal y se observa que todas las variedades presentan proporción similar
de regeneración, sólo en el caso de genotipo CML327 no existió formación de brotes en todas las
concentraciones.
31
En la gráfica 12 se observa una respuesta similar a la gráfica 11 pues todos los
genotipos tuvieron un alto porcentaje de regeneración, aunque en menor proporción que en
el medio normal.
En este caso el pretratamiento utilizado no tuvo impacto sobre el experimento con
manosa, por lo que se recomienda no hacerlo en los próximos experimentos.
La bioingieniería se está aplicando en la agricultura para obtener cultivos
transgénicos que superen en calidad a los conseguidos por métodos tradicionales, por esto
se han experimentado nuevas técnicas de mejoramiento.
Al hablar de aumentar la calidad nos referimos a: la obtención de plantas cuyas
proteínas contengan mayores niveles de aminoácidos esenciales, carbohidratos y lípidos para
mejorar el contenido energético y las propiedades fimcionales de sus harinas, la modificación
de compuestos tóxicos o alérgicos con alimentos de origen vegetal, reducir el uso de
insecticidas, incrementar la resistencia de las plantas contra plagas, enfermedades y efectos
no deseados de herbicidas.
En el campo de la salud, se ha demostrado que los frutos de plantas transgénicas
sintetizan y acumulan proteínas antigénicas (Nieto-Jacob0 et al., 1999).
No podemos olvidar los riesgos que pudieran generar las plantas transgénicas, como
son que estas trasmitan sus caracterkticas a especies silvestres convirtiéndolas en malezas o
plagas, o generar enfermedades más agresivas contra ellas.
Nieto-Jacob0 et al (1 999) menciona que los genes de resistencia a antibióticos crean
inquietud, ya que son empleados como marcadores de selección en el proceso de producción
de plantas transgénicas y se teme que pudieran pasar a los microorganismos que habitan en
el tracto digestivo de los animales consumidores y generarse patógenos resistentes a dichos
antibióticos, aunque esto no esta totalmente comprobado.
32
GENOTIPO DE MAÍZ FORMACI~N DE [MANOSA] dl CALLOS
EMBRIOGÉNICOS (?x,) 323
1.25 1 O0 0.752 91.7 0.352
1 O0 2.5 1 O0
5 87.5 327 O 40.6
0.352 14.5" O. 752
O 2 16x72 9.3"
28.1" 2.5 60 * 1.25
34.3 * O. 752 3 1.2" 0.352 10.7 O 72x2 16
56.2* 5 56.2* 2.5 1 O0 1.25 1 O0 0.752 91.6 0.352 1 O0
5 15 Tabla 7. Efecto del pretratamiento sobre el callo embriogénico de las cuatro líneas de maíz en presencia de manosa. *Diferencia significativa ( x*; p < 0.05)
33
GENOTIPO DE % DE REGENERACIóN # DE LOTE DE MAÍZ MSR+ M MSR EMBRIONES ORIGEN DE
LOS CALLOS c o L o c A J J o s 3 23 40 1 O0 10 0.352
0.752 1.25 2.5 5 88.9" 88.9 9
3 27
50" 75 12 0.752 25" 50 12 0.352 70 90 10 O
2 16x72 O 16 1 O0
62.5" 1 O0 24 2.5 47.9" 81.3 48 1.25 72.7" 1 O0 33 0.752
40 92.9 30 0.352 50
5 11 1 O0 54.5
5 1 O0 1 O0 3 Tabla 8 Porcentaje de regeneración de los callos embriogénicos de diferentes líneas de maíz m medio MSR normal y MSR con 5 g/l de manosa. *Diferencia significativa ( x2; p < 0.05)
72x2 16 O 0,352 0.752 1.25 2.5
9 9 10
9 14 16 9 8
1 O0 1 O0 1 O0
1 O0 93.3 80.8 1 O0 1 O0
33.3 77.8" 80"
1 O0 35.7" 75 "
66.7* 87.5
34
323 327 216x72 72x216
GENOTIPO
Gráfica 10. Porcentaje de formación de callos embriogénicos de cuatro líneas de maíz pretratados durante siete días con medio C1 M
r
I
I
m0.352 gll
00.752 g / ¡
O 1 25 gn m2.5 gh
323 327 216x72 72x216
GENOTlPO
I Gráfica 11. Porcentaje de regenración de callos embriogénicos pretratados, en medio MSR normal a partir de embriones previamente expuestos a diferentes concentraciones de manosa.
323 327 216x72 7 2 x 1 6
GENOTlPO
I
I
Gráfica 12. Porcentaje de regeneraclon de callos embriogénicos pretratados, en medio MSR con 5 g/l de manosa a partir de embriones previamente expuestos a diferentes concentraciones del agente selectivo.
*:* Se comprueba que el glufosinato es un buen agente selectivo en los genotipos
empleados, y se recomienda su empleo en maíz.
*:* Como puede verse en los resultados, el genotipo que presentó mayor sensibilidad al
glufosinato fue CML323.
*:* La manosa no resultó ser un buen agente selectivo en las líneas de maíz utilizadas.
*:* La variedad con mayor sensibilidad a la manosa h e CML323.
*:* El pretratamiento aplicado en el experimento con glufosinato confirió resistencia al
agente selectivo.
*t. La línea que presento mayor sensibilidad al glufosinato con el pretratamiento h e
CML327.
*:* En el caso del experimento con manosa el pretratamiento no tuvo ningún efecto.
*:* El genotipo 327 fue la que presento mayor sensibilidad a la manosa con el
pretratamiento.
*:* Se sugiere repetir ambos experimentos para confirmar los resultados y afinar las curvas
dosis respuesta.
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