5 presentacion joana_azevedo

Joana Azevedo e Victor Freitas REQUIMTE/ Laboratório Associado Química Verde Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

[email protected] [email protected]

25 Marzo 2015

MIGRACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DEL CORCHO AL VINO

mailto:[email protected]



Evidencias!

Disoluciones de vino modelo

INTRODUCCIÓN

COMPUESTOS FENÓLICOS

DATOS PRELIMINARES

MIGRACIÓN DE COMPUESTOS

AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Algunos meses después

Color amarillo pálido

Hipótesis

¿Hay una migración de los compuestos del corcho al vino?

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Esto es bueno o malo?

Hipótesis

¿Qué tipo de compuestos migran?

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Corcho

Constituyentes

estructurales

Suberina

Lignina

Polisacáridos

Constituyentes no estructurales

Inorgánicos

Extractables

ceras

Pequeñas moléculas

Compuestos fenólicos

Compuestos Fenólicos INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Compuestos Fenólicos

Color (antocianons y

flavanoles)

Astringentes y amargos

anticancerígenicos

antioxidantes

Taninos

Taninos hidrolizables

Ácido Galico Ácido Elágico

Taninos Condensados

Caracterización de los compuestos fenólicos del corcho INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Fraccionamiento mediante cromatografía de baja presión

(Toyopearl ®, 250 x 25 mm d. i.,eluyente: MeOH; flujo: 0.8 mL.min-1)

Maceración hidroalcóholica del corcho

(12% EtOH; 5.0 gL-1 ácido tartarico; pH 3.2)

Purificación y aislamiento mediante HPLC-DAD semi-preparativa

Caracterización mediante HPLC-DAD/ESI-MS y RMN

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Fraccionamiento del extracto de corcho (Toyopearl®)

Cromatograma :

Ácidos Fenólicos y Aldeidos (A, B, C y D)

OH

OH

OH

COOH

OH

OH

COOH

OH

OH

CH

CH COOH

OH

CH

CH

MeO

COH

Gallic acid Protocatechuic acid

Conyferaldehyde

Cafeic Acid

OH

COH

MeO

Vanilin

Derivados Ácido Elagico y Gálico (F, G y H)

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

m/z 301

OH

OH

OH

OH

COOH

COOH

OH O

OH

OH

OHHOOC

m/z 505

O

OO

OOH

OH

OH

OOH

OH

OHHOOC

m/z 469

Ellagic Acid Valoneic Acid Valoneic Acid Dilactone

FERNANDES, A., MATEUS, N., CABRAL, M., de FREITAS, V. Analysis of phenolic compounds in cork from Quercus suber L. by HPLC-DAD/ESI-MS. Food Chemistry 125, 2011, 1398-1405.

Identificación por LC ESI/MS

Identificación de los compuestos del corcho

Identificación de los compuestos del corcho INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Taninos elágicos (H, I, J, K, L y M)

Identification by LC ESI/MS

OH

OH

OH

O

OO

OH

O

OH

O

HH

OHOH

OH

O

OH

OHOH

O

OH

OHOH

O

OH

OH

OH

O

OO

O

O

OH

O

HH

OHOH

OH

OOH

OH

OH

O

OH

OHOH

O

OHOH

OH

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OO

O

O

OH

O

HH

m/z 633 (HHDP-galoyl-glucose)

m/z 783 (diHHDP-glucose)

m/z 785 (HHDP-digaloyl-glucose)

OHOH

OH

O

OH

OHOH

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OO

O

O

O

O

HH

m/z 935 (diHHDP-galoyl-glucose)

OHOH

OH

O

OH

OHOH

O

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

OO

O

O

O

O

HH

OH

OH

OH

O

m/z 937 (HHDP-trigaloyl-glucose)

O

HO OH

OHOHOHOH

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

OH

OH

O O

O

OO

O

R1OO

O

R2

m/z 933 (Castalagin/ vescalagin)

Fracionamiento extracto del Corcho (Toyopearl®) –

Chromatogram :


Compuestos fenólicos identificados en corcho INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Postulated Compounds Compound number [M-H]- m/z MS2 ions (m/z) MS3 ions (m/z)* l máx (nm) Fraction

Protocatechuic aldehyde 1 137 109 - 280; 310 I Vanillin 2 151 136 108 279; 308 I Protocatechuic acid 3 153 109 - 259; 293 I Gallic acid 4 169 125 97 270 I Conyferaldehyde 5 177 162 133; 120; 106 289; 340 I Caffeic acid 6 179 - - 322 I Ferulic acid 7 193 149 134 319 I Ellagic acid 8 301 257; 229 - 250; 373 I, II Ellagic acid-pentose 9 433 301 257; 229 253; 373 I Ellagic acid-deoxyhexose 10 447 301 257; 229 253; 373 I Ellagic acid-hexose 11 463 301 257; 229 253; 373 I Valoneic acid dilactone 12 469 425 407; 301 253; 373 II HHDP-glucose 13 481 301 257; 229 262; 379 I Valoneic acid 14 505 313 - 253; 370 II Dehydrated tergallic-C- glucoside 15 613 593; 523; 493 465; 301; 299 253; 373 II

HHDP-galloyl-glucose 16 633 463; 301 257; 229; 185 262 III

Trigalloy-glucose 17 635 483; 465 421; 313; 169 277 II Di-HHDP-glucose 18 783 481; 301 257; 229 271 III; IV HHDP-digalloyl-glucose 19 785 633; 483; 301 257; 229 271 III; IV

Tetragalloyl-glucose 20 787 635; 617 573; 465; 403 274 III Castalagin / Vescalagin 21 933 915; 631 613; 569 247 VII; VIII Di-HHDP-galloyl-glucose 22 935 633; 873; 783 571; 329; 299 271 VI

Trigalloyl-HHDP-glucose 23 937 785; 767; 635; 465 301 277 VIII

Pentagalloyl-glucose 24 939 787; 769 617; 599; 447 279 V

Mongolicain A / B 25 1175 873; 855; 721; 677 829; 785; 767 267 VIII


Propiedades Antioxidantes INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

DPPH (2,2-diphenyl-1-picrilhidrazyl) como radical libre. Los compuestos analizados reaccionan

con DPPH e inducen la disminución de la absorbancia medida a 515 nm.

FRAP (Ferric Reducing Power Assay). Los compuesto analizados reaccionan con FRAP e inducen el

aumento de la absorbancia a 593 nm

DPPH. + AH DPPH-H + A.

Propiedades Antioxidantes INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES Todos los compuestos individuales (a 10 mM) mostraron un poder reductor y la capacidad

de estabilizar los radicales libres

FERNANDES, A., FERNANDES, I., CRUZ, L.,MATEUS, N., CABRAL, M., FREITAS, V. 2009 Antioxidant and Biological Properties of Bioactive Phenolic compounds from Quercus suber L.. J. Agric. Food Chem. 57, 11154-11160.

Propiedades Biológicas – Efecto antiproliferativo (ensayo SRB) INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Lineas de céulas cancerígenas (1,5 x 105 cells/mL):

- MCF-7, Células cancerígenas mamarias

- CaCo-2 and HT-29, Células cancerígenas del colon


Parada de la incubación:

TCA 50 % , 1 h at 4ºC

Tinción: SRB (0.4 %, 1 % acetic acid)

Lectura Abs a 490 nm: Triz buffer (10 mM, pH 8.15, 30’)

Células (proteina)

24 h, 37 ºC, 5 % CO2

Concentración de los polifenonles

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

MCF-7

0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0

0

30

60

90

120 di-HHDP-gluc

HHDP-digaloíl-gluc

di-HHDP-galoíl-gluc

trigaloíl-HHDP-gluc

Pentagaloíl-gluc

Castalagina

Mongolicanina B

Concentração (mM)

% C

on

tro

lo (

Ab

s 4

92

nm

)

MCF-7

0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0

0

30

60

90

120 di-HHDP-gluc

HHDP-digaloíl-gluc



Pentagaloíl-gluc

Castalagina

Mongolicanina B

Concentração (mM)

% I

nib

içã

o (

Ab

s 4

92

nm

)

Caco-2

0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0

30

60

90

120

Concentração (mM)

% C

on

tro

lo (

Ab

s 4

92

nm

)

HT-29

0,0 6,3 12,5 25,0 50,0 100,0

30

60

90

120

Concentração (mM)

% C

on

tro

lo (

Ab

s 4

92

nm

)

Todos los compuestos individuales fueron capaces de inhibir la proliferación de las tres líneas de células

cancerígenas estudiadas a las dos concentraciones más altas

Propiedades Biológicas – Efecto Antiproliferativo (ensayo SRB)


MCF-7

0,0 3,3 12,5 25,0 50,0 100,0

0

30

60

90

120 di-HHDP-gluc

HHDP-digaloíl-gluc



Pentagaloíl-gluc

Castalagina

Mongolicanina B

Concentração (mM)

% I

nib

içã

o (

Ab

s 4

92

nm

)

Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

¿Hay una migración de los compuestos del

corcho hacia el vino?

¿En qué cantidad?

¿Estas cantidades influyen en la calidad del

vino?

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo

Disoluciones de vino modelo almacenadas durante 36 meses a 30º C

Diferentes tipos de corcho:

FT- Corcho Natural “flor” con superficie tratada

TT- Corcho Natural “Third” con superficie tratada

La migración de los compuestos fue seguida por

HPLC-DAD/ESI-MS

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo

AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. 2014 Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance.. Eur Food Res Technol 239, 951-960.

Perfil representativo de HPLC de los compuestos fenólicos que migran desde las disoluciones de vino modelo después de 18 meses de almacenamiento.

Después de 9 meses los compuestos presentes en mayor

cantidad eran: ácido gálico, ácido protocatéquico, aldeido

protocatéquico y vainillina.

Entre 18 y 27 meses de almacenamiento, se detectaron

compuestos más complejos como taninos hidrolizables.

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES El contenido de estos compuestos no es suficiente para influir en la calidad sensorial del vino. Sin embargo, pueden tener un papel importante en reacciones redox.


Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de

vino modelo

27 months

Gallic

acid

Protocatec

huic ac

id

Castal

agin/ve

scala

gin

Protocatec

huic Aldeh

yde

Dehyd

rated

tercg

allic-

c-gluco

se

Valoneic

Acid

Ferulic

Acid

Cafeic

Acid

Di-HHDP-G

alloylg

lucose

Vanilin

Mongolicain

Valoneic

Acid-dila

ctone

Ellagic

Acid Hex

ose

Sinapic

Acid

Ellagic

Acid Pen

tose

Ellagic

Acid-deo

xyhex

ose

Ellagic

Acid0.00.10.20.3

2

4

6

8

10

Natural Cork "Flor" w ith surface treatment

Natural Cork "Third" w ith surface treatment

*

Gal

lic A

cid

Equi

vale

nts

(mg/

L)

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Resultados – Migración de los compuesto del corcho en disoluciones de vino modelo

La diferencia en la migración de compuestos a lo largo del tiempo puede reforzar su importancia en el envejcimiento del vino


0 5 10 15 20 25 300

2

4

6

8

10

12

14***

Natural Cork "Third" w ith surf

Natural Cork "Flor" w ith surfa

MonthsTo

tal p

heno

lics

conc

entr

atio

n (m

g/l)

galli

c ac

id e

q.

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGARDECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Propiedades Antioxidantes – disoluciones vino modelo

Todas las disoluciones de vino modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales

libres (DPPH) y poder reductor (FRAP)

Esta capacidad aumentó considerablemente con los niveles de compuestos fenólicos totales.

AZEVEDO, J., FERNANDES, I., LOPES, P.,ROSEIRA, I., CABRAL, M., MATEUS, N., FREITAS, V. Migration of Phenolic Compounds from different cork stoppers to wine model solutions: Antioxidant and Biological relevance. Eur Food Res Technol 239, 2014, 951-960.

DPPH

FT TT0

2

4

6

8

109 months

18 months

27 monthsm

M T

rolo

x Eq

uiva

lent

s

FRAP

FT TT0

2

4

6

8

109 months

18 months

27 months

**

mM

Tro

lox

Equi

vale

nts

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Actividad antiproliferativa utilizando 2 líneas celulares de cancerígenas: MKN-28 and MCF-7


IC50* ± SEM

27 months MKN-28 MCF-7

TT 14.80 ± 0.43 14.44 ± 0.18

FT 14.49 ± 0.70 15.16 ± 0.37

Las disoluciones de vino modelo fueron capaces de inhibir la proliferación de las

dos líneas de células de cancer evaluadas

Stopincuba on:TCA50%,1hat4ºC

Stain:SRB(0.4%,1%ace cacid)

ReadAbsat490nm:Trizbuffer(10mM,pH8.15,30’)

Cells(protein)

24h,37ºC,5%CO2

PolyphenolConcentra ons

IC50, compound concentration (in μM) causing an inhibition by 50 % of cell growth.

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Estudios de Transporte Transepitelial

30’ 60’ 120’

Apical 0’

Caco-2 cell line

HPLC-DAD UV-Vis Spectra

MS MS, MS2 e MS3

Disoluciones de vino modelo

Apical 120’

Apical

Basolateral

12-well polycarbonate transwell, 0,4-µm, 21 days

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIEMENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Estudios de Transporte Transepitelial

El transporte de los compuestos totales a través de células Caco-2 aumentó 20-30%

indempendientemente del tiempo de almacenamiento.

(los tres principales compuestos detectados en la cara basolateral fueron el ácido galico acid, el ácido

protocatéquico y el aldeido protocatéquico. Otros compuestos se encontraron en forma de contenido traza)

No se detectaron diferencias entre los corchos “Flor” y “Third”.


Basolateral

30 60120 30 60

120

0

20

40

60

80

100

120FT

TT

Incubation Time (min)

Tran

spor

t eff

icie

ncy

(%)

Apical

0120 0

120

0

20

40

60

80

100

120FT

TT

Incubation Time (min)

Tran

spor

t eff

icie

ncy

(%)

Wine model solution

Apical

Basolateral

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Conclusiones

La liberación de los compuestos del corcho al vino aumenta con el tiempo

Todas las disoluciones modelo mostraron cierta capacidad para captar radicales

libres (DPPH) y poder reductor (FRAP).

La baja complejidad de la matriz fenólica parece facilitar su absorción y

biaoactividad

Hipótesis: Los tapones de corcho pueden reforzar las propiedades fisico-

químicas y biológicas del vino debido a la migración de los compuestos

fenólicos del corcho hacia el vino durante el período de almacenamiento.

INTRODUCCIÓN


DATOS PRELIMINARES


AGRADECIMIENTOS

RESULTADOS

CONCLUSIONES

Agradecimientos

“ O Vinho é o melhor lugar para se encontrar com os amigos”

Carlos Arruda

5 presentacion joana_azevedo

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