Detección de Chlamydia trachomatis en Mujeres

Embarazadas por la Técnica de Papanicolaou,

Ensayo Inmunoenzimatico y Reacción en

Cadena de la Polimerasa

Ponente: Sergio Cardona Tebar

Octubre 2010

OBJETIVO

Comparar tres diferentes pruebas diagnosticas utilizadas para

la detección de Chlamydia trachomatis a 125 mujeres

embarazadas con o sin síntomas que asistieron a su primera

consulta en el Hospital General Regional Ignacio Zaragoza de

México D. F.

Técnica de Papanicolaou

Ensayo inmunoenzimatico

Reacción en cadena de la polimerasa

CONCEPTOS GENERALES

REINO ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE

Bacteria Chlamidiales Chlamydiaceae

Chlamydophila

C. AbortusC.Psittaci

C. PecorumC. CaviaeC. Felis

ChlamydiaC. TrachomatisC. Muridarum

C. Suis

Clasificación científica de la Chlamydia trachomatis

Palabra del griego khlamýs, khlamýdös que significa "capa" o "encapotado"

Chlamydia:

Nueva clasificación propuesta por Karin Everett, Bush y Anderson en 2002

Chlamydia trachomatiscaracterísticas

• En un microorganismo intracelular obligado que infecta a las

células del epitelio plano, glandular y especialmente el de

reparación o de metaplasia.

• Es una bacteria Gram-negativa, aerobia y no móvil.

• La Chlamydia es reconocida como el patógeno de transmisión

sexual más común en el mundo.

• Tiene propiedades similares a los VIRUS , ya que contienen

DNA Y RNA.

• Se comporta como PARASITO intracelular ya que utiliza las

proteínas celulares para su crecimiento y multiplicación.

Chlamydia trachomatis características

• No pueden sintetizar ATP *, por lo que requieren un hábitat intracelular.

• Inhibición de fusión de los lisosoma

• Se dividen por fisión binaria.

• Son esféricas u ovaladas observándose como cocos.

• Morfológicamente presenta dos estructuras diferentes que son los llamados Cuerpos Elementales (CE) y los Cuerpos Reticulados (CR).

• la Chlamydia se adhiere a la base de los micro vellos de la célula y de allí se interna por un mecanismo de endocitosis.

*Trifosfato de adenosina (ATP), molécula que se encuentra en todos los seres vivos y constituye la fuente principal de energía utilizable por las células para realizar sus actividades.

Ciclo de vida de la Chlamydia trachomatis

La diferencia de la Chlamydia de otras bacterias y de los virus

es que presentan dos estructuras morfológicas diferentes.

Cuerpos Elementales.

Cuerpo Reticulares.

Características Cuerpos elementales Cuerpos reticularesForma Redondos Redondos

Tamaño 300nm a 400nm 800nm a 1000nmFase Extracelular Intracelular

Metabolismo Inactivos ActivosEstructura Resistentes Frágiles

Fase infectiva Si NoFase replicativa No SiSíntesis de ATP No Si

C.Reticular

Cuadro comparativo Cuerpos elementales y Cuerpos reticulares

C.Elemental

Cuatro cuerpos elementales rodeada por el cuerpo reticulado que los produjo De la Universidad de Southampton Escuela de Medicina.

Ciclo de crecimiento de la Chlamydia

cuerpo elemental

Cuerporeticular

célula

núcleo

inclusión

Ciclo de desarrollo de la Chlamydia trachomatis

Complicaciones de la Chlamydia trachomatis en la mujer

por orden de aparición:

1) Infección vaginal: Al inicio del contacto, portadora asintomática.

2) Cervicitis: Inflamación del cuello de la matriz por la infección.

3) Endometritis: Infección de la mucosa de la cavidad de la matriz.

4) Salpingitis: Inflamación de las trompas de Falopio.

5) Enfermedad Inflamatoria Pélvica (Linfogranuloma venéreo):

Infección de la cavidad peritoneal y estructuras anexas

Chlamydia trachomatis

En las mujeres embarazadas, si no es tratada la enfermedad puede provocar partos prematuros.

Cérvix con secreción

Chlamydia trachomatis

La Chlamydia puede provocar en el hombre:

• Epididimitis (esterilidad).

• Linfogranuloma venéreo.

• Uretritis, cuyos síntomas son:

-Dificultad para orinar.-Micción dolorosa.-Sensación de orinar.-Secreción del pene.-Sensibilidad testicular.

Chlamydia trachomatis

En los niños la Chlamydia puede causar:

Conjuntivitis neonatal.Neumonía tempranaConjuntivitis purulentaRinitisVulvitisOtitisRinofangitis

Manifestación clínica y Serotipos

Manifestaciones clínicasEspecie Serotipo Enfermedad

Chlamydia tracomatis

A,B,C Tracoma

D,E,F,G,H,I,J

Conjuntivitis

Uretritis

Cervicitis

Salpingitis

Endometritis

Epididimitis

Neumonía

L1, L2, L3Linfogranuloma

venéreo

TECNICA DE PAPANICOLAOU

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA(PCR)

ENSAYO INMUNOENZIMATICO (EIA)

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (DIF)

Para Shinna y Gupta, la imagen que da mayor sensibilidad diagnostica esal inicio del ciclo celular, en la que se puede observar una finavacuolación del citoplasma en forma de mordidas de polilla o comoinclusiones nebulares, sumado a esto se puede observar una granpresencia de polimorfonucleares

Citología

No se le considera positivo a presencia de Chlamydia

Técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis. Bioquímico estadounidense que imita el fenómeno de replicación del ADN que ocurre de manera natural en las células vivas

La PCR utiliza una enzima llamada

Polimerasa para multiplicar rápidamente

el pequeño fragmento de ADN.

Reacción en cadena de la polimerasa(PCR)

Para llevar a cabo esta técnica los científicos aíslan el

fragmento que va a ser amplificado en un tubo de

ensayo y le aplican calor para separar las dos cadenas

de la molécula

Termociclador

Ciclo de la PCR

Se divide en 3 fases:

1)Desnaturalización

Donde se calienta el ADN para separar las cadenas que lo forman

2)Templado

La temperatura de la mezcla se rebaja para que los cebadores ofragmentos iniciadores del ADN se enlacen con las cadenasseparadas de esta molécula

3) Polimerización

La temperatura de la mezcla se eleva hasta los 75 °C para que la polimerasa copie rápidamente la molécula de ADN

Ciclo de la PCR

Inmunoensayo enzimático (EIA)

• El fundamento de esta técnica consiste en que la Chlamydiatrachomatis cuando está presente en la muestra, se une alanticuerpo monoclonal anti-LPS usado como el reactivodetector presente en la placa comercial, formando uncomplejo que se revela al adicionar el conjugado delanticuerpo anti-inmunoglobulina humana con la peroxidasa yposteriormente el sustrato de enzima.

• Se desarrolla un color amarillo a naranja en proporción a lacantidad de antígeno presente en la muestra, por medio deun detector espectrofotométrico.

Inmunofluorescencia (DIF)

• La inmunofluorescencia (DIF) es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos.

• Sobre un porta se deposita una muestra en la que se busca la presencia de un determinado antígeno.

• Se añade un suero específico del antígeno problema marcado con isotiocinato de fluoresceína (conjugado).

Detención de antígeno por Inmunofluorescencia Directa

Si el antígeno problema se encuentra presente en lamuestra, se une el conjugado. En caso contrario elconjugado se elimina con un lavado del porta.La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia,que emite luz ultravioleta de una determinada longitud deonda.

ESTUDIO

Material y métodos

Material biológico• 2 muestras fueron tomadas a cada

una de las 125 mujeres embarazadas al acudir a su primera revisión medica

• Las muestras fueron tomadas con un hisopo de algodón esterilizado

• Todos las muestras fueron encontradas satisfactorias para su evaluación citopatológica. De las que 105 mostraban síntomas de la infección y 20 no mostraban ningún síntoma

Estudio citológico

El primer hisopo de algodón fue extendido en una laminillafue teñida usando la técnica de Papanicolaou y observada enun microscopio de luz.Se encontró:

Células de metaplasia infectadas conChlamydia que contenían múltiples osencillas inclusiones al interior delcitoplasma. Los cuerpos de inclusióntenían una homogénea distribución deapariencia nebular.

Además se observo una sustancial cantidad de polimorfonucleares

•Células de metaplasia donde se observan múltiples inclusiones nebulares dentro del citoplasma•el contorno de las vacuolas no está claramente definido.•Polimorfonucleares.

•Inclusiones nebulares se observa al interior de la célula de metaplasia.•Nucleos excentricos•el contorno de la célula está bien definido.

Inmunoensayo enzimático (EIA)

• El segundo hisopo de algodónfue puesto en el medio detransporte incluido en el equipode EIA.

• Todas las muestras se probaron para el antígeno según las instrucciones incluidas en el equipo

• La muestra fue considerada positiva si la densidad óptica estuviera más allá del límite calculado usando un control negativo

Detector de inmunoensayo

• 500 micro litros de la mezclapreparada para EIA fueron tomadosy procesados.

• Fueron centrifugadas por 15minutos a 4 C, se des-ionizó y selavaron por 10 minutos.

• Se volvió a centrifugar y seincubaron a 54 C con proteinasapor 10 minutos

Termociclador

Tubos de PCR

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• Las muestras cuyos resultados difirieron fueron testeados (probados) por DIF.

• Las muestras fueron analizadas con un microscopio de fluorescencia.

• El criterio usado para determinar positivo a Chlamydia fue la presencia de 5 o más cuerpos elementales.

Una muestra fue considerada como Verdadera positiva cuando 2 o más de las técnicas de diagnostico comparadas, demostraron la presencia de Chlamydia

Inmunoflourescencia directa (DIF)

RESULTADOS

Detección De Chlamydia trachomatis Grupo

Sintomáticas Asintomáticas(112) (13)

Método Positivos Positivos Total positivosPapanicolaou 2 2 4

EIA 11 1 12PCR 2 1 3

2% 10% 2%

86%

sintomáticas

Papanicolaou EIA PCR NEGATIVAS

15% 8%

8%69%

asintomáticas

Papanicolaou EIA PCR NEGATIVAS

MUESTRA PAPANICOLAOU EIA PCR DIF

24

25

47

50

71

72

74

77

89

99

101

103

104

POSITIVO

NEGATIVO

Muestras Positivas para Chlamydia trachomatisPor los 4 diferentes métodos

Características sociales y demográficas de las pacientes

• La edad promedio de las personas infectadas fue de 24 años

• 2 de las pacientes infectadas eran solteras

• Las pacientes eran sexualmente activas con una edad promedio de 21 años

• 100% de los participantes estaban en el tercer trimestre de su embarazo

• El número de embarazos promedio fue de 3

• El número promedio de parejas sexuales fue de 1

• El nivel socioeconómico promedio fue medio

• Solo una paciente tenia historia de ETS

Análisis Comparativo para la detección de Chlamydia por los 3 diferentes métodos

Método Sensibilidad EspecificidadPositivos

verdaderosPrecisión

Papanicolaou 100 99.18 75 99.2

EIA 100 92.62 25 92

PCR 100 100 100 100

Hallazgos citológicos adicionales

Diagnostico citológicoNegativas 2

Cándida spp 17Coco bacilar 5

Actinomyces spp 1Proceso inflamatorio 96

chlamydia 4Total muestras 125

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Porcentaje de casos

Negativas 1.6%

Candida spp 13.6%

Cocobacilar 4.0%

Actinomyces spp 0.8%

Proc. Inflamatorio 76.8%

Chlamydia 3.2%

RESUMEN

En resumen, a pesar de que la técnica de Papanicolaou no es

considerada fiable para el diagnostico de la Chlamydia ésta

puede ser superior a el Inmunoensayo enzimatico y ofrecer un

diagnostico adecuado en mujeres embarazadas cuando la

muestra es satisfactoria para ser diagnosticada y es realizada

por citotecnólogos muy experimentados y calificados.

Por otra parte, PCR demostró ser la prueba diagnóstica con

mas especificidad y sensibilidad

Varios autores como, Geerling, Kapur y Waters no consideran a la

técnica de Papanicolaou lo suficientemente especifica debido a la

dificultad para diferenciar entre una real inclusión de

Chlamydia, de otros con características morfológicas o estructuras

parecidas, como núcleos degenerados, gránulos de lípidos, detritus

bacteriana.

Por consiguiente han sugerido que la Chlamydia es encontrada solo

en casos donde las inclusiones son de tipo nebular y no en las de

tipo de tiro al blanco, ya que estas representan material celular

amorfo, según Michelle Henry

En este estudio el tipo de inclusiones encontrados en las

muestras positivas fueron del tipo nebular y tales inclusiones

fueron encontradas en un número limitado

Esta observación es respaldada por varios investigadores

como Kellogg y Foster que han reportado que tales

inclusiones son muy frágiles y por lo tanto rara vez son

encontradas intactas

CONCLUSIÓN

La técnica de Papanicolaou y PCR son adecuadas pruebas

diagnosticas para la detección de Chlamydia trachomatis en

mujeres embarazadas. EIA no es una prueba diagnóstica

confiable

BIBLIOGRAFIA

Bush, R.M. and Everett, K.D.E. Molecular Evolution of the Chlamydiaceae.Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 203 -204. 2001

Reacción en cadena de la polimerasa. Microsoft® Student 2009 [DVD]. Microsoft Corporation, 2008.

Barnes. R. Infecciones causadas por Chlamydia trachomatis . Enfermedades de Transmisión Sexual. Philadelphia , USA. Cap 6. 1999.

Murray P. Drew W. Kobayashi G. Thompson J. Microbiología médico 1ª edición Española 1992. p. 354-378.

Masson-salvat Diccionario medico.3ª edición. Barcelona: Salvat editores, S.A. 1971: p.45.

Bañuelos C. Deleon I. Hernandez J. Martinez L. Akle D. Miranda J. Reyes E. Detection of Chlamydia trachomatis in women by the Papanicolaou technique, enzime immunoassay and polimerase chain reaccion. Acta Cytologica.2000. 44(2). 114-123

Henry M. Jensen K.Skoglund C. Armstrong D. Clamydia trachomatis in routine cervical smears. A microscopic and ultrastructural analysis. Acta Cytologica. 1993. 37: 343-352

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