DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN ''V

VITRODEVitis vinifera VAR. CABERNET SAUVIGNON

MARIA EMILIA ROA BASTIDAS

ANDRES DAVID TORRES HERNANDEZ

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U'D'C'A

FACULTAD DE INGENIER REROT'UICA

20'12

UDCAgloRE ^^r.lFECHA: ,'1 N0\ Tttt lAOo&

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DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN ''V

VITRODE

Vitis viniferaYAR. CABERNET SAUVIGNON

MARIA EMILIA ROA BASTIDAS

ANDRES DAVID TORRES HERNNDEZ

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar con el titulode lngeniero Agrnomo

Director

RODOLFO ALBERTO MEJA CRUZ

lngeniero Agrnomo; M. Sc

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES

FACULTAD DE INGENIERi CNOHIIICI

BOGOT

2012

El autor concede a la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientalespermiso para reproducir este trabaio para fines educativos.

12"./l 14

7/^Jrcf .l''^u"/ '/D"u'

Andres Torres

Univercidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U'D'C'A

Ingenieria Agronmica

Emilia Roa

2012

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN 'A'

VITRO DE

Vitis vinifera YAR. CABERNET SAUVIGNON

Por

Emilia Roa

Andres Torres

NOTA DE ACEPTACION:

A

ilr,rJ-.S* J-.-

-

Jurado

DEDICATORIA

Este trabajo de grado est enteramente dedicado a Dios, a ti que me diste laoportunidad y, sin soltarme de la mano me guiaste y me llevaste a la gloria... Estar

hoy escribiendo mi paso final de mi carrera como pregrado'

Amispadresporseresehombro,esamano,esafe|icidaddaada'porestarenlas buenas como en las malas, mi carrera profesional va dedicada con demasado

amor para ustedes, Francisco J. Roa y Amanda del Rocio Bastidas A mishermanas; camila, Valentina e lsabela, les dedico el apoyarme siempre, y estar de

acuerdo en la toma de mis decisiones. A mi familia, abuelas' to(a) s' primo(a) s' a

todos les dedico mis logros.

Amismejoresamigosquienesnodejarondecreerenm|esdedicomitrabajodegrado;RicardoGi|,Ne|sonGa|eano,A|ejandraCeba||os'Natha|iaRamrez,Nata|iaSoto.

Y con todo mi amor y cario mi trabajo de grado va dedicada en memoria de mi

hermano, amigo, primo Fabio Santiago Roa Rocha' quien siempre confi' crey' y

me nimo, me fortaleci de llegar a estar donde' a la fecha estoy'

Emilia Roa

Dedico este trabajo cle grado a Dios que en los momentos de crisis me cargo en

susbrazosyforta|ecien|osmomentosdedudaeincertidumbreymebendicehoy para dar el ltimo paso en mi carrera de pregrado y el primero

en mi vida

orofesional.

A mis padres y hermanos que compartieron mis logros, reveces y soportaron ms

ideas cada vez que mi habitacin y casa se transformaba en un laboratorio, austedes, Hugo Torres, Mara lns Hernndez, Hugo Leonardo y Diego, a misobrina Mara Camila y su madre sandra M. Cabezas, a todos ustedes les dedico

con amor toda mi carrera profesional y cada uno de los logros que faltan por venir.

Recuerden que el vino mejora con los aos y solo hasta hoy estamos en vendimia,falta mucho para mejorar pero poco para estar entre los ganadores'

Andrs D. Torres

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo de grado es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,participaron varias personas, opinando, estando en los momentos de alegra como

en los momentos de tristeza, apoyndonos incondicionalmente y dndonos nimo

cuando se pensaba negativamente.

Debo agradecer de manera especial y sincera al profesor Rodolfo Meja Ingenieroagrnomo de la universidad De Ciencias Aplicadas y Ambientales, por habernos

permitido finalizar nuestra tesis de grado, y en general a todos los profesores por

la colaboracin durante todo el proceso formativo y acadmico en el crecimiento

dentro de la carrera.

A todos ms amgos y compaeros que me apoyaron y permitieron en estos cinco

aos una convivencia dentro y fuera del aula, tengo palabras solo deagradecimiento; Catalina Medina, Geovanna Guerrero, Jenny Guerrero' Luis

Miguel Gutienez, Natalia Gom2, Julian Barn, Gustavo Melgarejo"' Gracias'

Paraaquel|osquehancompartidoconmigo|os.,iresyvenires''ene|p|anopersonal, de quienes siempre he recibido palabras de aliento " Gracias

Finalmente, debo agradecer a mi Universidad De Ciencias Aplicadas yAmbientalesU.D.c.Aporhaberparticipadoyhabermepermitidoesca|arenlavidaprofesional, Gracias'

Emilia Roa

Agradezco a nuestros directores de tesis quienes siempre nos apoyaron en este

mar de ideas y fortalecieron nuestro trabajo cada vez que se presentaba algunadificultad.

A todos mis compaeros y amigos que participaron, apoyaron y daban una voz de

aliento cuando ms se necesit, a ustedes, catalina Medina, Geovanna Guerrero,Jenny Guerrero, Luis Miguel Gutierrez, carolina sanchez, oscar Delgado...

Gracias por compartir estos cinco aos de carrera por encontrar en ustedes una

voz de aliento y por ser partcipes de los bueno y malos momentos dentro de

nuestras aulas de clase y fuera de ellas.

Y definitivamente agradezco a mi universidad De Ciencias Aplicadas yAmbienta|esu.D.c.A.porserparticipedemis|ogros,porpermitirmeVo|arenm|ssueos plasmndolos en este documento y haberme visto crecerprofesionalmente, Gracias,

Andrs D. Tones

LJn tnvento no es nunca un proceso puramente mental. Al contraio, resulta de la

lucha entre la idea y el mundo mateial. Entre Ia idea y el invento ya hecho,

siempre se encuentra el trabaio y el sufimiento de! inventor. El "nacimiento" de la

ldeaeseltiempoplacenterodeltrabajomenta!creativo,duranteelcualtodopareceposible,porquenotienenadaquevercontarealidad'La"ejecucin,'esel

tiempodereunrtodos/osmedlosnecesariosparalarealizacindelaidea,estodavia un perodo creativo, durante el cual se vencen los obstculos naturales y

e! inventor adquiere talla, aun si puede sucumbir. La "introduccin" del invento, es

el tiempo de Ia tucha contra la ignorancia y Ia envidia, la pereza y la mala fe' Ia

resistenctayagresinabieadeinteresesdeotrasc/ases'unverdaderomartiria'incluso cuando se tiene xito

(Rudolf Diesel, 191 3)

RESUMEN

En Colombia, la vitivinicultura ha tenido un crecimiento significativo en los ltimos

aos, centrado especialmente en el departamento de Boyac, dando unaalternatva diferente de crecimiento a los agricultores de la zona. sin embargo,

sta planta para produccin de vino al tener una adecuacin diferente al tropical'tiene muchos condicionantes que dificultan la produccin, entre ellos laimportacin de materiales para su propagacin. Por esta razn la herramientabiotecnolgica del cultivo in vitro, se convierte en una alternativa que podra

solventar el anterior problema. El presente trabajo se bas en el desarrollo de unprotocolo para la introduccin in vitro de vitis vinifera var. cabernet sauvignon,

mediantelaidentificacindelmejorpropguloenestecasoe|tipodeyema(algodn/invierno) y el agente desinfectante, hipoclorito de sodio NaCIO (en dosconcentraciones:1,5%y5o/o;ydostiemposdeinmersin:10miny20min)'Paralasistematizacin de la informacin se utilizaron los programas winstats versin

'l'11

y statgraphics centurion XV versin 15.2.14. Los resultados indican que el tipo de

propgulo que mejor respuesta dio fueron las yemas tipo algodn' cuandointeractanconhipoc|ortodesodioal5%entiemposdeinmersindel0minutos.

INDICE

f NTRODUCCTN.................... "'.."."212. JUSTIFICACIN.............. .....'....233. oBJETIVOS... "......."..'.'.."""""244. REVISIN DE L|rERATURA..........'...'.. """""25

4.1. lmportancia agronmica en el mundo .. "" ' """""""" "254.2. lmportancia agronmica en Colombia ' " " ' " " "" "" "264.3. Sistemticadel gneroVitis........."" "' " """"""" " "28

4.4. Biologa de la vid """""""254.4.1 . Ciclo Vital " """"""" 294.4.2. Ciclo bianual... " "" ""30

4.5. Fisiologia de la vid " "' " '304.6. lmportancia, formacin y diferenciacin de las yemas" " "" ' "' """"""'32

4.6.1. Fase de paralatencia . "" ' """" '324.6.2. Fasedeendolatencia"' ""' ' """"'334.6.3. Fase de ecolatenca '' ' ' "' ' 334.6.4. Clasificacin de lasyemasdevid: evolucin " " " " " " " ' ' " ' " "344.6.5. Ciclo evolutivo de las yemas de Vid: Dinmica " " "" " "" " "" "'34

4.7. Tiposdeyemasdevid """""" '"' ""3737

4.7 .1. Yema Pronta...4.7.2. Yema hibernar, latente o mixta """' " """""" "384.7.g. Yema latente.. ' "" "" 38

.394.8. Variedades ....4.8.1. Gabernet Sauvignon Vitis vinifera ' """" ' """' " " "40

4.9.

4.10.

........40

4.10.1. Phytium -...'............. 424.10.2. Rhizoctonia ....-..... .. '424.10.3. A1ternaria................. ...'. . ...'."" " " 43

4.11. Cultivo in vitro, propagacin de la vid . ...."'... . "" "" " "43

4.12. Variedades, material vegetal y tipo de regeneracin.'.......... '."" """"" '44

4.13. Reguladores del crecimiento vegeta1...........' """"""""""45Auxinas ... '""" "45Citoouininas """" "'46Giberelinas..... "" " '46AcidoAbscsico (ABA) ' "" " "" " '46Eti1eno............ "" " 47

Mtodos Quimicos para el control de dormancia in vitro"""""""" "47Metodologas en cultivo de tejidos vegetales '' " "" "" "" """" " "48

Organognesis directa... ........ " " "49

Organognesisindirecta " " "" " "49Embriognesis somtica......... """"49rganos de perennidad formados en cultivos aspticos """"""""49Cultivo de embriones """""' " " "'49

Etapas de la propagacin in vitro.'.""""' """' " """'50Obtencin y establecimiento del explante in vitro """" "" " ' " "50

Desinfeccin de los inculos " ' " "50Seleccin del medio de cultivo """' " " """""" " 51

lncubacin en condiciones adecuadas "" " "" " "53Enraizamiento. """ '54

Factores limitantes al cultivo in vitro"""""" """""" '54Fenolizacin.'. A6

5.2. Materiales ..."''"" "575.2.1. Material Vegetal """"'57

5.3. Materiales para siembra ... " "" "" " " 575.3.1. Preparacin de explantes para la introduccin .."""" " " """" " """57

5.4. Tratamientos evaluados para la introduccin yemas in vitro """"""" " "58

5.4|l . Evaluaciones preliminares "'""""585.4.2. Tratamientos propuestos..'... """ " " '595.4.3. Variables evaluadas en los protocolos de desinfeccin (Bioensayo l-ll)

''" "" 61

5.4.4. Evaluacinestadistica...... """'"" 625.4.5. Toma de datos... '..'...... """ """""""62

5.5. Preparacin de medios de Cultivo"" " "" " " " "" " """'63

6. RESULTADOSYDISCUSIN """"""""""""'646.1. Evaluacin de sobrevivencia fase 1 "" " "646.1.1. Efecto de la concentracin del hipoclorito de sodio"""' " " "" "" " 64

6.2. Evaluacin de la concentracin de NaCl' tiempo de NaCl' tipo de yema y

aplicacin de antioxidantes versus el porcentaje de brotacin "' "" "" """"""'73

6.3. Eliminacin de explantes a travs del tiempo " " ' """" "'75

6.4.Eva|uacinde|porcentajedemorta|idaddeexp|antesporcontaminacinfngica y bacteriana versus tiempo y concentracin de NaCl " """' "" "" ""'76

6.5. Evaluacin con dos variables de la concentracin de NaCl' tiempo de

NaCl, tipo de yema y aplicacin de antioxidantes versus el porcentaje de

sobrevivencia. """" ' """""" "'79

5.1.

6.6. Evaluacin con dos variables de la concentracin de NaCl, tiempo deNaCl, tipo de yema y aplicacin de antioxidantes versus el porcentaje debrotacin......... '.'...'....'.'..." " 846.7. Evaluacin de sobrevivencia fase 2.......... .. . .. " " " '876.8. Protocolo para la introduccin in vitro de Vitis vinifera var. cabernetSauvignon....... ...." """" 93

7. CONCLUSIONES ........,......... .'..'.'...'."""""""'e4

8. RECOMENDACIONES......... .....'."."""""""""95

8I8L|OGRAF|A.................... e6

ANEXOS

Anexo 1. Composicin del medio de cultivo de Murashige & skoog 1962.......101

Anexo 2. Base de datos primera fase".............. """""""""""102Anexo 2. Base de datos primera fase ....'....'....' "" """"" "" "103

Anexo 2. Base de datos primera fase..'.... .....'.. "" " "" "" " '104

Anexo 2. Base de datos primera fase. '.... ....... " ' " "" " 105

Anexo 2. Base de datos primera fase....'.'.'..'.." "' " " """"""106Anexo3.Basededatossegundafase........" " ' "" " " "" "107

Anexo 4. Grfica prueba Z para dos proporciones con diferencia significativa 107

Anexo 5. Grfica prueba Z para dos proporciones sin diferencia significativa..l0S

Anexo 6. Comparacin de Proporciones - Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada" "'"" " "" "108

Anexo 7. Reporte ANOM.....'...'.. "" "" " "" " 109AnexoS.Proporcionesobservadasparacadaunade|as4muestras...'..'..'..'109Anexo 9. Comparacin de Proporciones - Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada""'

'"""""'110Anexo 10. Comparacin de Proporciones - Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada '

110

o""," ,,, .",;",;.;;;;;,;;". - ;",:";,;;;,"";" ;;;;";;r"" " ' """"111

Anexo 12. Comparacin de Proporciones - Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada"'1

o""-",,.,"o.;;,";;':...'

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn Eichhorn-Lorenz Fuente: (Coombe, 1995)

Tabla 2. Medios de cultivo y condiciones experimentales utilizadaspara la iniciacin y multiplicacin "in vitro" de las diferentesvariedades fuente: (Toms, 1995)

Tabla 3. Protocolo de desinfeccin; se observa cada una de lasetapas llevadas a cabo para cada producto'

51

INDICE DE FGURAS

FIGURA 1. Fisiologa de los rganos de la vid, fuente: (Raynier' 2001):(Raynier,2001)

FIGURA 2. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn BBCH'

Fuente: (Meier, 2001)

FIGURA 3. Ciclo evolutivo: dinnrica de las yenras' fuerrte (Raynter,

2001)

FIGURA 4. Tipos de yemas de vid, Fuente: (Lanzarini, et al,2O09) 37

FIGURA 5. Material vegetal yema con segmento de tallo, recin Sgsembrado in vlfro

FIGURA 6. a. Primera fase. b. Segunda fase para el desarrollo de un

protocolo para la introduccin in vitro de Vftis vinifera var ' C 'Sauvtgnon

FIGURA 7. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes vs elporcentaje de la concentracin del desinfectante para la introduccinin vitro C. Sauvignon

FIGURA 8, Porcentaje de los agentes que promovieron la eliminacin

de los explantes vs el porcentaje de la concentracin del desinfectanteoara la introduccin ln vlfro C' Sauvignon

31

35

36

ol

64

oo

FIGURA 9. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes vs tiempo deinmersin en el desinfectante para la introduccin in vitro de C.Sauvignon 68

FIGURA 10. Porcentaje de los agentes que promovieron laeliminacin de los explantes vs tiempo de inmersin en eldesinfectante para la introduccin in vtro de C. Sauvignon

FIGURA 11. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes vs el tipode yema para la introduccin in vitro de Vlfls vinifera var' C' Sauvignon

FIGURA 12. Vista inferior formacin de raz y callo, explante de yema

tipo algodn, concentracin al 5o/o, y tiempode 10 minutos

FIGURA 13. Porcentaje sobrevivencia de los explantes vs laaplicacin del antioxidante para la introduccin in vitro de C'Sauvignon

FIGURA 14. Porcentaje de los agentes que promovieron laeliminacin de los explantes vs la aplicacin de antioxidante para la

introduccin in vitro de C. Sauvignon

F|GURAl5.Porcentajedebrotacinvseltipodeyemapara|aintroduccin in vitro de Vits vinifera var' C' Sauvignon

69

70

7'l

72

73

74

FIGURA 16' Porcentaje de plantas vivasantioxidante a los explantes para introduccin

var. C. Sauvignon

vs la aplicacin delin vitro de Vitis vinifera

76

FIGURA 17. Nmero de explantes eliminados vs el nmero delecturas reafizadas cada tercer da para la introduccin in vitro de Vitis

vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 18. explantes contaminados por los patgenos (Alternaria,Pythium, Rhizoctonia)

FIGURA 19. Porcentaje de mortalidad de explantes porcontaminacin bacteriana o fngica vs el tiempo de inmersin y laconcentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de vitis

vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 20. Porcentaje de sobrevivencia vs la concentracin deldesinfectante y el tiempo de inmersin de los explantes para laintroduccin in vitro de C. Sauvignon

FIGURA 21. Explante de yema tipo algodn, concentracin al 1'5o/o'en Droceso de crecimiento y enraizamiento

FIGURA 22. Porcentaje de sobrevivencia vs el tpo de yema yconcentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de

Sauvignon

FIGURA 23. Porcentae de sobrevivencia vs la aplicacin delantioxidante y la concentracin del desinfectante para la introduccin

in vitro de C. Sauvignon

76

77

la

7B

7g

B1

83

FfGURA 24. Explante de yema tipo algodn, concentracin al 1,5o/o,en Droceso de crecimiento

FIGURA 25. Porcentaie de Brotacin vs el tipo de yema y laconcentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de Vitisvinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 26. Porcentaje de Brotacin vs la aplicacin del antioxidantey la concentracin del desinfectante para la introduccin rn vitro deVitis vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 27. Explantes de yema tipo algodn var' CabernetSauvignon, broto, creci y enraiz la yema

FIGURA 28. Porcentaje de explantes que brotaron, crecieron yenraizaronvseltipodeyemay|aconcentracinde|desinfectantepara la introducci6n in vitro de C. Sauvignon

FIGURA 29. Porcentaje de explantes oxidados vs el tipo de yema y laconcentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de C'Sauvignon

FIGURA 30. Nmero de explantes que se contaminaron vs la

concentracin del desinfectante y el tipo de yema para la introduccin

in vitro de Vitis vinifera var' C' Sauvignon

85

86

89

on

91

Y

RESUMEN

En Colombia, la vitivinicultura ha tenido un crecimento significativo en los ltimos

aos, centrado especialmente en el departamento de Boyac, dando unaalternativa diferente de crecimiento a los agricultores de la zona. sn embargo,

sta planta para produccin de vno al tener una adecuacin dferente al tropical,

tiene muchos condicionantes que dfcultan la produccin, entre ellos laimportacin de materiales para su propagacin. Por esta 'azn la herramientabiotecnolgica del cultivo in vitro, se convlerte en una alternativa que podrasolventar el anteror problema. El presente trabajo se bas en el desarrollo de unprotocolo pafa la introduccin ,n vitro de vitis vinifera var. cabernet sauvignon,medante la identificacin del mejor propgulo en este caso el tipo de yema(algodn/invierno) y el agente desnfectante, hpoclorito de sodo NaCIO (en dosconcentraciones: 1,5% y soa; y dos tiempos de inmersin: 1omin y 20min). Para lasistematizacin de la informacin se utilizaron los programas winstats versin 1.11

y Statgraphics centurion XV versin 15.2.14. Los resultados indican que el tipo de

propgulo que mejor respuesta dio fueron las yemas tipo algodn' cuandointeractan con hipoclorito de sodio al 5% en tiempos de inmersin de 10 minutos.

I. ]NTRODUCCION

La uva ( Vlfls vinifera L.) es un frutal de clima templado, que necesita un nmero dehoras con temperaturas por debajo de cierto nivel crtico pafa romper el perodo deletargo o de reposo de sus yemas, un perodo en el que su actividad vegetativa y

metablica se detiene casi totalmente, como un mecanismo de adaptacin para

proteccin contra fros extremos que pueden daar los tejidos (Raynier, 2001)'

A lo largo de cada ciclo anual, la vid asegura un ciclo vegetativo, en el cual ocurre

el crecimiento y desarrollo de los rganos vegetativos (pmpanos, hojas, zarcillosy races); su perennidad mediante el almacenamiento de resefvas (agostamiento)y la adquisicin de endolatencia de las yemas. Y un ciclo reproductivo en el cual

se da el crecimiento y desarrollo de los rganos reproductores (inflorescencias,flores y bayas) y su maduracin (Raynier, 2001)

Es conocido que las diferentes variedades de vid se enfrentan a numerososproblemas cuando se cultivan en condiciones naturales. son problemas derivados

cte su mayof o menor resistencia a las temperaturas extremas, a enfermedades

provocadas por microorganismos (bacfenas, hongos o vrus), a la depredacin por

Darte de insectos, entre otros (Toms' 1995).

Lauvatradicionalmentesepropagademaneravegetativamedianteacodos'yasea areos o terrestres, e injertos. sin embargo, la herramienta biotecnolgica del

cultivo rn vtro, se basa en el concepto de la totipotencialidad celular, donde cada

clula tiene el potencial de producir una planta completa (Margara' 1988)'

El medio de cultivo, es la combinacin slida o liquida de nutrientes y agua'

Usua|menteinc|uyesalesinorgnicas,carbohidratos,vitaminasyaminocidos.Amenudosedenom|namediobasa|ypuedesersup|ementadocona|gnregu|adorde crecimiento, y ocasionalmente con otras sustancias con actividad hormonal'

La

tcnica de multiplicacin vegetativa in vitro, a partir de yemas axilares y apicales'

21

se refiere a la rpida estimulacn del desanollo de brotes apicales (meristemos)(Toms, 1995).

La expresin cultivo ln vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de unfrasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene

dos caractersticas fundamentales: la asepsia (ausencia de grmenes, entreotros), y el control de los factores que afectan el crecimiento (Toms, 1995).

Aunque se han desarrollado varios trabajos de investigacin relacionados con elcultivo de tejidos en Vitis vinifera Var. Cabernet Sauvignon en otras regiones delmundo; se ha encontrado en ensayos preliminares que estos protocolos no son

aplicables en el trpico, ya que, la vid es un frutal de clima templado que requiere

horas frio, pasando precisamente por estaciones que en pases como colombia no

se presentan; por lo cual los propgulos no tienen el vigor y calidad que requieren

en el momento de llevar a cabo una introduccin del material vegetal bajocondiciones de cultivo in vitro.

Segn investigaciones realizadas.en Jurez (Mxico) se consider al observar elcomportamiento de tratamientos con yemas axilares y pices, que el de las yemas

axilares era el explante para usarse en la etapa de la muliiplicacin de brotes, se

tuvieron los mejores resultados para propagaci'n in vitro de vid variedad GloboRojo, porque |as yemas axi|ares se encuentran en principio de formacin, mentrasque las yemas apicales (yema con la primera hoja) ya se han formado y sudesarrolfo es ms lento in vitro (Osuna & Saucedo, 2010)'

El presente trabajo tiene como finalidad establecer un protocolo para laintroduccin in vitro de Vitis vinifera var. Cabernet Sauvignon, que servira de base

para poder iniciar una produccin a mayor escala'

22

2. JUSTIFICACION

Gracias al crecimiento que ha tenido la vitivinicultura en Colombia, es necesaro

desarrollar estrategias que contribuyan al desarrollo del cultivo, entre ellas lasrelacionadas con la propagacin. La vid es un cultivo que tradicionalmente sepropaga de manera vegetativa medante acodos areos o terrestres, e injertos,sin embargo esto implica tener material base (plantas madre) que permitan eldesanollo de estas tcnicas; en Colombia no estn dadas las condicones para el

mantenimiento de estas plantas madre, por lo que la mayoria de los cultivadores

recurren a la importacin del material, aunque el lcA realiza todo su pro@socuarentenario para el ingreso de plantas, mucho de este material vegetal sesiembra contaminado, por esta razn se incrementa considerablemente los costos

de produccin por la prdida del material vegetal importado. Es en este punto' en

donde la herramienta biotecnolgica del cultivo in vitro, se converte en unaalternativaquepodraSuperaresta|imitante,pesea|osproblemasdeoxidacinyfeno|izacinquegenerae|explanteene|medodecu|tivo.A|encontrarmetodo|ogas que se adapten a nuestras condciones, Se Superara |a importacindel material vegetal, dando como valor agregado, la eliminacin de plagas y

enfermedades que en ocasiones estn ligados con el material importado

En colombia desde el inicio del proyecto vitivincola en el viedo Marqus de

Punta|argaene|aolgS2yMarquesdeVil|adeLeyvaene|ao1985'|asvariedades que se nan estabilizado para el departamento de Boyac son;Cabernetsauvignon,sauvignonblanc,Riesling,RieslingxSilvanneryPinnotnour'Lauvaquemsseconsumeenvinoanive|mundiales|aCabernetsauvignon.

z

3. OBJETIVOS

General

o Desarrollar un protocolo para la introduccin y mantenimienlo in vitro deVitis vinifera var. Cabernet Sauvignon.

Especficos

o ldentificar el mejor tipo de yema, para la introduccin ln vitro de v. viniferavar. Cabernet Sauvignon

. Determinar las condiciones ptimas de limpieza para la introduccin in vitro

de Vlfis vinifera var. Cabernet Sauvignon

24

4. REVISION DE LITERATURA

Como planta perenne, la vid tiene una vida de treinta a cuarenta aos y no entraen produccin hasta el tercero o cuarto ao despus de la plantacin. Su vida es

una sucesin de ciclos anuales interdependientes, pues las condiciones devegetacin a lo largo de un ciclo debidas al medio y al hombre, tienen influencias

en los ciclos vegetativos siguientes (Fregoni,2005).

4.'1. lmportancia agronmica en el mundo

En la antigua Mesopotamia 4.000 aos a.C., hoy en da Egipto y Siria, se encontr

una orueba del cultivo Vitis vinifera; a partir de esto se comienza a expandir elrubro en toda Europa. Los griegos fueron los que introdujeron las vias yprodujeron vino en sus colonias, y ms tarde los romanos practicaron la viticulturaen todo su imperio, lo cual tuvo una gran importancia para estas civilizaciones. Los

que introdujeron el vino en Francia fueron los colonizadores griegos del Massalia(Marsella). Durante el periodo del imperio romano, Galia (Francia) pas a ser unafuente tan abundante de vino que se crearon leyes para proteger la produccin de

Italia. Debido a la cada del imperio romano la produccin de vino se redujoconsiderablemente pasando a ser una actividad exclusivamente monstica dado

que el vno fue siempre importante en los sacramentos cristianos. Pero en los

siglos Xll y XVI la produccin de vinos se generaliz nuevamente y fue la principal

fuente de explotacin en Francia. Durante el siglo XVll se desarroll la botella que

contendria el vino y la utilizacin del corcho, esto hace posible el almacenamiento

de|mismo.Losquehoyson|osmejoresviedosdeBurdeoscomenzaronaserexpandidos por sus aristocrticos propietarios a fines del siglo XVII y principios del

XV|||;mientrasque|osbritnicosdesarro||aron|osviedosde|va||ede|Duero(Portuga|).Enestesiglotambincomenz|amodernacomerca|izacnde|vinoespaol (Lpez, 2009).

25

No solo la produccin de vino se daba en Europa sino tambin fuera de esta como

en Chile que comienza a partir del siglo XVl, en EE.UU. a partir del siglo XVlll'como tambin en Australia a partir del siglo XlX. En 1863 la viticultura europea es

en casi toda su totalidad devastada por la filoxera acabando las vias por losproblemas de las races. El control de esta plaga se encontr en Amrica en el

ao de 1880, al realizar injertos sobre patrones nativos americanos los cuales eranresistentes a la filoxera. En la primera mitad del siglo XX, la viticultura y laproduccin de vino se vio afectada debido a los conflictos blicos sufriendoadulteracin, sobreproduccin y fraude. Mientras que en la segunda mitad delsiglo XX fue notable por los avances tcnicos, as como en el rea de lavitivinicultura como por la incesante globalizacin de la produccin del vino (Lpez'2009).

4,2. lmportancia agronmica en Colombia

En Colombia, como aconteci en todas las regiones colonizadas por Espaa'

existen vestigios de la introduccin de la vid desde principios del siglo XVI en

asentamientos y encomiendas, que no pasaron de ser intentos de la pocacolonial y del perodo siguiente; Henao (2004), menciona que existen testmonosqueen|apob|acindeTane||a(Urabantioqueo)secu|tiv|avid,yquefueoosiblemente la sede de santa Mara la Antigua del Darin. se cree igualmente

queene|va||einterandinodeSogamosocrecieron|asvides,tantoquedejaronsus hue||as en grabados |ticos de |a poca, mostrando una mirla ( Iurdus sp.)ocoteando un racmo de uvas. Al desplomarse una parte del mortero que cubra la

cpula de la lglesia de Firavitoba, Boyac; que cuenta con 400 aos' dej aldescubierto el entramado que lo sostena, y que haba sido elaborado consarmientosdevid.Loanterior,pareceindicarquequiensintrodujeron|aSprimerasvidesaestareginfueronlosjesuitas,puesenlahaciendadestos'unode los primeros centros de operacin de la Compaa de Jess' sobreviven

algunas vides de lo que parece ser la cepa silvestre americana que denomnaron

26

missin. Quijano (2006), menciona que las cepas de esta variedad se encuentranan productivas.

El cultivo comercialmente se inici a comienzos del siglo XX, en los valles de la

margen occidental del ro cauca, en el norte del Departamento del Valle delCauca, con la plantacin de efensiones pequeas que, ms tarde, se ampliaron a

otras zonas. De esta manera, en el ao 1932 haba viedos en Antioquia,Santander, Tolima y Santa Marta. Pero solo hasta 1945, se impulsverdaderamente la viticultura, cuando Alberto Grajales plant 180 vides en elmunicipio de la unin. Las primeras plantas fueron obsequiadas gracias a unproyecto vitcola del gobierno espaol que dirigi seferino Gonzlez en elMunicipio de Bolvar, Valle del Cauca

El cultivo de la vid, para elaboracin de vino, en el altiplano colombiano, en

altitudes entre 2.200 y 2.650 msnm, se inici en 1982, en la Loma de Puntalarga,

en el Valle del sol, departamento de Boyac. Los cultivos de uva en la localidad

de Villa de Leyva se iniciaron con algunas variedades alemanas, entre las que se

encontraban Riesling, Sylvaner, Pinot Negro y Kerner (Henao, 2004)' Entre losmunicipios de sutamarchn y Villa de Leyva, a2.215 msnm, se encuentra ubicado

el viedo "Marqus de Villa de Leyva" que tiene plantadas las variedadesCabernet Sauvignon y Sauvignon Blanc importadas de Francia y Chardonnaytradas de Napa Valley, California, USA (Marqus de Villa de Leyva' 2010)'

Actualmente, en Colombia se cultivan uvas para consumo en fresco en 16

municipios del departamento del Valle del cauca (mayor productor), distribuido a

|olargodelrocauca(4olatitudnorte).otrosproductoresdeuvademesa,son|oSdepartamentos de Tolima, Huila y Santanderes' Mientras que en 16 municipios de

las provincias de Sugamuxi, Valderrama, Tundama' Norte y Rcaurte alto en el

departamento de Boyac (5o latitud norte,72" longitud oeste)' se cultivan vides

con destino a la elaboracin de vinos (Almanza, 201 1)'

27

En Colombia las prdidas ocasionadas por las enfermedades causadas porhongos y virus son muy limitantes en el cultivo de la vid, porque disminuyen hasta

un 80% de cada cosecha. Reducen la calidad, el vigor y longevidad de los viedos

incrementan los costos de produccin. En el pas hay enfermedades causadas por

hongos son prevalentes debido a las condiciones climticas favorables para el

desarrollo de las mismas. Las principales son: el mildiu, el oidium, la botrytis y la

roya. Tambin se presentan las enfermedades ocasionadas por virus, que causan

deformaciones y redueen apreciablemente el vigor y la longevidad de los viedos.

Las variedades que son ampliamente cultivadas en Colombia son muysusceptibles a las enfermedades causadas por hongos y virus. (Ministerio deagricultura y desarrollo rural, 2008t

En Bolivia para reducir enfermedades y plagas decidieron injertar variedadesproductorasenpatronesresistentes,propaganpormediode|cu|tivodetejidos'yaqueseuti|izanpequeosrganosdetejidosdeplantasencrecimientoactivoquese los cultiva bajo condiciones aspticas y controladas a las que se les davariadas aplicacones, una de ellas el microinjerto in vitro. utilizan el medo de

cultivo Murashige & Skoog, desinfectan con alcoho| e hipoc|orito de sodio al 2%(Rodrguez, 2006).

4.3. Sistemtica del gnero Vitis

LaVitispertenecealordendelasRhamna/es,familiaAmpetidaceaequesedivideen dos subfamllias: Lecoideae y Ampelideae'

La subfamilia de la Ampelidee los principales gneros son Ampelopsls' Clssus'

Pathenocissus,Arnpelocissusydentrode|oscua|esestelgneroobjetodeestudio|aVifis.Losprmeroscuatrognerosseuti|izanparafinesornamenta|es.Dada la magnitud y la mportancia econmica del gnero Vifls se tendrn en

cuenta slo las espectes que pertenecen a ella (Fregoni' 2005)'

28

El gnero Vlfls comprende alrededor de 40 especies asiticas, y cerca de 30especies americanas, pertenecientes a dos subgneos Muscadinia (cuenta conun patrimonio cromosmico de 2n=40) y comprende las especies ( Vftisrotundifolia, Vitis vinifera, Vis munsoniana, Vitis popenoei); y Vt|is (cuenta con unpatrimonio cromosmico de 2n=38) (Fregoni, 2005).

4.3.1. Clasificacin taxonmica de Vitis vinifera

Segn Fregoni (2005), la calsificacin taxonmica de Vitis vinifera es:

Reino: Plantae

Divisin: MagnolioPhYta

Clase: MagnolioPsida

Orden: Rhamnales

Familia: AmPelidacea

Genero: Vitis

Esoecie: Vitis vinifera

4.4. Biologa de la vid

Enlasp|antasdeVidcu|tivadasyobtenidaspormultip|icacnVegetatva'seconsideraquesedesarro|lantrescic|osenfuncinde|periododevida:uncc|ovital, un ciclo bianual y un ciclo anual (produccin) (Pinto' et al' 2003)'

4.4.1. Ciclo Vital

Coincidentecon|aduracinde|avidade|ap|anta,ycomprendecuatrofasesdeduracinvariab|edependiendode|ascondicioneSambientalesyculturaIeS.

ZY

. fase improductiva: desde el ao de plantacin al segundo o tercerao

. fase de oroduccin creciente: desde el tercer o cuarto ao al sexto

. fase de produccin constante: del sexto al vigsimo ao

. fase de produccin decreciente: en adelante, hasta el arranque de la

plantacin (Pinto, ef a/, 2003).

4.4.2. Ciclo bianual

Durante el primer ao la vid asegura su perennidad constituyendo y diferenciando

las yemas. Durante el segundo ao, las yemas formadas el ao anteriorevolucionan desarrollando los rganos vegetativos y fructferos. Ambos procesos

son coincidentes en el tiempo en una misma planta (Pinto, et a|,2003)'

4.5. Fisiologia de la vid

Los nutrientes son absorbidos por las raices; luego se genera una migracin de

savia bruta; para el desarrollo de procesos vitales, tales como la fotosntesis,respiracin y transpiracin por las hojas; la migracin de la savia es elaborada por

las hojas primero hacia los rganos en crecimiento y despus hacia los rganosde acumulacin (Fig. 1) (Raynier, 2001).

30

.{gt:!ltt If

I

Tttc

ci. i-;:;'lr't

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'-"4 r:" ,.r.r,: t

Figura 1. Fisiologia de los rganos de la vd, fuente: (Raynier' 2001)

La intensidad fotosnttca est relaconada con el clima y la nutricin' Latemperatura ptirna para la fotosntesis de la vid en el da est en un rango de

27

a3o.c,sisupera35"C|aactividadfotosintticadisminuyeysedetenedebidoaque los estomas de las hoias se cierran Las sustancias en el suelo son de

gran

importancia,especialmenteN,Mg,Fe,yKsonloselementosindispensablesparael proceso fotosinttico. Incluso la temperatura sobre la humedad atmosfrica'

la

Fij rql: arl 5tr- f!

JI

disponibilidad de agua en el suelo y la intensidad de luz afectan el fenmeno de la

fotosntesis (Fregoni, 2005)

La vid es una planta C3 (solo con el ciclo de Calvin), sin embargo si en los climasclidos el cultivo est bien fertilizado (N) y tiene buen regado puede proporcionaruna produccin de 1O0kg/ha/ao de materia seca. Sembrar la vid en climastemplado-fro, por el contrario, hay una disminucin de das con temperaturasptimas para la fotosntesis y se incrementa la fotorespiracin, por lo que muchos

de los productos primarios de la fotosntesis son consumidos por la planta, lo que

conlleva a que disminuya el llenado de los racimos (Fregoni' 2005).

4.6. lmportancia, formacin y diferenciacin de las yemas

Las yemas de la vid se encuentran en posicin lateral con respecto al eje delbrote, insertadas en los nudos de las axilas de las hojas. Las yemas estncubiertas de escamas y de pelos, dentro de ellas tienen uno o ms ejes, rodeadopor las hojas en la se puede discernir los contornos de los zarcillos (Fregoni, 2005)

4.6.1 , Fase de Paralatencia

Durante esta etapa gran parte de las yemas (en especial las basales) an tenen lacapacidad potencial de brotar pero permanecen en reposo, debido principalmente

a|adominanciaejercidapor|ayemaapica|y|asanticipadasde|ossarmientosan en crecimiento. Esta capacidad potencial de brotar se va perdiendopaulatinamente conforme se avanza en la estacin y el sarmiento va madurando.

Este va perdiendo desde la base su color verde por desintegracin de la clorofila

en las clulas epidermales y tornndose paulatinamente desde caf claro a oscuro

debidoa|aacumu|acinde|igninayotroscompuestosfenlicosenlasparedescelulares (Pnto, ef al,2OO3).

J

4.6.2. Fase de endolatencia

Durante la endolatencia, a pesar de que no se observan cambios visibles, este es

un estado fisiolgico y bioqumicamente activo, durante el cual se producencambios en el contenido de agua de las yemas y en los niveles de reguladores de

crecimento y otras substancias quimicas (Pinto, ef a/' 2003).

En este estado las yemas salen solo si han cumplido un mnimo de horas de.fro

que le permitan pasar a las etapas siguientes (Pinto, ef al' 2OO3)

Las yemas endolatentes de vid poseen un requermiento mnimo de fro para

brotar el cual se satsface mediante exposiciones a bajas temperaturas (Kliewer &Soleimani, 1972).

4.6.3. Fase de ecolatencia

En la que las yemas a pesar de poseer plenamente su capacidad de brotar,permanecen en reposo hasta que las mayores temperaturas de la primavera les

permitan su salida de este estado y aseguren el normal desarrollo del nuevo brote

(Pinto, ef a/, 2003).

Las investigaciones realizadas a los cambios bioqumicos que ocurfen en las

yemasduranteel|etargonohansidocapacesdedefinirta|fenmeno,especialmente en lo que se refiere a los factores determinantes en la entrada y

salida del letargo. Se sabe que durante la quietud inicial se presenta unincremento de la concentracin de cido absccico (ABA) y de la enzimaribonucleasa, en tanto que junto a la giberelina (GA) la actividad enzimtca y larespiracinsereducen.A|entrara|aetapadereposomientrasseacumulafro'sereduce el nivel de ABA y RNA soluble, mantenindose estables tanto la actividad

enzimticacomolosalmidonesensusnivelesbajosyaltos,respectivamenteAlfina|deestaetapasegenerancitoquininasygibere|inasqueprovocan|aactividaddelaplantahastalatercerafasedequietudfinal,mientrasquealmismotiempoaumentae|RNAso|uble,|arespiraciny|aactividadenzimticay|osa|midones

se reducen al convertrse en azcares que son oxdados, lo que favorece el inicio

de actividad de la planta, el que deriva en la apertura de las yemas florales y

vegetativas (Pinto, ef a/, 2003).

4.6.4. Clasificacin de las yemas de vid: evolucin

Existe una escala extendida BBCH es un sistema para una codificacin uniforme

de identificacin fenolgica de estadios de crecimiento para todas las especies de

plantas mono y dicotiledneas. (Fg. 2) describe un nuevo sistema para laidentificacin de las etapas de crecimiento de vid llamado sistema BBCH Se trata

de una adaptacin, para la vid, de una escala bsica que abarca todos los cultivos

de plantas monocotiledneas y dicotiledneas. Existen otros dos sistemas que ha

dado lugar a una preferencia por Coombe ('1995), pero con algunasmodificaciones (Tabla 1 ).

Estas modificaciones se han discutido, y un nuevo sistema de medicin ydescripcin de las etapas de la vid que ofrece una simple enumeracin de las

principales etapas y, al mismo tiempo, ofrece etapas intermedias detalladas(Coombe, 1995).

4.6.5. Giclo evolutivo de las yemas de Vid: Dinmica

La formacin y diferenciacin de yemas (pronta y mixta) son los primeros actos delsubciclo reproductivo que se llevan a cabo durante el ao: lo que se lleva a cabo a

partir de mayo.

La yema latente (YL) compuesta de la yema principal (YP) y de las yemassecundarias (YS) est en estado de dormicin en el sarmiento. En primavera, layema principal se desarrolla dando un ramo foliado' las yemas secundaras

permanecendormidas.Anive|deunnudoyen|aaxilade|ashojasseencuentraunayemapronta(YP)yunayemalatente(YL).LaYPsedesarrollay|aYLentraendormicindurantee|verano.Ene|otoo'|adormicinde|asyemas|atentesVa

34

desapareciendo progresivamente hasta la primavera siguiente (Fig. 3) (Raynier'2001).

->->3r*rhdsoo ol 05 09 1t f3 15 55

ffi#fltl+#57 61 63 65 6a

f,f-*#rfhfl*71 79 75 77

wtr{tflFigura 2. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn BBGH' Fuente:

(Meier, 2001)

Apenas brota la yema latente se origina un brote que en la vid se suele denominar

pmpano. El pmpano se convierte en sarmiento despus que se lignifica' es

decir, ouando adquiere las caractersticas de madera; este proceso se denomina

maduracin del sarmiento o "agostamiento"' Los pmpanos se ensanchan en la

zona donde se insertan yemas, hojas, zarcillos y' en algunos casos' tambin

racimos.

35

Tabla 1. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn Eichhorn- LorenzFuente: (Coombe, 1995)

Estados Mayores Todos los estados modificados de E-L porCoombe (1995)1. Yema de invierno

2. Yema hinchada

3. Yema de algodn. Brotacin 4. Punta verde. Tejido de la primera hoja visible

5, Roseta de puntas de hojas visbles7. Prmera ho.la separada del pce caulinar

9. 2-3 hojas separadas. Pmpanos 2-4cm long.11. 4 hoias seoaradas

Figura 3, Giclo evolutivo: dinmica de las yemas, fuente: (Raynier' 2001)

"QPinwTU",L#s;* i .*."\ry,o\

ilq'

Ese eneanchamiento sa llama nudo y la porcin de bro@ o sermiento comprendida

entre dos nudos, se llama entrenudo (F9.4). Los enhEnudoe son ms cortos en labase del brote, cerca de su nacimiento en el sarmiento, desps tienen su longitudnormal hasta el extremo en que vuelven a acofafse. Con lae msmascarac{erlsticas anatmicas del brote, 8 pueden encontrar las feminelas o netos ylos chupones, gue nacn respec{ivamente de las yemas prontas y de madera vieiao adventicia (Lanzarini, & Mangione,2009).

4,7. TlpoedeyemaedcVid1.7.1. Yem prcnt

se forma en la primavera-verano, diez dfes antes de las yemas m)es, y enen un

dEsanollo de poco ms de un meS. Dan origen a un bfob recin formado (ramo

anticipado) gue puede ser estril, inrtil o il (Fg' 4) (Ftegoni' 2005)'

Flgura 4. Tlpoo de ysmar de vid, Fuenb: (Lrnzerini & trnglone' 2l9l

La latencia de las yemae est controlada gencamente y ee nducida por el

fotoperlodo y las baias tamporeturas' Su trmino ocurre en la primavera despus

que las yemas han acumulado una cierta cantidad de hora frlo'

37

Diversas reacciones que ocurren en el metabolismo de las clulas vegetalespueden conducir a la produccin de especies reactivas de oxgeno como elradical hidroxilo (OH), el radical superxido (Oi), el perxido de hidrgeno y eloxgeno singlete. En general, estas especies se forman por transferencia de un

electrn desde una molcula donora al oxgeno, generando el radical superxido,

que posteriormente es convertido HzOz.

La catalasa es una enzima que se encuentra presente en las clulas aerbicas y

que descompone el perxido de hidrgeno (HzOz) en oxgeno molecular y H2O'

Su rol fisiolgico es eliminar el exceso de HzOz producido durante el metabolismo

celular evitando de este modo su acumulacin y consiguiente dao celular (Pinto'et a|,2003)

4.7 .2. Yema hibernar, latente o mixta

se forma en la base de la yema pronta, sucesivamente se insertan en la base es

decir se inicia la agrupacin de los racimos, se completa en la primavera, su ciclo

dura aproximadamente 1 ao, durante la actividad vegetativa. Las yemas de

invierno no brotan porque estn inhibidos por la actividad del pice vegetativo

(dominancia apical) (Fregoni, 2005).

4.7.3. Yema latente

Son|abasede|asramasquepermanecensubdesano||adasycubiertasporlostejidos formados sucesivamente que crecen en el tronco o en las ramas' a veces

s|odespusdeVar|osaosdesuformacincomoresu|tadodeeventosparticulares (poda drstica, heladas, entre otros) (Fregoni' 2005)'

Luego de la cosecha, comienzan procesos hormonales internos en la planta y se

modifican sus estructuras. Las hojas comienzan a perder su clorofila y a tomar los

coloresdelotoo:amarillos,marrones'ocresCuandolashojascaen'laplanta

38

extrae del suelo los nutrentes indispensables que transporta a travs de la savia y

entra en reposo vegetativo hasta la prxima primavera (Lanzarini, & Mangione,2009).

4.8. Variedades

Los vinos se derivan del jugo fermentado de la uva. Existen alrededor de 5.000variedades o (cepas) en todo el mundo (entre naturales, hibridas y diseadas en ellaboratorio), pero solo unas treintena se explota comercialmente. se dividen enblancas y en tintas y, en general, producen vinos en esas dos categoras. como la

pulpa, en ambos casos es verdosa, la coloracin de los tintos se explica por el

contacto del zumo con la cscara u hollejo (Sabogal' 2007)'

No todas las variedades tienen la misma vocacin vitcola. como consecuencia de

las caractersticas morfolgicas de los racimos y de las bayas' como por ejemploe|grosorylaformade|asbayas,e|espesorde|ho||ejo,|aconsistenciade|apulpa,e|nmerodesemi||as,yenfuncindeldestinodelasuvas,sedistinguenvarias categoras de variedades:

- Las variedades de vino, de bayas jugosas que se prestan al prensaoo'Garnacha, Merlot, Syrah, Cariena, Cabernet Sauvignon' Melon' Gamay'

Chardonnay, entre otras (Raynier' 2001)'

- Las variedades de mesa, de racimos sueltos, con bayas bastantes gruesas'

conpulpacrujenteydepielresistente,DattierdeBeyrouth,|ta|ia,Cardina|,entre otros (RaYnier, 200'l)'

- Las variedades destinadas al secado, de bayas generalmente apirenas (sin

semilla) y pulpa bastante consistente' Sultanina (B)' Corinto (N)' Perlette'aunque a veces de bayas con semillas como el Moscatel de Alejandra y el

Rosaki (RaYnier' 2001 )'

20

Sin embargo, ciertas variedades tienen varios usos. Es el caso del Moscatel deAlejandra que es utilizado alavez como uva de mesa, uva pasa, uva de vino parala produccin de vino moscatel y de vino para destilar y producir alcohol (Raynier,2OO1).

4.8.1. Cabernet Sauvignon Vitis vinifera

La Cabernet sauvignon es la variedad tinta que ha tenido ms xito en todo el

mundo. Esta cepa se desarroll en Burdeos y su nombre comenz a ser conocido

hacia finales del siglo XVlll y comienzos XIX (Rankyne, 1995).

Las bayas pequeas como las de cabernet sauvignon tienen relativamente poca

pulpa; los raspones tienen un pH comprendido entre 4 y 5 debido al bajo contenldode cido libre y el alto contenido de potasio. su contenido en azcar es menor de

un 1o/o y contiene entre 0,5 y 3,5o/o de polifenoles en peso; estos sonleucoantocianos y catequinas que tienen un sabor marcadamente astringente ypueden ser responsables de hasta un 20o/o de contenido de taninos de las uvas

recolectadas. Las semillas contienen hasta un 507o de los mismos taninos ypueden ser la mayor fuente de estos en el vino. Contiene tambin aceites amargos

de semilla de uva. Las pieles contienen una considerable cantidad de azcar,

normalmente alrededor de un 80% respecto al contenido en la pulpa (Rankyne,1995).

4.9. Requerimiento de fro

Las exigencias de frio de los diferentes frutales de hoja caduca de las zonastempladas para pocrer salir del estado de receso, varan segn la especie y

tambin segn la variedad. El requerimiento de fro de una determinada especie

se mide en unidades de tiempo en que ocurren las bajas temperaturasestimuladoras, las cuales se han definido como menores aToC y superiores a 3oC'

las temperaturas cercanas a ooc o inferiores resultan ineficaces para promover la

40

salida del receso, esto es en parte, porque estaran inhibiendo la accin de lashormonas positivas. La unidad de tiempo es la "hora-fro", definindose sta como

t hora en que deben ocurrir ininterrumpidamente las temperaturas adecuadas(3oC-7oC) (Aristizabal, 1 995).

Los frutales caducifolios requieren de una acumulacin de estas horas para salir

del reposo, emplendose esta acumulacin como un mecanismo de defensa; esto

es oara evitar la brotacin cuando las condiciones ambientales sean favorables

por un perodo en el invierno, con lo cual los brotes jvenes quedaran muyindefensos a la accin de las posteriores heladas de invierno. Por otro lado, las

altas temperaturas durante el invierno (>= 20oC) pueden reducir o anular losefectos de la acumulacin previa de fro. El efecto de estas temperaturas depende

de una interaccin entre ellas y la duracin de su exposicin, ya que mientras msalta es la temperatura, menor es el perodo necesario para obtener reduccin en

las horas-fro acumuladas (Aristizabal' 1995).

Los frutales de la zona templada, sin embargo, no son capaces de brotarinmediatamente despus del cumplimiento de horas-fro; se requieren de "horas-

grado" para provocar la brotacin, definindose este concepto como "el nmero de

horas a una temperatura determinada multiplicada por el nmero de grados por

encima de una temperatura basal", luego se deben sumar todas las horas-graclo

ocurridas a distintas temperaturas (Aristizabal, 't995)

Por ejemplo, I horas a 20oC son 8-(20*-10*-)=80 h/grados (* nmero de horasmedidas, ** temperatura sumatoria de |as horas medidas, *** temperatura basa|),tomando como temperatura basal 10oC' Este mecanismo de las horas-grado

permite a la planta encontrarse an en estado latente cuando todava hay riesgo

dehe|adasprimavera|esdespusdehabersecump|ido|ashoras-frionecesariasoara la brotacin (Aristizabal, 1995)'

En ciertas zonas agroclimticas, donde las necesidades de bajas temperaturas cle

los rboles no son plenamente satisfechas, las plantas presentan sntomas de

41

receso prolongado, el cual se caracteriza por una brotacin y floracin deficiente e

inegular, y fnalmente en una dsminucin en la produccin y calidad de la fruta.

Para superar estos problemas, se han adoptado distintas medidas, como laseleccin de variedades de menores requerimientos de fro y la aplicacin devarios productos qumicos capaces de producir el quiebre del receso, pero nosolamente el requerimiento de fro es importante, sino tambin la edad de lasyemas. La vid es una de las especies con mayor variabilidad gentica, con una

gran cantidad de cultivares exstentes en la actualidad y repartidas en los msdiversos climas. Esto explica en parte el amplio rango de requerimiento asignado a

esta especie, que flucta entre las 150 y 1200 horas fro (Westwood' 1982)

4.10. Enfermedades de la vid

4.10.1. Phyumocasiona la podredumbre comn de las races de las plantas. Esta es unaenfermedad muy comn en el campo y los invernaderos, donde el organismo mata

a las plantas en los semilleros recin plantados (Jarvis, 1992). Esta enfermedadpor lo general implica relaciones complejas con otros hongos comoPhytophthora y Rhizoctona (Werner, 1 997).

4.10.2. RhizoctoniaE|gneroRhizoctoniasecaracterizaporlaproduccindeesc|erociosenunatextura uniforme con redes hifales que unen el micelio con plantas'

Rhizoctonia solana se caracteriza por:

Pigmentos marrones oscuros de las hifas

Ramificacin cerca del septo central en la hifa vegetativa joven

C|ulasmu|tinuc|eadasen|ahifaVegetativajoven(Werner'1997)'

42

4.10.3. Alternaria

Es un hongo ascomiceto esto es, del filo de las Ascomycotas. Las diferentesespecies de este gnero son uno de los mayores patgenos de plantas.Enfermedad de la vid causada por un hongo que provoca manchas rojas en lashojas.

La descripcin de un hongo denominado Altemaria vlfis, patgeno de la uva,reportados en numerosos pases han indicado que el organismo invade solamente

tejido foliar dbil o daado y que su incidencia en frutos es mayor cuando stosson primero daados por insectos (Daz & Bastida, 1971)'

4.11. Gultivo in vitro, propagacin de la vid

La creacin de nuevos viedos o la renovacin de instalaciones de viedos ahora

imoroductivas, o incluso la sustitucin de las variedades de vid cultivadas cada

ao se requiere la disponibilidad de un gran nmero de plantas dentro de la

variedadelegda,quegaranticeuncomportamientocontendenciahomognea(Fregoni, 2005).

E| cultivo de tejidos, como tcnica, consiste esencialmente en ais|ar una porcindelaplanta(explante)yproporcionar|eartificialmente|ascondicionesfsicasyquimicas apropadas, para que las clulas expresen su potencial intrnseco o

inducido y producr un mayor nmero de copias de la planta usada (Fregoni'

2005).

Elcu|tivoinvitrodep|antaspodemosdefinir|ocomoe|cu|tivodetodotipodeclulas, tejidos u rganos vegetales bajo condiciones de esterilidad Con estesistema de cultivo se pueden regular todos los factores que influyen en la

produccin y cultivo de especies vegetales' desde los requerimientos

43

nutricionales, pasando por la luz, fotoperiodo, temperatura, humedad, entre otros(Toms, 1995).

4.'12. Vaiedades, material vegetal y tipo de regeneracin

Para la micropropagacin de vid, las variedades ms evaluadas han sido Globo

Rojo, Criolla Chica, Criolla Grande, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir, Chardonay'Riesling, Moscatel, entre otras (Osuna & Saucedo,2010).

La propagacin comercial de la vid, es mediante enrazamiento de estacasdormantes, sin embargo, este mtodo no nos permite un rpido abastecimiento de

material vegetativo. con el xito de los programas de seleccin clonal, losvirlogos, quienes obtuvieron plantas libres de virus, o los fitomejoradores, quedesarrollan nuevas variedades, tienen una gran necesidad de un rpidoabastecimiento de especmenes nicos' Un mtodo que se propone para cubrir

estas demandas de produccin comercial, es la llamada multiplicacin vegetativa

in vitro. segn investigaciones realizadas en Jurez (Mxico) se consider alobservar el comportamiento de tratamientos con yemas axilares y pices, que el

de las yemas axilares era el explante para usarse en la etapa de la multiplicacin

de brotes, se tuvieron los mejores resultados para propagacin rn vifro de vidvariedad Globo Rojo. Por qu las yemas axilares se encuentran en principio deformacin, mientras que las yemas apicales (yema con la primera hoja) ya se hanformado y su desarrollo es ms lento n vlfro (Osuna & Saucedo' 2010)'

EnBo|iviaparareducirenfermedadesyp|agasdecidieroninjertarvariedadesproductorasenpatronesresistentes,propaganpormediodelcultivodetejidos'yaqueseuti|izanpequeosrganosdetejidosdep|antasencrecimientoactivoquese los cultiva bajo condiciones aspticas y controladas a las que se les davariadas aplicaciones, una de ellas el microinjerto in vitro. utilizan el medio de

cu|tivoMurashige&Skoog,desinfectancona|coholehipoc|oritodesodioa|2%(Rodriguez et al, 20O6)

44

Segn Galzy mencionado en (Guiazu et al, 2005) propone para el cultivo ln vlfrode yemas de vid un medio compuesto por los macronutrientes de Knop diluidos a

la mitad, los micronutrientes de Berthelot y seis vitaminas del grupo B. en trabajoslocales se micropropagaron las variedades realizando la brotacin de las estacas

uninodales en medio de Murashige y Skoog diluido a la mitad adicionado 0.5mg L-I de ciido giberlico (AGs) y 1mg.L-r de bencilaminopurina (BAP). Para ladesinfeccin del material vegetal lo ms utilizado es cloro comercial (hipoclorito desodio 5,25%i.a) con tiempos de 5 minutos a 15 minutos aproximadamente, conconcentraciones de 1% a 50% (Osuna & Saucedo,2010).

4.13. Reguladores del crecimiento vegetal

Las hormonas vegetales o fitohormonas son sustancias qumicas orgnicas que

se sintetizan naturalmente, y se activan en pequeas concentraciones. sonmolculas especficas involucradas en la induccin y regulacin del crecimiento y

desanollo de las plantas. Estas sustancias son sntetizadas en un lugar especifico

y traslocadas al lugar de accin (Hartmann et al' 2OO2)'

Enlapropagacindeplantas,lashormonasvegeta|estienengranimportanciayaque no slo son parte del mecanismo interno que regula la funcin vegetal, sino

queel|aspuedeninducirunarespuestaespecficaencu|tivo.Tambinexstenciertas sustancias qumicas, algunas naturales y otras sintticas' que muestran

efectos hormona|es en plantas, stos son c|asificados como regu|adores de|crecimiento vegetal (Hartmann et al' 2002) '

4.13.'1.1. Auxinas

Las auxinas ms utilizadas en cultivo de tejidos son el cido 2'4Diclorofenoxiactico (2,4-D), el cido Naftalenactico (ANA)' el cido Indolactico(AlA), y el cido Indolbutrico (AlB), siendo el AIB y el ANA auxinas sinttcas' Las

auxinassonsntetzactasapartirdeL-triptfanoenprimordiosdehoja'hojas

45

jvenes y semillas en desarrollo. sus funciones incluyen dominancia apical,estimulacin del alargamiento celular, desdiferenciacin celular, accin sobretropismos, formacin de capas de abscisin en frutos y hojas, y activacin delcrecimiento del carnbium (Hartmann et al,20021.

4.13.1.2. Citoquininas

Las sustancias naturales incluyen kinetina, zeatina, e lsopentiladenina (2ip). Labenciladenina (BA o BAP) es una sustancia sinttica. otras sustancas conactividad de citoquinina son thiourea, difenilurea, TDZ (thidiazuron) y CPPU (N-(2-cloro-4-piridul)n-fenilurea). Estas sustancias son esenciales para la divisin celulary su interaccin con las auxinas es una de las relaciones primordiales en lapropagacin in vitro de plantas. Las citoquininas tambin actan en plantasintactas para retrasar o reducir la senescencia, retardar el rompimiento de la

clorofila y las protenas celulares (Hartmann et al, 2002)

4.13.1.3. Giberelinas

Promuevenlae|ongacinde|osbrotesatravsde|adivisiny|ae|ongacincelular en tallos de plantas en roseta o de formas enanas. ocurren en altas

concentraciones en semillas en desarrollo y tienen funcin en el desarrollo del

embrin,|agerminacinycontro|deladormancia.E|compuestocomercia|msimportante es el cido giberlico (Rojas & Ramirez, 1993)'

4.13.1.4. cido Abscsico (ABA)

Es sintetizado del cido mevalnico directamente o del rompimento decarotenoides, su biosntesis ocurre en los cloroplastos El ABA est presete en

todos los rganos de las plantas superiores pero su funcin depende de su

concentracin.Tenesuprincipa|funcinenelcontro|de|asre|acioneshdricasdelos estomas, juega un papel en las reservas alimenticias' tiene funcin en ladormancia de yemas y semillas' la abscisin y la respuesta de las plantas al

estrs, particularmente de humedad ya que controla el cierre de los estomas y

46

controla la toma de agua y de iones por las races, tambin induce al letargo,afecta la senescencia y abscisin de las hojas. En la propagacin de plantas estinvolucrado en la germinacin y dormancia de las semillas, y juega un papel en laembriognesis y la produccin de semillas (Rojas & Ramrez, 1993).

4.13.1.5. Etileno

Es un gas de estructura muy simple, sintetizada de la metionina. Los carbohidratos

externos, la luz, las citoquininas, las auxinas y el dixido de carbono estimulan laproduccin de etileno, as como el ACC (un cido involucrado en su sntesis). Enaltas concentraciones tiene efecto en la epinasta, senescencia y abscisin dehojas y frutos. Interaccona en otros procesos como en formacin de racesadventicias, estimula la floracin y las yemas laterales, la produccin de ltex,diferenciacin del tallo, estimula la germinacin y sobrepone la planta a ladormancia (Rojas & Ramrez, 1993).

4.13.2. Mtodos Quimicos para el control de dormancia in vitro

Diversos productos qumicos pueden sustituir parcialmente el efecto del fro, as

permitir la brotacin y floracin de variedades en lugares de insuficiente suma de

fro, como los subtrpicos o las zonas merdionales de clima templado. An en

zonas de suficiente fro, para una normal brotacin pueden contribuir a unabrotacin, ms uniforme si hay yemas de menor desarrollo o madurez (Gil, 2000).

Existen varios mtodos que se han utilizado para el control de la dormancia tales

como el aceite mineral, azida sdica, extracto de ajo, entre otros; pero el msefectivo y ms utilizado es la cianamida hidrogenizada el cual posee la capacidad

de suplir la falta de fro para diversas especies frutales, modficando el periodo de

receso invernal y estimulando precozmente la brotacin (skw-Trostberg, 1987). Lacianiamida se consigue comercialmente con el nombre de Dormex con un 49% de

n.

47

La Cianamida Hidrogenada presenta una composicin qumica simple, siendo suscomponentes N, C e H. Despus de la aplicacin el ingrediente activo esrpidamente metabolizado e incorporado en los aminocidos de la planta (Ortiz,1987).

Hoy constituye una prctica comn la aplicacin directa a las yemas enconcentraciones de 1 a 2% en lugares de poco fro para posibilitar la fruticultura;ya que esta puede producir primores (cerezas, uva), uniformar la brotacin (kiwi,manzano); y hacer coincidir la floracin de polinizantes (cerezo, peral) (Eres,1987).

Por consiguiente, uno de los principales efectos por el cual se vincula la cianamida

con el trmino del receso, es debido a la inhibicin de la actividad de las catalasas(Pinto ef at, 2003). Al disminuir la actividad de la catalasa, conduce a un estrsoxidativo en varios sistemas, debido al incremento de perxidos de hidrgeno,Ensayos sealan que la cianamida, reacciona con la enzima hierro de la catalasa,

lo cual provoca la inhibicin de la descomposicin de los perxidos junto a loscambios oroducidos en los niveles de catalasa despus de la aplicacin decianamida hidrogenada. Tambin existen cambios en la expresin de algunosgenes, especialmente de aquel encargado de la regulacin del gen de la catalasa

(Pinto ef al,2003)

4.'13.3. Metodologias en cultivo de tejidos vegetales

Existen varias vas generales para rcalizat la propagacin vegetal in vitro omicropropagacin, lo cual depende directamente del material vegetal que sedeseepropagaren|aboratorio,suestadofisio|gico,ysuproduccindemeristemos y yemas apcales o axilares. si no existe una metodologa yadesarrollada, se debe experimentar para encontrar una va para lamicropropagacin de una planta (Roca, 1991)'

48

4.13.3.1. Organognesis directa

sistema para formar brotes directamente de una parte de la planta sin formacin

de callo (Roca, 1991).

4.13.3.2. Organognesis indirecta

Mtodo de estimulacin del desanollo de brotes a partir de callos (Roca, 1991).

4.1 3.3.3. Embriognesis somtica

La mayora de sistemas que forman embriones somticos lo hacen mediante una

ruta indirecta donde las clulas dan origen a proembriones los cuales a Su vez dan

origen a las etapas sucesivas similares a la embriognesis cigtica (Roca, 1991).

4.13.3.4. rganos de perennidad formados en cultivos asptcos

Algunas plantas producen estos rganos in vitro como minitubrculos en papa,

tallos bulbosos en lirios, cebollas, etc., y los protocormos en orqudeas, por mediode los cuales es posible realizar siembras directas o almacenamiento degermoplasma (Roca, 1 991 ).

4.13.3.5. Cultivo de embriones

El cultivo de embriones es usado para estudiar los requerimientos nutricionales de

embrionesendesarro||o,pararescatarembrioneshbridosdecruzamientosinterespecficos e intergenricos, producir monoploides' y para superar la latencia

delassemi|lascausadaporinhibidoresoporfactoresmecnicos'Asmismo,elcultivo de vulos ntactos se ha empleado para el rescate de embriones(polinizados y fertilizados in vitro), para inducir callognesis y embriognesissomtica, y se aplica en casos donde los embriones dependen de fuentesexternas de nutrimentos como en las orqudeas. Los embriones que se obtienen

delassemil|as,sonais|adosindividualmenteygerminadosinvitroparaobteneruna planta por explante. Aunque el cultivo de embriones no es una tcnca

cle

micropropagacinoclonacininvitroenunsentidoestricto'esunatcnicadonde

49

se cultiva el germoplasma para su multplcacn, el cual de otra manera seperdera (Roca, 1991).

4.13.4. Etapas de la propagacin in vitroPara iniciar la propagacin in vitro se requiere de la seleccin del inculoapropiado, la eliminacin de los microorganismos que se encuentran en lasuperfice de los inculos (que es a lo que se le denomina desinfestacin), laseleccin del medio de cultivo apropiado para el inculo, as como las condiciones

adecuadas de incubacin para el desarrollo del mismo (Barba ef al' 2001).

4.'13.4.1. Obtencin y establecimiento del explante in vitro

La micropropagacin puede iniciarse prcticamente a partir de cualquier parte de

la planta: rganos, tejidos o clulas. La eleccin depende de los objetivos que sepersigan y de la especie que se vaya a propagar. se tiene que tener en cuenta la

calidad de la planta madre, la edad fisiolgica de la planta madre y del inculo,

poca del ao, tpo y tamao del inculo (Barba et al,20O1).

4.'13.4.2. Desinfeccin de los inculos

Las plantas invariablemente llevan adheridos en su superficie externa diversos

microorganismos (como bacterias, hongos y levaduras), que de no ser eliminadospreviamente a la siembra, contaminarn los medios de cultivo afectando eldesarrollo de los inculos. Entonces, para obtener resultados satisfactorios en el

cultivo rn vitro, es necesario establecer un mtodo que permita su eliminacin del

material biolgico mediante una desinfestacin (Barba et a\,2001)'

La desinfestacin es la eliminacin de los microorganismos presentes en la

superficie externa de los inculos mediante agentes qumicos (hipoclorito decalcio, hipoclorito de sodio) (Barba ef al 2001)'

50

4.13.4.3, Seleccin del medio de cultivo

Como organismo multicelular, una planta es el resultado de las divisiones mitticas

sucesivas del cigoto. Cada lula de la planta completa posee la mismainformacin gentica. Para el crecimiento y desarrollo in vitro del material vegetal

separado de la planta es necesario que el medio de cultivo contenga todosaquellos nutrentes, vitaminas y fitoreguladores del crecimiento de las clulas'Debido a que cada planta tiene necesidades nutricionales especficas, no exste

un medio de cultivo de uso general (Tabla 2). El medio de cultivo puede usarsecon una consstencia semislida o lquida. Cuando se emplea semislido elmaterial de soporte que generalmente se usa es el agar, el cual gelifica el medio,

mientras que cuando es lquido el material de soporte puede ser papel filtro, fibra

de vidrio. entre otros (Barba ef al,2001).

Tabla 2. Medios de cultivo y condiciones experimentales utilizadas para lainiciacin y multiplicacin "in vitro" de las diferentes variedades fuente:(Toms,1995)

4.13.4.3.1. ComPonentes

a. Carbonob. Nutrimentos mineralesc. Vitaminas

Proocolo N"l Prolocolo No2 Protocolo No3

Exphnto

Mcdio Bse

Suplemcotos

Iluninacin

mmvcmo aprcal r erin ln(!,]|nudo, nflorcscen r tsxok)

lls-\ii \LS \ls+\'r i$S ts+\'rr \LS

3fu,/l- Srclrrr 2mg.''l . B\ 30g,rl. $c.e l mg 2-tD 0 1m8/L Bi 30g,/l, Scro6,2mg B\ 6U,/L agaf

fotopcrirdrr I mcundad Ostud

=

Erplmto

Medio Bse

Slplemcntm

Ilumicin

B(nes fngmenrs de cdlo

lils+\rr tS \g+\-n. iUS IfS.\ u \l-\

30g,rl Srcarose ?mg/1. Bt 4l'L \t 3i4r'L Sacaxr 2mg B.\ 2rng,/L \ \.\ gn- fgat Xg/ L Srclrosx lmS B.\ 6Srl. .\gr

51

Agente gelificante (en caso de medios semislidos)Sustancias reguladoras de crecimientoOtros compuestos (Roca, '1991).

Generalmente se hace referencia al conjunto de componentes a + b + c comoal medio basal (MB)

4.13.4.3.2. Preparacin del medio de cultivo

Es necesario preparar el medio utilizando agua destilada o agua desm in eralizada '

El procedimiento para la preparacin de los medios depender, en primerainstancia, del tipo del medio, de su consistencia y de la presencia de componentes

termolbiles. En general, se pueden distinguir:

a. Medios semislidos sin sustancias termolbiles (lncorporacin del mediobasal(MB),delosreguladoresdecrecimiento,ajustedelpH;Adicinydisolucin del agar; Esterilizacin en el autoclave) (Roca' 1991)'

b. Medios lquidos con o sin sustanca termolbiles. Para su preparacin sesigue el mismo procedimiento de a', pero sin adicionar agar (Roca'

199r ).c. Medios semislidos con una o ms sustancias termolbiles

(lncorporacin de los compuestos que pueden ser esterilizados enautoc|ave, ajuste de| pH; Adicin y diso|ucin de| agar; Esteri|izacin enel autoclave; Incorporacin de la sustancia(s) termolbil(es)'previamenteesteri|izado(s)porfiltracin;Distribucindelmedioen|osrecipientes de cultivo) (Roca, 1991)'

4.13.4.3.3. Desinfeccin

Para establecer cultivos aspticos es conveniente:

Trabajar en ambientes adecuadosEsterilizar los medios de cultivo

d.e.

f.

52

- Desinfectar superficialmente los explantes, liberndolos de bacterias yhongos exgenos

- Realizar los cultivos respetando ciertas normas de asepsia (Roca' 1991)

Hay una vasta gama de compuestos qumicos que se pueden utilizar comodesinfectantes para los explantes, pero en la actualidad es casi generalizado el

empleo de etanol (7\o/ovlv) y de hipoclorito de sodio (Naclo) del 1o/o al 5.25o/ocontenido en productos de uso domstico (agua de lavandina). En algunos casosresulta til el agregar algn agente tensoactivo (por ejemplo, Tween-2o). Despusde tratar el explante con las soluciones desinfectantes es necesario remover del l

los restos del producto, mediante varios lavados con agua destilada estril,haciendo un mnimo de tres enjuagues sucesivos (Roca' 1991 )'

Por asepsia en el establecimiento y ulterior manipulacin de los cultivos es precso

adoptar algunas Precauciones as:

a.Antesdecomenzar'desinfectar|amesay|asparedesde|acmaraconetanol 70%. lgualmente es conveniente desinfectar la parte externa de los

recipientes que contienen los medios de cultivo, antes de introducirlos en la

cmara (Roca, 1991).b. Es necesario que |as manos y, eventua|mente, |os antebrazos de| cu|tivador

sean desinfectados con etanol 70% (Roca' '1991)'c.Losinstrumentosmet|icosempleadossedebenf|amearpreviamentecon

etanol al 95% (Roca' '199't).d.Rea|izar|asoperacionesdetransferenciaydiseccin|omscercaposib|ea

la llama de un mechero (Roca' 1991)'

4.13.4.4. Incubacin en condiciones adecuadas

Latemperatura(de20a30.Cgenera|mente)y|a|uz(l2hdiariasde|uminosidad,hasta|uzcontinua,yde1000al0000lxdeintensidad)son|osfactoresfsicosms importantes para et desarrollo in vitro (Barba et al' 2001)

4.13.4.5. Enraizamiento

El enraizamiento satisfactorio de una microestaca es fundamental para lasobrevivencia de las plantlas generadas in vitro. La generacin de un sistemaradical puede inducirse antes o despus de extraer la microestaca del recipiente

de vidrio. Es ms eficiente enraizar en terreno por costos y beneficios que en el

mismo medio, ya que, las ventajas que trae en el ambiente externo es que regulansus mecanismos fisiolgicos al mismo tiempo de la induccin de races, lo que

representa una economa en tiempo y costos (Barba ef al' 2001)'

4.13.5. Factores limitantes al culvo in vitro

4.13.5.1. Contaminacin

La contaminacin de los explantes se puede presentar en forma exgena por

deficiente esterilizacin del material vegetal o en forma endgena cuando se trata

de contaminantes sistmicos difciles de controlar (seemann, 1993) En el cursode|crecimientode|asp|antas,haymuchosmicroorganismosde|aSuperficeodelarizsferaquepueoencolonizarlaplantaatravsdeaberturasnaturales'heridas, etc., adicionalmente hay patgenos facultativos y obligados que pueden

colonizarla, o penetrarla va vectores o mediante plantas hospederas (seemann'

1993).

4.13.5.2. Oxidacin

La|uzy|aespeciesonfactoresdeterminantesen|aoxidacindeespectesencultivo rn vitro. Adems existen otros factores que son condconantes

para que se

produzca oxidacin (Margara, 1 988)'

El pardeamiento de los explantes es un problema que se presenta con mayor

frecuenciaenexplantesdeespecies|eosasysere|acionaconlaliberacina|medioyoxidacindepolifenoles,quedancomoresultadoproductostxicosparael exPlante (Seemann, 1993)'

54

Tanto los explantes como el medio de cultivo de algunas especies, sobre todoleosas. una vez puestas en cultivo in vitro, tienen la tendencia a manifestar unpardeamiento que, en forma extrema, lleva a la muerte de los explantes Estepardeamiento se produce por accin de enzimas oxidasas que contienen cobre,

como las polifenoloxidasas y las tirosinasas, que se liberan al herirse los tejidos.La inhibicin del crecimiento de los explantes, por otro lado, ocurre por laoxidacin de los fenoles y la consecuente formacin de compuestos quinnicos,

altamente activos (Seemann, 1 993).

4.13.5.3. Fenolizacin

Durante el cultivo in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor medida

situaciones de estrs, ocasionadas por daos mecnicos o por las condiciones del

cultivo in ylfro (como la composicin del medio). Estas situaciones estimulan elmetabolismo de los compuestos fenlcos. La sntesis de fenoles va a producir una

serie de reacciones de hipersensibilidad, tales como la exudacin al medio del

contenido de las lulas deterioradas. De igual forma, las clulas vecinas de las

oue inicialmente fueron lesionadas se ven afectadas, incluso aunque esas lulas

no parezcan estarlo, llevando finalmente a una muerte prematura. En general, los

fenoles son sustancias lbiles y fciles de oxidar. Los productos generados por la

oxdacn tienen carcter fitotxico, por lo que son capaces de alterar eventos

morfogenticos y/o de crecimientos y desarrollo, potenciando en otras ocasiones

otros procesos de oxidacin, puesto que se convierte en potentes oxidaciones

(Afanador, 2005).

Otros mtodos que han dado buen resultado cuando la sntesis de fenoles nopuede evitarse son: |a dispersin, adsorcin o |avado, con sustancias como elcarbn activado (cA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificacin del potencialredox (disminuyendo los agentes redox), o las disponibi|idad de oxigeno' |ainactivacin de enzimas de tipo fenolasa (quelantes)' y otros sistemas como la

incubacinencondicionesdeoscuridad,bajopH,incubacinatemperaturasmsbajas, entre otros. En general lo que se busca al proporcionar estas condiciones

55

es reducr la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos para esta enzima(Afanador, 2005).

La adicin de sustancias antioxdantes, es otro de los mtodos que suelenaplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que se pueden convertir

en oxdantes muy potentes, invirtindose su efecto positivo en el control de los

fenoles (Afanador, 2005).

segn (Rivero, et at,20o1), presume que existe una relacin entre la oxidacin yla posicin que ocupa e| nudo en |a rama, ya que en cu|tivos como |a uva ( yfiisvinifera L.), se ha detectado un efecto significativo de la posicin de los pices'determinando menor contenido de compuestos fenlicos en los laterales que en

los terminales, con la consecuente reduccin de la oxidacin'

4.13.5.4. Vitrificacin

La vitrificacin es un problema que se pfesenta en ciertas especies herbceas y

|eosas,ysere|acionaconprob|emasfisio|gicosquedancomoresu|tadoe|desarrollo de tejidos vtreos, translcidos de difcil sobrevivencia al transplante(Seemann, 1993)

56

5. MATERIALES Y METODOS

5.1. Localizacin

La presente investigacin se llev a cabo en el "Laboratorio de BiotecnologaAgrcola" de la Facultad de Ingeniera Agronmica de la Universidad de Ciencias

Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. ubicada en Bogot D.C.

5.2. Materiales

5.2.1. Material Vegetal

Los explantes utilizados para la presente investigacin, fueron estacas lignificadas

con mnimo dos yemas, obtenidos de plantas v. vinifera L. Var. Cabernetsauvignon, los cuales fueron suministrados por el Viedo Ain Karin de Villa de

Leyva Boyac, que se encuentra a una altitud de 2145-3000 msnm' con una

temperatura promedio de l3-'16'c y noches frias, alcanzando temperaturas de

3"C. Las estacas lignificadas que se manipularon para la siembra se encontraban

enestadosuno(1)ydos(2)segn|ac|asificacindeLorenz(Coombe,1995)para yemas de vid. Se consider el uso de yemas axilares, ya que en los trabajosrealizadosporOsunaenel2010,ycorroboradosentrabajospreviosenel|aboratorio 2oog-2011, se encontr que para |a variedad Globo Rojo' stasrespondan ms rpido a los procesos de diferenciacin en comparacin a las

vemas termnales.

5.3. Materiales Para siembra

5.3.1. Preparacin de explantes para la introduccin

El material colectado en campo plantas de vid var' Cabemet Sauvignon (yemas

con segmento de tallo) era almacenado para su transporte en un litro de agua en

so|ucinconcidoascrbico(0.5g/L)ycidocitrico(0'5g/L)porunmXimodetiempo de dos das Este tratamiento evitaba que las yemas empezaran procesos

57

de oxidacin previo al prooeso de intoduccin in vitto. En el laboratorio las yemes

eran lavadas con jabn desinfectante (Protex @). Posteriormente el materal erasegmentado y separado en frascos de vklrio, donde, ee separaban las yemas tpo

1 en un frasco diferente a las yemas tipo 2. En el momento del corte se aseguraba

la yema con un segmento de tallo (Fig. 5), y de ahl * ptocedla a realizar lasembra.

Figun 5. tteril vegetrl yem con egmcnb de tllo, ncln aembrdo lnviho

5.4. Trtmientoc eveluldol pen le introduccin yemar n vfro

5,t.1. Eveluclonoa Prellmlnru

Lostfatamientospropustosrespondenaunaseriedeobservacioneequesaobtuvieron cle nsayqs prelmineres, donde se encontr que los tiempos de lavado

para deeinfeccin inferiores a l0 minutos, independiente de |a concentracin de|agente desinfectante, permitlan el cecimiento filngico y bacterial a partir del

explantasembrado,Raznporlacualnosetuvierongncuentiatiemposinfofiorg$alcitado.Deigualforma,etoemismosensayospermitierondeterminarqueel

empleo de agentes antioxidantes en el medio no era un formula tan efectiva para

el control de oxidacin, como s lo era el enjuague del explante con cidoascrbico por un tiempo no mayor a 5 minutos.

5.4.2. f atamientos propuestos

Bajo condiciones de cmara de flujo laminar, se evaluaron dos tipos de yema(invierno, algodn) a las cuales se les realizaron lavados para la desinfeccinvariando la concetracin del agente desinfectante hipoclorito (1.5 y 5%) y dostempos de lavado (10 y 20 minutos).

De igual forma se evalu la aplicacin de cido ascrbico en concentraciones de

0.5g/L para evitar problemas de oxidacin de los explantes.

Todos los explantes que se llevaron al proceso de introduccin in vitro fuerontratados con un fungicida (Benomil) en concentraciones de 4gll.

De tal forma, la interaccin factorial de tratamientos fue:

2* x2** x2*"* x tratamientos

*2 tipos de yema (x y y )**2 concentracones de hipoclorito

*.-2 tiempos de desinfeccin

**** Presencia o ausencia de agente antioxidante

Se utilizaron 2 testigos; uno con yema tipo invierno y el otro con yema tipoalgodn, los 2 testigos se manejaron con interaccin del agente desinfectante ydel agente antioxidante (tabla 3).

qo

Tabla 3. Protocolo de desinfeccin; se observa cada una de las etapasllevadas a cabo para cada producto.

njuague concertracin de llaoo fempos lOO 5 mn en: tuntkda + Antordarte Yem de Tratamaento

Jabn0esinfectante

10 min

Funsicda + Antioridante lnvarno T1Funsicida sn Antoxidante Tetigo T2Fungicida + Antioxidante AlgodnFunqicida sn Antioxidante Testgo I4

2U mtn

tungcida + Antoxdante lnviernoFunEicida sin Antioxdante TestigoFungicida+ Antioxidante Alsodn T7Funricda sin Antioxdante Testico T8

5 10 mn

Funqicda + Antioidante Invterno T9Fungicida sn Antioidante Testigo f10Fugcida + Antioxidante Algodn Tl.1Funscida sin Antioxidante Testi:o 112

5 20 min

Funrlcda+ Antioidante lnverno T13Fungicda sn Antoxidante Testgo f14Fungicida + Antoxidante Algodon T15

Funscida sin Antioxdante TestitoTestgo Absoluto TA

Para el montaje de los tratamiento de la fase uno, se utilizaron tubos de ensayocon capacidad de 20 ml, en los cuales se depositaron 10 ml de medio MS. Por

cada tubo de ensayo, se sembr un solo explante (segn el tipo de yema), el cualcorresoondia a la unidad experimental. La contaminacin fngica o bacterial'sobre el explante, nos daba a conocer la presencia del agente patgeno (Fig.6a).La ausencia de contaminacin permiti evaluar la oxidacin y/o el desarrolloradicular o caulinar de los explantes.

Luego de obtener los resultados apropiados se realiz un trasplante, donde, se

utilizaron frascos cte compota con capacidad de 50m1, a los que se les adicion15ml de medio por frasco (Fig. 6b). Los medios se ubicaron el en Laboratoro cleBiotecnologa del bloque o de la sede de la universidad de ciencias Aplicadas y

Ambientales.

60

b)

Figun 6. a. Primera frre (regmento de tallo + y6ma po elgodn e Invlsmoembrad in vtto medlo f,s % parbr). b. segunda fe3o (yomar vlvag inalgrln egente contrmlnenb mmbrede ln vito medlo tS % parba)

5.1,3. Variableo evluad en loa plotocoloc de dlnfeccln (Bioenaeyo l{l)

se evaluaron les rcspuestss de tos explanGs a los trataminto8 considerando:

Para el primer ensaYo:

. Ausencia o presencia de conaminacin' En caso de en@ntrarcontraminacin se clasific segrin el po de patgeno en: filngico o

bacteriano' Para la determinacin Especifica del po de patgeno' ste se

ais|parasusiembrayposteriorreconocimientoenmediodecultivoPDA.Los explantes contaminadoe fueron descarbdoo para connuar con la

evaluecin'

61

Ausencia o presencia de oxidacin: los explantes que no se contaminaron

se les evalu la oxidacin con una escala de puntaje de 1 a 3; donde 1 esausencia con un 10% de contaminacin,2 presencia moderada con un 50%

de contaminacin y 3 oxidacin total. Los materiales que se consideraroncon puntaje 3 fueron descartados en la evaluacin de brotacin (Azofeifa'2009).

Desarrollo de brotes: en esta variable se consider la diferenciacin caulinar

de la yema.

Para el segundo ensayo:

a. Desarrollo caulinar: respuesta de brotacin-crecimiento caulinar

b. Desarrollo radicular.

5.4.4. Evaluacin estadstica

considerando la interaccin de variables, el alto nmero de tratamientos y el bajo

nmero de repeticiones, se recurri a un anlisis estadstico con la prueba Z; la

cual permite probar la diferencia de los efectos de los factores principalesevaluando el efecto de la variable independiente sobre la media de la muestra

(Pagano, 2006). Para probar la diferencia de los efectos de los factores principalesy para las interacciones de dos factores se hizo una prueba de Chi2 el cual se

utiliza para verificar el ajuste a la normalidad, o a cualquier otra distribucin terica

de probabilidad (Arvelo, 1998).

5.4.5. Toma de datos

Se realizaron tablas (Ver Anexo 13) segn la numeracin que se asign a cadacaso de contaminacin bacteriana y/o fngica, oxidacin o fenolizacin se aislaban

oseretirabanporcomp|eto;as,tdejarenobservacin,3exc|uirde|ensayo.Cadatercerdiaen|aSemanasehaca|atomadedatosconcincolecturasrea|izadas,esto se llev a cabo en un perodo de 2 aos aproxmadamente'

b.

o

5.5. Preparacin de medios de Cultivo

Procedimiento de desinfeccin de medos: La preparacin de los medios se realiz

con tres (3) das de anterioridad a la siembra y se esterilizaron en un autoclave a15 P.S.l. en un transcurso de una hora. Para el desarrollo del protocolo se utiliz

un medio MS modificad o en /, partes (ver anexo 1), al que se le adicionaSacarosa 35gramos/Litro Myoinositol lOOmiligramos/Litro (Azofeifa' 2009)'

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6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Evluecin de cobrevlvencia fare I

6.1.1. Efacto de h concentrecin dol hlpoclorito ds odloLas concentraciones de hipoclorito evaluadas no fueron influyentes en la limpieza

de fttopatgenos en las plantas utilizadas; ya que ms del 5070 de log materiales

sembrados bajo condicioneE in vitto se eliminaron por contaminacbn agentesbacterianos, filngicoo y de oxidacin.El porcentaje de sobrevivencia para h corrcentracin del 1.57o irdependiente delas dems variabtes fue del 20.830/o, mientras que para la concentracin del 5%

fue figeramente superior en tan solo un 4.160,6, es decr un25oA en total (F9. 7).Segrln el anlisis eetadfstico, no hubo diferencia significativa entre los doetratamentc (Ver Anexo 5).

o%.'% So/o

Porccntrlc de Gonc'ntrtcln dc ilaClO

Flgura 7. Porcentrle de cobevlvencia de loa explenbo w el porcentaie de

concenfecln del dealnfsctnb pre le Intoduccln In vto C' Sawignon

S 25o/otc< 20%Poo3 1s%Eo

E le/ooeoGs%

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El mayor porcentaje de sobrevivencia se present en las concentraciones dehipoclorito al 5%, al contrario de lo que menciona Fregoni (2005), 37o dehipoclorito de sodio por 15 minutos o'10% de hipoclorito de sodio por 5 minutos,

seguido por tres lavados sucesivos inmerso en agua destilada, cada 10 minutos.(Fig. 7) esto lo confirma osuna et al (2010) en su trabajo de investigacin depropagacin in vitro de vid variedad globo rojo donde dice que para mantener losexplantes libres de contamnantes se sometieron las yemas axilares y pices de

vid al 50% de cloro comercial y este tratamiento mantuvo libre de contaminacin

bacteriana y fngica a los explantes, aumentando as el porcentaje desobrevivencia de los explantes.

Individualmente se ve el porcentaje de los agentes que promovieron la eliminacinde los explantes a causa de la contaminacin bacteriana, fngica, y por oxidacin

(Fig. 8). La contaminacin se midi por tubo de ensayo, en presencia o ausenciadel agente contaminante, ya que, se podia presentar contaminacin bacteriana o

fngica solas o ambas en un mismo tubo de ensayo.

con concentraciones del agente desinfectante al 1,5% se elimin un 12,5Vo de

explantes por contaminacin bacteriana, y al subir este agente al 5%, aumentotambin la contaminacin bacterial eliminando un 16,70/o de explantes' Para el

caso de la contaminacin fngica el porcentaje de explantes elimnados seincremento considerablemente, un 63% con la concentracin baja de hipoclorito y

un 54% con la del 5% del agente desinfectante (Fig. 8)' Los resultados anterorespermten deducir que los hongos son ms sensibles al hipoclorito de sodio; y por

esta razn, se dsmnuye la contaminacin por causa de este patogeno en

concentraciones altas. con las bacterias no pasa esto, razn por la cual el

crecimiento de las bacterias es ms favorable en estas con@ntracones' Lo

anterior se observa en el trabajo de Prez & lvarez (2002) dnde los explantesson nmersos en una solucin de hipoclorito de Sodio al 1% con agitacin por 5min obtenindose ausencia de agentes fngicos y pero no decontaminacinbacterana.

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! Baderianar FngicarOxidadn

1.5% 5%Porcenlic de Concencln de NrGIO

F|gure8.Porcentrtede|oorgenteaqueprcnovieron|e||minac|nde|ooexptanter vr e| porcentrje de |e concenfc|n de| deo|nfctanto pr. |ainfoduccin In vto C. reuvlgnon

Para |a concentracin a| 1,5oh |a oxirJacin fue de| 29,17% miefitras que para laconcentracin del 5% fue |iger