2015a dna recombinante1 [modo de compatibilidad]
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TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE
Tecnología del DNA recombinante
• Conjunto de técnicas que permiten el aislamiento de genes, su purificación, modificación y expresión en organismos diferentes de aquel de origen.
Herramientas: Nucleasas
• DNA o RNA ss o ds• Endonucleasas: no requiere extremos.• Exonucleasas: substratos con extremos
Endonucleasas. S1 nucleasa
Exonucleasas cadena única
Exonucleasa cadena doble
RNasa H
• Degrada RNA de un híbrido RNA - DNA
Endonucleasas de restricción
• Evolución dotó a las diferentes especies bacterianas con endonucleasas específicas para distinguir su propio DNA del DNA extraño.
• Marcada especificidad para reconocer cortas secuencias de nts.
• Existencia de muchas E.R. c/u reconociendo una secuencia específica.
Tipos de E.R.• Tipo I: reconoce y corta a distancias variables
del sitio de reconocimiento. Mínimo 400 pb y máximo 7 Kb. Corta DNA doble cadena.
• Tipo III: cortan DNA doble cadena aprox. 25 pb de su sitio de reconocimiento.
• Tipo II: cortan DNA en el sitio de reconocimiento. Generan fragmentos reproducibles.
• Tipos I y III: no producen fragmentos reproducibles de DNA.
Secuencias palindrómicas
• Palabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha, que de derecha a izuierda.
• Radar• Anilina• Dábale arroz a la zorra el abad.• T T A G C A C G T G C T A A • A A T C G T G C A C G A T T
Enzimas de restricción
• Por ejemplo:EcoRI
• Otros ejemplos:– BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de
Bacillus amyloliquefaciens– SmaI – la primera que se aisló de Serratia
marcesens– HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de
Haemophilus influenzae
Escherichia(género)
coli(especie) cepa R
Primera enzima aisladade ese organismo.
Tipos de corte • “Sticky” o pegajosos –
es más fácil para volver a ligarse los extremos.– Ejms.
• EcoRI• Bam HI• HindIII
• “Blunt” o abruptos– Ejm.
• SmaI
E.R: extremos cohesivos
E.R: extremos cohesivos
→
Mapas de restricción
• Analizando los fragmentos producidos por varias E.R en particular y en combinación se consigue deducir el orden de los segmentos dentro de la molécula original.
• Digerir con E.R en forma individual y simultanea, correr en gel y determinar su tamaño.
Mapas restricción
Ejemplos de mapas de restricción
• DNA circular digerido con:• DNA lineal digerido con:
Hacer mapa de restricción
• DNA no digerido 7 Kb.• Hind III 6.2 0.8 Kb.• Sma I 5.8 1.2 kb.• Hind III + Sma I 5.8 0.8 0.4 Kb
Mapa Restricción