EXTRACCIN DE ADN EN FRESA

INTRODUCCINLa extraccin del ADN de cualquier organismo, a un bajo costo y con el mnimo trabajo en el laboratorio, con una suficiente concentracin y pureza en poco tiempo, es importante para muchos investigadores interesados en el estudio de la clasificacin y filogenia de organismos. (Osorio-Cadavid et al., 2009).Uno de los problemas al trabajar con vegetales es la composicion de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extraccin del contenido celular, incluyendo el ADN (Dellaporta et al., 1983).

El ADN constituye el material gentico de los organismos, es el componente qumico primario de los cromosomas y el material del que los genes estn formados.

Dicha pared se debe romper por accin mecnica, en seguida, se deben destruir las membranas celulares de manera que el ADN, acompanado de otros compuestos (proteinas, enzimas, carbohidratos), quede disponible.La muestra de tejido obtenida se agrega a una solucion buffer o tampon de extraccion, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o alta fuerza ionica (para que sea soluble el ADN) y de altas concentraciones de NaCl. Los agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la accion de enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que actuen como cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl se emplean para prevenir la contaminacion de la muestra con polisacaridos que afectan la pureza del ADN, pu- diendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restriccion; la base para la separacion de los polisacaridos de los acidos nucleicos, es su solubilidad diferencial en presen- cia de las altas concentraciones de NaCl los polisacaridos precipitan bajo la accion de fuerzas centrifugas. A la mezcla anterior se agrega un detergente anionico como el SDS (sodio dedecil sulfato), que solubiliza proteinas, tejidos y membranas, evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extraido presente coloracion gris o parda, la cual se debe a la actividad de polifenoloxidadas presentes en algunos tejidos, se incluye en el buffer de extraccion P.V.P (polivinil pirrolidona) (Porebski et al. 1997)Para separar las protenas, se lleva la mezcla de tejido con el tampon a incubacion a 65C con lo cual se desnaturalizan las proteinas. Para retirar las proteinas denaturadas y la mayoria de los polisacaridos, se agrega una sal como el acetato de potasio frio. Por centrifugacion se separan tejidos, membranas, polisacaridos y proteinas de los acidos nucleicos, los cuales quedan en el sobrenadante. Finalmente hay que separar el ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe precipitar el mismo, usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la precipitacion del ADN en presencia de ARN. El ARN se remueve adicionando enzima RNAasa a la solucion (Velasco, 2005). El objetivo de esta prctica fue aislar el ADN del fruto de fresa mediante la utilizacin de una tcnica rpida y econmica.MATERIALES Y MTODOSLa extraccin de ADN de una manera econmica y muy simple se llev a cabo en el laboratorio, se realiz de una manera preliminar en tres frutos: fresa, guayaba y manzana, se maceraron en una bolsa de platico con las manos, por otro lado se prepar la solucin de extraccin, con una cucharadita de sal, una de detergente lquido lavatrastos, y medio vaso de agua. En esta solucin se agreg la fruta macerada y se agito durante 5 minutos y finalmente se adiciono un volumen equivalente de alcohol frio para precipitar el ADN y con un gancho de vidrio se tom el ADN para visualizarlo.Este mtodo fue emprico de ah la tarea de estandarizar un protocolo de extraccin con cantidades y tiempos para hacerlo ms eficaz y eficiente. Se describe a continuacin.Para la extraccin de ADN se utilizaron seis muestras de 30 g de fresa previamente macerada en un mortero con pistilo durante 5 min. Se prepar una solucin buffer para la extraccin de ADN utilizando 60 g de cloruro de sodio (NaCl), 60 ml de detergente lquido y 880 ml de agua destilada. En un vaso de plstico se colocaron los 30 g de la fruta molida y se adicionaron 50 ml de solucin buffer. Las muestras se dividieron en dos grupos con tres repeticiones para cada uno. En el primer grupo las muestras se agitaron durante 5 minutos y se procedi a filtrar utilizando filtros de cafetera y vasos de plstico. El segundo grupo de muestras se coloc en bao Mara a una temperatura de 60 C durante 20 minutos con agitaciones cada 5 minutos una vez trascurrido el tiempo procedi a filtrarse de la misma manera que el primer grupo de muestras. Al filtrado (50 ml aprox.) se le adicionaron 50 ml de alcohol frio al 70% para precipitar el ADN, se dej que actuara 5 minutos y con un gancho de vidrio previamente esterilizado se tom el ADN para visualizarlo y hacer las comparaciones correspondientes. RESULTADOS Y DISCUSIONEn la primera etapa de la prctica se corroboro que de manera fcil, sencilla y econmica puede realizarse la extraccin de ADN, y que adems puede realizarse con cualquier fruto como se realiz. La segunda parte es estandarizar esta manera sencilla y convertirla en un protocolo para que sea reproducible y confiable, solo se trabaj con un tipo de fruta, por que anteriormente comprobamos que se extrae de la misma manera en cualquier fruto. Ahora lo que segua es estandarizar el procedimiento y las cantidades exactas de reactivos (Sal de mesa o cloruro de sodio y detergente liquido), de las muestras, de agua y de alcohol, adems de los tiempos que son muy importantes en todo procedimiento.Al macerar las fresas, se rompieron las paredes celulares que contena el fruto de la fresa, liberando el contenido celular. La pared de los ncleos de las clulas est formada por lpidos la cual se rompi por accin del detergente lquido utilizado. El incubacin d las muestras a 60 C hacen que el proceso de separacin de ADN y oros compuestos sea ms eficiente, potencializan la accin de la sal y el detergente.La sal permiti que el ADN precipitara en la solucin fra de alcohol y que las cadenas de ADN no se cortaran. El alcohol se utiliz para que el ADN ya no estuviera disuelto en el agua y pudiramos sacarlo de la disolucin. Este proceso se le conoce como precipitacin el ADN. En la figura 1 ADN obtenido del fruto de la fresa precipit y present una apariencia blanquecina y fibrosa.En esta prctica se realiz una extraccion simple de ADN de varios frutos. La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol. La solucin de lavavajillas y sal es capaz de romper la pared celular y las membranas plasmtica y nuclear. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. A continuacin se muestran las fotografas donde se observa el ADN total extrado en la prctica.

Figura 1. ADN de fresa, la imagen de la izquierda son las muestras cuando se aplica calor y la imagen de la derecha es la muestra si calor.

La obtencin de ADN integro y puro es una parte fundamental para el buen desempeo de las tcnicas utilizadas en biologa molecular (Tang et al. 2005, Wang et al. 2005). Una de las ventajas de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as como un alto rendimiento. Sin embargo, en ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos mtodos son susceptibles de contaminacin, variacin y errores por los mltiples pasos de manipulacin (Strmer et al. 2007). El rendimiento de los kits depende del tipo de tejido y la cantidad de muestra inicial, as como de la capacidad de unin de la membrana. En los ltimos aos ha aumentado el uso de los de mtodos de extraccin comerciales debido a que la matriz permite capturar selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con molculas ntegras; al tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y se disminuye la posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno. Extractos con estas caractersticas aumentan la sensibilidad y reproducibilidad de las tcnicas moleculares, con lo que se garantiza la obtencin de resultados confiables. Aunque se sacrifique el rendimiento en algunas ocasiones, las tcnicas actuales de biologa molecular no requieren de grandes cantidades de material gentico. Independientemente del mtodo de extraccin que se utilice, lo importante es realizar cada paso con cuidado para obtener ADN integro y puro que permita llevar a cabo las tcnicas posteriores.

CONCLUSINDe una manera sencilla y rpida se logr obtener DNA de material vegetal, y as comprobar la existencia del mismo y los reactivos mnimos necesarios para su extraccin. Adems que se observ que el hecho de emplear temperatura durante el proceso de extraccin como se realiz, el rendimiento en ADN es mayor con respecto al que no se emplea temperatura. Esto de manera visual, para corroborar todo este es necesaria una cuantificacin en un espectrmetro y tambin es necesario hacer pruebas en la pureza del ADN con geles de agarosa y de amplificacin por PCR para evaluar si el ADN extrado de esta manera es til en trabajos posteriores.

LITERATURA CITADAVelasco M. R. 2005. Marcadores moleculares y la extraccin de adn molecular markers and the dna extraction. Facultad de Ciencias Agropecuarias Vol3 No.1 Dellaporta, S. L., J. Wood and J. B. Hicks. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter. 1(4):19-21.Porebski, S., Bailey L. G., Baum B. R. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter. 15(1): 8-15.Osorio-Cadavid, E., M. Ramrez, W. A. Lpez, L. A. Mambuscay. 2009. Estandarizacin de un protocolo sencillo para la extraccin de ADN genmico de levaduras. Revista Colombiana de Biotecnologa. 11 (1):125-131.